CN103501804A - 眼泪替代物 - Google Patents

Abstract

本发明表征了用于治疗或预防干眼的粘蛋白多肽的眼用制剂。

Description

眼泪替代物

相关申请 

本专利申请要求2010年12月21日提交的美国临时申请号61/425,524的优先权，其内容通过引用整体并入本文。 

技术领域

本发明一般地涉及含有重组粘蛋白的组合物，其可用作用于治疗干眼的眼泪替代物。 

背景技术

泪膜是含有电解质和蛋白质(4种主要的蛋白质是：溶菌酶、乳铁蛋白、脂质运载蛋白和分泌型IgA)的水溶液，并具有在水-气界间处的源自睑板腺的脂质层(1)。泪液的一种非常重要的蛋白组分是一组被称作粘蛋白的蛋白质。已知它们是分泌型(MUC2、5AC、5B、6、7、9)或膜相关型(MUC1、3A、3B、4、16)。在前者中，MUC5AC已经在泪液中鉴别出(2)，并且MUC5AC、5B、6和7的mRNA在泪腺组织中检测出，但是MUC2却不然(3)。已经报道，膜相关型粘蛋白MUC1、3A、3B、4、16由角膜上皮和结膜上皮、泪器表达，并存在于泪液中(2)。所述粘蛋白给予泪液保护角膜细胞和结膜细胞免于干燥和摩擦应激的能力。此外，分泌型粘蛋白之一MUC5AC是一种大的、形成凝胶的粘蛋白，其可以捕获异物并参予它们经由鼻泪管从眼睛的清除。膜结合的粘蛋白是多糖包被的重要组分，所述多糖包被是锚定至角膜细胞和结膜细胞的肌动蛋白细胞骨架上的保护层，且从细胞表面向外延伸达大约200nm。除了它的保护作用以外，相信它与泪膜水相的粘蛋白相互作用并锚定所述粘蛋白。相信粘蛋白上的丰富的O-聚糖结构会充当经由碳水化合物特异性的受体(粘附素)附着于宿主细胞的病毒和细菌的诱饵受体。因而，在细胞表面上的碳水化合物结构与泪膜中的可溶性粘蛋白之间的所有组成成分的差异，将决定眼睛对特定病原体的易感性。 

干眼是通过泪膜的数量、质量或稳定性不足来解释的病症(4)。干眼病症可以分类成眼泪缺乏型或蒸发型(4)。前者进一步细分成舍格伦综合征相关的病症(原发型和继发型)和非舍格伦的眼泪缺乏病症(泪管疾病、泪管阻塞和机能障碍性瞬目反射)(4)。蒸发型干眼病症细分成油缺乏的、眼睑相关的和由眼睛表面的变化造成的那些(4)。最常见的是，水分缺乏型干眼与减少的眼泪产生有关，蒸发型干眼通常由睑板腺机能障碍造成(4)。在早期的将干眼疾病分类的尝试中，将该病症分成5类：粘蛋白缺乏、脂质缺乏、水分缺乏、眼睑异常或不充分的眨眼功能、和眼睛表面异常(5)。 

因为泪膜参予隐形眼镜的润滑和水合，无问题的隐形眼镜佩戴需要正常的泪膜。此 外，隐形眼镜佩戴可以促成亚临床干眼病症。因而，成功的镜片佩戴可能需要泪液替代物。 

人工泪液可以根据化学组成或生物学效应进行分类。下述组分已经用于人工泪液中(关于不同的商购可得的眼泪替代物中的组分的综合列表，参见(6))：1)水，2)盐水溶液，3)甘油、单糖类和二糖类(例如甘油、蔗糖、葡萄糖(dextrose)、山梨醇、甘露醇)，4)多糖类(例如粘液[胶质]、葡聚糖和粘多糖[透明质酸钠、硫酸软骨素钠])，5)合成的聚合物(例如乙烯基衍生物、乙二醇衍生物、其它合成的聚合物[聚山梨酯])，6)明胶，7)生物流体(例如血清、初乳、唾液、卵白蛋白和粘蛋白)，和8)脂质(6)。所述生物流体均未商品化(6)。 

发明内容

本发明提供了一种眼用制剂，其包含一定量的重组粘蛋白多肽。所述重组粘蛋白以有效地治疗或预防干眼的量存在于所述制剂中。任选地，所述制剂含有药学上可接受的载体。 

所述药学上可接受的载体含有一种或多种选自下述的成分：表面活性剂；张度剂；缓冲剂；防腐剂；共溶剂；和增粘剂(viscosity building agents)。 

所述重组粘蛋白多肽是，例如，PSGL-1、CD34、CD43、CD45、CD96、GlyCAM-1和MAdCAM-1或其片段。例如，所述粘蛋白多肽包含PSGL-1的至少一个区域，诸如细胞外部分。可替换地，所述重组粘蛋白多肽是分泌型粘蛋白或膜相关型粘蛋白。所述分泌型粘蛋白是MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7或MUC9。所述膜相关型粘蛋白是MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4或MUC16。 

在某些方面，所述重组粘蛋白被一种或多种糖基转移酶糖基化。例如，所述重组粘蛋白被唾液酸化。在某些实施方案中，多个重组粘蛋白是交联的，使得分子量大于1000kDa。在某些方面，所述重组粘蛋白多肽与免疫球蛋白多肽的至少一个区域(诸如重链免疫球蛋白多肽的区域)共价连接。优选地，所述免疫球蛋白多肽是免疫球蛋白重链的Fc区。 

本发明还包括，通过给受试者的眼表面施用本发明的眼用制剂来治疗具有干眼的受试者的方法。 

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料都可以用于实践或试验本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。在本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。如果出现矛盾，以本说明书及其中的定义为准。另外，所述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的，无意成为限制性的。 

从下述详细描述和权利要求显而易见本发明的其它特征和优点。 

具体实施方式

本发明涉及用作泪膜补充剂的眼用制剂。更具体地，本申请涉及滴入眼睛中的水性制剂，或者要在其中预浸泡或储存待插入眼睛中的物体的水性制剂，该物体为诸如隐形眼镜、软膏剂或待插入结膜囊中的固体装置。 

具体地，本发明涉及用于治疗和/或预防干燥性角结膜炎或干眼综合征中的眼科临床症状和征象的眼用药物组合物，其包含重组粘蛋白多肽作为有效成分。 

所述制剂可用于治疗诸如干燥性角结膜炎或干眼综合征的障碍。一般而言，所述制剂也可有效地缓解眼刺激的征状，诸如由干燥的环境条件或由隐形眼镜佩戴造成的那些征状。 

定义。 

本文中使用的术语“急性的”表示快速发作的病症，和严重但是持续时间短的征状。 

本文中使用的术语“止痛剂”表示，适合于长期使用的管理间歇的和/或慢性的身体不适的化合物/制剂。 

本文中使用的术语“麻醉剂”或“麻醉”表示适合于短期暂时使用的管理急性的身体疼痛的化合物/制剂，其在施用所述化合物/制剂的身体部位/器官中具有产生麻木的或敏感性降低的效果(例如，眼睛角膜的敏感性降低)。 

本文中使用的术语“水性的”通常表示水性组合物，其中按水的重量计算，载体的含量＞50％，更优选地＞75％和特别是90％。 

在本文中定义的术语“慢性的”是指持久的、持续的病症，或特征在于频繁复发的病症，优选持续/复发大于3个月、更优选大于6个月、更优选大于12个月、和甚至更优选大于24个月的病症。 

本文中使用的术语“舒适的”表示，与疼痛、灼热、刺感、瘙痒、刺激或与身体不适有关的其它征状的身体感觉相比，身体良好或缓解的感觉。 

本文中使用的术语“舒适的眼用制剂”表示眼用制剂，它使身体从与干眼疾病和/或眼睛不适有关的征状缓解，并且在滴入眼睛中时仅仅引起可接受的水平的疼痛、灼热、刺感、瘙痒、刺激、或与眼睛不适有关的其它征状，它们小于施用当前市售的浓度所观察到的那些。 

本文中使用的术语“干眼”表示眼泪产生不足和/或异常的眼泪组成。本文定义的干 眼疾病的成因包括但不限于下述的：自发性先天性无泪、眼球干燥症、泪腺摘除和感觉性去神经支配；胶原血管疾病，包括类风湿性关节炎、韦格纳氏肉芽肿病和系统性红斑狼疮；舍格伦综合征和与舍格伦综合征有关的自身免疫疾病；由睑缘炎或酒渣鼻造成的脂质泪液层异常；由维生素A缺乏造成的粘蛋白泪液层异常；沙眼、白喉性角膜结膜炎；皮肤粘膜病症；老化；绝经；和糖尿病。本文定义的干眼征象和/或征状也可能由其它情况引起，所述情况包括但不限于：长时间视力工作；用计算机工作；处于干燥环境中；眼睛刺激；隐形眼镜、激光原位角膜磨镶术(LASIK)及其它屈光外科手术；疲劳；和用药，诸如异维A酸、镇静剂、利尿剂、三环抗抑郁药、抗高血压药、口服避孕药、抗组胺药、鼻解充血药、β-阻断剂、吩噻嗪、阿托品和缓解疼痛的阿片剂诸如吗啡。 

短语“有效量”是本领域公知的术语，表示这样的药剂量：当掺入本发明的药物组合物中时，其以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比产生一些所需效果。在某些实施方案中，该术语表示消除、减少或维持(例如，预防其蔓延)干眼和/或眼刺激的迹象和/或征状、或者预防或治疗干眼和/或眼刺激所必需的或足够的量。所述有效量可以随诸如下述因素而变化：治疗的疾病或病症、施用的具体组合物、或疾病或病症的严重程度。本领域技术人员可以根据经验确定具体药剂的有效量，而不需要过多的实验。 

要用主题方法治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”表示人或非人动物，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。 

短语“药学上可接受的”是本领域公知的，并且表示这样的组合物、聚合物和其它材料和/或其盐和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。 

短语“药学上可接受的载体”是本领域公知的，并且表示，例如，药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与将任何补充剂或组合物或其组分从一个器官或身体部位携带或运输至另一个器官或身体部位，或者将药剂递送至眼睛的表面。每种载体必须是“可接受的”，其含义是，与所述组合物的其它成分相容，且对病人无害。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无热原的。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉末；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、葵花子油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山 梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；(21)树胶诸如HP-瓜尔胶；(22)聚合物；和(23)应用于药物制剂中的其它无毒的相容物质。 

术语“药学上可接受的盐”是本领域公知的，并且表示本发明的组合物或其任意组分，包括但不限于，治疗剂、赋形剂、其它材料等的相对无毒的无机和有机酸加成盐。药学上可接受的盐的例子包括：衍生自矿物酸如盐酸和硫酸的那些，以及衍生自有机酸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的那些。用于形成盐的合适无机碱的例子包括氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。还可以用合适的有机碱形成盐，包括无毒并足够强以形成这类盐的那些有机碱。出于例证的目的，这样的有机碱的类别可以包括：单-、二-、和三-烷基胺诸如甲胺、二甲胺和三乙胺；单-、二-或三-羟基烷基胺诸如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基还原葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；(三羟基甲基)氨基乙烷；氨丁三醇，等。参见，例如，J.Pharm.Sci.，66：1-19(1977)。 

当与诸如干眼和/或眼刺激等病症关联使用时，术语“预防”是本领域公知的，并且表示组合物的施用使得与没有接受所述组合物的受试者相比，减少了受试者中的医学状况的征象和/或征状的频率，或者延迟了其发作。 

本文中使用的术语“眼泪替代物”和“人工泪液”可以互换使用，且各自表示这样的一种或多种分子或组合物：其润滑、“湿润”、模仿内源泪液的稠度，辅助天然泪液积累，或者在眼睛施用后以其它方式提供干眼征象和/或征状和病症的暂时缓解，包括但不限于聚合物(例如，纤维质聚合物)、眼睛表面保护剂、湿润剂或在FDA的眼泪替代物专文中提及的其它组分。术语“眼泪替代物组分”表示其一种或多种组分。 

术语“治疗”是本领域公知的术语，其表示减少或改善任何病症或疾病的至少一种征象和/或征状。 

粘蛋白多肽。 

在不同的方面，本发明提供了可用于治疗干眼的、含有重组粘蛋白多肽的组合物。 

“粘蛋白多肽”是指具有粘蛋白结构域的多肽。所述粘蛋白多肽具有一个、两个、三个、五个、十个、二十个或更多个的粘蛋白结构域。所述粘蛋白多肽是特征在于被O-聚糖取代的氨基酸序列的任意糖蛋白。例如，粘蛋白多肽每2个或3个氨基酸就是丝氨酸或苏氨酸。所述粘蛋白多肽是分泌型蛋白。可替换地，所述粘蛋白多肽是细胞表面蛋白。 

粘蛋白结构域富含氨基酸苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸，其中寡糖通过N-乙酰基半乳糖胺与羟基氨基酸(O-聚糖)连接。粘蛋白结构域包括O-连接的糖基化位点，或可替换地由O-连接的糖基化位点组成。粘蛋白结构域具有1、2、3、5、10、20、50、100或更多个O-连接的糖基化位点。可替换地，粘蛋白结构域包括N-连接的糖基化位点。粘蛋白多肽的质量的50％、60％、80％、90％、95％或100％归因于聚糖。粘蛋白多肽是由MUC基因(即，MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5a、MUC5b、MUC5c、MUC6、MUC11、MUC12等)编码的任意多肽。可替换地，粘蛋白多肽是P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)、CD34、CD43、CD45、CD96、GlyCAM-1、MAdCAM-1、红细胞血型糖蛋白、糖萼素、血型糖蛋白、涎福林(sialophorin)、白涎蛋白(leukosialin)、LDL-R、ZP3和表糖癌蛋白。优选地，所述粘蛋白是PSGL-1。PSGL-1是一种同型二聚体糖蛋白，其具有两个二硫键连接的1型跨膜拓扑学的120kDa亚基，每个亚基包括402个氨基酸。在细胞外结构域中，存在15个重复的10-氨基酸共有序列，所述共有序列含有3或4个用于添加O-连接的寡糖的潜在位点。在一个实施方案中，所述10-氨基酸共有序列是A(I)Q T T Q(PAR)P(LT)A(TEV)A(PG)T(ML)E(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方案中，所述10-氨基酸共有序列是A Q(M)T T P(Q)P(LT)A A(PG)T(M)E(SEQ ID NO：2)。预计PSGL-1在每个单体中具有超过53个用于O-连接的糖基化的位点和3个用于N-连接的糖基化的位点。 

所述粘蛋白多肽含有整个粘蛋白蛋白质或粘蛋白蛋白质的一部分。可替换地，所述粘蛋白蛋白质包括所述多肽的细胞外部分。例如，所述粘蛋白多肽包括PSGL-1的细胞外部分或其一部分(例如，在GenBank登记号A57468中公开的氨基酸19-319)。所述粘蛋白多肽还包括PSGL-1的信号序列部分(例如，氨基酸1-18)、跨膜结构域(例如，氨基酸320-343)和细胞质结构域(例如，氨基酸344-412)。 

所述重组粘蛋白多肽可以作为寡聚体(诸如二聚体、三聚体或五聚体)存在。优选地，所述融合多肽是二聚体。 

“非粘蛋白多肽”表示这样的多肽，其质量的至少小于40％归因于聚糖。 

所述粘蛋白多肽与整个粘蛋白蛋白质或粘蛋白蛋白质的一部分相对应。例如，所述重组粘蛋白多肽包含粘蛋白蛋白质的至少一部分。“至少一部分”是指，所述粘蛋白多肽含有至少一个粘蛋白结构域(例如，O-连接的糖基化位点)。所述粘蛋白蛋白质包含所述多肽的细胞外部分。例如，所述粘蛋白多肽包含PSGL-1的细胞外部分。 

所述重组粘蛋白多肽被一种或多种糖基转移酶糖基化。第一多肽被2种、3种、5种或更多种糖基转移酶糖基化。糖基化是序贯的或连续的。可替换地，糖基化是同时的或随 机的，即，没有特别的顺序。所述第一多肽被能够向蛋白主链添加N-连接的或O-连接的聚糖、或者能够在蛋白主链上产生N-连接的或O-连接的聚糖的任意酶糖基化。例如，第一多肽被α2，3-和/或α2，6-唾液酸转移酶糖基化。α2，3/6-唾液酸转移酶的合适来源包括但不限于：GenBank登记号NP_059132、AAO39150、ABP35533、ABP35532、ABQ10741、ABQ10740、AAS77221、AAS77220、AAS77219、AAS77216、AAS77215、AAS77214、AAX20109、AAO39151、AAO39149、AAP47170、AAP47169、AAP47168、AAP47167、AAP47166、AAP47165和AAP47164，并通过引用整体并入本文。在具体实施方案中，所述第一多肽被α2，3/6-唾液酸转移酶和核心2β1，6-N-乙酰基葡糖胺基转移酶二者糖基化。核心2β1，6-N-乙酰基葡糖胺基转移酶的合适来源包括但不限于：GenBank登记号CAA79610、Z19550、BAB66024、AP001515、AJ420416.1、AK313343.1、AL832647.2、AY196293.1、BC074885.2、BC074886、BC109101、BC109102.1、M97347.1、BAG36146.1、CAD89956.1、AAH74885.1、AAH74886.1、AAI09102.1、AAI09103.1、AAA35919.1、AAH17032、O95395、NP_004742、EAW77572、NP_004742.1、BC017032、AF102542.1、AAD10824.1、AF038650.1、NM_004751.2、Q9P109、NP_057675、EAW95751、AF132035.1、AAF63156.1和NP_057675.1。所述第一多肽的质量的超过40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％归因于碳水化合物。 

在某些方面，所述重组粘蛋白多肽与第二多肽可操作地连接。本文中使用的“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包括与非粘蛋白多肽可操作地连接的粘蛋白多肽的至少一部分。 

在融合蛋白内，术语“可操作地连接”意图指示，所述粘蛋白多肽和第二多肽化学连接(最常见的是通过共价键诸如肽键)，其连接方式允许对所述粘蛋白多肽进行O-连接的和/或N-连接的糖基化。当被用于表示编码融合多肽的核酸时，术语可操作地连接是指，编码粘蛋白多肽和非粘蛋白多肽的核酸在框架内彼此融合。非粘蛋白多肽可以与粘蛋白多肽的N-端或C-端融合。 

任选地，所述粘蛋白融合多肽与一个或多个额外部分连接。例如，融合蛋白可以额外与GST融合蛋白连接，其中，融合蛋白序列与GST(即，谷胱甘肽S-转移酶)序列的C-端融合。这种融合蛋白可以促进融合蛋白的纯化。可替换地，所述融合蛋白可以额外与固体支持物连接。本领域技术人员已知多种固体支持物。例如，融合蛋白与下述物质连接：颗粒(其由例如金属化合物、二氧化硅、胶乳、聚合物材料制成)；微孔滴定板；硝酸纤维素、或尼龙或它们的组合。 

所述融合蛋白包括在其N-端处的异源信号序列(即，不存在于由粘蛋白核酸编码的多 肽中的多肽序列)。例如，可以除去天然粘蛋白糖蛋白信号序列，并用来自另一种蛋白质的信号序列替换。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列，可以增加多肽的表达和/或分泌。 

本发明的嵌合蛋白或融合蛋白可以通过标准重组DNA技术生产。例如，根据常规技术，将编码不同多肽序列的DNA片段在框架内连接在一起，例如，通过使用平端化的或交错末端化的末端进行连接，用限制性酶消化来提供合适的末端，根据情况加入粘性末端，用碱性磷酸酶处理以避免不希望的接合，和酶促连接。所述融合基因通过常规技术，包括自动化的DNA合成仪合成。可替换地，使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物会在两个连续基因片段之间产生互补突出端，其可以随后退火并重新扩增以产生嵌合的基因序列(参见，例如，Ausubel等人.(编)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，1992)。此外，许多编码融合部分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区)的表达载体是商购可得的。可以将编码粘蛋白的核酸克隆进这样的表达载体中，使得所述融合部分与免疫球蛋白蛋白质在框架内连接。 

所述融合多肽可以作为寡聚体(诸如二聚体、三聚体或五聚体)存在。优选地，所述融合多肽是二聚体。 

使用本领域已知的编码粘蛋白的序列，构建所述粘蛋白多肽和/或编码所述粘蛋白多肽的核酸。粘蛋白多肽和编码粘蛋白多肽的核酸的合适来源包括各个GenBank登记号NP663625和NM145650、CAD10625和AJ417815、XP140694和XM140694、XP006867和XM006867和NP00331777和NM009151，且通过引用整体并入本文。 

所述粘蛋白多肽部分作为变体粘蛋白多肽来提供，所述变体粘蛋白多肽具有在天然存在的粘蛋白序列(野生型)中的改变，所述改变会导致增加的碳水化物含量(相对于未突变的序列)。如本文中使用的，天然存在的(野生型)粘蛋白序列中的改变包括在核苷酸和/或氨基酸序列中的一个或多个置换、添加或缺失，使得一个或多个氨基酸置换、添加或缺失被引入编码的蛋白中。通过标准技术，诸如定位诱变和PCR介导的诱变，可以将改变引入天然存在的粘蛋白序列中。 

例如，与野生型粘蛋白相比，所述变体粘蛋白多肽包含额外的O-连接的糖基化位点。可替换地，所述变体粘蛋白多肽包含氨基酸序列改变，后者会导致与野生型粘蛋白多肽相比增加的丝氨酸、苏氨酸或脯氨酸残基数目。通过使用本领域技术人员已知的方法确定粘蛋白中蛋白质与碳水化合物的比率，可以评估该增加的碳水化合物含量。 

可替换地，所述粘蛋白多肽部分作为变体粘蛋白多肽提供，所述变体粘蛋白多肽具 有在天然存在的粘蛋白序列(野生型)中的改变，所述改变会导致粘蛋白序列具有更多的O-糖基化位点，或使粘蛋白序列优选地被肽N-乙酰基半乳糖氨基转移酶识别，从而导致更高程度的糖基化。 

在某些实施方案中，所述粘蛋白多肽部分作为变体粘蛋白多肽提供，所述变体粘蛋白多肽具有在天然存在的粘蛋白序列(野生型)中的改变，所述改变会导致粘蛋白序列更耐受蛋白水解(相对于未突变的序列)。 

所述粘蛋白多肽包括全长PSGL-1。可替换地，所述第一多肽包含小于全长的PSGL-1多肽，例如，PSGL-1多肽的功能片段。例如，所述第一多肽是在PSGL-1多肽的长度中的小于400个连续氨基酸，例如，在PSGL-1多肽的长度中的小于或等于300个、250个、150个、100个或50个连续氨基酸，并且是在PSGL-1多肽的长度中的至少25个连续氨基酸。所述第一多肽是，例如，PSGL-1的细胞外部分，或者包括其部分。示例性的PSGL-1多肽和核酸序列包括GenBank登记号：XP006867、XM006867、XP140694和XM140694。 

第二多肽优选地是可溶性的。在某些实施方案中，所述第二多肽包括促进融合多肽与第二粘蛋白多肽缔合的序列。所述第二多肽包括免疫球蛋白多肽的至少一个区域。“至少一个区域”意在包括免疫球蛋白分子的任意部分，例如轻链、重链、Fc区、Fab区、Fv区或其任意片段。免疫球蛋白融合多肽是本领域已知的，且描述在例如美国专利号5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147和5,455,165中。 

第二多肽包含全长免疫球蛋白多肽。可替换地，第二多肽包含小于全长免疫球蛋白多肽，例如，重链、轻链、Fab、Fab₂、Fv或Fc。优选地，第二多肽包括免疫球蛋白多肽的重链。更优选地，第二多肽包括免疫球蛋白多肽的Fc区。 

与野生型免疫球蛋白重链的Fc区的效应子功能相比，第二多肽具有更少的效应子功能。可替换地，第二多肽具有与野生型免疫球蛋白重链的Fc区相似或更大的效应子功能。Fc效应子功能包括，例如，Fc受体结合、补体结合和T细胞消耗活性(参见例如，美国专利号6,136,310)。检测T细胞消耗活性、Fc效应子功能、和抗体稳定性的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，所述第二多肽对Fc受体具有低的亲合力或没有亲合力。可替换地，所述第二多肽对补体蛋白C1q具有低的亲合力或没有亲合力。 

本发明的另一个方面涉及载体，优选表达载体，其含有编码粘蛋白多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物的核酸。所述载体含有编码粘蛋白多肽的核酸，其可操作地连接至编码免疫球蛋白多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物的核酸。另外，所述载体包 含编码糖基转移酶(诸如α2，3-和/或α2，6-唾液酸转移酶)的核酸。本文中使用的术语“载体”表示这样的核酸分子：其能够运输它已经连接的另一种核酸。一类载体是“质粒”，所述质粒是指，在其中可以连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中可以将额外DNA区段连接进病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入在其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型(episomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加体型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后会整合进宿主细胞的基因组中，并因此随着宿主基因组进行复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这种载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体经常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意图包括起等同功能的这样的其它形式的表达载体，例如，病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。 

本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，该核酸以适于在宿主细胞中表达的形式存在，这意味着所述重组表达载体包括一个或多个调节序列，所述调节序列基于要用于表达的宿主细胞而选择，其与要表达的核酸序列可操作连接。在重组表达载体内，“可操作连接”意图表示，目标核苷酸序列以允许所述核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当将载体引入宿主细胞中时，在宿主细胞中)的方式与调节序列连接。 

术语“调节序列”意图包括启动子、增强子及其它表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列被描述在，例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。调节序列包括指导核苷酸序列在多种宿主细胞中的组成型表达的那些调节序列，和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些调节序列(例如，组织特异性的调节序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可以取决于诸如下述因素：要转化的宿主细胞的选择，希望的蛋白表达水平等。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由本文描述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。 

可以将本发明的重组表达载体设计成用于在原核或真核细胞中表达融合多肽。例如，可以在细菌细胞(诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达融合多肽。合适的宿主细胞另外描述于：Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。可替换地，可以在体外转录和翻译重组表达载体，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。 

蛋白在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中进行，其中使用含有组成型或诱导型启动子的载体指导融合蛋白或非融合蛋白的表达。融合载体向在其中编码的蛋白添加多个氨基酸，通常添加在所述重组蛋白的氨基端。这种融合载体通常用于三种目的：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的可溶性；和(iii)通过在亲和纯化中起配体的作用来辅助重组蛋白的纯化。在融合表达载体中，经常在融合部分和重组蛋白的接头处引入蛋白水解性切割位点，以实现在融合蛋白纯化之后重组蛋白与融合部分的分离。这样的酶及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988.Gene67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，它们分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与靶重组蛋白融合。 

合适的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann等人，(1988)Gene69：301-315)和pET11d(Studier等人，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)60-89)。 

使大肠杆菌中的重组蛋白表达最大化的一个策略是，将所述蛋白在具有受损的蛋白水解性地切割所述重组蛋白的能力的宿主细菌中表达。参见，例如，Gottesman，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)119-128。另一个策略是，改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的各自密码子是在大肠杆菌中优先利用的那些(参见，例如，Wada，等人，1992.Nucl. Acids Res.20：2111-2118)。通过标准DNA合成技术，可以实现本发明的核酸序列的这种改变。 

融合多肽表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari，等人，1987.EMBOJ.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982.Cell30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987.Gene54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和picZ(InVitrogen Corp，San Diego，Calif.)。 

可替换地，使用杆状病毒表达载体，可以在昆虫细胞中表达融合多肽。可用于在培养的昆虫细胞(例如，甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)细胞或SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith，等人，1983.Mol. Cell.Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989.Virology170：31-39)。 

使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987.Nature329：840)和pMT2PC(Kaufman，等人，1987.EMBOJ. 6：187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，经常由病毒调节元件提供表达载体的控制功能。例如，常用的启动子源自多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于原核和真核细胞的其它合适的表达系统，参见，例如，Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989的第16和17章。 

本发明的另一个方面涉及其中已经引入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换地使用。应当理解，所述术语不仅用来指特定的主题细胞，而且也指所述细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或者环境影响而造成某些修饰可能在继代中发生，因此实际上所述后代可能不同于母代细胞，但仍然被包括在本文使用的该术语的范围内。 

宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞，例如，可以在下述细胞中表达融合多肽：细菌细胞诸如人肠杆菌，昆虫细胞诸如甘蓝夜蛾，酵母或哺乳动物细胞(诸如人、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。 

通过常规转化或转染技术，可以将载体DNA引入原核细胞或真核细胞中。本文中使用的术语“转化”和“转染”意图表示，多种本领域公知的将外来核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。适合用于转化或转染宿主细胞的方法可以参见：Sambrook，等人.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其它实验室手册。 

就哺乳动物细胞的稳定转染而言，已知的是，取决于使用的表达载体和转染技术，仅小部分细胞可以将外源DNA整合进它们的基因组中。为了识别并选择这些整合体，通常将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的基因与目标基因一起引入宿主细胞中。不同的选择标记包括赋予对药物(诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的那些标记。可以将编码选择标记的核酸与编码融合多肽的核酸在同一载体上引入宿主细胞中，或者，可以在分开的载体上引入。通过药物选择(例如，已经整合了选择标记基因的细胞会存活，而其它细胞死亡)，可以鉴别被引入的核酸稳定地转染的细胞。 

本发明的宿主细胞，诸如培养的原核或真核宿主细胞，可以用于生产(即，表达)融合多肽。因此，本发明另外提供了使用本发明的宿主细胞生产融合多肽的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(在其中已经引入了编码融合多肽的重组表达载体)，从而产生融合多肽。在另一个实施方案中，所述方法进一步包 括从培养基或宿主细胞中分离多肽。 

所述融合多肽可以根据常规条件进行分离和纯化，诸如提取、沉淀、色谱法、亲和色谱法、电泳等。例如，可以如下纯化免疫球蛋白融合蛋白：使溶液流经含有固定化的蛋白A或蛋白G的柱，所述蛋白A或蛋白G选择性地结合融合蛋白的Fc部分。参见，例如，Reis，K.J.，等人，J.Immunol.132：3098-3102(1984)；PCT申请公开号WO87/00329。所述融合多肽然后可以如下洗脱：用离液盐处理洗脱，或用醋酸水溶液(1M)洗脱。 

可替换地，使用本领域已知的方法，可以化学合成根据本发明的粘蛋白多肽和或融合多肽。多肽的化学合成描述在，例如，Peptide Chemistry，APractical Textbook，Bodasnsky，Ed.Springer-Verlag，1988；Merrifield，Science232：241-247(1986)；Barany，等人，Intl.J.Peptide Protein Res.30：705-739(1987)；Kent，Ann.Rev.Biochem.57：957-989(1988)，和Kaiser，等人，Science243：187-198(1989)。使用标准的肽纯化技术，纯化所述多肽，使得它们基本上不含有化学前体或其它化学试剂。用语“基本上不含有化学前体或其它化学试剂”包括这样的肽制品：其中所述肽与在肽的合成中所涉及到的化学前体或其它化学试剂分离。在一个实施方案中，用语“基本上不含有化学前体或其它化学试剂”包括这样的肽制品：其具有小于约30％(按干重计)的化学前体或非肽化学试剂，更优选小于约20％化学前体或非肽化学试剂，更优选小于约10％化学前体或非肽化学试剂，最优选小于约5％化学前体或非肽化学试剂。 

多肽的化学合成促进修饰的或非天然的氨基酸(包括D-氨基酸和其它小有机分子)的引入。用对应的D-氨基酸同种型替换肽中的一个或多个L-氨基酸，可以增加肽对酶促水解的抵抗力，并且增强生物活性肽的一种或多种性质，即，受体结合、功能效能或作用的持续时间。参见，例如，Doherty，等人，1993.J.Med.Chem.36：2585-2594；Kirby，等人，1993.J.Med.Chem.36：3802-3808；Morita，等人，1994.FEBS Lett.353：84-88；Wang，等人，1993.Int.J.Pept.Protein Res.42：392-399；Fauchere和Thiunieau，1992.Adv.Drug Res.23：127-159。 

向肽序列中引入共价交联可以从构象上和拓扑学上约束多肽主链。该策略可以用于开发具有增加的效能、选择性和稳定性的融合多肽的肽类似物。由于环形肽的构象熵低于其线性对应物，采用特定构象可能使环形类似物与非环形类似物相比熵的下降量减少，从而使结合自由能更有利。经常通过在肽的N-和C-端之间、在侧链和N-或C-端之间[例如，用K₃Fe(CN)₆，在pH8.5](Samson等人，Endocrinology，137：5182-5185(1996))、或在两个氨基酸侧链之间形成酰胺键而完成大环化。参见，例如，DeGrado，Adv Protein Chem，39：51- 124(1988)。还将二硫键引入线性序列中以降低它们的柔性。参见，例如，Rose，等人，Adv Protein Chem，37：1-109(1985)；Mosberg等人，Biochem Biophys Res Commun，106：505-512(1982)。此外，已经用青霉胺(Pen，3-巯基-(D)缬氨酸)替代半胱氨酸残基，以增加一些阿片样-受体相互作用的选择性。Lipkowski和Carr，Peptides：Synthesis，Structures，and Applications，Gutte，编，Academic Press第287-320页(1995)。 

眼用制剂。 

本发明表征了包含重组粘蛋白的新颖眼用制剂，其在滴至眼睛表面后是舒适的，且对于重复的长期使用而言是安全的。因此，本文所述的舒适的眼用制剂会治疗干眼和/或眼睛刺激的征象和征状，并增加这样的制剂在用于治疗和/或预防与干眼疾病和/或眼睛不适有关的征象和征状的用途中的长期患者顺应性。 

本发明还部分地基于，单独的重组粘蛋白可以有效地改善泪膜稳定性(评估为泪膜破碎时间和眼睛保护指数(Ocular Protection Index)的增加)和改善总体眼睛表面健康(评估为减少的角膜染色(corneal staining)和结膜发红，增加的角膜敏感性、降低的眨眼率和改善的视力表现)。 

因此，所述制剂在滴入眼睛后是舒适的，且可以用于缓解急性的或慢性的干眼疾病，并且特别适合用于间歇性和长期使用。本发明的制剂还可以用于治疗其它眼障碍，如果它含有针对该障碍的药物。 

在眼用制剂中的粘蛋白的量可以随产品类型而较大地变化。例如，在隐形眼镜相关的溶液中，粘蛋白浓度在约0.001％至5.0重量％之间变化。在干眼制剂中，粘蛋白水平在约0.1％至约10.0重量％之间变化。在固体眼用插入剂递送装置中，粘蛋白水平达到约90.0重量％或更大。在每类制剂内，浓度可能随诸如待治疗的干眼病症的严重程度等因素而变化，以增强粘蛋白溶液的特定性质。这些范围用于例证目的，无意以任何方式限制权利要求的范围。 

示例性的眼用组合物作为润滑滴眼剂特别地有用，润滑滴眼剂即，人工泪液溶液、泪液补充剂、局部眼科药物施用的递送媒介物。在大多数这些应用中中，所述组合物以缓冲的无菌水溶液的形式提供。通常，这些溶液具有约1-100cps的粘度。作为溶液，所述组合物以滴眼剂的形式分配在眼睛中。但是，应当理解，本文所述的组合物还可以配制为粘稠的液体(即，粘度从几百至几千cps)、凝胶或软膏剂。在这些应用中，粘蛋白组分分散或溶解在适当的媒介物中，所述媒介物例如Lubragel、GRR Lubricating Jelly或Karajel，它们都是United-Guardian，Inc.，Hauppauge，N.Y的注册了商标的产品。 

示例性的组合物还可以配制为固体眼睛插入剂，当放入眼睛的结膜穹窿中时，其随着时间而溶解或消蚀。 

溶胀-控释装置由均匀分散在玻璃质聚合物(诸如水溶性纤维质)中的粘蛋白组成。当将所述插入剂置于眼中时，泪液开始渗入基质，随后基质溶胀，并最终溶解。随着该过程发生，粘蛋白被释放进眼中，以在长时间段内提供干眼征状的缓解。 

可消蚀的装置也是由均匀分散在聚合物基质中的粘蛋白组成。在该情况下，粘蛋白通过导致基质聚合物溶解的化学反应(水解)而释放，经常在装置的表面处。通常，所述基质材料是聚酸酐或聚(原酸酯)。 

在另一个实施方案中，所述粘蛋白可以被化学修饰或交联，以充当它自身的“基质”，其中粘蛋白构成整个或几乎整个装置，从而提供可供眼睛利用的最大量的粘蛋白。 

此外，在某些隐形眼镜相关的实施方案中，可以将本文公开的示例性的跨膜或表面粘蛋白掺入隐形眼镜浸泡和护理溶液中以及隐形眼镜佩戴者的润滑滴眼剂中。 

在另一个实施方案中，所述粘蛋白可以用于药物递送。最常见的和方便的眼用药物递送方法是，通过局部滴眼剂。通常，使用的溶液媒介物会被泪液快速地稀释，并在几分钟内从眼睛排出。如此短的停留时间会阻碍药物在眼睛中的吸收并因此阻碍其生物利用度。经常通过极大地增加药物的浓度来克服短停留时间，以改善生物利用度。由于目前被处方的许多眼用药物的全身性作用，这经常导致显著的不希望的副作用。 

已经进行了许多研究来改善药物媒介物在眼睛表面处的停留时间，以及促进药物与媒介物的相互作用或缔合。一个已经商品化的方案是，利用交联的羧基-功能聚合物，诸如由B.F.Goodrich提供的

该聚合物的生物粘附性质已经成为在美国专利号4,615,697和美国专利号5,188,826(它们二者通过引用整体并入)中描述的控释眼用制剂的基础。 

这些交联的羧基-功能聚合物会在水溶液中溶胀，但是保持作为微米大小的水合颗粒。此外，在中性pH，它们的性质基本上是阴离子性的。由于许多眼用药物(例如噻吗洛尔和匹鲁卡品)是带正电荷的，因此它们会通过静电相互作用与带负电荷的聚合物颗粒缔合。并且，由于所述水合颗粒是微孔性的，药物可以被吸收进基质中。当将这类眼用溶液放入眼中时，水合的聚合物颗粒会附着于粘膜表面，从而提供延长的停留时间。在该停留期间，药物从水合的聚合物颗粒释放，由此提供向眼睛的更有效局部递送。 

在示例性的组合物中使用的粘蛋白按定义是“生物粘附性”的，且含有多个负电荷。鉴于该信息，可以预期本发明的粘蛋白以与交联的羧基-功能聚合物类似的方式起眼用 药物递送媒介物的作用。在实践中，这些跨膜或表面粘蛋白会提供优良的保留时间，因为它们不仅能够与上皮表面相互作用，而且还与泪膜中的天然粘蛋白相互作用。 

示例性的眼用制剂包括来自任意数目的本文所述的示例性来源的重组粘蛋白。另外，可以根据需要采用其它溶液组分。 

赋形剂。

在某些实施方案中，本发明的粘蛋白制剂包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文中使用的术语赋形剂概括地表示，与所述制剂的活性剂联合使用的无生物活性的物质。赋形剂可以用作，例如，增溶剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、粘度剂、稀释剂、惰性载体、防腐剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、矫味剂或着色剂。优选地，选择至少一种赋形剂，以给所述制剂提供一种或多种有益的物理性质，诸如增加的活性剂的稳定性和/或可溶性。“药学上可接受的”赋形剂是这样的赋形剂：其已经被州或联邦管理机构批准用于动物，且优选地用于人类，或者在美国药典、欧洲药典或其它普遍公认的药典中被列出用于动物，且优选地用于人类。 

赋形剂的其它例子包括：某些惰性蛋白诸如白蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如天冬氨酸(其可以可替换地被称作天冬氨酸盐/酯)、谷氨酸(其可以可替换地被称作谷氨酸盐/酯)、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸和组氨酸；脂肪酸和磷脂诸如磺酸烷基酯和辛酸烷基酯；表面活性剂诸如十二烷基硫酸钠和聚山梨酯；非离子表面活性剂诸如 

或标明为200、300、400或600的聚乙二醇(PEG)；标明为1000、1500、4000、6000和10000的Carbowax；碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、海藻糖和糊精，包括环糊精；多元醇诸如甘露醇和山梨醇；螯合剂诸如EDTA；和成盐抗衡离子诸如钠。 

可以用于本发明的制剂中的载体的例子包括：水，水和水可混溶的溶剂(诸如C₁-至C₇-烷醇)的混合物，包含0.5-5％无毒水溶性聚合物的植物油或矿物油，天然产物，诸如明胶、海藻酸盐、果胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、黄原胶、角叉菜胶、琼脂和阿拉伯胶，淀粉衍生物，诸如乙酸淀粉和羟丙基淀粉，以及其它合成产物，诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚氧化乙烯，优选交联的聚丙烯酸，诸如中性Carbopol，或者那些聚合物的混合物。载体的浓度通常是活性成分浓度的1-100000倍。 

在一个具体实施方案中，所述载体是聚合的粘膜粘着媒介物。适合用于本发明的方法或制剂中的粘膜粘着媒介物的例子包括、但不限于：包含一种或多种聚合的助悬剂的聚合物水性混悬液，所述聚合的助悬剂包括但不限于葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、 多糖凝胶、

纤维质聚合物和含羧基的聚合物系统。在一个具体实施方案中，所述聚合的助悬剂包含交联的含羧基的聚合物(例如，聚卡波非)。在另一个具体实施方案中，所述聚合的助悬剂包含聚乙二醇(PEG)。适合用于本发明的稳定的眼用粘蛋白制剂中的交联的含羧基的聚合物系统的例子包括但不限于：Noveon AA-1、

和/或 

(InSite Vision)。 

在具体实施方案中，本发明的粘蛋白制剂包含一种或多种选自下述的赋形剂：眼泪替代物、张度增强剂、防腐剂、增溶剂、粘度增强剂、湿润剂、乳化剂、润湿剂、掩蔽剂和填充剂。添加的赋形剂的量和类型是根据所述制剂的具体要求，且通常是在约0.0001％至90重量％的范围内。 

眼泪替代物。

术语“眼泪替代物”表示这样的分子或组合物：其润滑、“润湿”、模仿内源泪液的稠度，辅助天然泪液积累，或者在眼睛施用后以其它方式提供干眼征象或征状和病症的暂时缓解。多种眼泪替代物是本领域已知的，并且包括、但不限于：单体多元醇，例如，甘油、丙二醇和乙二醇；聚合的多元醇诸如聚乙二醇；纤维素酯，诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟基丙基纤维素；葡聚糖诸如葡聚糖70；水溶性蛋白诸如明胶；乙烯基聚合物，诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚维酮；和卡波姆，诸如卡波姆934P、卡波姆941、卡波姆940和卡波姆974P。许多这样的眼泪替代物是商购可得的，包括、但不限于：纤维素酯诸如Bion

Teargen

Tears

Tears Natural

Tears Naturale

和 

和聚乙烯醇诸如Akwa

Moisture

Murine 和Visine

眼泪替代物还可以由石蜡组成，诸如商购可得的Lacri-Lube软膏剂。用作眼泪替代物的其它商购可得的软膏剂包括LubrifreshMoisture Eyes

和Refresh

在本发明的一个优选实施方案中，所述眼泪替代物包含羟丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素或HPMC)。根据一些实施方案，HPMC的浓度范围为约0.1％至约2％w/v，或者在所述范围内的任何特定值。根据一些实施方案，HPMC的浓度范围为约0.5％至约1.5％w/v，或者在所述范围内的任何特定值。根据一些实施方案，HPMC的浓度范围为约0.1％至约1％w/v，或者在所述范围内的任何特定值。根据一些实施方案，HPMC的浓度范围为约0.6％至约1％w/v，或者在所述范围内的任何特定值。在一个优选的实施方案中，HPMC的浓度范围为约0.1％至约1.0％w/v，或者在所述范围内的任何特定值(即，0.1- 0.2％、0.2-0.3％、0.3-0.4％、0.4-0.5％、0.5-0.6％、0.6-0.7％、0.7-0.8％、0.8-0.9％、0.9-1.0％；约0.2％、约0.21％、约0.22％、约0.23％、约0.24％、约0.25％、约0.26％、约0.27％、约0.28％、约0.29％、约0.30％、约0.70％、约0.71％、约0.72％、约0.73％、约0.74％、约0.75％、约0.76％、约0.77％、约0.78％、约0.79％、约0.80％、约0.81％、约0.82％、约0.83％、约0.84％、约0.85％、约0.86％、约0.87％、约0.88％、约0.89％或约0.90％)。 

例如，但非限制性地，包含羟丙基甲基纤维素的眼泪替代物是

润滑滴眼剂。(CibaVision-Novartis)是无菌的润滑滴眼剂，其含有3mg/g的羟丙基甲基纤维素，并用过硼酸钠防腐。提供了基于HPMC的泪液的其它例子。 

在另一个优选的实施方案中，所述眼泪替代物包含羧甲基纤维素钠。例如，但非限制性地，包含羧甲基纤维素钠的眼泪替代物是

是与正常泪液类似的润滑制剂，其含有温和的、不致敏的防腐剂，即稳定化的氧氯复合物(oxychloro complex)

)，其在使用时最终变成天然泪液的组分。 

在一个优选的实施方案中，所述眼泪替代物或其一种或多种组分是具有在下述范围内的粘度的水溶液：其在使模糊、眼睑结块等最小化的同时，优化支持泪膜的效力。优选地，所述眼泪替代物或其一种或多种组分的粘度范围为1-150厘泊(cpi)，例如，5-150cpi、5-130cpi、30-130cpi、50-120cpi、60-115cpi(或在所述范围内的任何特定值)。在一个具体实施方案中，所述眼泪替代物或其一种或多种组分的粘度是约70-90cpi，或者在所述范围内的任何特定值(例如但不限于，85cpi)。 

使用Brookfield锥板式粘度计Model VDV-III Ultra⁺(其具有CP40或等效纺锤体，剪切速率为大约22.50+/-大约10(1/秒))或Brookfield粘度计Model LVDV-E(其具有SC4-18或等效纺锤体，剪切速率为大约26+/-大约10(1/秒))，可以在20℃+/-1℃的温度测量粘度。可替换地，使用Brookfield锥板式粘度计Model VDV-III Ultra⁺(其具有CP40或等效纺锤体，剪切速率为大约22.50+/-大约10(1/秒))或Brookfield粘度计Model LVDV-E(其具有SC4-18或等效纺锤体，剪切速率为大约26+/-大约10(1/秒))，可以在25℃+/-1℃测量粘度。 

在某些实施方案中，用合适的盐(例如，磷酸盐)，将所述眼泪替代物或其一种或多种组分缓冲至pH5.0-9.0，优选pH5.5-7.5，更优选pH6.0-7.0(或在所述范围内的任何特定值)。在某些实施方案中，所述眼泪替代物另外包含一种或多种成分，包括但不限于，甘油、丙烯甘油、甘氨酸、硼酸钠、氯化镁和氯化锌。 

盐、缓冲剂和防腐剂。

本发明的制剂还可以含有药学上可接受的盐、缓冲剂或防腐剂。这样的盐的例子包括从下述酸制备的那些盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。这样的盐还可以制成碱金属或碱土金属盐，诸如钠、钾或钙盐。缓冲剂的例子包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。 

就pH的调节(优选地调至生理pH)而言，缓冲剂可能是特别有用的。本发明的溶液的pH应当维持在4.0-8.0、更优选约5.5-7.5、更优选约6.0-7.0的范围内。可以加入合适的缓冲剂，诸如硼酸、硼酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、碳酸氢钠、TRIS和不同的混合的磷酸盐缓冲液(包括Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄的组合)及其混合物。硼酸盐缓冲液是优选的。通常，缓冲剂以在约0.05-2.5重量％、优选0.1-1.5％范围内的量使用。 

在某些实施方案中，所述制剂另外包含防腐剂。防腐剂通常可以选自季铵化合物诸如苯扎氯铵、苯佐氯铵等。苯扎氯铵更好地描述为：N-苄基-N-(C₈-C₁₈烷基)-N，N-二甲基氯化铵。防腐剂的其它例子包括：抗氧化剂诸如维生素A、维生素E、维生素C、棕榈酸视黄酯和硒；氨基酸半胱氨酸和蛋氨酸；柠檬酸和柠檬酸钠；和合成的防腐剂诸如硫柳汞和对羟基苯甲酸烷基酯，包括例如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。其它防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、苄索氯铵、苯酚、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、间甲酚、硝酸苯汞、醋酸苯汞或硼酸苯汞、过硼酸钠、亚氯酸钠，醇诸如三氯叔丁醇、丁醇或苯甲醇或苯基乙醇，胍衍生物，诸如双氯苯双胍己烷或聚六亚甲基双胍、过硼酸钠、

山梨酸和稳定化的氧氯复合物(例如，

)。优选的防腐剂是：季铵化合物，尤其是苯扎氯铵或它的衍生物诸如Polyquad(参见美国专利号 4,407,791)，烷基汞盐，对羟基苯甲酸酯和稳定化的氧氯复合物(例如，

)。在适当时，将足量的防腐剂加入眼用组合物中，以确保在使用中保护免于细菌和真菌造成的继发性污染。 

在具体实施方案中，本发明的粘蛋白制剂包含选自下述的防腐剂：苯扎氯铵，0.001％至0.05％；苄索氯铵，至多0.02％；山梨酸，0.01％至0.5％；聚六亚甲基双胍，0.1ppm至300ppm；聚季铵盐-1(Omamer M)，0.1ppm至200ppm；次氯酸盐、过亚氯酸盐或亚氯酸盐化合物，500ppm或更少，优选10-200ppm)；稳定化的过氧化氢溶液，与合适的稳定剂在一起的、导致0.0001-0.1％的过氧化氢重量百分比的过氧化氢来源；对-羟基苯甲酸的烷基酯及其混合物，优选对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，0.01％至0.5％；双 氯苯双胍己烷，0.005％至0.01％；三氯叔丁醇，至多0.5％；和稳定化的氧氯复合物 0.001％至0.5％。 

在另一个实施方案中，本发明的局部制剂不包括防腐剂。对于佩戴隐形眼镜的患者、或者使用几种局部滴眼剂的患者和/或具有已经受损的眼睛表面(例如干眼)的患者(其中可能更希望限制接触防腐剂)，这样的制剂是有用的。 

粘度增强剂和湿润剂。

在某些实施方案中，可以将粘度增强剂加入本发明的粘蛋白制剂中。这样的试剂的例子包括多糖，诸如透明质酸及其盐、硫酸软骨素及其盐、葡聚糖、纤维素家族的不同聚合物、乙烯基聚合物和丙烯酸聚合物。 

在某些实施方案中，本发明的粘蛋白制剂包含选自下述一种或多种的眼用湿润剂和/或增强粘度的聚合物：纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素(0.01-5％)、羟乙基纤维素(0.01％至5％)、羟丙基甲基纤维素或羟丙甲纤维素(0.01％至5％)和甲基纤维素(0.02％至5％)；葡聚糖40/70(0.01％至1％)；明胶(0.01％至0.1％)；多元醇诸如甘油(0.01％至5％)、聚乙二醇300(0.02％至5％)、聚乙二醇400(0.02％至5％)、聚山梨酯80(0.02％至3％)、丙二醇(0.02％至3％)、聚乙烯醇(0.02％至5％)和聚维酮(0.02％至3％)；透明质酸(0.01％至2％)；和硫酸软骨素(0.01％至2％)。 

根据本领域已知的标准方法，诸如使用粘度计或流变仪，可以测量本发明的稳定的眼用粘蛋白制剂的粘度。本领域技术人员会认识到，诸如温度和剪切速率因素可能影响粘度测量。在一个具体实施方案中，使用Brookfield锥板式粘度计Model VDV-III Ultra⁺(其具有CP40或等效纺锤体，剪切速率为大约22.50+/-大约10(1/秒))或Brookfield粘度计Model LVDV-E(其具有SC4-18或等效纺锤体，剪切速率为大约26+/-大约10(1/秒))，可以在20℃+/-1℃测量粘度。在另一个实施方案中，使用Brookfield锥板式粘度计Model VDV-III Ultra⁺(其具有CP40或等效纺锤体，剪切速率为大约22.50+/-大约10(1/秒))或Brookfield粘度计Model LVDV-E(其具有SC4-18或等效纺锤体，剪切速率为大约26+/-大约10(1/秒))，在25℃+/-1℃测量本发明的眼用制剂的粘度。 

张度增强剂。

如果需要的话，通常通过张度增强剂来调节张度。这样的试剂可以是例如离子型和/或非离子型。离子型张度增强剂的例子是碱金属或碱土金属卤化物，例如，CaCl₂、KBr、KCl、LiCl、Nal、NaBr或NaCl、Na₂SO₄或硼酸。非离子型张度增强剂是，例如，脲、甘油、山梨醇、甘露醇、丙二醇或葡萄糖(dextrose)。通常用张度剂调节本发明的水溶液以 模仿正常泪液的渗透压，其相当于0.9％氯化钠溶液或2.5％甘油溶液。约225-400mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度是优选的，更优选280-320mOsm。 

增溶剂。

所述制剂可能额外需要增溶剂的存在，尤其是在一种或多种成分倾向于形成混悬液或乳状液时。合适的增溶剂包括，例如，泰洛沙泊、脂肪酸甘油聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇酯、聚乙二醇、甘油醚、聚山梨酯20、聚山梨酯80或这些化合物的混合物。在优选的实施方案中，所述增溶剂是蓖麻油和环氧乙烷的反应产物，例如市售产品Cremophor或Cremophor蓖麻油和环氧乙烷的反应产物已经被证实是特别好的增溶剂，其被眼睛极好地耐受。在另一个实施方案中，所述增溶剂是泰洛沙泊或环糊精。使用的浓度特别地取决于活性成分的浓度。加入的量通常足以使活性成分溶解。例如，增溶剂的浓度是活性成分浓度的0.1-5000倍。优选地，增溶剂不是环糊精化合物(例如α-、β-或γ-环糊精，例如烷基化的、羟基烷基化的、羧基烷基化的或烷氧基羰基-烷基化的衍生物，或单-或二-糖基-α-、β-或γ-环糊精，单-或二-麦芽糖基-α-、β-或γ-环糊精或潘糖基-环糊精)。 

使用方法。 

本发明表征了治疗和/或预防受试者中的与干眼和/或眼刺激有关的征象和征状的方法，所述方法包括：使用上述的单独的新颖NSAID制剂或组合的泪液/NSAID制剂。例如，治疗和/或预防干眼和/或眼刺激的方法可以包括：向有此需要的受试者的眼表面施用包含重组粘蛋白的制剂。 

还提供了增加受试者的泪膜的泪膜破碎时间(TFBUT)的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者的眼表面施用制剂，所述制剂包含在药学上可接受的载体中的重组粘蛋白。任选地，用于增加TFBUT的眼用制剂可以另外包含眼泪替代物或其一种或多种组分。 

还提供了增加受试者的眼睛的眼睛保护指数(OPI)的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者的眼表面施用制剂，所述制剂包含在药学上可接受的载体中的重组粘蛋白。任选地，用于增加OPI的眼用制剂可以另外包含眼泪替代物或其一种或多种组分。 

还提供了用于改善、治疗、缓解、抑制、预防或以其它方式减少受试者的眼睛不适的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者的眼表面施用制剂，所述制剂包含在药学上可接受的载体中的重组粘蛋白。任选地，用于改善、治疗、缓解、抑制、预防或以其它方式减少眼睛不适的眼用制剂可以另外包含眼泪替代物或其一种或多种组分。 

还提供了改善受试者的眼睛的总体眼睛表面健康的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者的眼表面施用制剂，所述制剂包含在药学上可接受的载体中的低剂量的至少一 种重组粘蛋白。任选地，用于增加OPI的眼用制剂可以另外包含眼泪替代物或其一种或多种组分。 

在本发明的眼用制剂中的一种或多种重组粘蛋白的有效量将取决于药物的吸收、灭活和排泄速率以及化合物从所述制剂的递送速率，并且将适合用于短期或长期使用来分别治疗急性的或慢性的病症。应当指出，剂量值也可以随要减轻的病症的严重程度而变化。进一步应当理解，对于任何特定受试者，应当根据个体需要和施用所述组合物或者监督所述组合物施用的人员的专业判断随时间调整具体剂量方案。通常，使用本领域技术人员已知的技术确定剂量。 

本发明的重组粘蛋白的剂量将随下述因素而变化：患者的征状、年龄和其它身体特征，要治疗或预防的病症的性质和严重程度，期望的舒适程度，给药路径，以及补给的形式。任何主题制剂可以以单次剂量的形式或者以分份剂量的形式进行施用。通过本领域技术人员已知的或者本文教导的技术，可以容易地确定本发明的制剂的剂量。 

对于本发明的任何特定制剂而言，可能需要鉴定有效剂量或量以及所述制剂的给药时机的任何可能影响。这可以通过常规实验来完成。通过施用所述制剂并如下评估施用的效应，可以评估任意制剂以及治疗方法或预防方法的有效性：测量一个或者多个如本文所述的与所述组合物的效力有关和与患者的舒适程度有关的指标，并将这些指标的治疗后值与相同指标在治疗之前的值进行对比，或者将这些指标的治疗后值与使用不同制剂时相同指标的值进行对比。 

对于给定的患者而言，产生最有效治疗的任何特定制剂的精确给药时间和量将取决于具体化合物的活性、药代动力学和生物利用度、患者的生理学状况(包括年龄、性别、疾病类型以及阶段，总体身体状况，对给定剂量和药物治疗类型的应答性)、给药路径等。本文提供的指引可以用来优化治疗，例如，确定最佳的给药时间和/或量，这将仅需要由监测受试者和调整剂量和/或时机组成的例行实验。 

配制进本发明的组合物中的几种重组粘蛋白的联合使用可以减少任何个别组分的需求剂量，因为不同组分的功效的生效和持续时间可能是互补的。在这样的联合治疗中，不同的重组粘蛋白可以一起或者分开地，且同时地或者在一天内的不同时间递送。 

通过测量泪膜破碎时间(TFBUT)的变化、眼睛保护指数(OPI)的变化、眼睛舒适度的改善、通过染色和/或发红测出的炎症减轻、角膜敏感性改善(例如，通过Cochet-Bonnet试验测量)、眨眼率下降、视敏度改善(例如，通过眨眼间间隔视敏度衰退(Inter-blink Interval Visual Acuity Decay，IVAD)试验测量)，可以评估本发明的制剂和组合物在治疗和预防与干 眼疾病和/或眼睛刺激有关的征象和征状中的效力。与施用给眼睛表面之前的TFBUT、OPI、眼睛不适度、炎症、角膜敏感性、视敏度、角膜染色和/或眨眼率相比，在向眼睛表面施用本发明的制剂和组合物以后受试者中的TFBUT和/或OPI的增加、和/或眼睛舒适度的改善、角膜敏感性的改善和/或视敏度的改善、和/或炎症水平和/或眨眼率的下降指示，所述制剂可有效地治疗和预防与干眼疾病和/或眼睛刺激有关的征象和征状。 

本发明的眼用制剂可有效地增强泪膜稳定性。泪膜稳定性的一种量度是，与将眼用制剂滴入眼睛中之前测量的TFBUT(即，基线TFBUT)相比，在将眼用制剂滴入眼睛中之后测量的泪膜破碎时间(TFBUT)的增加。例如，但非限制性地，与基线TFBUT相比，滴入后的TFBUT增加了大约0.5-10秒或更多(或在所述范围内的任何特定值)。更具体地，与基线TFBUT相比，在滴入后测量时，TFBUT增加了约0.5秒、约1秒、约1.5秒、约2秒、约2.5秒、约3秒、约3.5秒、约4秒、约4.5秒、约5秒、约5.5秒、约6秒、约6.5秒、约7秒、约7.5秒、约8秒、约8.5秒、约9秒、约9.5秒、约10秒或更多。 

确定临床上有意义的TFBUT增加的一种方法是，与在将眼用制剂滴入眼睛中之前测量的OPI(即，基线OPI)相比，在将眼用制剂滴入眼睛中之后测量的眼睛保护指数(OPI)的增加(即，改善)。该方案测量被称作眼睛保护指数(OPI)的TFBUT的临床上有关的改变，已经被证实可用于评估造成干眼的因素和评价它的治疗剂。 

当研究TFBUT和眨眼间间隔(IBI＝完全眨眼之间的时间)之间的关联时，可能提出，它们的相互作用会辅助调节眼睛表面的完整性。当TFBUT长于IBI时，存在受保护的表面。相反地，当TFBUT短于IBI时，存在未受保护的表面。研究已经证实，在TFBUT的一秒内，患者报告眼睛不适，并且在此后不久，发展浅层点状角膜炎。为了防止这些征状和征象，TFBUT必须匹配或超过眨眼间间隔期，从而提供眼睛表面的完全保护。当定量试剂对泪膜稳定性的影响时，可以进行二项式分析。该指标允许治疗后的2种可能结果：1)成功＝TFBUT匹配或超过眨眼间间隔期，使得眼睛表面受到保护，和2)失败＝TFBUT保持短于眨眼间间隔期，使得眼睛表面未受保护。≥1的OPI评分被视作有利的，因为患者具有泪液保护的眼睛表面，从而产生更少的与干眼有关的征象和征状。＜1的OPI评分被视作不利的，因为患者具有暴露的眼睛表面，从而产生更多的与干眼有关的征象和征状。 

本发明的眼用制剂会有效地增加(即，改善)OPI。例如，但非限制性地，与基线OPI相比，当在将眼用制剂滴入眼睛中之后测量时，OPI改善了约0.1-10或更多(或在所述范围内的任何特定值)。更具体地，与基线OPI相比，当在滴入后测量时，OPI改善，由此使得OPI增加了约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.01.2、1.4、1.6、1.8、2.0、 2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0或更多。与在将眼用制剂滴入眼睛中之前测得的眼睛不适相比，当在将眼用制剂滴入眼睛中之后测量时，有效地减少了眼睛刺激/不适，因此患者评估的眼睛不适更少。 

使用多种方法，包括但不限于在向眼中滴入荧光素钠以后照明眼睛，或其等效方法，可以测量TFBUT。通过将TFBUT除以眨眼之间的按秒计的时间(眨眼间间隔，或“IBI”)，可以得到OPI。 

与在施用之前的眼睛舒适水平相比，在施用本发明的制剂和组合物之后受试者的眼睛舒适增加或眼睛不适下降指示，所述制剂可有效地治疗和预防与干眼有关的征象和征状，限于主观量表(例如但不限于，将眼睛不适确定为轻度、中度、重度、或0、1、2、3、4等的标准化的主观量表，或其它适当量表)、反射应答(例如，畏缩-反射)和生理学应答，包括但不限于心率、血压和出汗水平的变化。 

通过测量角膜染色、结膜发红、角膜敏感性、眨眼率和视力表现的变化，可以评估本发明的制剂和组合物在改善总体眼睛表面健康中的效力。评估这些参数的方法分别包括：丽丝胺绿或荧光素钠染料，标准化的评估量表，Cochet Bonnet感觉测量法或非接触感觉测量法，视频记录和软件分析，和问卷调查，或眨眼间间隔视敏度衰退(IVAD)试验。 

包装。 

可以将本发明的制剂包装为单次剂量产品或多次剂量产品。所述单次剂量产品在打开包装之前是无菌的，并且在所述包装中的所有组合物意图在1次或几次应用中施用给患者的一只眼或双眼。通常不必要使用抗微生物防腐剂以在包装打开以后维持组合物的无菌度。如果是软膏剂制剂的话，可以将所述制剂包装成适当的软膏剂，这是本领域技术人员已知的。 

多次剂量产品在打开包装之前也是无菌的。但是，因为所述组合物的容器可能被开启许多次才能将容器内的所有组合物耗尽，所以多次剂量产品必须具有足够的抗微生物活性，以确保组合物不会因为对容器的重复打开和操作而受到微生物污染。该目的所需的抗微生物活性水平是本领域技术人员众所周知的，并且在官方出版物中有具体规定，诸如美国药典(“USP”)和食品和药品管理局的其它出版物，以及其它国家的相应出版物。在那些出版物中提供了眼用药物产品抗微生物污染的防腐规定的详细描述，以及用于评价具体制剂的防腐效力的操作的详细描述。在美国，防腐效力标准通常被称为“USP PET”要求(首 字母简略词“PET”代表“防腐效力试验”)。 

单次剂量包装设计的使用消除了对组合物中的抗微生物防腐剂的需求，从医学观点看，这是一项显著的优点，因为用于使眼用组合物防腐的常规抗微生物剂(例如，苯扎氯铵)可能引起眼睛刺激，特别是对于患有干眼病症或者预先存在眼睛刺激的患者，或者使用多个防腐产品的患者。但是，目前可得到的单次剂量包装设计，例如通过被称为“成型、灌装和密封”的方法制备的小容量塑料瓶，对于生产商和消费者而言具有几个缺点。单次剂量包装系统的主要缺点是，需要远远更大量的包装材料，这既浪费又增加成本，并且给消费者带来不便。并且，存在这样的风险：消费者不会按照被教导的那样，在将一滴或两滴施用给眼之后抛弃单次剂量容器，而是相反，他们保留已开封的容器以及其中剩余的任何组合物用于以后使用。单次剂量产品的这种不适当使用，会造成单次剂量产品的微生物污染风险，并且当被污染的组合物施用于眼睛时，会造成眼睛感染的相关风险。 

尽管本发明的制剂优选地配制成“即用型”水溶液，在本发明的范围内预见到替代性的制剂。因而，例如，可以将眼用溶液的活性成分、表面活性剂、盐、螯合剂或其它组分、或者它们的混合物低压冻干，或者以其它方式提供为准备在水中(例如，在去离子水或蒸馏水中)溶解的干粉或片剂。由于所述溶液的自防腐特性，不需要无菌水。 

试剂盒。 

在另一个实施方案中，本发明提供了用于包装和/或贮存和/或使用本文所述的制剂的试剂盒，以及用于实践本文所述的方法的试剂盒。因而，例如，试剂盒可以包括一个或多个容器，所述容器含有一种或多种本发明的眼用溶液、软膏剂、凝胶、持续释放制剂或装置、混悬液或制剂、片剂或胶囊剂。可以将所述试剂盒设计成便利运输、使用和贮存中的一个或多个方面。 

所述试剂盒可以任选地包括指导材料，其含有公开了使用在其中提供的制剂的方法的指示(即，方案)。尽管所述指导材料通常包括书面材料或打印材料，但并不局限于此。本发明预见到能够存储这种指导并且将其传送给末端用户的任何介质。这样的介质包括但不限于：电子存储介质(例如，磁盘、磁带、卡盘、芯片)，光学介质(例如CD ROM)等。这类介质可以包括提供这样的指导材料的因特网网站地址。 

实施例。 

下面指出了本发明的眼用制剂的实施例，所述实施例具体说明了这样的溶液的组成和制备方法。 

实施例I。 

本文没有具体描述的、本领域已知的标准分子生物学方法通常基本上遵循下述参考文献：Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Springs Harbor Laboratory，New-York(1989，1992)，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md.(1988)，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md.(1989)，和Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley & Sons，New York(1988)，和Watson等人，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York，和Birren等人.(编)Genome Analysis：A Laboratory Manual Series，第1-4卷Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)，和在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法，并通过引用并入本文。如在标准PCR方案中那样进行聚合酶链式反应(PCR)：A Guide To Methods and Applications，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。与流式细胞计量术(FACS)相组合的原位PCR可以用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等人，Blood1996，87：3822.)。执行RT-PCR的方法是本领域众所周知的。 

细胞培养。 

如在Czauderna，等人.(NAR，2003.31：670-82)中所述，培养HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心)。在含有10％FCS的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中在37℃培养人角质形成细胞。在含有10％FCS的Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中在37℃培养小鼠细胞系B16V(美国典型培养物保藏中心)。培养条件如在Methods Find Exp Clin Pharmacol.1997，19(4)：231-9中所述。 

实施例II。 

逆转干眼发作的兔模型。 

如下在兔中建立干眼：通过外科手术封闭泪腺排泄管，并使兔保持不治疗至少4周。参见Gilbard，J.P，1996，“Dry Eye：phramcological approaches，effects，and progress”CLAO J.22，141-145。在通过希尔默试验和眼睛表面染色证实干眼以后，滴入本发明的制剂，其为在中性等渗缓冲水溶液中的0.01、0.1、1.0％、5％或10％浓度的溶液。以一滴50微升，将所述制剂施用至眼睛表面，每天至多1-5次，每天施用，持续2-10周。每周1次地监测干眼征状，持续2-10周，并且希尔默评分的增加和/或眼睛表面染色的量的减少指示本发明的制剂在干眼疾病治疗中的效力。 

实施例III。 

媒介物制剂和示例性的滴眼剂制剂。 

水性滴眼剂制剂任选地含有通常掺入的多种添加剂，诸如缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、氨基酸、醋酸钠、柠檬酸钠等)、等渗剂(例如，糖诸如山梨醇、葡萄糖和甘露醇，多元醇诸如甘油、浓缩甘油、聚乙二醇和丙二醇，盐诸如氯化钠)、防腐剂或消毒剂(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、对-羟基苯甲酸酯诸如对-羟基苯甲酸甲酯或对-羟基苯甲酸乙酯、苯甲醇、苯乙醇、山梨酸或其盐、硫柳汞、三氯叔丁醇等)、溶解助剂或稳定剂(例如，环糊精和它们的衍生物、水溶性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮)、表面活性剂诸如聚山梨酯80(吐温80))、pH调节剂(例如，盐酸、乙酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵等)、螯合剂(例如，依地酸钠、柠檬酸钠、缩合磷酸钠)等。 

除了上面列出的添加剂以外，水性混悬液形式的滴眼剂制剂还可以含有助悬剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油酯)和分散剂(例如，表面活性剂诸如泰洛沙泊和聚山梨酯80，离子聚合物诸如海藻酸钠)，从而确保所述滴眼剂制剂是进一步均匀的微粒和令人满意地分散的水性混悬液。 

眼用软膏剂可以包含已知的软膏剂基质，诸如纯化的羊毛脂、矿脂、液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质(plastibase)、液体石蜡、聚乙二醇等。 

实施例IV。 

用于制备溶液的起始原料如下：氯化钠6.55g；柠檬酸三钠一水合物7.35g；柠檬酸0.035g；EDTA Na₂0.050g；甘露醇1.800g；丙基甲基纤维素1.00g；适当的或所需的量的粘蛋白多肽。 

通过将上面指出的量的氯化钠、柠檬酸三钠、柠檬酸一水合物、EDTA Na₂、甘露醇和丙基甲基纤维素加入1升水中，制备溶液。将前述组分溶解，并在15磅的压力和120℃的温度下高压灭菌，并冷却至4℃。通过温和加热至约50℃并用手振摇，将适当的或所需的量的粘蛋白多肽溶解在500mg吐温^TM80中，并定量地转移至在恒定磁力搅拌下的1升上述混合物中。将所述混合物在冷藏室(4℃)中搅拌过夜。得到澄清溶液。将该溶液在约4℃的冰箱中储存备用。如下确定重组粘蛋白多肽的终浓度：通过在C-18柱上的高压液相色谱法，使用95％甲醇和5％H₂O的混合物作为洗脱溶剂，并在适当的纳米处通过光谱测定法监测流出物。粘蛋白多肽的浓度保持稳定至少6周。将所述溶液在深色瓶子中在4℃保存。 

实施例V。 

用于制备溶液的起始原料如下：蔗糖76g；柠檬酸三钠一水合物7.35g；柠檬酸0.035g；EDTA Na₂0.050g；甘露醇1.8g；所需量的粘蛋白多肽；TWEEN^TM80500mg。 

通过将上面指出的量的氯化钠、柠檬酸三钠、柠檬酸一水合物、EDTA Na₂和甘露醇加入1升水中，制备含有粘蛋白多肽的溶液。将前述组分溶解，并在15磅的压力和120℃的温度下高压灭菌，并冷却至4℃。通过温和加热至约50℃并用手振摇，将适当的或所需的量的粘蛋白多肽溶解在500mg吐温^TM80中，并定量地转移至在恒定磁力搅拌下的1升上述混合物中。将所述混合物在冷藏室中搅拌过夜。得到澄清溶液。将该溶液在约4℃的冰箱中储存备用。 

实施例VI。 

给0.5-1.0流体盎司滴眼瓶装入15ml无菌水溶液，每1ml该溶液含有：适当的或所需的量的粘蛋白多肽；TWEEN^TM80；0.5mg Nacl；6.85mg柠檬酸三钠一水合物；7.35mg柠檬酸；0.031mg EDTA Na₂；0.05mg甘露醇；1.8mg适量(Q.S.)水补至1ml。 

将2滴溶液放入遭受干燥的、刺激性的双眼的个体的一只眼中，每天1-5次，持续2-10周的时段。使用相同的计划表，将未防腐的正常生理盐水溶液放入另一只眼中，用于对比目的。与盐水溶液处理的眼相比，被治疗的眼显示出主观舒适和外观的显著改善。 

术语“溶液”在前述说明书中的应用不应解释为是指根据纯技术定义的真溶液。相反，应当解释为是指，肉眼看起来是溶液的混合物，因此，词语“溶液”应当解释为涵盖了溶解的粘蛋白多肽、它的衍生物和前体的透明乳状液。 

为了解释和例证本发明的目的，已经给出了前述详细说明。应当理解，本发明不限于阐述的详细信息，并且可以做出多种改变。意图涵盖本领域技术人员会做出的这样的改变和变化，只要下述权利要求允许且与现有技术状态相一致。 

其它实施方案 

尽管已经结合其详细说明描述了本发明，但是前述说明书意在只是说明性的，并且不限制本发明的范围，本发明的范围由附上的权利要求的范围限定。其它方面、优点和改变是在下述权利要求的范围内。 

参考文献 

1.GIFfany JM.The normal tear film.In：Geerling G， Brewitt H，eds.Dev Ophtalmol，vol41.Basel：Karger，2008：1. 

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3.Paulsen F， Langer G， Hoffman W，Berry M.Human lacrimal gland mucins.Cell Tissue Res2004；316：167. 

4.Foulks GN.What is dry eye and what does it mean to the contact lens wearer？Eye &  Contact Lens2003；29(1S)：S96. 

5.Holly FJ，Lemp MA.Tear physiology and dry eyes.Surv Opthalmol1977；22：69. 

6.Murube J，Paterson A，Murube E.Classification of artificial tears.I：Composition and properties.Adv Exp Med Biol1998；438：693. 

7.Gustafsson A，Holgersson J.A new generation of carbohydrate-based therapeutics：recombinant mucin-type fusion proteins as versatile inhibitors of protein-carbohydrate interactions.Expert Opin.Drug Discov2006；1：161. 

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种制剂，其包含有效地治疗或预防干眼的量的重组粘蛋白多肽，该制剂包含药学上可接受的载体，该药学上可接受的载体包括一种或多种选自下述的成分：表面活性剂、张度剂、缓冲剂、防腐剂、共溶剂和增粘剂；且其中该重组粘蛋白多肽是P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)、CD34、CD43、CD45、CD96、GlyCAM-1、分泌型粘蛋白、膜相关型粘蛋白、MAdCAM-1或其片段。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述粘蛋白多肽包含所述PSGL-1的至少一个区域。

3.根据权利要求2所述的制剂，其中所述粘蛋白多肽包括所述PSGL-1的细胞外部分。

4.根据权利要求1所述的制剂，其中该分泌型粘蛋白是MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7或MUC9。

5.根据权利要求1所述的制剂，其中该膜相关型粘蛋白是MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4或MUC16。

6.根据权利要求1所述的制剂，其中所述重组粘蛋白被一种或多种糖基转移酶糖基化。

7.根据权利要求1所述的制剂，其中所述重组粘蛋白被唾液酸化。

8.根据权利要求1所述的制剂，该制剂包含多个重组粘蛋白，其中所述多个重组粘蛋白交联，使得分子量大于1000kDa。

9.根据权利要求1所述的制剂，其中所述重组粘蛋白多肽与免疫球蛋白多肽的至少一个区域共价连接。

10.根据权利要求9所述的制剂，其中该免疫球蛋白多肽包含重链免疫球蛋白多肽的区域。

11.根据权利要求9所述的制剂，其中该免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白重链的Fc区。

12.根据权利要求1所述的制剂，其用于治疗患有干眼的受试者，包括向受试者的眼表面施用该制剂。

Claims (16)

1.一种眼用制剂，其包含有效地治疗或预防干眼的量的重组粘蛋白多肽。

2.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中该制剂另外包含药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的眼用制剂，其中该药学上可接受的载体包括一种或多种选自下述的成分：表面活性剂、张度剂、缓冲剂、防腐剂、共溶剂和增粘剂。

4.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中该重组粘蛋白多肽是PSGL-1、CD34、CD43、CD45、CD96、GlyCAM-1、MAdCAM-1或其片段。

5.根据权利要求4所述的眼用制剂，其中所述粘蛋白多肽包含P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的至少一个区域。

6.根据权利要求5所述的眼用制剂，其中所述粘蛋白多肽包括P-选择素糖蛋白配体-1的细胞外部分。

7.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中该重组粘蛋白多肽是分泌型粘蛋白或膜相关型粘蛋白。

8.根据权利要求7所述的眼用制剂，其中该分泌型粘蛋白是MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7或MUC9。

9.根据权利要求7所述的眼用制剂，其中该膜相关型粘蛋白是MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4或MUC16。

10.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中所述重组粘蛋白被一种或多种糖基转移酶糖基化。

11.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中该重组粘蛋白被唾液酸化。

12.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中多个重组粘蛋白交联，使得分子量大于1000kDa。

13.根据权利要求1所述的眼用制剂，其中该重组粘蛋白多肽与免疫球蛋白多肽的至少一个区域共价连接。

14.根据权利要求13所述的眼用制剂，其中该免疫球蛋白多肽包含重链免疫球蛋白多肽的区域。

15.根据权利要求13所述的眼用制剂，其中该免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白重链的Fc区。

16.一种治疗患有干眼的受试者的方法，该方法包括：向受试者的眼表面施用权利要求1的眼用制剂，其中该制剂另外包含药学上可接受的载体，该载体包括一种或多种选自下述的成分：表面活性剂、张度剂、缓冲剂、防腐剂、共溶剂和增粘剂；且其中该重组粘蛋白多肽是PSGL-1、CD34、CD43、CD45、CD96、GlyCAM-1、分泌型粘蛋白、膜相关型粘蛋白、MAdCAM-1或其片段。