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CN103501789A - 通过抑制增殖性激酶cdk4和cdk6保护肾组织免于局部缺血 - Google Patents

通过抑制增殖性激酶cdk4和cdk6保护肾组织免于局部缺血 Download PDF

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CN103501789A
CN103501789A CN201180065126.1A CN201180065126A CN103501789A CN 103501789 A CN103501789 A CN 103501789A CN 201180065126 A CN201180065126 A CN 201180065126A CN 103501789 A CN103501789 A CN 103501789A
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cdk4
ischemia
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inhibitor
event
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D·P·迪洛克
N·E·沙普尔斯
J·C·斯特鲁姆
J·E·比希
P·J·罗伯茨
B·D·汉弗莱斯
K-K·王
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University of North Carolina at Chapel Hill
Brigham and Womens Hospital Inc
G1 Therapeutics Inc
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University of North Carolina at Chapel Hill
Brigham and Womens Hospital Inc
G1 Therapeutics Inc
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Abstract

本发明公开的主题涉及保护细胞和或组织免受由于局部缺血的损伤的方法和组合物。具体地，本发明公开的主题涉及向已暴露于局部缺血或有局部缺血的风险的个体给药的细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂的保护作用。

Description

通过抑制增殖性激酶CDK4和CDK6保护肾组织免于局部缺血
优先权声明
本申请要求2010年11月17日提交的美国临时专利申请系列号61/458,140的权益，其公开整体援引加入本文。
政府利益
本发明公开的主题是在美国国立卫生研究院授予的基金号R43AI084284的美国政府支持下完成的。因此，美国政府享有本发明公开的主题的某些权利。
技术领域
本发明公开的主题涉及保护健康细胞免受局部缺血损伤的方法和组合物。例如，本发明公开的主题涉及使用细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)抑制剂以诱导哺乳动物个体内某些组织和/或细胞如肾中的药理静止，从而增强该个体的临床结果。
简写
%=百分比
μg=微克
μL=微升
μM=微摩尔
BrdU=5-溴-2-脱氧尿苷
CAT=计算机化轴向断层扫描
CDK=细胞周期蛋白依赖性激酶
CDK4/6=细胞周期蛋白依赖性激酶4和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6
CT=计算机断层扫描
dL=1/10升
DMSO=二甲基亚砜
g=克
h=小时
IC50=50%抑制浓度
i.p.=腹腔内
IRI=局部缺血再灌注损伤
kg=千克
mg=毫克
nM=纳摩尔
PD=6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]-嘧啶-7-酮(也称为PD0332991)
RLU=相对光单位
SEM=平均标准误差
背景技术
由于不存在证实保护肾免于缺血性损伤的疗法，所以管理目前包括支持患者直至肾能够自愈的时间。管理策略包括使用利尿剂以调节体积状态、磷结合剂以及在需要时透析。值得注意的是，这些疗法均不改变肾修复过程的自然历史，并且一些证据表明利尿剂和透析可能甚至使肾损伤恶化。因此，对实用方法有持续需要以保护有计划发生、有风险发生或已发生局部缺血和/或其相关事件的个体。
发明内容
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供一种在细胞或组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，其中所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的化合物，并且其中所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
在一些实施方案中，本发明公开的主题提供一种在肾细胞或肾组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或肾组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，其中所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的化合物。
在一些实施方案中，在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之前、在个体暴露于局部缺血和/或相关事件的同时、或者在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后向个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。在一些实施方案中，在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后约24小时至约48小时之间向个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。
在一些实施方案中，抑制CDK4和/或CDK6的化合物为选择性CDK4和/或CDK6抑制剂。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂是除CDK4和/或CDK6以外的细胞周期蛋白依赖性激酶的不良抑制剂。
在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是心脏手术，或者与低血压性发作相关的其他手术。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药用于CT扫描、幽门成形术(pylorogram)和冠状动脉造影术(artiography)的放射性造影剂。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是与血容量减少(例如，由于失血)和/或低血压时期相关的创伤。
在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药减少肾血流的药物或物质，如阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是在移植之前收获、转运和/或冷藏肾同种异体移植物。
本发明公开的主题的目的是提供通过向个体给药有效量的CDK4/6抑制剂化合物来保护所述个体中的健康细胞免受局部缺血的影响的方法。
本发明公开的主题的目的已在上文中陈述，并且其全部或部分通过本发明公开的主题来实现，当连同下文最佳描述的附图进行描述时，其他目的会变得明显。
附图说明
图1A为示出CDK4/6抑制诱导原代人肾近端小管上皮细胞中的G1停滞的一组直方图。用不同浓度(0nM、10nM、30nM、100nM、300nM或1μM)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991)处理16小时的原代人肾近端小管上皮细胞的细胞周期分析的代表性直方图。将细胞收获、固定、染色并通过流式细胞术分析。利用Verity(Verity Software House,Topsham,Maine,United Statesof America)的Mod-FitTM软件拟合数据。渐增浓度的CDK4/6抑制剂产生“完全的”G1-停滞而没有细胞毒性的迹象。
图1B为示出CDK4/6抑制诱导原代人肾近端小管上皮细胞中的G1停滞的线图。用不同浓度(0nM、10nM、30nM、100nM、300nM或1μM)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991)处理16小时的原代人肾近端小管上皮细胞的细胞周期分析。将细胞收获、固定、染色并通过流式细胞术分析。利用Verity(Verity Software House,Topsham,Maine,United States of America)的Mod-FitTM软件拟合数据。G1(菱形)、G2/M(正方形)和S(三角形)中的细胞的相应%在图上示出。
图2为示出CDK4/6抑制阻断原代人肾近端小管上皮细胞的增殖的条形图。将细胞用不同浓度(0nM、10nM、30nM、100nM、300nM或1μM)的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991)处理72小时。温育之后，利用(Promega,Madison,Wisconsin,United States of America)定量细胞增殖。数据代表4个重复的平均值(相对光单位，RLU)+/-标准差。
图3A为示意图，其示出CDK4/6抑制剂单一剂量给药后局部缺血再灌注损伤之后5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入上皮细胞的研究的剂量给药计划。局部缺血再灌注损伤之前将小鼠用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991;150mg/kg)或媒介物(乳酸钠缓冲液)通过口服管饲法处理1小时。损伤后21小时将BrdU(100mg/kg)通过i.p.注射给药。BrdU注射后3小时将小鼠处死，并且定量BrdU掺入肾上皮细胞。
图3B为示意图，其示出2个剂量的CDK4/6抑制剂后局部缺血再灌注损伤之后5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入上皮细胞的研究的剂量给药计划。局部缺血再灌注损伤之前将小鼠用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991;150mg/kg)或媒介物(乳酸钠缓冲液)通过口服管饲法处理1小时。损伤后21小时将BrdU(100mg/kg)通过i.p.注射给药。另外2小时后，将小鼠用PD0332991或媒介物第二次处理。第二次剂量给药后22小时，小鼠接受BrdU的第二次注射。第二次注射BrdU后3小时，将小鼠处死，并且定量BrdU掺入肾上皮细胞。
图4A为示出局部缺血性损伤后24小时用CDK4/6抑制剂处理防止上皮细胞进入S-期的条形图。图的右边示出来自局部缺血再灌注损伤(IRI)前1小时根据图3A所示的剂量给药计划用媒介物(浅色阴影柱)处理的5只小鼠和用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991；深色阴影柱)处理一次的6只小鼠的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞的平均数据。双向ANOVA,***p<.001(Bonferroni’s事后检验)。图的左边示出用媒介物(浅色阴影柱)或PD0332991(深色阴影柱)处理但不进行局部缺血再灌注损伤(CLK)的小鼠的数据。
图4B为示出局部缺血性损伤后48小时用CDK4/6抑制剂处理防止上皮细胞进入S-期的条形图。图的右边示出来自进行局部缺血再灌注损伤(IRI)并根据图3B所示的剂量给药计划用媒介物(浅色阴影柱，n=5)或用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991；深色阴影柱，n=6)处理两次的小鼠的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞的平均数据。双向ANOVA,***p<.001(Bonferroni’s事后检验)。图的左边示出根据剂量给药计划用媒介物(浅色阴影柱)或PD0332991(深色阴影柱)处理，仅不进行局部缺血再灌注损伤(CLK)的小鼠的数据。
图5为示出用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并-[2,3-d]嘧啶-7-酮(PD0332991)处理在双侧局部缺血再灌注损伤后24小时显著降低血清肌酸酐水平。手术前7天采集基线血清肌酸酐水平，并且媒介物处理组与药物处理组之间没有可察觉的基线差异(分别为.050mg/dL±0.027和0.044mg/dL±0.044)。手术后24小时，媒介物组中的血清肌酸酐为2.27mg/dL±0.0732，而药物处理组中的血清肌酸酐为1.74mg/dL±0.143。在媒介物组中N=8，而在药物处理组中N=9。通过双向ANOVA用Bonferroni事后检验分析的***p<.001。
具体实施方式
参考所附实施例(其中示出代表性实施方案)，现在在下文中更充分地描述本发明公开的主题。但是，本发明公开的主题可以以不同的形式体现，并且不应当解释为受限于本文所示的实施方案。更确切地，提供这些实施方案以使本公开充分且完整，并且这些实施方案会向本领域技术人员充分传达本发明的实施方案的范围。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的技术人员的通常理解相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献整体援引加入本文。
在整个说明书和权利要求中，给定的化学式或化学名应当包括所有活性的旋光异构体和立体异构体，以及外消旋混合物(若存在此类异构体和混合物)。
在一些实施方案中，本发明公开的主题允许保护肾免受局部缺血和诱发局部缺血的肾毒素的急性毒性作用。在肾损伤之前、期间或之后立即给药可口服和无毒的小分子激酶抑制剂以在较晚的时间点增强肾再生。
据证实对肾损伤应答诱导肾增殖。如本文第一次公开的，看来局部缺血后的肾增殖依赖于CDK4/6的激酶活性。例如，如图4A和4B所示，通过CDK4/6抑制剂的给药可以减少局部缺血后的肾细胞增殖。此外，在肾损伤附近的一段时间中，某些循环肾毒素可以以细胞周期依赖性方式进一步增加肾损伤。因此，通过药理使用CDK4/6抑制剂将肾上皮细胞短暂维持在G1(药理静止或PQ)可以在清除循环肾毒素后允许增强的肾修复。参见图5。在局部缺血性损伤时短暂PQ会增强随后的肾恢复。因此，本发明公开的主题利用这样的发现，增殖的细胞对外毒素高度敏感，因此短暂PQ是治疗性的。本发明公开的主题可以包括在肾局部缺血性损伤之前、同时或之后(如20小时内)给药(例如，口服或IV)CDK4/6抑制剂(例如，选择性CDK4/6抑制剂)。可以维持CDK4/6抑制剂的治疗水平直至诱发肾损伤的条件已逆转(一般24-48小时)。然后可以撤走CDK4/6抑制剂(利用不被肾完全清除的化合物)，并且肾再生性增殖可以继而发生。例如，可以在与低血压相关的手术(例如心脏搭桥手术)之前或者在转运肾同种异体移植物(例如肾移植中的冷-局部缺血)之前或者在使用包含碘的放射性造影剂(其诱发肾局部缺血)之前诱导PQ。这样的损伤后24-48小时在肾毒素已清除和/或全身血压已恢复时PQ可以逆转。
因此，本发明公开的主题部分涉及这样的观察，药理静止提供保护防止形成肾损伤，特别是肾局部缺血。例如，肾局部缺血可以由任何原因(例如手术或创伤性休克期间)的低血压所致，并且还是几种肾毒性药物(例如但不限于用于CAT扫描的包含碘的造影剂)的损伤机制。
I.定义
虽然我们认为本领域技术人员完全理解以下术语，但是为了便于说明本发明公开的主题解释以下定义。
遵循长期的专利法常规，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”在本申请包括权利要求中使用时是指“一个(种)或多个(种)”。因此，例如，提及“化合物”或“细胞”包括多个这样的化合物或细胞等。
与“包括”、“含有”或“特征是”同义的术语“包含”是包容性或开放性的，并且不排除额外的未列举的元素或方法步骤。“包含”是用于权利要求语言的专门术语，其表示所列举的元素是必不可少的，但是可以加入其他元素，并且仍然形成权利要求的范围内的构成。
在本文中使用时，短语“由…组成”排除权利要求中未指明的任何元素、步骤或成分。当短语“由…组成”出现在权利要求的主体中而不是紧接在前序之后时，其仅限制该主体所列出的元素；其他元素并未从整个权利要求排除。
在本文中使用时，短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制在指定的物质或步骤，加上不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新特征的物质或步骤。
关于术语“包含”、“由…组成”和“基本上由…组成”，当本文中使用这三个术语中的一个时，本发明公开和要求保护的主题可以包括另外两个术语的使用。
术语“和/或”，当用于描述两种项目或情况，例如CDK4和/或CDK6时，是指两种项目或情况均存在或均适用的情况，以及仅所述项目或情况之一存在或适用的情况。因此，CDK4和/或CDK6抑制剂可以是抑制CDK4和CDK6的化合物、仅抑制CDK4的化合物或者仅抑制CDK6的化合物。
“健康细胞”或“正常细胞”是指个体中的不表现出疾病(例如但不限于癌症或其他增殖性疾病)的特征、症状和/或标志的任何细胞。在一些实施方案中，所述健康细胞是肾细胞。在一些实施方案中，所述健康细胞是组织如肾中的细胞。在一些实施方案中，所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的，并且在一些实施方案中，所述损伤是局部缺血相关的。
“局部缺血”可以指组织或器官供血不足，这导致所述组织或器官不能满足代谢的需要。向局部缺血性器官或组织再灌注(恢复血流)可以导致产生过量的活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)，因而引起氧化应激，这导致一系列的事件如线粒体氧化磷酸化的改变，ATP的减少(这还在局部缺血期间发生并作为局部缺血的结果)，胞内钙的增加以及蛋白激酶、磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶和核酸酶的激活，导致细胞功能/完整性的丧失。
局部缺血再灌注损伤(IRI)指在经历局部缺血(例如，当器官在移植或自体移植中通过手术切除和重新连接时)的组织中血液循环重新开始后发生的损伤。通过额外的实例而不是限制的方式，这样的损伤还在血液循环为了器官移植中断后重新开始时发生；在心肌梗死后用经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、支架或搭桥处理冠状动脉后发生；以及在向中风患者给药溶栓剂后发生。另一实例是在为了心脏手术暂时中断心脏血流时，通常通过心脏停跳溶液的同时给药。另一实例是当在四肢上充气止血带时由整形外科医生在无血区域中为了手术中断四肢的血流。这样的损伤可以在许多组织中发生，例如但不限于肾、肠、心脏、肝、脑、甲状腺、皮肤、肠粘膜、听觉系统、肺、膀胱、卵巢、子宫、睾丸、肾上腺、胆囊、胰、胰岛、胃、血管或肌肉(例如，骨骼肌、平滑肌或心肌)组织以及它们的组合。在一些实施方案中，所述损伤在心脏、肺、肾组织或它们的组合中发生。在一些实施方案中，患有所述损伤的细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
在一些实施方案中，损伤发生在肾细胞或组织中。因此，在一些实施方案中，通过本发明公开的主题治疗(例如，减轻或预防)的IRI可以包括肾局部缺血再灌注损伤。在一些实施方案中，肾细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
“有风险暴露于局部缺血”是指预定在将来暴露于局部缺血的个体，或者有机会在将来无意地暴露于局部缺血的个体。
“化合物的药学有效量”是指在个体中有效提供有益结果的量。在一些实施方案中，有效量是暂时(例如，几小时或几天)诱导个体中的细胞的静止状态所需的量。
在一些实施方案中，抑制CDK4和/或CDK6的化合物没有脱靶(off-target)效应，例如但不限于长期毒性、抗氧化效应和/或雌激素效应。“没有”可以指CDK4/6抑制剂化合物不具有不期望的或脱靶效应，特别是当其在体内使用或者通过基于细胞的测定进行评价时。
在一些实施方案中，“没有”可以指选择性CDK4/6抑制剂不具有脱靶效应，例如但不限于长期毒性、抗氧化效应、雌激素效应、酪氨酸激酶抑制效应、对除CDK4/6之外的CDK的抑制效应；和/或非CDK4/6依赖性细胞中的细胞周期停滞。
“基本上没有”脱靶效应的选择性CDK4/6抑制剂是这样的CDK4/6抑制剂，其可以具有一些较小(minor)的脱靶效应，所述脱靶效应不干扰所述抑制剂提供对抗CDK4/6依赖性细胞中的细胞毒性化合物的保护作用的能力。例如，“基本上没有”脱靶效应的CDK4/6抑制剂可以对其他CDK具有一些较小的抑制效应(例如，对CDK1或CDK2的IC50>0.5μM;>1.0μM或者>5.0μM)，只要所述抑制剂提供CDK4/6依赖性细胞中的选择性G1停滞。
“减轻”或“预防”或其语法变体分别是指，减少效应或者完全防止效应发生。“缓解”可以指减轻和/或预防。
“药理性静止”是指细胞周期的暂时停滞。
在一些实施方案中，本发明公开的主题中所治疗的个体期望是人个体，但是应当理解本文所述的方法对所有脊椎动物物种(例如，哺乳动物、鸟类等)有效，术语“个体”旨在包括所有脊椎动物物种。
更具体地，本文提供哺乳动物的治疗，例如，人，以及由于濒危而具有重要性的那些哺乳动物(例如西伯利亚虎)、对人类具有经济重要性(为了供人食用而在农场饲养的动物)和/或社会重要性(作为宠物饲养或在动物园中饲养的动物)的那些哺乳动物，例如，除了人之外的食肉动物(例如猫和狗)、猪类(猪、肉猪和野猪)、反刍动物(例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马。因此，本文所述的方法的实施方案包括家畜的治疗，包括但不限于家养猪(猪和肉猪)、反刍动物、马等。
在本文中使用时，术语“烷基”是指C1-20(含端值)、线性的(即，“直链的”)、支链的、或环状的、饱和的、或者至少部分不饱和的以及在一些情况中完全不饱和的(即，烯基和炔基)烃链，包括例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基基团。“支链的”是指其中低级烷基基团例如甲基、乙基或丙基与直链烷基链相连的烷基基团。“低级烷基”是指含有1-约8个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基基团(即C1-8烷基)。“高级烷基”是指含有约10-约20个碳原子，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基基团。在某些实施方案中，“烷基”特指C1-8直链烷基。在其他实施方案中，“烷基”特指C1-8支链烷基。
烷基基团可以任选地由一个或多个烷基基团的取代基取代(“取代的烷基”)，所述取代基可以相同或不同。术语“烷基基团的取代基”包括但不限于烷基、取代的烷基、卤代、芳基氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳烷基氧基、芳烷基硫基、羧基、烷氧基羰基、氧代和环烷基。可以沿着烷基链任选地插入一个或多个氧原子、硫原子或者取代或未取代的氮原子，其中氮的取代基是氢、低级烷基(本文也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。
因此，在本文中使用时，术语“取代的烷基”包括本文定义的烷基基团，其中所述烷基基团的一个或多个原子或官能团被另外的原子或官能团(包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基)替代。
本文使用的术语“芳基”是指芳香族部分，其可以是单个芳香环，或者稠合的、共价连接的或连接至共有基团(例如但不限于亚甲基或亚乙基部分)的多个芳香环。所述共有的连接基团还可以是羰基(如在二苯甲酮中)、氧(如在二苯醚中)或氮(如在二苯胺中)。术语“芳基”具体地包括杂环芳香化合物。芳香环可以包括苯基、萘基、联苯基、二苯醚、二苯胺和二苯甲酮等。在特定的实施方案中，术语“芳基”是指含有约5-约10个碳原子(例如5、6、7、8、9或10个碳原子)并且包含5元-和6-元烃和杂环芳香环的环状芳香基团。
芳基基团可以任选地由一个或多个芳基基团的取代基取代(“取代的芳基”)，所述取代基可以相同或不同，其中“芳基基团的取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷基氧基、羧基、羰基、酰基、卤代、硝基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰基氨基、芳酰基氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷硫基、亚烷基和–NR'R″(其中R'和R″可以各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基)。
因此，在本文中使用时，术语“取代的芳基”包括本文定义的芳基基团，其中所述芳基基团的一个或多个原子或官能团被另外的原子或官能团(包括例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基)替代。
芳基基团的具体实例包括但不限于环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
术语“杂芳基”是指其中芳香环或环的骨架中的至少一个原子是除碳以外的原子的芳基基团。因此，杂芳基基团含有一个或多个选自包括但不限于氮、氧和硫的非碳的原子。
在本文中使用时，术语“酰基”是指其中羧基基团的-OH已被另一个取代基替代的有机羧酸基团(即，由RCO—表示，其中R是本文定义的烷基或芳基基团)。因此，术语“酰基”具体地包括芳基酰基基团，例如乙酰基呋喃和苯甲酰甲基基团。酰基基团的具体实例包括乙酰基和苯甲酰基。
“环状的”和“环烷基”是指含有约3-约10个碳原子(例如3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)的非芳香的单环或多环体系。环烷基基团任选地可以是部分不饱和的。环烷基基团还可以任选地由本文定义的烷基基团的取代基、氧代和/或亚烷基取代。沿着环烷基链可以任选地插入一个或多个氧原子、硫原子或者取代或未取代的氮原子，其中氮的取代基是氢、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，由此得到杂环基团。代表性的单环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环的环烷基环包括金刚烷基、八氢萘基、萘烷、樟脑、莰烷和降金刚烷基(noradamantyl)。
术语“杂环”或“杂环的”是指其中环状环的骨架碳原子中的一个或多个被杂原子(例如氮、硫或氧)替代的环烷基基团(即，上文所述的非芳香的环状基团)。杂环的实例包括但不限于四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉、二氧杂环己烷、哌啶、哌嗪和吡咯烷。
“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”是指烷基-O-基团，其中烷基如上所述。在本文中使用时，术语“烷氧基”可以指例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。术语“氧基烷基”可以与“烷氧基”互换使用。
“芳氧基(aryloxyl)”或“芳氧基(aryloxy)”是指芳基-O-基团，其中芳基基团如上所述，包括取代的芳基。在本文中使用时，术语“芳氧基”可以指苯氧基或己氧基，以及被烷基、取代的烷基、卤代或烷氧基取代的苯氧基或己氧基。
“芳烷基”是指芳基–烷基–基团，其中芳基和烷基如上所述并且包括取代的芳基和取代的烷基。示例性芳烷基基团包括苄基、苯乙基和萘甲基。
“芳烷基氧基(aralkyloxyl)”或“芳烷基氧基(aralkyloxy)”是指芳烷基-O-基团，其中所述芳烷基基团如上所述。示例性芳烷基氧基基团是苄氧基。
术语“氨基”是指-NR’R”基团，其中R’和R”各自独立地选自包括以下基团的组：H以及取代和未取代的烷基、环烷基、杂环、芳烷基、芳基和杂芳基。在一些实施方案中，氨基基团是-NH2。“氨基烷基”和“氨基芳基”是指-NR’R”基团，其中分别地，R’如上文关于氨基所定义的，R”是取代或未取代的烷基或芳基。
“酰氨基”是指酰基-NH-基团，其中酰基如上所述。
术语“羰基”是指-(C=O)-，或者与上文命名的母体基团的碳原子连接的成双键的氧取代基。
术语“羧基”是指–COOH基团。
在本文中使用时，术语“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘基团。
术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”是指-OH基团。
术语“氧代”是指其中碳原子被氧原子替代的上文已述的化合物。
术语“氰基”是指-CN基团。
术语“硝基”是指-NO2基团。
术语“硫代”是指其中碳或氧原子被硫原子替代的上文已述的化合物。
II.化合物和方法
在一些实施方案中，本发明公开的主题允许保护肾免受局部缺血和诱发局部缺血的肾毒素的急性毒性作用。在肾损伤之前、期间或之后立即给药可口服和无毒的小分子激酶抑制剂以在较晚的时间点增强肾再生。对肾损伤应答而诱导肾增殖。见图4A和4B。在肾损伤附近的一段时间中，某些循环肾毒素会以细胞周期依赖性方式进一步增加肾损伤。因此，通过药理使用CDK4/6抑制剂将肾上皮细胞短暂维持在G1(药理静止或PQ)会在清除循环肾毒素后允许增强的肾修复。见图5。在局部缺血性损伤时短暂PQ会增强随后的肾恢复。该发现利用这样的发现，增殖细胞对外毒素高度敏感，因此短暂PQ是治疗性的。所述方法可以包括在肾局部缺血性损伤之前、同时或之后(例如20小时内)给药(口服或IV)CDK4/6抑制剂。所述CDK4/6抑制剂可以是选择性CDK4/6抑制剂。可以维持CDK4/6抑制剂的治疗水平直至诱发肾损伤的条件已逆转(一般24-48小时)。然后可以撤走CDK4/6抑制剂(利用不被肾专门清除的化合物)，并且肾再生性增殖会继而发生。例如，可以在与低血压相关的手术(例如心脏搭桥手术)之前或者在使用包含碘的放射性造影剂之前诱导PQ。这样的损伤后24-48小时在肾毒素已清除和/或全身血压已恢复时PQ可以逆转。
肾通常是静止的器官，但是其在损伤时能够通过细胞增殖来极大地修复。肾对减少的血流以及减少肾血流的毒素所致的局部缺血特别敏感。局部缺血性损伤之后，肾上皮细胞增殖显著增加。如本文所示，局部缺血性损伤之后的增殖可以被诱导PQ的CDK4/6抑制剂所抑制。见图4A和4B。在损伤后12-72小时持续的PQ允许清除肾损伤时产生的循环肾毒素，从而促进肾恢复。
Davis等人的美国专利第6,369,086号(下称“‘086专利”)看来描述：选择性CDK抑制剂可以用于限制细胞毒性剂的毒性并且可以用来防止化疗诱发的脱发。具体地，‘086专利描述了作为特异性CDK2抑制剂的羟吲哚化合物。相关的期刊文献(参见Davis et al.,Science,291,134-137(2001))看来描述：CDK2的抑制产生细胞周期停滞，降低上皮细胞对细胞周期活性的抗肿瘤药的敏感性，并且可以预防化疗诱发的脱发。但是，该期刊文献由于不可再现结果而后被撤回。不同于这些标榜的选择性CDK2抑制剂的保护效应(通过撤回所述期刊文章而对其质疑)，在一些实施方案中，本发明公开的主题涉及保护组织和/或细胞如肾组织和/或细胞免受局部缺血的影响。
可以通过用抑制剂预治疗(即，预定暴露于局部缺血或有风险暴露于局部缺血的个体的先前CDK4/6抑制剂治疗)来向个体提供CDK4/6抑制剂的保护效果。
在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是心脏手术，或者与低血压性发作相关的其他手术。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药用于CT扫描、幽门成形术和冠状动脉造影术的放射性造影剂。在一些实施方案中，局部缺血的诱发性发作是肾同种异体移植物收获(例如，尸体的肾同种异体移植物收获)，具有在血流不存在下转运和/或储存肾期间诱发的冷-局部缺血。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是与血容量减少(例如，由于出血、脱水等)和/或低血压时期相关的创伤。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药减少血流量(例如，肾血流)的药物或物质，例如但不限于阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。
在本文中使用时，术语“选择性CDK4/6抑制剂化合物”是指这样的化合物，其选择性抑制CDK4和CDK6中的至少一种，或者其主要的作用模式是通过抑制CDK4和/或CDK6。因此，选择性CDK4/6抑制剂是这样的化合物，其一般具有比对其他激酶或对其他酶更低的对CDK4和/或CDK6的50%抑制浓度(IC50)。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其他CDK(例如CDK1和CDK2)的IC50可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC50的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其他CDK的IC50可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC50的至少20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其他CDK的IC50可以是所述化合物对CDK4或CDK6的IC50的100倍以上或1000倍以上。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是选择性抑制CDK4和CDK6的化合物。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂不是天然存在的化合物(例如，异黄酮)。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂是一种或多种酪氨酸激酶的较差的抑制剂(例如，>1μM体外IC50)。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂是丝氨酸和/或苏氨酸激酶的高效抑制剂。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂是较差的CDK1抑制剂(例如，(例如，>1μM体外IC50)。在一些实施方案中，所述CDK4/6抑制剂的特征是与CDK1相比具有10倍或50倍或100倍或更大的抑制CDK4或CDK6的相对效力。
在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是选择性诱导CDK4/6依赖性细胞中的G1细胞周期停滞的化合物。因此，当按照本发明公开的方法用所述选择性CDK4/6抑制剂化合物处理时，处于G1期的CDK4/6依赖性细胞的百分比升高，而处于G2/M期和S期的CDK4/6依赖性细胞的百分比降低。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂是这样的化合物，其诱导CDK4/6依赖性细胞中的基本上纯粹的(pure)(即“完全的(clean)”)G1细胞周期停滞(例如，其中用所述选择性CDK4/6抑制剂处理诱导细胞周期停滞，以致按照标准方法(例如，碘化丙锭染色或其他)测定，大多数的细胞停滞于G1，处于G2/M和S期的细胞群体合计为总细胞群体的20%、15%、12%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少)。
虽然已报告非特异性激酶抑制剂星形孢菌素在一些细胞类型中间接地诱导G1停滞(参见Chen et al.,J.Nat.Cancer Inst.,92,1999-2008(2000))，但是选择性CDK4/6抑制剂可以直接且选择性地诱导细胞(例如肾上皮细胞)中的G1细胞周期停滞以提供保护，具有减低的长期毒性，并且不需要在暴露于局部缺血之前用所述抑制剂长时(例如，48小时或更长)治疗。具体地，虽然一些非选择性激酶抑制剂可以通过降低CDK4蛋白水平引起一些细胞类型中的G1停滞，但是，不拘于任何一种理论，认为本发明公开的方法的益处至少部分归因于选择性CDK4/6抑制剂能够直接抑制细胞(例如，肾细胞)中的CDK4/6的激酶活性而不降低它们的细胞浓度。
在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是基本上没有脱靶效应(特别是与抑制除CDK4和/或CDK6之外的激酶相关)的化合物。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是除CDK4/6之外的CDK(例如，CDK1和CDK2)的较差的抑制剂(例如，>1μM IC50)。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物在非CDK4/6依赖性细胞中不诱导细胞周期停滞。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂化合物是酪氨酸激酶的较差的抑制剂(例如，>1μM IC50)。其他不期望的脱靶效应包括但不限于长期毒性、抗氧化效应和雌激素效应。
抗氧化效应可以通过本领域已知的标准测定进行测定。例如，无显著抗氧化效应的化合物是不显著地清除自由基例如氧自由基的化合物。可以将化合物的抗氧化效应与抗氧化活性已知的化合物例如染料木黄酮比较。因此，无显著的抗氧化活性的化合物可以是抗氧化活性为染料木黄酮的抗氧化活性的约1/2、1/3、1/5、1/10、1/30或1/100的化合物。雌激素活性也可以通过已知的测定进行测定。例如，非雌激素化合物是不显著地结合和激活雌激素受体的化合物。基本上没有雌激素效应的化合物可以是雌激素活性为具有雌激素活性的化合物(例如，染料木黄酮)的约1/2、1/3、1/5、1/10、1/20或1/100的化合物。
可以按照本发明公开的方法使用的CDK4/6抑制剂包括任何已知的小分子(例如，<1000道尔顿，<750道尔顿、或者少于<500道尔顿)CDK4/6抑制剂，或者其药学可接受的盐。在一些实施方案中，所述抑制剂是非天然存在的化合物(即，自然界中未发现的化合物)。已报道几类化合物具有CDK4/6抑制能力(例如，在无细胞测定中)。用于本发明公开的方法的选择性CDK4/6抑制剂可以包括但不限于，吡啶并[2,3-d]嘧啶(例如，吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮和2-氨基-6-氰基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮)、三氨基嘧啶、芳基[a]吡咯并[3,4-d]咔唑、含氮的杂芳基取代的脲、5-嘧啶基-2-氨基噻唑、苯并噻二嗪、吖啶硫酮和异喹啉酮。
在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶为吡啶并[2,3-d]嘧啶酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶酮为吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮由氨基芳基或氨基杂芳基基团取代。在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮由氨基吡啶基团取代。在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮为2-(2-吡啶基)氨基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮。例如，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮化合物可以具有Barvian等人的美国专利公开第2007/0179118号中所述的式(II)的结构，该专利公开整体援引加入本文。在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶化合物为6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(即，PD0332991)或其药学可接受的盐。参见Toogood et al.,J.Med.Chem.,2005,48,2388-2406。
在一些实施方案中，所述吡啶并[2,3-d]嘧啶酮为2-氨基-6-氰基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮。例如，Tu等人描述了包括2-氨基-6-氰基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-酮在内的选择性CDK4/6抑制剂。参见Tu et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2006,16,3578-3581。
在本文中使用时，“三氨基嘧啶”是其中嘧啶环中的至少三个碳原子由具有式–NR1R2的基团取代的嘧啶化合物，其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基。每个R1和R2的烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基基团可以进一步由一个或多个羟基、卤代、氨基、烷基、芳烷基、环烷基、杂环、芳基或杂芳基基团取代。在一些实施方案中，所述氨基基团中的至少一个是具有–NHR结构的烷基氨基基团，其中R为C1-C6烷基。在一些实施方案中，至少一个氨基基团是环烷基氨基基团或羟基取代的环烷基氨基基团，具有式–NHR，其中R是由或不由羟基基团取代的C3-C7环烷基。在一些实施方案中，至少一个氨基基团是杂芳基取代的氨基烷基基团，其中所述杂芳基基团可以进一步由芳基基团取代基取代。
芳基[a]吡咯并[3,4-d]咔唑包括但不限于萘基[a]吡咯并[3,4-c]咔唑、吲哚并[a]吡咯并[3,4-c]咔唑、喹啉基[a]吡咯并[3,4-c]咔唑和异喹啉基[a]吡咯并[3,4-c]咔唑。参见例如Engler et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003,13,2261-2267;Sanchez-Martinez et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003,13,3835-3839;Sanchez-Martinez et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003,13,3841-3846;Zhu et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003,13,1231-1235;and Zhu et al.,J.Med Chem.,2003,46,2027-2030。合适的芳基[a]吡咯并[3,4-d]咔唑还公开于美国专利公开第2003/0229026号和第2004/0048915号中。
含氮的杂芳基取代的脲是包含脲部分的化合物，其中脲氮原子之一由含氮的杂芳基基团取代。含氮的杂芳基基团包括但不限于包含至少一个氮原子的5-10元芳基基团。因此，含氮的杂芳基基团包括例如吡啶、吡咯、吲哚、咔唑、咪唑、噻唑、异噁唑、吡唑、异噻唑、吡嗪、三唑、四唑、嘧啶、哒嗪、嘌呤、喹啉、异喹啉、喹喔啉、噌啉、喹唑啉、苯并咪唑、苯邻二甲酰亚胺等。在一些实施方案中，所述含氮的杂芳基基团可以由一个或多个烷基、环烷基、杂环基、芳烷基、芳基、杂芳基、羟基、卤代、羰基、羧基、硝基、氰基、烷氧基或氨基基团取代。在一些实施方案中，所述含氮的杂芳基取代的脲为吡唑-3-基脲。所述吡唑可以进一步由环烷基或杂环基团取代。在一些实施方案中，所述吡唑-3-基脲为：
Figure BDA00003517074100181
参见Ikuta,et al.,J.Biol.Chem.,2001,276,27548-27554。可以按照本发明公开的主题使用的其他脲包括美国专利公开第2007/0027147号中所述的式(I)的联芳基脲化合物。还参见，Honma et al.,J.Med.Chem.,2001,44,4615-4627;和Honma et al.,J.Med.Chem.,2001,44,4628-4640。
Shimamura等人描述了合适的5-嘧啶基-2-氨基噻唑CDK4/6抑制剂。参见Shimamura et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2006,16,3751-3754。在一些实施方案中，所述5-嘧啶基-2-氨基噻唑具有结构：
Figure BDA00003517074100191
有用的苯并噻二嗪和吖啶硫酮化合物包括例如Kubo等人公开的那些。参见Kubo et al.,Clin.Cancer Res.1999,5,4279-4286和美国专利公开第2004/0006074号，这些文献整体援引加入本文。在一些实施方案中，所述苯并噻二嗪由一个或多个卤代、卤代芳基或烷基基团取代。在一些实施方案中，所述苯并噻二嗪选自4-(4-氟苄基氨基)-1,2,3-苯并噻二嗪-1,1-二氧化物、3-氯-4-甲基-4H-苯并[e][1,2,4]噻二嗪-1,1-二氧化物和3-氯-4-乙基-4H-苯并[e][1,2,4]噻二嗪-1,1-二氧化物。在一些实施方案中，所述吖啶硫酮由一个或多个氨基或烷氧基基团取代。在一些实施方案中，所述吖啶硫酮选自3-氨基-10H-吖啶酮-9-硫酮(3ATA)、9(10H)-吖啶硫酮、1,4-二甲氧基-10H-吖啶-9-硫酮和2,2’-二苯基二胺-双-[N,N’-[3-酰氨基-N-甲基氨基)-10H-吖啶-9-硫酮]]。
在一些实施方案中，本发明公开的方法的个体是已暴露于、正暴露于、或预定暴露于局部缺血的个体。
通常，可以在暴露于局部缺血之前24-20小时直至暴露后24-48小时的时间段中向所述个体给药CDK4/6抑制剂化合物。然而，如果期望，此时间段可以扩展至早于暴露于局部缺血前的24小时的时间。此外，所述时间段可以扩展长于暴露于局部缺血之后的24-48小时，只要较晚给药所述CDK4/6抑制剂至少产生一些保护作用。
在一些实施方案中，可以在局部缺血之前的时间段向个体给药CDK4/6抑制剂，从而所述CDK4/6抑制剂的血浆水平在给予所述局部缺血事件时达到峰值。如果期望，可以向个体给药多剂量的CDK4/6抑制剂化合物。或者，可以向个体给药单剂量的CDK4/6抑制剂。
在一些实施方案中，本发明公开的主题涉及CDK4/6抑制剂(例如，选择性CDK4/6抑制剂)保护细胞或组织免受局部缺血性损伤和/或相关事件的能力。因此，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供一种在细胞或组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的细胞或组织中的损伤的方法，所述细胞或组织例如肾、肠、心脏、肝、脑、甲状腺、皮肤、肠粘膜、听觉系统、肺、膀胱、卵巢、子宫、睾丸、肾上腺、胆囊、胰、胰岛、胃、血管或肌肉细胞或组织，其中所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制CDK4/6的化合物。在一些实施方案中，所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的，并且在一些实施方案中，所述损伤是局部缺血相关的。在一些实施方案中，所述细胞或组织为肾(即，肾的)细胞或组织。
可以在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之前、期间或之后在任何合适的时间给药抑制CDK4/6的化合物。在一些实施方案中，在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后约24至约48小时之间(例如，约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时)向所述个体给药CDK4/6抑制剂。在一些实施方案中，在个体暴露于局部缺血和/或相关事件之前(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时)向所述个体给药CDK4/6抑制剂。
在一些实施方案中，抑制CDK4/6的化合物为选择性CDK4/6抑制剂。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂对其他CDK的IC50是所述化合物对CDK4或CKD6的IC50的至少2、5、10、100或1000倍。在一些实施方案中，所述选择性CDK4/6抑制剂是除CDK4和/或CDK6以外的细胞周期蛋白依赖性激酶(例如，CDK1)的不良抑制剂(例如，具有>1μM的IC50)。
在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是心脏手术(例如，心脏搭桥手术)，或者与低血压性发作相关的其他手术。在一些实施方案中，局部缺血的诱发性发作是肾同种异体移植物收获(例如，尸体的肾同种异体移植物收获)，具有在血流不存在下转运和/或储存肾期间诱发的冷-局部缺血。在一些实施方案，诱发局部缺血的事件是给药放射性造影剂。在一些实施方案中，所述放射性造影剂用于CT扫描、幽门成形术或冠状动脉造影术。在一些实施方案中，所述放射性造影剂是包含碘的放射性造影剂。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是与血容量减少(例如，由于出血或脱水)和/或低血压时期相关的创伤。
在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是给药减少血流(例如，肾血流)的药物或物质，例如但不限于阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是急性组织局部缺血或梗死，例如但不限于由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。在一些实施方案中，诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。
III.活性化合物、盐和制剂
在本文中使用时，术语“活性化合物”是指CDK4/6抑制剂化合物，或者其前药(例如但不限于可以在体外或体内形成所述CDK4/6抑制剂的各种酯和其他衍生物)、溶剂化物(例如但不限于水合物)和/或药学可接受的盐。在一些实施方案中，“活性化合物”为选择性CDK4/6抑制剂化合物，其前药、溶剂化物和/或药学可接受的盐。活性化合物可以通过任何合适的方法向个体给药。当然，给药活性化合物的量和时机可以取决于治疗的个体、所述个体已暴露于、正暴露于或预定暴露于的局部缺血和/或相关事件的性质、给药方式、所述活性化合物的药代动力学性质、以及处方医师的判断。因此，由于个体的差异性，下述剂量仅作参考，并且医师可以逐步增加(titrate)所述化合物的剂量以实现医师认为适合所述个体的治疗。在考虑期望的治疗程度时，医师可以权衡各种因素如个体的年龄和体重、先前存在的疾病的存在、以及其他疾病的存在。可以制备药物制剂用于任何期望的给药途径，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、i.p.或或气雾剂给药，这会下文中更详细地讨论。在一些实施方案中，所述制剂可以制备为用于意图移植入移植受者的离体器官(例如，肾)或组织的维持溶液。
任何特定活性化合物的治疗有效量(其用途在本文所述的实施方案的范围内)可以随化合物和个体稍微改变，并且可以取决于所述个体的疾病状况和递送途径。作为一般性的提议，约0.1-约200mg/kg的剂量可以具有疗效，其中所有重量是基于活性化合物的重量计算的，包括使用盐的情况在内。在一些实施方案中，剂量可以是提供达到约1-5μM或更高的活性化合物的血清浓度所需的化合物的量。较高水平时的毒性问题可以将静脉给药剂量限制至较低水平，例如达到约10mg/kg，其中所有重量是基于活性化合物(base)的重量计算的，包括使用盐的情况在内。约10mg/kg-约50mg/kg的剂量可以用于口服给药。典型地，约0.5mg/kg-5mg/kg的剂量可以用于肌肉内注射。在一些实施方案中，对于静脉内或口服给药，剂量可以是约1μmol/kg-约50μmol/kg，或者，任选地，约22μmol/kg-约33μmol/kg的所述化合物。
根据本发明公开的方法，本文所述的药学活性化合物可以固体或液体的形式口服给药，或者可以溶液剂、混悬剂或乳剂的形式肌肉内给药、静脉内给药或者经吸入给药。在一些实施方案中，所述化合物或盐还可以脂质体混悬剂的形式经吸入给药、静脉内给药或肌肉内给药。当通过吸入给药时，所述活性化合物或盐可以是粒度为约0.5-约5微米并且任选地为约1-约2微米的多个固体颗粒或液滴的形式。
药物制剂可以包含任何药学可接受的载体中的本文所述的活性化合物或其药学可接受的盐。如果期望溶液剂，对于水溶性化合物或盐，水是可选的载体。对于水溶性化合物或盐，有机媒介物可以是适合的，例如甘油、丙二醇、聚乙二醇或其混合物。在后一情况中，有机媒介物可以含有大量的水。然后，可以本领域技术人员已知的合适的方式，典型地通过0.22微米滤器过滤，来灭菌处理在两种情况的任一种中的溶液剂。灭菌之后，可以将溶液剂分配入适当的容器中，例如去热原的玻璃小瓶。任选地，通过无菌的方法进行此分配过程。然后可以对小瓶进行灭菌密闭，并且，如果需要，可以冻干小瓶的内容物。
除了活性化合物或其盐之外，药物制剂还可以含有其他添加剂，例如pH-调节添加剂。具体地，有用的pH-调节剂包括诸如盐酸的酸、碱或缓冲剂，例如乳酸钠、乙酸钠、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或葡萄糖酸钠。此外，制剂可以含有抗菌防腐剂。有用的抗菌防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苄醇。当制剂被置于设计用于多次给药用途的小瓶中时，通常使用抗菌防腐剂。可以利用本领域公知的技术冻干本文所述的药物制剂。
为了口服给药，药物组合物可以采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂等形式。含有各种赋形剂(例如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙)的片剂与各种崩解剂(例如淀粉(例如，马铃薯淀粉或木薯淀粉)和某些复杂的硅酸盐)及粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶)一起使用。此外，为了压片目的，润滑剂例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石通常很有用。相似类型的固体组分还用作软-和硬-填充明胶胶囊中的填充剂。此方面的材料还包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量的聚乙二醇。当期望含水的混悬剂和/或酏剂用于口服给药时，本发明公开的主题的化合物可以与各种甜味剂、调味剂、着色剂、乳化剂和/或助悬剂，以及稀释剂(如水、乙醇、丙二醇、甘油)及其各种组合联用。
在本文所述的主题的另一实施方案中，提供在密封容器中的单位剂型形式的、可注射的、稳定无菌制剂，其包含本文所述的活性化合物或其盐。所述化合物或盐以冻干物的形式提供，所述冻干物能够用适当的药学可接受的载体复原(reconstitute)以形成适合注射入个体的液体制剂。当所述化合物或盐基本上不溶于水时，可以使用足量的生理可接受的乳化剂以乳化含水载体中的所述化合物或盐。特别有用的乳化剂包括磷脂酰胆碱和卵磷脂。
本文提供的其他实施方案包括本文公开的活性化合物的脂质体制剂。配制脂质体混悬剂的技术是本领域公知的。当所述化合物是水溶性盐时，利用常规的脂质体技术，可以将所述化合物掺入脂质囊泡中。在这种情况下，由于所述活性化合物的水溶性，所述活性化合物可以大量包含在脂质体的亲水性中心或核内。采用的脂质层可以具有任何常规组成，并且可以含有胆固醇，或者可以不含胆固醇。当所关注的活性化合物是水不溶性的时，仍然采用常规的脂质体制剂技术，盐可以大量包含在形成脂质体的结构的疏水性脂质双层内。在两种情况的任一种中，通过使用标准的超声和均质化技术，可以降低制得的脂质体的大小。可以冻干包含本文公开的活性化合物的脂质体制剂以制备冻干物，所述冻干物可以用药学可接受的载体例如水复原以重新产生脂质体混悬剂。
本文还提供药物制剂，其适合作为气雾剂通过吸入给药。这些制剂包含期望的本文所述化合物或其盐的溶液剂或混悬剂，或者所述化合物或盐的多个固体颗粒。可以将期望的制剂置于小室中并雾化。雾化可以通过压缩空气或通过超声能量来完成以形成包含所述化合物或盐的多个液滴或固体颗粒。液滴或固体颗粒的粒度应为约0.5-约10微米，并且任选为约0.5-约5微米。固体颗粒可以通过以本领域已知的任何适当的方式，例如通过微粉化处理固体化合物或其盐来获得。任选地，固体颗粒或液滴的粒度可以是约1-约2微米。在此方面，商品雾化器可用于实现此目的。所述化合物可以美国专利第5,628,984号中所述的方式，通过可呼吸颗粒的气雾悬浮剂给药，该专利整体公开援引加入本文。
当适合以气雾剂形式给予的药物制剂是液体形式时，所述制剂可以包含在含水载体中的水溶性活性化合物。可以存在表面活性剂，其使制剂的表面张力降低以致在接受雾化时足以形成期望粒度范围内的液滴。
如本文所示，本发明提供水溶性和水不溶性的活性化合物。在本文中使用时，术语“水溶性的”意在限定以约50mg/mL或更大的量溶于水的任何组分。此外，在本文中使用时，术语“水不溶性的”意在限定在水中的溶解度小于约20mg/mL的任何组分。在一些实施方案中，水溶性化合物或盐可以是令人期望的，而在其他实施方案中，水不溶性化合物或盐也可以是期望的。
在本文中使用时，术语“药学可接受的盐”是指在正确的医学判断范围内，适合与个体(例如，人个体)接触使用而没有不适合的毒性、刺激、变应性反应等，与适当的益处/风险比相称，并且对其预期用途有效的本发明公开的主题的化合物的那些盐，以及两性离子形式(如果可能的话)。
因此，术语“盐”是指本发明公开的主题的化合物的相对无毒性的无机酸和有机酸加成盐。这些盐可以在最终分离和纯化所述化合物的过程中原位制备，或者通过分开地使游离碱形式的纯化的化合物与合适的有机酸或无机酸反应并分离由此形成的盐进行制备。就本发明公开的主题的化合物是碱性化合物而言，它们均能够与各种无机酸和有机酸形成很多种不同的盐。虽然对于向动物给药，这些盐必须是药学可接受的，但实际上，通常期望首先从反应混合物中分离药学不可接受的盐形式的碱性化合物，然后通过用碱性试剂处理简单地转化成游离碱化合物，其后将所述游离碱转化成药学可接受的酸加成盐。碱性化合物的酸加成盐通过以常规方式使游离碱形式与足量的期望的酸接触产生所述盐来进行制备。游离碱形式可以通过以常规方式使盐形式与碱接触并分离所述游离碱来再生。游离碱形式与其各种盐形式在某些物理性质方面(例如在极性溶剂中的溶解度)略微不同，但在其他方面，对于本发明公开的主题的目的而言，盐相当于其各自的游离碱。
药学可接受的碱加成盐是与金属或胺例如碱金属和碱土金属的氢氧化物或者有机胺形成的。用作阳离子的金属的实例包括但不限于钠、钾、镁、钙等。合适的胺的实例包括但不限于N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
酸性化合物的碱加成盐通过以常规方式使游离酸形式与足量的期望的碱接触产生所述盐来进行制备。游离酸形式可以通过以常规方式使盐形式与酸接触并分离所述游离酸来再生。游离酸形式与其各自的盐形式在某些物理性质方面(例如在极性溶剂中的溶解度)略微不同，但在其他方面，对于本发明公开的主题的目的而言，盐相当于其各自的游离酸。
盐可以从无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等制备，盐的实例有硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(naphthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙基磺酸盐等。盐还可以从有机酸例如脂肪族一元羧酸和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷双酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等制备。代表性的盐包括乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。药学可接受的盐可以包括基于碱金属和碱土金属(例如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子，以及无毒性的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还包括氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。参见，例如，Berge et al.,J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19，其援引加入本文。
实施例
以下实施例提供示例性实施方案而不是为了以任何方式限制本发明公开的主题的范围。由于本公开和本领域技术的一般水平，技术人员可以理解以下实施例仅是示例性意图，并且在不脱离本发明公开的主题的范围的情况下可以使用许多变化、修改和变型。
除非另有说明，本发明公开的主题的实施可以采用在本领域的技术之内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这类技术在文献中充分解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current edition);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Methods inEnzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.);Remington’s Pharmaceutial Sciences,18th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990);Carey and Sundberg,Advanced OrganicChemistry3rd Ed.(Plenum Press)Vols A and B(1992)。PCT公开号WO2010/051127、WO2010/039997；以及WO2010/132725也整体援引加入本文。
实施例1合成PD
Figure BDA00003517074100261
Figure BDA00003517074100271
线路1：合成PD。
如以上路线1中所示合成PD。除了将化合物D转化成化合物E的反应以及将化合物F转化成化合物G的反应之外，路线1中所示的反应大体上按照之前报道的方法进行(参见VandelWel et al.,J.Med Chem.,48,2371-2387(2005);和Toogood et al.,J.Med.Chem.,48,2388-2406(2005))。
化合物D转化成化合物E：
在氮气下将化合物D(40g,169mmol)溶于无水THF(800mL)并在冰浴中冷却该溶液，向其缓慢地加入MeMgBr(160mL,480mmol,3M在乙醚中)并搅拌1h。用饱和NH4Cl水溶液终止反应，并在水和EtOAc之间分配。分离有机层，并用EtOAc萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。浓缩得到油状中间体产物(41.9g,98%)。
将上述中间体(40g,158mmol)溶于无水CHCl3(700mL)。加入MnO2(96g,1.11mol)，在搅拌下将混合物加热至回流，持续18h，再另外加入MnO2(34g,395mmol)，继续回流4h。通过硅藻土(Celite)垫过滤固体并用CHCl3洗涤。浓缩滤液得到黄色固体状化合物E(35g,88%),Mp:75.8-76.6°C。
化合物F转化成化合物G：
Figure BDA00003517074100281
将化合物F(5g,18.2mmol)溶于无水DMF(150mL)并加入NBS(11.3g,63.6mmol)。在r.t.下搅拌反应混合物3.5h，然后倒入H2O(500mL)中，过滤沉淀并用H2O洗涤。从EtOH重结晶固体得到白色固体状化合物G(5.42g,80.7%),mp:210.6-211.3°C。
PD的表征数据：
LC-MS:448.5(ESI,M+H).纯度:～99%
1H NMR(300MHz,D2O):9.00(s,1H),8.12(dd,J=9.3Hz,2.1Hz,1H),7.81(d,J=2.4Hz,1H),7.46(d,J=9.6Hz,1H),5.80-5.74(m,1H),3.57-3.48(m,8H),2.48(s,3H),2.37(s,3H),2.13-1.94(m,6H),1.73-1.71(m,2H).
13C NMR(75MHz,D2O):203.6,159.0,153.5,153.3,152.2,139.9,139.4,139.2,133.1,129.0,118.7,113.8,107.4,51.8,42.2,40.0,28.0,25.2,22.6,10.8.
实施例2通过CDK4/6抑制保护非血液组织和细胞
使用有效和选择性的CDK4/6抑制剂如PD0332991(如实施例1所述合成)在正常人原代肾近端小管上皮细胞中诱导G1停滞。见图1A和1B。观察到细胞周期的G0/G1分数的剂量依赖性增加，伴随着G2/M和S-期分数的完全减少。在这种情况下，细胞进入药理静止并维持在这种状态下，直至它们从这种停滞释放。
将正常人原代肾近端小管上皮细胞平板接种，并在24小时后暴露于浓度为0、10nM、30nM、100nM、300nM或1μM的PD0332991。处理后16小时；通过标准方法将细胞收获，在冰冷的甲醇中固定直至DNA染色的时间。处理样品，将DNA用碘化丙啶(PI)溶液染色并通过流式细胞术分析。利用Verity(Verity Software House,Topsham,Maine,United States ofAmerica)的细胞分析软件Mod-FitTM进一步分析流式细胞仪的数据，其中细胞周期分数计算为整个群体的百分比。
CDK4/6抑制阻断正常人原代肾近端小管上皮细胞的增殖。将这些细胞以适当的密度接种于96孔板中，并且在37°C下于加湿培养箱中在5%CO2下培养24小时。在24小时后将细胞暴露于涵盖大剂量范围的有效和选择性的CDK4/6抑制剂，在这种情况下为PD0332991。所研究的剂量范围为0、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM或3μM PD0332991。暴露后72小时，根据制造商的说明书，将CDK4/6受抑制的细胞用
Figure BDA00003517074100291
(Promega,Madison,Wisconsin,United States of America)处理。将平板在发光计中以1秒/孔读数。将结果置于Microsoft Excel中并分析。在图2中，当处理后72小时与DMSO对照相比时，在这种抑制剂的存在下获得明显的剂量依赖性的细胞增殖抑制。这个结果联合图1A和1B证实CDK4/6依赖性非血液细胞可以进入药理静止，因此增殖受到抑制。
实施例3用PD0332991处理小鼠、IRI以及BrdU掺入肾上皮细胞的方法
化合物：如实施例1所述合成PD0332991。
药物制备及剂量给药：将PD0332991溶于50mM乳酸钠缓冲液(pH4.0)中至终浓度15mg/ml。在局部缺血再灌注手术之前1小时通过口服管饲法用150mg/kg剂量的PD0332991或媒介物处理小鼠。
剂量给药计划：在如图3A所示一次IRI前PD0332991或媒介物(乳酸钠缓冲液)剂量给药之后以及在如图3B所示两次(IRI前一次和IRI后一次)PD0332991或媒介物剂量给药之后监测局部缺血再灌注损伤(IRI)后的肾细胞增殖(基于肾上皮细胞中BrdU掺入)。在IRI后21小时，或者在IRI后21小时和45小时，i.p.注射BrdU(100mg/kg)。最终BrdU剂量后3小时将小鼠处死。通过计数放大下肾上皮细胞视野中的BrdU(+)细胞数目来目视定量BrdU阳性(BrdU(+))细胞。
双侧局部缺血再灌注损伤：手术之前将8周龄的雄性小鼠用戊巴比妥钠(60mg/kg体重，腹腔内)麻醉。在整个过程中将体温控制在36.5°C-37.5°C。双侧切入腹膜允许接近两个肾。将肾暴露，并且通过用非创伤性微动脉瘤夹(Roboz,Rockville,MD)同时夹住两个肾的肾蒂来诱发局部缺血。将夹住的肾放回腹膜腔28分钟，然后移除夹子，导致再灌注损伤。用创缘夹闭合侧面的切口，并且允许小鼠在它们的家笼中恢复。
总结：经历IRI并按照图3A的剂量给药计划用PD0332991剂量给药一次的肾表现出比来自损伤后24小时用媒介物处理的小鼠的受损的肾显著更少的BrdU(+)细胞。见图4A。接受两个剂量的PD0332991小鼠也表现出比损伤后48小时接受两个剂量的媒介物的小鼠更少的BrdU掺入。见图4B。来自未经历IRI的小鼠的肾细胞表现出很少的BrdU掺入。见图4A和4B。
实施例4用PD0332991处理小鼠、双侧IRI以及血清肌酸酐测量的方法
化合物：如实施例1所述合成PD0332991。
药物制备及剂量给药：将PD0332991溶于50mM乳酸钠缓冲液(pH4.0)中至终浓度15mg/ml。在局部缺血再灌注手术之前1小时通过口服管饲法用150mg/kg剂量的PD0332991或媒介物处理小鼠。
双侧局部缺血再灌注损伤：手术之前将8周龄的雄性小鼠用戊巴比妥钠(60mg/kg体重，腹腔内)麻醉。在整个过程中将体温控制在36.5°C-37.5°C。双侧切入腹膜允许接近两个肾。将肾暴露，并且通过用非创伤性微动脉瘤夹(Roboz,Rockville,MD)同时夹住两个肾的肾蒂来诱发局部缺血。将夹住的肾放回腹膜腔28分钟，然后移除夹子，导致再灌注损伤。用创缘夹闭合侧面的切口，并且允许小鼠在它们的家笼中恢复。
血清肌酸酐测量：手术后24小时，将尾静脉血采集在肝素化的红细胞微量压积毛细管(Fisher Scientific,Pittsburgh,Pennsylvania,United States ofAmerica,Cat.#22-362-566)中，并且以5000转/分(RPM)离心15分钟。上清保留为血清。通过Beckman肌酸酐分析仪2测量血清肌酸酐，其利用与包含10mM硼酸钠、240mM氢氧化钠和10mM十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液混合的10mM苦味酸溶液。相对于肌酸酐标准品测量血清肌酸酐并记录为毫克/分升。
总结：双侧局部缺血再灌注损伤之前1小时，将小鼠用50mM乳酸钠缓冲溶液或150mg/kg剂量的PD0332991处理。手术后24小时，通过尾静脉将血液采集在肝素化的红细胞微量压积毛细管中。然后从采集的血液提取血清，并且在Beckman肌酸酐分析仪2上按照制造商的说明书进行血清肌酸酐测量。结果显示接受媒介物处理的8只小鼠的组的平均血清肌酸酐测量为2.27mg/dL±0.0732，而接受PD0332991的9只小鼠具有1.74mg/dL±0.143的平均肌酸酐测量。药物处理组和媒介物处理组之间通过未配对的t-检验的比较表明显著差异，p-值为0.0062。手术之前7天还测量基线血清肌酸酐，并且媒介物处理组和药物处理组具有相似的平均肌酸酐水平，分别为0.050mg/dL和0.044mg/dL。见图5。
应当理解，在不脱离本发明公开的主题的范围的情况下可以改变本发明公开的主题的各种细节。此外，上述说明仅是出于例证目的而非限制性目的

Claims (13)

1.一种在细胞或组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的化合物，其中所述细胞或组织的特征在于损伤后的增殖是CDK4/6依赖性的。
2.一种在肾细胞或肾组织暴露于局部缺血和/或相关事件之前或之后缓解需要治疗的个体中的所述细胞或组织中源自局部缺血和/或相关事件的损伤的方法，所述方法包括向所述个体给药药学有效量的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)的化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中在所述个体暴露于所述局部缺血和/或相关事件之前、在所述个体暴露于所述局部缺血和/或相关事件的同时、或者在所述个体暴露于所述局部缺血和/或相关事件之后向所述个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述个体暴露于局部缺血和/或相关事件之后约24小时至约48小时之间向所述个体给药抑制CDK4和/或CDK6的化合物。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述抑制CDK4和/或CDK6的化合物为选择性CDK4/6抑制剂。
6.权利要求5的方法，其中所述选择性CDK4/6抑制剂是除CDK4和/或CDK6以外的细胞周期蛋白依赖性激酶的不良抑制剂。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是心脏手术，或者与低血压性发作相关的其他手术。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是给药用于CT扫描、幽门成形术和冠状动脉造影术的放射性造影剂。
9.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是与血容量减少和/或低血压时期相关的创伤。
10.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是给药减少肾血流的药物或物质，如阿司匹林、布洛芬、他克莫司和/或环胞素。
11.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是由动脉栓塞或者原位动脉或静脉血栓形成引起的急性组织局部缺血或梗死。
12.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是肠扭结的扭曲或者器官血流的其他短暂解剖学中断。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述诱发局部缺血的事件是植入肾移植受者之前的肾收获和/或转运。
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