CN103505743A - 含功能性microRNA/siRNA的细胞微粒子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含功能性microRNA/siRNA的细胞微粒子及其应用。具体地，本发明公开了一种功能性microRNA和/或siRNA的用途，用于制备施用于哺乳动物的组合物，施用所述组合物后在动物体内的第一部位中形成细胞微粒子，并运送到第二部位，从而改善第二部位的生理状态或治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。所述用途有利于优化功能性microRNA和/或siRNA的给药方式。

Description

含功能性microRNA/siRNA的细胞微粒子及其应用

发明领域

本发明属于医药领域，具体地涉及功能性microRNA/siRNA的新应用，更具体地涉及含功能性microRNA/SiRNA的细胞微粒子及其应用。

背景技术

微小核糖核酸microRNAs(microRNA)是一类长约19-23个核苷酸的单链小核糖核酸分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可以通过抑制靶基因的翻译过程对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，microRNA已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测microRNA至少能调控5300个人类基因，也就是所有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的microRNA被发现，其中microRNA与肿瘤的关系越来越成为研究的重点，已经发现若干microRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。

干扰核糖体酸(small interfering RNA，siRNA)是一类由20多个核苷酸组成的双链RNA分子，可以通过特异性降解靶基因的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)起到沉默基因表达的作用。这一过程被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。

RNA干扰是基因转录后调控的一种方式。siRNA可以对其靶基因进行特异性识别，并能招募被称为沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)的蛋白质复合体。RISC包含核糖核酸酶等，可以通过靶向切割同源性mRNA的方式，特异、高效地抑制基因的表达。由于使用RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于生物医学实验研究及各种疾病的治疗领域。

MicroRNA及siRNA参与疾病治疗

目前研究已经证明可以通过调节生物体内特定微小核糖核酸的含量或通过注入外源性siRNA，阻断或延缓疾病的进程。两者都可以通过影响特定蛋白质的表达参加疾病的治疗和预防。比如miR-206在骨骼肌中的表达可改善运动神经元的损伤或丧失，其作用主要是通过促进与激活肌肉与肌肉的神经元之间联系的再生来实现的，从而可以治疗肌萎缩性侧索硬化(或称ALS)；通过下调肝脏中的miR-122表达，能够对丙型肝炎起到治疗作用；miR-15和miR-16的丢失和之后导致的Bcl-2过表达是人类慢性淋巴性白血病(CLL)发生的重要的机理，在生物体过表达miR-15和miR-16可以起到治疗CLL的作用。

尽管MicroRNA及siRNA的研究开发取得了不少成果，但将其作为药物真正用于医疗还面临很多问题，尤其是如何提高此类药物的传送效率，通常需要在病灶部位给药才能有效地发挥其药效，而这种原位给药的治疗方法严重限制了药物的应用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种制备施用于哺乳动物的组合物的功能性microRNA和/或siRNA的用途，所述组合物在动物体内的第一部位中形成细胞微粒子，并运送到第二部位，从而改善第二部位的生理状态或治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。

本发明的另一目的在于提供一种异位治疗方法，所述方法包括步骤：给需要治疗的对象，在第一部位施用microRNA和/或siRNA，从而治疗第二部位的疾病。所述方法有利于给药方式多元化，克服某些部位不便给药的难题，有利于寻找到最适合治疗对象的给药方式。

在本发明的第一方面中，提供了一种功能性microRNA和/或siRNA的用途，它用于制备施用于哺乳动物的组合物，所述组合物在动物体内的第一部位中形成细胞微粒子，并被运送到第二部位，从而改善第二部位的生理状态或治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。

在另一优选例中，所述的部位包括细胞、组织和/或器官。

在另一优选例中，所述的第一部位远离第二部位。

在另一优选例中，一种被细胞微粒子包裹的功能性microRNA和/或siRNA的用途，用于制备治疗非产生该细胞微粒子的部位的疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的功能性microRNA为动物microRNA或其表达载体、植物microRNA或其表达载体、或微生物microRNA或其表达载体、或其组合；或所述的功能性microRNA为天然的microRNA或其表达载体、人工合成的microRNA或其表达载体、或其组合；

所述的功能性siRNA为动物siRNA或其表达载体、植物siRNA或其表达载体、或微生物siRNA或其表达载体、或其组合；或所述的功能性siRNA为天然的siRNA或其表达载体、人工合成的siRNA或其表达载体、或其组合。

在另一优选例中，所述的第一部位包括：肝脏、肺脏、胃肠道、乳腺、肾脏、脑、脾脏、淋巴、甲状腺、生殖器官、血细胞或淋巴细胞；和/或

所述的第二部位包括：脑、松果体、垂体、眼、耳、鼻、口、咽、腮腺、扁桃体、食道、气管、甲状腺、胸腺、乳腺、肺、心脏、胃、肠、阑尾、肝脏、胆囊、脾脏、胰腺、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、子宫、卵巢、输卵管、阴道、输精管、前列腺、阴茎、睾丸、肛门、骨骼、肌肉、结缔组织、神经、淋巴、血液、骨髓、或皮肤。

在另一优选例中，所述的第一部位包括：肝脏、肺、胃肠道、肾脏、血细胞、淋巴。

在另一优选例中，所述的疾病包括功能性microRNA和/或siRNA特异性相关疾病，包括(但不限于)：肿瘤、急慢性传染病或其它急慢性疾病。

在另一优选例中，所述的急慢性传染病包括：病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS的病毒性疾病，细菌性疾病(例如结核、细菌性肺炎)，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；

在另一优选例中，所述的其它急慢性疾病包括：呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌系统代谢性疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病。

在另一优选例中，所述的组合物，其施用方式包括口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜、或腔道给药。

在本发明第二方面中，提供了一种细胞微粒子的制备方法，它包括步骤：将功能性microRNA和/或siRNA施用于哺乳动物并被摄入，从而在所述哺乳动物的某一部位中所述功能性microRNA和/或siRNA被包裹，形成细胞微粒子。

在另一优选例中，所述的细胞微粒子是可释放的，并可运送至另一部位。

在另一优选例中，所述的施用方式包括口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜、腔道给药。

在另一优选例中，所述的部位包括：细胞、组织和/或器官。

在另一优选例中，所述的某一部位为本发明所述的第一部位。

在另一优选例中，所述的另一部位为本发明所述的第二部位。

在本发明第三方面中，提供了一种药物组合物，它包含：(1)药学上可接受的载体；以及(2)功能性microRNA和/或siRNA；其中所述的microRNA和/或siRNA在施用于哺乳动物后，在所述哺乳动物的某一部位中被包裹，从而形成细胞微粒子。

在另一优选例中，所述的部位包括细胞、组织和/或器官。

在另一优选例中，所述的细胞微粒子可被运送到另一部位，并在所述的另一部位发挥其功能。

在另一优选例中，所述的某一部位为本发明所述的第一部位。

在另一优选例中，所述的另一部位为本发明所述的第二部位。

在另一优选例中，所述药物组合物包括：片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、注射液、粉针剂、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、或栓剂。

在本发明第四方面中，提供了一种治疗方法，它包括步骤：给需要治疗的对象，在第一部位施用功能性microRNA和/或siRNA，从而治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：给需要治疗的对象，在第一部位施用microRNA和/或siRNA，所述的microRNA和/或siRNA被摄入并被包裹形成细胞微粒子后，被运送至第二部位，从而治疗第二部位的疾病。

在另一优选例中，所述的功能性microRNA和/或siRNA，其施用方式包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜、或腔道给药。

在另一优选例中，所述的第一部位远离第二部位。

在另一优选例中，所述的第二部位为病灶部位。

在本发明第五方面中，提供了一种治疗方法，它包括步骤：给需要治疗的对象，施用在本发明第三方面所述的药物组合物，从而治疗所述对象的疾病。

在另一优选例中，所述的需要治疗的对象包括人。

在另一优选例中，所述的疾病包括microRNA和/或siRNA特异性相关疾病，包括(但不限于)：肿瘤、急慢性传染病或其它急慢性疾病，其中，所述的急慢性传染病包括：病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等病毒性疾病，细菌性疾病(例如结核、细菌性肺炎)，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病；所述的其它急慢性疾病包括：呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌系统代谢性疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病；

在另一优选例中，所述的疾病包括：消化系统疾病(如肝癌)或循环系统疾病(如淋巴癌)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了静脉注射人工合成siRNA后，小鼠肝细胞中的siRNA含量变化。

图1B显示了静脉注射人工合成siRNA后，小鼠淋巴细胞中的siRNA含量变化。

图2A显示了胆总管注射人工合成microRNA后，小鼠肝细胞中的microRNA含量变化。

图2B显示了胆总管注射人工合成microRNA后，小鼠淋巴细胞中的microRNA含量变化。

图3A显示了静脉注射microRNA表达质粒后，小鼠肝细胞中microRNA的含量变化。

图3B显示了静脉注射microRNA表达质粒后，小鼠淋巴细胞中microRNA的含量变化。

其中，图3A和3B中各自有四组数据，分别为6h、12h、18h和24h；每组均由5个柱状图组成，每组的柱状图从左到右依次是Normal、Ad-control、Control plasmid、Ad-miR-145和miR-145plasmid。

具体实施方式

发明人经过深入的研究，意外地发现一种非病灶部位(或远离病灶部位)给予microRNA和/或siRNA实现治疗病灶部位疾病的治疗方法。所述方法有利于某些疾病治疗时给药方式的多元化，更有利于寻找最适合病人的给药方式。在此基础上，完成了本发明的内容。

本发明所述的功能性microRNA或siRNA

本发明所述的功能性microRNA可包括各个物种的microRNA，如包括动物、植物或微生物的功能性microRNA。也可以包括任何形式的microRNA，优选包括天然的功能性microRNA或其表达载体、人工合成的功能性microRNA或其表达载体、或其组合。

本发明所述的功能性siRNA可包括各个物种的siRNA，如包括动物、植物或微生物的功能性siRNA。也可以包括任何形式的siRNA，优选包括天然的功能性siRNA或其表达载体、人工合成的功能性siRNA或其表达载体、或其组合。本发明所用的人工合成的功能性microRNA或siRNA可按本领域常规方法合成得到。

本发明所述的功能性microRNA和/或siRNA的用途

本发明所述的microRNA和/或siRNA可作为活性成分，用于制备施用于哺乳动物(如人)的组合物，所述组合物后在动物体内的第一部位中形成细胞微粒子，并被运送到第二部位，从而改善第二部位的生理状态或治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。

其中，所述的疾病包括microRNA和/或siRNA特异性相关疾病，所述microRNA和/或siRNA特异性相关疾病是指所述microRNA和/或siRNA可改善或治愈的疾病，包括(但不限于)：肿瘤，急慢性传染病(例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS的病毒性疾病，例如结核、细菌性肺炎的细菌性疾病，以及其它各种病原微生物导致的急慢性传染病等)，以及其它急慢性疾病(例如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，血液与造血系统疾病，如心脑血管疾病的循环系统疾病，内分泌系统代谢性疾病，消化系统疾病，神经系统疾病，泌尿系统疾病，生殖系统疾病和运动系统疾病等)。

本发明所述的施用方式或给药方式

本发明所述的活性成分可通过胃肠道，鼻腔，气管，肺，非病灶部位的静脉或表皮、皮内、皮下，心内，肌肉，骨髓，腹腔，硬膜外，口腔，舌下，眼部，直肠，阴道，尿道，耳道等途径给药。优选施用方式或给药方式包括：口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜、或腔道给药。

其中，所述口服给药的方式包括吞服、含化等。所述呼吸道给药的方式为吸入方式，包括超声雾化吸入、氧气雾化吸入、手压式雾化吸入等。所述注射给药的方式包括动脉注射、肌肉注射、心内注射、皮下注射、皮内注射等。所述透皮给药或经皮给药，包括离子导入法、电致孔透皮法等。所述粘膜给药的方式包括鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼粘膜给药、直肠粘膜给药、子宫给药及阴道粘膜给药等。所述腔道给药的方式包括直肠给药、阴道给药、尿道给药、鼻腔给药、耳道给药等。

本发明所述的第一部位和第二部位

在本发明中，本发明所述的第二部位不同于本发明所述的第一部位。

本发明所述的第一部位是指动物体内，具有吸收microRNA和/或siRNA并将其以细胞微粒子包裹形式重新分泌的能力的各个细胞、组织和/或器官。例如：肝脏、肺脏、胃肠道、乳腺、肾脏、脑、脾脏、淋巴、甲状腺、生殖器官、血细胞、淋巴细胞等。

本发明所述的第二部位是指在第一部位形成的细胞微粒子被运送到的另一部位，并在此部位发挥功能的，所述第二部位包括细胞、组织和/或器官，例如：脑、松果体、垂体、眼、耳、鼻、口、咽、腮腺、扁桃体、食道、气管、甲状腺、胸腺、乳腺、肺、心脏、胃、肠、阑尾、肝脏、胆囊、脾脏、胰腺、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、子宫、卵巢、输卵管、阴道、输精管、前列腺、阴茎、睾丸、肛门、骨骼、肌肉、结缔组织、神经、淋巴、血液、骨髓、皮肤等。

细胞微粒子

细胞微粒子是机体内细胞在正常和病理状态下都会分泌的直径在30-1000nm之间的膜结构小体，由细胞膜类似的膜结构包裹的、包含细胞内容物的天然小颗粒，包括exosome和shedding vesicle两种。体内和体外的实验都证明细胞微粒子可以由红细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、肥大细胞、上皮细胞和肿瘤细胞等多种细胞分泌。细胞把特异的生物活性分子如蛋白质、mRNA等包裹到细胞微粒子中，这些生物活性分子通过细胞微粒子被运输到相应的受体细胞并调节受体细胞的生物功能，这种由细胞微粒子介导的细胞间信息传递在一些生理和病理过程中扮演着十分重要的作用。

本发明所述细胞微粒子包括各种大小在10-500nm之间，由细胞分泌的，具有脂质双层膜的天然生物囊泡，包括exosome、shedding vesicles以及针对各种细胞分泌的shedding vesicles的特称。

如本发明所用“包裹有功能性microRNA和/或siRNA的细胞微粒子”、“分泌性microRNA和/或siRNA”、“细胞微粒子-microRNA和/或siRNA复合物”可互换使用。

本发明所述的包裹有功能性microRNA和/或siRNA的细胞微粒子，可以是按本领域常用方法制得，优选按以下步骤制得：将功能性microRNA和/或siRNA施用于哺乳动物(如人)并被摄入，从而在所述哺乳动物的某一部位(如本发明所述的第一部位)中将摄入的功能性microRNA和/或siRNA进行包裹，形成细胞微粒子。所述的细胞微粒子是可释放的，并可运送至另一部位(如病灶部位)。例如，所述的细胞微粒子可进入动物体的循环系统，然后进入病灶部位。

本发明所述的细胞微粒子包裹有本发明所述的功能性microRNA和/或siRNA(即分泌性microRNA和/或siRNA)，被运送至病灶部位，并发挥治疗及预防病灶部位疾病的作用。所述“分泌性”是指上述microRNA或siRNA在进入动物体(如人)后，在某一部位被加工成细胞微粒子并被运送(如通过血液循环)至另一部位(即病灶部位)。

本发明提供了一种产生和检测分泌性microRNA和/或siRNA的方法，包括步骤：

1．制备microRNA或siRNA；

所述microRNA或siRNA的制备方式包括：化学合成microRNA成熟体序列或siRNA成熟体序列、通过载体表达microRNA成熟体序列或siRNA成熟体序列、或提取天然microRNA或siRNA。

2．将microRNA或siRNA施用于动物(如人)；

3．检测动物血液中分泌性microRNA和/或siRNA的含量；

所述方法包括：荧光实时定量PCR法。优选的，所述荧光实时定量PCR法(Real-time PCR)检测分泌性microRNA和/或siRNA含量的具体方法包括以下步骤：1)提取血清RNA；2)对血清RNA进行逆转录(RT)，然后对其产物cDNA进行PCR扩增。根据PCR反应中的得到的CT值，推导出最初参与反应的血清中特定分泌性microRNA和/或siRNA的含量。

药物组合物

本发明所述的活性成分是指本发明所述的功能性microRNA和/或siRNA。其中所述的microRNA和/或siRNA被施用于哺乳动物后，在所述哺乳动物的第一部位中被包裹，从而形成细胞微粒子。所述的细胞微粒子是可释放的，并可运送至第二部位，所述的第二部位为病灶部位。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的活性成分及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个注射剂。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠等)、明胶、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明所述的药物组合物的给药方式与本发明所述的施用方式(或给药方式)一致。

本发明所述药物组合物的剂型与给药方式一致，例如(但不限于)：片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、注射液、粉针剂、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、栓剂等。

治疗方法

本发明提供了一种治疗方法，所述方法包括步骤：给需要治疗的对象(如哺乳动物，包括人)，在第一部位(如远离病灶部位)施用本发明所述的功能性microRNA和/或siRNA，从而治疗所述对象第二部位(即病灶部位)的疾病。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：给需要治疗的对象，在第一部位施用本发明所述的功能性microRNA和/或siRNA，所述的microRNA和/或siRNA被摄入并被包裹形成细胞微粒子后，被释放、运送至第二部位，从而治疗所述对象第二部位的疾病，其中，所述的第二部位不同于(优选为远离)第一部位。

在另一优选例中，所述的施用方式(即给药方式)优选包括口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜、腔道给药等。具体如上文所述。所述的第一部位或第二部位如上文所述。

本发明还提供了一种治疗方法，包括步骤：给需要治疗的对象，施用本发明所述的药物组合物，从而治疗所述对象的疾病。

本发明提供了一种更加优选地治疗方法，具体包括步骤：(1)根据疾病的种类确定能够起到疾病治疗作用的microRNA和/或siRNA；(2)制备相应的microRNA或siRNA；(3)将microRNA或siRNA注射入人体；(4)检测体内血清中分泌性microRNA或siRNA的含量；(5)检测靶细胞中microRNA或SiRNA的含量；(6)检测靶细胞功能的改变；(7)检测疾病治疗效果。

细胞微粒子介导的microRNA传输作为新型给药方式治疗疾病的优点

由于细胞微粒子是由细胞分泌的、由细胞膜类似的膜结构包裹的、包含细胞内容物的天然小颗粒，它可以很容易的进入细胞，并且无毒副作用，因此细胞微粒子是一种高效的药物载体。由于细胞可以不间断地分泌细胞微粒子，它的获取相对容易，成本较低。经过改造处理的细胞微粒子还可以特异性地靶向受体细胞如肿瘤细胞，进而治疗疾病。

本发明的主要优点是：

1.提供了一种异位治疗疾病的方法，所述方法包括，给患者在远离病灶部位(如胆总管)施用功能性microRNA/siRNA，在其某一部位形成细胞微粒子，即“细胞微粒子－功能性microRNA/siRNA”复合物，并被运送(如通过进入循环系统)至即病灶部位(如淋巴细胞等)，从而达到治疗病灶部位疾病的作用。

2.细胞微粒子作为一种天然的生物相容性材料，使其充当载体介导的外源microRNA及siRNA的传输，有利于为将microRNA及siRNA作为抗病药物在全身进行给药治疗疾病。发展细胞微粒子介导的外源microRNA作为药物治疗疾病具有巨大的应用前景和市场价值。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1静脉注射人工合成siRNA可进入肝细胞及淋巴细胞

本实施例通过尾静脉注射方式，将人工合成的siRNA注入小鼠体内。siRNA在小鼠体内被肝细胞重新吸收，再次通过细胞微粒子将siRNA分泌入血液，在血液中形成“细胞微粒子-siRNA复合物”。循环系统中的淋巴细胞会摄取“细胞微粒子-siRNA复合物”，复合物中的siRNA会进入淋巴细胞并发挥相应的作用。

主要实验材料：

Balbc雄性小鼠数只(18-22g)、戊巴比妥钠、注射器、人工合成siRNA 092-3及NC(上海吉玛制药技术有限公司)、淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)、TaqMan探针(miR-U6及092-3)及实时荧光定量PCR(Real-Timequantitative PCR)相关试剂(Takara公司)。

实验方法及步骤：

1.动物实验：雄性Balbc小鼠(南京大学模式动物所),饲养3d后将饮食、饮水、活动正常者纳入实验。随机分组后，分别给小鼠尾静脉注射生理盐水(Normal组)、阴性对照siRNA(NC组)及092-3siRNA(092-3组)，于6h、12h、18h和24h处死小鼠，取血及肝组织。

2.淋巴细胞的分离：将新鲜的1ml抗凝血与PBS以1:1混匀后，加于2ml的细胞分离液液面之上，以2000转/分的速度离心15分钟，此时离心管中由上至下分为四层，收集第二层环状呈乳白色的淋巴细胞放入含4-5ml PBS的试管中，充分混匀后，以2000转/分的速度离心20分钟，所得沉淀即为淋巴细胞。

3.Real-Time quantitative PCR检测肝组织及淋巴细胞中092-3 siRNA水平：

(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取淋巴组织和肝组织中的RNA；

(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA，反应体系为：2μl淋巴细胞或肝组织的RNA，2μl 5×AMV缓冲液、1μl 10mM各种dNTP混合物(Takara公司)、0.5μlAMV(Takara公司)以及1μl miR-U6或092-3逆转录引物(美国ABI公司)，用3.5μlDEPC水补足体积至10μl。

(3)进行Real-Time quantitative PCR，反应体系及反应程序如下表1所示：

表1

PCR水	14.77μl
		10×buffer	2μl
MgCl2	1.2μl
		dNTP	0.4μl
Taq酶	0.3μl
		TaqMan探针	0.33μl
cDNA	1μl

进行PCR反应，条件为95℃5min，95℃15s，60℃1min，40个循环。

(4)检测结果经分析

结果表明，在尾静脉注射人工合成的siRNA 092-3(上海吉玛制药技术有限公司)后6小时，小鼠肝脏中的该外源siRNA的含量显著升高，12小鼠后仍然高于正常水平，但略低于6小时的情况。之后，在18小时后恢复到正常情况，结果见图1A。图中，Normal组表示尾静脉注射生理盐水组，NC组表示尾静脉注射人工合成的阴性对照siRNA，092-3组表示尾静脉注射人工合成的siRNA。

在尾静脉注射人工合成的092-3后6小时，小鼠淋巴细胞中同样检测到了高表达的该外源siRNA，其高浓度持续到注射后18小时，并在24小时时渐渐恢复正常，结果见图1B。

上述结果可以看出，静脉注射人工合成siRNA后，所述外源siRNA确实可以通过血液循环被相关组织吸收，如肝脏。

所述外源siRNA也进入了淋巴细胞内。然而，所述外源siRNA进入淋巴细胞的原因可能有两种：(1)肝脏可以作为一个发生器，将外源siRNA加工成被细胞微粒子包裹的siRNA，或称“细胞微粒子-siRNA复合物”，所述分泌siRNA然后进入循环系统，被循环系统中的淋巴细胞吸收，从而进入其中。(2)淋巴细胞可能直接吞噬静脉注射后血液中的游离siRNA而导致淋巴细胞中siRNA含量升高。

因此，为了排除第二种可能性，发明人进行如下实验(见实施例2)。

实施例2小鼠胆总管注射人工合成的microRNA可进入肝脏和T细胞

本实施例通过向小鼠胆总管注射人工合成microRNA：HA2-1，结果显示，在此种注射方式下，外源性microRNA同样可以进入肝细胞和淋巴细胞。

主要实验材料：

Balbc雄性小鼠数只(18-22g)、戊巴比妥钠，人工合成microRNA(HA2-1)、手术器械、静脉注射针、注射器、手术缝合线、淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)及Real-Time quantitative PCR相关试剂(Takara公司)。

实验方法及步骤：

1.动物实验：

(1)用戊巴比妥钠，按照40mg/kg体重的剂量麻醉小鼠；

(2)小鼠麻醉后，将其固定在试验台上，在小鼠腹部隔膜下方(肝脏处)剪开长约1-2cm的创口，找到胆总管；

(3)将人工合成的microRNA注射进胆总管，此时针头插入胆总管的方向指向肝脏方向，注射剂量为200微升，注射时可看到肝脏接近胆总管处略微发白，证明注射成功；

(4)缝合小鼠伤口，放于温暖处，16h后处死，取血及肝组织。

2.随后的淋巴细胞分离、Real-Time quantitative PCR检测肝组织及淋巴细胞中HA2-1含量测试的实验步骤同实施例1。

结果如图2A和图2B所示，通过胆总管将人工合成的microRNA注射进入小鼠后16小时，小鼠肝脏和淋巴细胞中的外源microRNA的表达也显著上升。图中，Normal组表示尾静脉注射生理盐水组，HA2-1组表示尾静脉注射人工合成的microRNA。

由于在此实施例中，淋巴细胞并没有直接接触注射进小鼠体内的游离microRNA，因此，此结果排除了实施例1中，淋巴细胞可能直接吞噬静脉注射后血液中的游离microRNA而导致淋巴细胞中microRNA含量升高的可能。

进一步证明了淋巴细胞中外源microRNA进入的方式为：通过胆总管注射的microRNA进入肝脏→microRNA被肝细胞以“细胞微粒子-microRNA复合物”的形式分泌到循环系统→循环系统中的“细胞微粒子-microRNA复合物”被血液中的淋巴细胞捕获而进入淋巴细胞。

发明人同样进行了小鼠胆总管注射人工合成siRNA的实验，结果表明：经胆总管注射后，人工合成siRNA同样进入了肝细胞及淋巴细胞，说明了外源siRNA进入淋巴细胞的方式同样是：通过胆总管注射进入肝脏→被肝细胞以细胞微粒子的形式分泌到循环系统→循环系统中的细胞微粒子被血液中的淋巴细胞捕获从而进入淋巴细胞。

实施例3 静脉注射microRNA表达质粒可进入肝脏及T细胞

主要实验材料：

Balbc雄性小鼠数只(18-22g)、戊巴比妥钠、注射器、人工构建的过表达miR-145的质粒(pAd-miR-145)及腺病毒(Ad-miR-145)(本实验室)、淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司)、TaqMan探针(miR-U6及miR-145)及Real-Timequantitative PCR相关试剂(Takara公司)。

实验方法及步骤：

1.过表达miR-145的重组腺病毒(Ad-miR-145)的构建

(1)重组质粒pCMV-miR-145的构建

提取小鼠的基因组，克隆miR-145的pre-miR-145序列，经酶切、酶连将克隆的目的片段连接到经PacI酶切的pAdTrack-CMV载体上，随后经测序鉴定，将正确克隆命名为：pCMV-miR-145。

(2)重组腺病毒穿梭质粒pAd-miR-145的构建

将上步构建的pCMV-miR-145质粒经PmeI酶切，线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1电穿孔共转化BJ5183。经测序鉴定将正确的克隆命名为pAd-miR-145(miR-145 plasmid)，同时制备空载体腺病毒pAd-control(controlplasmid)作为阴性对照。

(3)重组腺病毒Ad-control和Ad-miR-145的获得及扩增纯化

抽提上述重组腺病毒质粒pAd-miR-145和pAd-control，转染70%贴壁的HEK293T，在荧光显微镜下观察噬斑的形成及病毒带有绿色荧光蛋白基因的表达。转染后的第12-14天，收集发生病变的细胞，于-80℃及37℃反复冻融3-4次裂解细胞，于100,000g，4℃离心10min后，收集含病毒的上清，用收集的上清再次感染HEK 293T细胞，大量扩增腺病毒并进行鉴定。随后根据纯化病毒试剂盒的操作说明对病毒进行纯化，用空斑法对Ad-miR-145重组病毒和Ad-control空载体病毒进行病毒滴度的测定，最后将备至好的高滴度的Ad-miR-145重组病毒和Ad-control空载体病毒，于-80℃保存备用。

2.动物实验：同实施例1，不同的是尾静脉注射的材料分别为pAd-miR-145、pAd-control、Ad-miR-145、Ad-control。

3.随后的淋巴细胞分离、Real-Time quantitative PCR检测肝组织及淋巴细胞中miR-145含量检测的实验步骤同实施例1。

结果如图3A和图3B所示，其中，

Normal组表示经尾静脉注射生理盐水组；

Ad-control组表示经尾静脉注射重组腺病毒阴性对照组；

control plasmid组表示经尾静脉注射阴性对照pAd-control质粒组；

Ad-miR-145组表示经尾静脉注射过表达miR-145组；

miR-145 plasmid组表示经尾静脉注射过表达miR-145的pAd-miR-145质粒组。

结果表明，通过尾静脉注射过表达miR-145的质粒和腺病毒进入小鼠体后，6小时，小鼠肝脏中的该miRNA的含量都显著升高，12h小鼠后仍然高于正常水平，但略低于6小时的情况。在之后的18小时注射过表达miR-145质粒组的小鼠肝组织中miR-145的表达迅速下降，直到24小时恢复到正常情况；然而，注射过表达miR-145的腺病毒，在24小时小鼠肝组织中miR-145的水平仍高于正常组，结果见图3A。

在尾静脉注射过表达miR-145的质粒及腺病毒后6小时，小鼠淋巴细胞中同样检测到了高表达的miR-145。然而，注射过表达miR-145的腺病毒组，其高浓度持续到注射后18小时，而注射过表达miR-145的质粒后，其高浓度只维持注射后6小时，在12小时即恢复正常，结果见图3B。

此实施例说明：通过尾静脉将高表达miR-145的质粒和腺病毒注入小鼠体后，小鼠肝脏和淋巴细胞中miR-145的表达有显著上升，但施用miR-145的腺病毒要优于miR-145质粒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种功能性microRNA和/或siRNA的用途，其特征在于，用于制备施用于哺乳动物的组合物，所述组合物在动物体内的第一部位中形成细胞微粒子，并被运送到第二部位，从而改善第二部位的生理状态或治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的功能性microRNA为动物microRNA或其表达载体、植物microRNA或其表达载体、或微生物microRNA或其表达载体、或其组合；或所述的功能性microRNA为天然的microRNA或其表达载体、人工合成的microRNA或其表达载体、或其组合；

所述的功能性siRNA为动物siRNA或其表达载体、植物siRNA或其表达载体、或微生物siRNA或其表达载体、或其组合；或所述的功能性siRNA为天然的siRNA或其表达载体、人工合成的siRNA或其表达载体、或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述的第一部位包括：肝脏、肺脏、胃肠道、乳腺、肾脏、脑、脾脏、淋巴、甲状腺、生殖器官、血细胞或淋巴细胞；和/或

所述的第二部位包括：脑、松果体、垂体、眼、耳、鼻、口、咽、腮腺、扁桃体、食道、气管、甲状腺、胸腺、乳腺、肺、心脏、胃、肠、阑尾、肝脏、胆囊、脾脏、胰腺、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、子宫、卵巢、输卵管、阴道、输精管、前列腺、阴茎、睾丸、肛门、骨骼、肌肉、结缔组织、神经、淋巴、血液、骨髓、或皮肤。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的疾病包括功能性microRNA和/或siRNA特异性相关疾病，包括：肿瘤、急慢性传染病或其它急慢性疾病。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物，其施用方式包括口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜、或腔道给药。

6.一种细胞微粒子的制备方法，其特征在于，包括步骤：将功能性microRNA和/或siRNA施用于哺乳动物并被摄入，从而在所述哺乳动物的某一部位中所述功能性microRNA和/或siRNA被包裹，形成细胞微粒子。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含：(1)药学上可接受的载体；以及(2)功能性microRNA和/或siRNA；其中所述的microRNA和/或siRNA在施用于哺乳动物后，在所述哺乳动物的某一部位中被包裹，从而形成细胞微粒子。

8.一种治疗方法，其特征在于，包括步骤：给需要治疗的对象，在第一部位施用功能性microRNA和/或siRNA，从而治疗第二部位的疾病，其中第二部位不同于第一部位。

9.一种治疗方法，其特征在于，包括步骤：给需要治疗的对象，施用权利要求7所述的药物组合物，从而治疗所述对象的疾病。

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