CN103483454A

CN103483454A - 一种用于制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的融合蛋白

Info

Publication number: CN103483454A
Application number: CN201310155532.8A
Authority: CN
Inventors: 郑意端
Original assignee: Shenzhen's Yangsi (jing-River Point li 5) Bio Tech Ltd
Current assignee: Shenzhen's Yangsi (jing-River Point li 5) Bio Tech Ltd
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103483454B; CN102732481A

Abstract

本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。所示融合蛋白用于制备细胞因子诱导的杀伤细胞。本发明还提供了人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法及采用所述方法制得的细胞。

Description

一种用于制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的融合蛋白

技术领域

本发明涉及生物技术及医学领域。具体地，本发明涉及一种用于制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的融合蛋白以及所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法。

背景技术

肿瘤发病率从有癌症记录以来，一直呈上升的趋势，特别是过去二三十年以来，肿瘤发病率以每年3％-5％的速度增长。随着肿瘤发病率的增长，针对肿瘤的治疗方案也在不断发展，免疫治疗是其中一种重要的治疗手段，此种治疗手段对于清除肿瘤患者体内残留的和转移的肿瘤细胞、防止肿瘤的转移和复发及提高患者的生存率具有重要的意义。在免疫治疗方法中，细胞生物治疗已经初露锋芒，并成为肿瘤治疗的重要发展方向。继淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)后，细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer，CIK)的杀瘤作用日益受到重视。

CIK细胞最早于1991年由美国斯坦福大学Schmidt wolf等首次报道，他们发现在多种细胞因子（干扰素、CD3单克隆抗体、白介素1和白介素2）作用下，外周血淋巴细胞可以被定向诱导并大量增殖成为肿瘤杀伤细胞。由于此类细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，因此具有T细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞(NK)的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤等优点。与其他过继性免疫治疗细胞相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤范围广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点。因此，CIK细胞被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。

如何制得CIK细胞一直受到研究者的关注。Schmidt Wolf等使用常规密度梯度离心方法分离健康成人外周血，制备单个核细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml进行培养，于培养第1天在培养体系中加入1×10³U/ml的干扰素-γ (Interferon-gamma，IFN-γ)，培养24小时后加入3×10²U/ml的重组人IL-2、1×10²U/ml的重组人IL-1、50mg/ml的CD3单克隆抗体，以后每3天更换一次新鲜培养液并补充重组人IL-2，并调整细胞浓度至2×10⁸L^-1，以获得CIK细胞。郝希山、任秀宝等将纤连蛋白(Fibronectin，FN)的活性片段作为细胞因子添加到CIK细胞培养体系中，得到的细胞群中含有高比例的在细胞表面同时表达CD3、CD56分子的细胞。

CIK细胞体外大量增殖并获得强大的细胞毒活性与多种因素密切相关，这些因素包括细胞因子IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN和CD3单克隆抗体等。其中，IL-2是T细胞分泌的一种细胞因子（由133个氨基酸组成的多肽，相对分子质量约为15×10³），是人体免疫应答的核心物质，能促进所有亚型的T细胞增殖，是效应最强的细胞因子。虽然CIK细胞的体内杀瘤活性不依赖IL-2的存在，但在体外大量培养时，IL-2可促进CIK细胞增殖和杀伤活性。此外，CD3单克隆抗体(CD3McAb)，作为一种有丝分裂促进剂，可促进细胞增殖。在采自淋巴瘤患者外周血的CIK细胞中加入抗CD3单克隆抗体，并将其与多种淋巴瘤和白血病细胞株共孵育，可使得这些细胞株对于CIK细胞介导的溶细胞作用的敏感性明显增加。

纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种位于细胞外基质中的大分子糖蛋白，分子量约550KD。FN由成纤维细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞等合成并分泌，参与细胞黏附、迁移、凋亡、形态改变等过程，具有止血、损伤修复等功能。由于FN分子量大，全分子表达存在基因工程上的困难。因此人们试图表达FN功能多肽并研究其功能，以期代替FN。细胞与FN的连接由整联蛋白介导，主要是整联蛋白α5β1，又称极晚期活化抗原VLA-5，可识别FN细胞结合结构域I (Cell-I)的RGD序列；整联蛋白α4β1，即VLA-4，可以与细胞结合结构域II (Cell-II)的CSl及CS5结合；硫酸软骨素蛋白聚糖及CD44分子可与FN羧基端肝磷脂结合结构域(Heparin-II)结合。美国专利第5198423号中成功构建了含有FN三个关键结构域的质粒，并转入大肠杆菌HBl01/Pch102 (FERM BP-2800)。研究表明，含有FN三个关键的功能结构域，即细胞结合域(cellbinding domain)、肝磷脂域(heparin domain)和CS-l区域的多肽能够发挥FN的主要生理功能。该多肽可参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。在培养淋巴细胞时加入该多肽和抗CD3抗体，该多肽能够与静息状态的T细胞表面整合素家族成员VLA-4、VLA-5相结合，抗CD3抗体可与T细胞上的TCR结合，两者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，然后通过Ras途径刺激T细胞的增殖和分化。吸附在培养介质上的重组该多肽可以在CD3单克隆抗体的协同作用下刺激T细胞活化。

细胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)是介导细胞与细胞或细胞与外基质间相互接触和结合的膜表面糖蛋白。细胞间粘附分子-l (intercelIular ceIl adhesion molecule-l，ICAM-1)是一种重要的细胞粘附分子，它由Rothlein等于1986年在研究淋巴细胞粘附时发现。人ICAM-1基因定位于染色体19 P 13.3-13.2区，长15.5kb，含7个外显子和6个内含子。人ICAM-1为经由长3.3kb的可诱导的mRNA编码的单链糖蛋白，属免疫球蛋白超家族。由于糖基化程度不同，不同种类细胞的ICAM-1分子量有所不同：介于76-114kD，其中核心多肽的分子量为55KD。在结构上ICAM-1分为细胞外功能区、跨膜区和胞质区。细胞外功能区由483个氨基酸组成，含有5个免疫球蛋白(Ig)样功能区，每个Ig样区由一个单独的外显子编码。信号肽和跨膜区及胞浆区分别由两个不同的外显子编码。其膜外NH₂-端的第1、2功能区为淋巴细胞功能相关抗原-I (1ymphocyte functional antigen-1，LFA-1)的结合部位。第2和第3结构域之间有一段连接序列，富含脯氨酸，类似免疫球蛋白的绞链区、可发生扭曲。以此连接区为界，氨基端的I-II结构域可结合LFA-1分子和鼻病毒，而羧基端侧的III结构域可以结合巨噬细胞分亿抗原-1分子(Mac-1)。LFA-I是ICAM-l的主要受体。Mac-1与ICAM-1的亲和力较低，且在激活的白细胞上只有一小部分Mac-1（约10％)可介导ICAM-1粘附。ICAM-1的主要胞外功能结构域为NH₂段I-II结构域.经序列分析及文献检索，ICAM-1 N段Q28-T207的180个氨基酸为主要功能序列。在TC A M-1与LFA-1分子结合过程中发挥关键作用。

在现有的细胞免疫治疗方案中，淋巴细胞体外高效增殖过程十分关键，而其中如何提高外周血单个核细胞体外扩增效率依然是目前本领域尚待完善的问题；另一方面，CIK细胞中起到关键杀瘤作用的是CD3/CD56双阳性细胞，因此在提高细胞增殖数量的基础上，提高CD3/CD56双阳性性细胞的比例显得同样重要。现有技术得到的CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞的比例仅占总细胞数的10-30％，无法充分满足有效治疗的需要，因此需要寻找新的培养方法来提高CD3/CD56双阳性细胞的比例。

发明内容

针对现有技术中外周血单个核细胞体外扩增效率及CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例均偏低的问题，本发明的一个目的是提供一种能够用于制备CIK细胞的新型蛋白，该蛋白与CD3单克隆抗体组合使用，可以有效刺激淋巴细胞增殖，同时提高CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞的比例。本发明的另一个目的是提供该新型蛋白在培育细胞因子诱导的杀伤细胞中的用途。本发明的又一个目的是提供一种提高人体外周血单个核细胞体外扩增效率和CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例的制备人细胞因子诱导的杀伤细胞的方法以及采用此方法制得的CIK细胞。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。

优选地，所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-1功能结构域与人纤连蛋白功能结构域是通过柔性肽连接，优选为SEQ ID NO: l。

根据本发明的具体实施方式，所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。

另一方面，本发明提供所述融合蛋白在制备人细胞因子诱导的杀伤细胞中的用途。

又一方面，本发明提供一种人细胞因子诱导的杀伤细胞，所述杀伤细胞通过包括以下步骤的制备方法制得：在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前，用含有有效量的本发明的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶。并且，所述制备方法还包括以下步骤：在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中，在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体；并且所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

根据本发明的具体实施方式，所述制备方法包括：1）用有效量的重组ICAM-FN和人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，然后用该细胞培养瓶培养经分离得到的人外周血单个核细胞；2）在所述人外周血单个核细胞培养过程中，于细胞培养液中加入人CD3单克隆抗体进行持续刺激，且人CD3单克隆抗体在细胞培养液中的浓度小于所述包被液中的浓度；和3）检测由诱导人外周血单个核细胞得到的CIK细胞的各项指标；

优选地，在所述包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25μg/ml，优选浓度为10-15μg/ml，所述人CD3单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml，优选浓度为4-7μg/ml，最优选浓度为5μg/ml；在所述细胞培养液中，所述人CD3单克隆抗体的浓度为50-100ng/ml。

还一方面，本发明提供一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前，用含有有效量的本发明的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶。并且，所述制备方法还包括以下步骤：在所送人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中，在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体的步骤；且所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

根据本发明的具体实施方式，在所述包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25μg/ml，优选浓度为10-15μg/ml，所述人CD3单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml，优选浓度为4-7μg/ml，最优选浓度为5μg/ml；在所述细胞培养液中，所述人CD3单克隆抗体的浓度为50-100ng/ml。

实验证明，本发明提供的新型融合蛋白（命名为ICAM-FN），可以引入到细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，用于制备CIK细胞。并且，在该细胞培养过程中加入CD3单克隆抗体，使所述融合蛋白与CD3单克隆抗体共同作用，更好地刺激了淋巴细胞的增殖，同时提高CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例，从而使得外周血单个核细胞体外扩增效率是传统方法的1.3倍，所得CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例是传统方法的1.3-6倍，同时还提高了CD3/CD8双阳性细胞所占比例，增强了CIK细胞的杀瘤活性，方法杀瘤活性提高10-40％。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明构建的pColdII-ICAM-FN表达质粒；

图2为IPTG诱导前后及不同浓度IPTG诱导的BL21(DE)表达的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中各泳道如下：A：蛋白Marker，B：IPTG诱前阳性菌裂解液上清，C：0.1mM IPTG诱导3h后阳性菌裂解液上清，D：0.5mM IPTG诱导3h后阳性菌裂解液上清，E：1.0mM IPTG诱导3h后阳性菌裂解液上清；

图3为ICAM-FN融合蛋白表达的Western Blot检测结果，其中，泳道A：阳性菌裂解液上清；泳道B：空白对照菌裂解液上清；

图4为纯化后的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道A：纯化后的目的蛋白；泳道B：蛋白Marker；

图5为PI染色检测CIK细胞活率的流式细胞检测图谱，其中活细胞比率为98.47％;

图6为CIK细胞生长曲线；

图7为本发明的方法得到的CIK细胞与传统方法得到的CIK细胞的细胞表型流式细胞检测图谱比较，其中，A：传统方法得到的CIK检测结果；B：本发明的方法得到的CIK检测结果；

图8为本发明的方法得到的CIK细胞与传统方法得到的CIK细胞的杀瘤活性比较，其中，A：传统方法得到的CIK杀伤效率；B：本发明的方法得到的CIK杀伤效率。

具体实施方式

为了使本发明的目的/技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的实施方案中构建了人细胞间粘附分子-1功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白ICAM-FN，并在原核细胞中进行表达纯化。其中，所述人细胞间粘附分子-1功能结构域（ICAM-1）包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域（FN）包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。

并且，所述人细胞间粘附分子-1功能结构域（ICAM-1）和人纤连蛋白功能结构域（FN）通过柔性肽连接，以利用其柔性使融合的两个结构域ICAM-1和FN在空间上可自由伸展，避免了活性位点的相互掩盖。

优选地，所述柔性肽序列为GGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 1）。

优选地，所述含有柔性肽的人细胞间粘附分子-1功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白的的DNA序列为SEQ ID NO: 2。在所述融合蛋白的构建过程中，所述人细胞间粘附分子-1功能结构域的正向引物为P1（SEQ ID NO: 3），反向引物为P2（SEQ ID NO: 4）；所述人纤连蛋白功能结构域的正向引物P3（SEQ ID NO: 5），反向引物为P4（SEQ ID NO: 6），通过两步PCR法得到拼接到一起的目的基因序列SEQ ID NO: 2。

优选地，所述人细胞间粘附分子-1功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白于大肠杆菌中表达，大肠杆菌表达载体是分子生物学常用表达载体，具有成本较低，生长周期短的优点。

优选地，所述人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白的表达载体为pColdII，并采用低温诱导的方式表达，优选于15ºC诱导表达，以抑制大肠杆菌自身蛋白表达，便于目的蛋白的纯化。

本发明的实施方案采用提供的新型融合蛋白来培养细胞因子诱导的杀伤细胞，步骤包括：

1）用有效量的重组ICAM-FN和人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，并用该细胞培养瓶培养经分离得到的人外周血单个核细胞；

2）在该人外周血单个核细胞培养过程中，于细胞培养液中加入人CD3单克隆抗体进行持续刺激，且人CD3单克隆抗体在细胞培养液中浓度小于前述包被液中浓度，以达到最佳刺激效果；和

3）检测由诱导人外周血单个核细胞得到的CIK细胞的各项指标。

其中所述重组ICAM-FN的原核表达采用低温诱导的办法进行，以抑制大肠杆菌自身蛋白表达，便于目的蛋白的纯化。本发明的实施方案中重组ICAM-FN构建及表达过程中使用的分子生物学方法为常规的分子生物学方法，未详述的技术方案可从例如《分子克隆实验指南（第3版）》中获得。

因此，本发明的实施方案提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前用含有有效量的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶的步骤，和在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体的步骤；其中所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-1功能结构域和人纤连蛋白功能结构域融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结合域，所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

所述本发明的CIK细胞制备方法引入了融合蛋白ICAM-FN，对淋巴细胞进行更有效的刺激，并在细胞培养全过程中加入CD3单克隆抗体，以形成持续的刺激。经测得，该方法得到的外周血单个核细胞体外扩增效率是传统方法的1.3倍，得到的CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例为传统方法的1.3-6倍，同时提高了CD3/CD8双阳性细胞所占比例，因而增强了CIK细胞的杀瘤活性，提高了细胞免疫治疗的效果。

优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述细胞培养瓶的包被液中，所述融合蛋白浓度为5-25μg/ml，优选浓度为10-15μg/ml，所述人CD3单克隆抗体浓度为1-10μg/ml，优选浓度为4-7μg/ml，最优选浓度为5μg/ml。该实施例的优选浓度条件下，可得到最佳的刺激效果，有效提高细胞免疫治疗的效果。

优选地，本发明实施例的人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法中，所述细胞培养液中人CD3单克隆抗体浓度为50-100ng/ml。

以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细描述。

实施例1 融合蛋白的获得

1. 目的基因的获得

根据人的ICAM-1和FN基因序列，设计两对引物：人ICAM-l的正向引物P1，反向引物P2；人FN的正向引物P3，反向引物P4。并通过两步PCR获得目的基因序列。引物序列如下：

Pl：5’-CATCATCATCATCATCATATGCAGACATCTGTGTCCCC-3’ (SEQ ID NO:3)

GGTGTTCT-3’ (SEQ ID NO: 4)

GATTCAC-3’ (SEQ ID NO: 5)

P4：5’-AGACTGCAGGTCGACAAGCTTTTATGTGGAAGGAACATCCAA

GAT-3’ (SEQ ID NO: 6)

P1引物5’端引入NdeI酶切位点（下划线且斜体部分），P2引物5’端引入柔性肽GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1) cDNA的互补序列（加框部分），以含有人ICAM-1 cDNA序列的质粒（购自Origene）为模板，扩增人ICAM-1胞外第I、II结构域。P3引物5’端引入柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列（加框部分），P4引物5’端引入Hind III酶切位点（下划线且斜体部分），以美国专利第5198423号中构建的含有人FN三个关键结构域的质粒pCHl02为模板，扩增人FN的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1区域的基因序列。所得两段基因序列分别以ICAM和FN命名。

第一步PCR：按照常规PCR方法分别扩增两段目的基因，100μl PCR反应体系，各组分如表1所示：

表l

模板质粒	lμL
		PCR缓冲液(10×)	10μL
dNTP(2.5 mmol/μL)	8μL
		MgCl₂ (25 mmol/μL)	8μL
正向引物(20 pmol/μL)	2μL
		反向引物(20 pmol/μL)	2μL
Taq DNA聚合酶	1μL
		灭菌双蒸水	68μL

注：扩增ICAM时模板质粒为含有ICAM-1 cDNA序列的质粒，正向引物为P1，反向引物为P2，扩增FN时模板质粒为质粒pCH102，正向引物为P3，反向引物为P4。

加好样品后，涡旋混匀，瞬时离心，放入PCR仪扩增，反应条件为：

95 ºC，5 min；

94 ºC，60 s，56ºC，45 s，72 ºC，90 s，30个循环；

72 ºC延伸10 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

第二步PCR：以回收的两段目的基因ICAM、FN为模板，以P1、P4为引物，进行PCR反应，100 μl PCR反应体系，各组分如表2所示：

表2

第一步PCR后回收的ICAM、FN基因	各l μL
		PCR缓冲液(1 0×)	1 0 μL
dNTP (2.5 mmol/μL)	8 μL
		MgCl₂(25 mmol/μL)	8 μL
正向引物P1 (20 pmol/μL)	2 μL
		反向引物P4 (20 pmol/μL)	2 μL
Taq DNA聚合酶	1 μL
		灭菌双蒸水	67 μL

PCR反应结束后，检测并回收拼接好的目的基因片段，该目的基因片段包含ICAM-l胞外第I、II结构域，柔性肽(SEQ ID NO: 1)，FN的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1区域的基因序列，命名为YC-ICAM-FN。

2. 克隆载体的构建

（1）目的基因与克隆载体的连接

将目的基因YC-ICAM-FN与pGEM-T载体连接，构建pGEMT-ICAM-FN质粒，操作步骤依照pGEM®-T Easy Vector Systems（T载体）使用说明进行。

（2）克隆质粒的转化

CaCl₂法制备感受态细胞DH5α，热激法将连接好的pGEMT-ICAM-FN质粒转化至感受态细胞DH5α，通过蓝白斑筛选白斑菌株。

（3）阳性菌的PCR鉴定

将白斑茵在LB液体培养基中培养，用P1、P4引物对菌液进行PCR鉴定，PCR结束经琼脂糖凝胶电泳检测，具有目的基因条带的菌液为阳性菌液，目的基因片段大小在2300bp左右，保存菌种。

（4）质粒测序鉴定

阳性菌株扩大培养，使周高纯度质粒小量提取试剂盒提pGEMT-ICAM-

FN，操作步骤按照说明书进行。对质粒进行测序鉴定。

3. 表达载体pColdII-ICAM-FN的构建及ICAM-FN的表达

（1）目的基因及表达载体的获得

用内切酶NdeI、HindIII分别双酶切pGEMT-ICAM-FN质粒和表达载体pColdlI，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的基因条带及载体条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因及载体片段。

（2）目的基因与表达载体pColdII连接

将回收的目的基因YC-ICAM-FN及表达载体pColdII加入表3所示连接体系进行连接。

表3

YC-ICAM-FN	8μL
		表达载体pColdII双酶切产物	1μL
连接酶缓冲液(10×)	2μL
		T4 DNA连接酶	1μL
灭菌双蒸水	8μL

构建后的表达质粒pColdII-ICAM-FN图谱见图1。

（3）表达质粒的转化

采用CaCl₂法制备感受态细胞BL21(DE)，取连接产物20μl在无菌条件下加入到制备好的100μl BL21(DE)感受态细胞中，热激法进行转化。经氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性菌株。

（4）阳性菌的鉴定

挑选阳性菌株于LB液体培养基中培养，用引物P1、P4对菌液进行PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，具有目的基因条带的菌液为阳性菌液。阳性菌保存菌种。

（5）质粒测序鉴定

PCR阳性菌扩大培养，使用高纯度质粒小量提取试剂盒提取pColdII-

ICAM-FN，操作步骤按照说明书进行。对质粒进行测序鉴定。

（6）ICAM-FN的诱导表达

经测序鉴定的阳性菌接种至含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD600达到0.6时加入0.1-1mM的IPTG进行低温(15ºC)诱导表达。分别在诱导前和诱导3h时取样lml，用于目的蛋白表达的检测。

4. 目的蛋白的表达及鉴定

（1）样品处理

收集诱导前和诱导3h的菌液各lml，10000g，4ºC，离心5min收集细胞沉淀，菌体沉淀用80μl细菌裂解缓冲液(50mMPB，5mM EDTA，pH7.5)重悬，加入20μl 5×SDS—PAGE电泳上样缓冲液，充分馄匀，沸水浴10 min，12000g，4ºC，离心10 min，取上清备用。

（2）SDS-PAGE电泳

制备蛋白电泳的分离胶和浓缩胶，安装电泳装置，将处理好的样品及Marker上样，进行电泳。SDS-PAGE电泳结果见图2。如图2所示，目的蛋白的分子量约为83kD，目的蛋白以可溶蛋白的形式表达，在不同浓度的IPTG诱导下表达量不同。最终选用0.5mM，诱导3h作为目的蛋白表达的诱导条件。

（3）Western blot检测

按照上述（1）（2）处理未转入重组质粒的空白BL21(DE)菌液及转入重组质粒pColdII-ICAM-FN的阳性菌液各1ml，进行蛋白电泳，电泳结束，将蛋白转移至PVDF膜上，5mg/ml的脱脂奶粉室温封闭lh，加入抗His单抗4ºC进行孵育，单抗孵育结束，PBST洗膜3次，每次10min，再加入酶标羊抗鼠二抗37ºC孵育lh，PBST和PBS先后洗膜3次，ECL发光显色，暗室中显影定影，阳性菌对应孔道在分子量83kD处有条带，而空白对照菌孔道无相应条带，检测结果见图3。

5. 重组ICAM-FN的纯化

取转入重组质粒pColdII-ICAM-FN的阳性菌液10000g，4ºC，离心5min，弃掉上清，收集菌体，用细菌裂解缓冲液(50mM PB，5mM EDTA，DH7.5)重悬菌体，冰浴超声裂解菌体。超声条件：冰水浴，超声4s，间隔5s，4min/次，重复至菌液变澄清为止。将超声破碎后的菌体悬液12000g，4ºC，离心10min，收集上清液，上样，用Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白，先后用25和300mmol/L的咪唑进行洗脱。最后以pH7.5的PB进行透析，0.22μm的滤膜进行过滤除菌，4ºC保存备用。将纯化后的目的蛋白样品进行SDS-

PAGE检测，检测结果见图4，灰度值分析显示，纯化后的目的蛋白纯度在90%上。

实施例2 制备CIK细胞

1. CIK细胞的制备

（1）75cm²培养瓶的处理

用DPBS配制包被液，含人CD3单克隆抗体5μg/ml，实施例1得到的ICAM-FN融合蛋白10μg/ml。取包被液l0ml，加入到75cm²培养瓶中，4ºC避光放置过夜备用。

（2）单个核细胞的制备

获取新鲜外周血l00ml，离心(700g，20min)，离心后分为两层，上层为血浆，下层为血细胞。上层血浆经处理后，放置于4ºC保存备用。下层血细胞用DPBs稀释至100ml，周比重为1.077的淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS清洗两次，显微镜下观察计数，最后用含5％的上述制备的血浆、50ng/m1人CD3单克隆抗体的淋巴细胞培养液GT-T55l重悬细胞，调节细胞密度3×l0⁶个/ml。

（3）CIK细胞的诱导扩增

将（1）中包被过夜的75cm²培养瓶弃掉包被液，用l0ml DPBS轻轻漂洗一次，再用10ml GT-T551轻轻漂洗一次。将步骤（2）得到的细胞悬液加入该75cm²培养瓶，然后加入重组人干扰素-γ (INF-γ)，使INF-γ终浓度为1000IU/ml，置于37ºC、5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24h。然后分别加入：重组人白介素-1 (IL-1)，终浓度为1ng/ml；重组人白介素-2 (IL-2)，终浓度为1000IU/ml。之后每3天向该细胞培养瓶中补加细胞培养液，补加的细胞培养液含有GT-T551培养基、0.5%步骤（2）获得的血浆、1000IU/ml重组人白介素-2 (IL-2)及50ng/ml的人CD3单克隆抗体。

2. CIK细胞各项指标检测

（1）细胞增殖

分别于第0d、4d、8d、l 0d、12d对上述步骤1（3）中培养的细胞取样，进行细胞计数，绘制细胞增殖曲线。

（2）细胞活率检测

于第12d对上述步骤1（3）中培养的细胞经荧光染料PI（碘化丙啶）染色，通过流式细胞检测得到CIK细胞的活率。检测结果如图5所示。结果显示培养12d的CIK细胞活率达到98%以上。

（3）细胞表型检测

于第12d对上述步骤1（3）中培养的细胞进行淋巴细胞表型检测，检查CD3+/CD56+CIK细胞比例。具体方法如下：取两支流式管，分别标记为阴性对照管、样品检测管，每管加入培养的CIK细胞悬液，每管细胞数为1 × l0⁶个。1000rpm，离心5min，弃上清液，用3ml PBS重悬细胞，1000rpm，离心5min，弃上清。再用100μl PBS重悬细胞，在阴性对照管内加入同型对照抗体10μl，样品检测管内加入10μl CD3/CD56荧光抗体、5μl CD8荧光抗体，充分混匀，室温反应15min。反应结束，每管加入2ml PBS重悬细胞，1000rpm，离心5min，弃上清，重复洗涤细胞一次。最终用400μl PBS重悬细胞，用BDCalibur流式细胞仪进行检测。检测结果如图6所示。

（4）杀瘤活性检测

用荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)对CIK敏感的肿瘤细胞K562进行染色，与上述步骤1（3）中第12d得到的CIK细胞混合培养一段时间后，用PI进行染色检测，其中CFSE和PI双标记的细胞即为CIK细胞杀伤的肿瘤细胞。

对比实施例1 制备对照CIK细胞

步骤1-5同实施例1。

1. CIK细胞的制备

（1）75cm²培养瓶的处理

用DPBS配置包被液，其中含人CD3单克隆抗体5μg/ml，人FN活性片段10μg/ml。取包被液10ml，加入到75cm²培养瓶中，4ºC避光放置过夜，备用。

（2）单个核细胞的制备

获取新鲜外周血100ml，离心(700g，20min)，离心后分为两层，上层为血浆，下层为血细胞。上层血浆经处理后，放置于4ºC保存备用。下层血细胞用DBPS稀释至100ml，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS清晰两次，显微镜下观察计数，最后用含5%的上述制备的血浆、50ng/ml人CD3单克隆抗体的淋巴细胞培养液GT-T551重悬细胞，调节细胞密度3×10⁶个/ml。

（3）CIK细胞的诱导扩增

将（1）中包被过夜的75cm²培养瓶弃掉包被液，用10ml DPBS轻轻漂洗一次，再用10ml GT-T551轻轻漂洗一次。将步骤（2）得到的细胞悬液加入该75cm²培养瓶，然后加入重组人干扰素-γ (INF-γ)，使INF-γ终浓度为1000IU/ml，置于37ºC、5%CO₂饱和湿度培养箱中培养24h。然后分别加入：重组人白介素-1 (IL-1)，终浓度为1ng/ml，重组人白介素-2 (IL-2)，终浓度为1000IU/ml。之后每3天向该细胞培养瓶中补加细胞培养液，该细胞培养液含有GT-T551培养基、0.5%步骤（2）获得的血浆、1000IU/ml重组人白介素-2 (IL-2)及50ng/ml的人CD3单克隆抗体。

2. CIK细胞各项指标检测

CIK检测项目及操作步骤同实施例2中步骤2。

试验结果

（1）细胞增殖及活率检测

实施例2和对比实施例1中的细胞取样计数结果如表4所示。绘制细胞生长曲线，如图6所示。

表4

由表4及图6可看出，本发明的方法制备的CIK细胞平均增殖倍数是660±19.76；传统方法制备的CIK细胞平均增殖倍数526±18.40。本发明的方法制备的CIK细胞增殖活力明显高于传统方法，约为传统方法的1.3倍。

（2）细胞表型检测

细胞表型的流式细胞仪检测结果见图7。本发明的方法制备的CIK细胞表型结果为：T淋巴细胞（CD3+细胞）占细胞总数的98%以上。其中，CD3+/CD56+细胞比例为40-60%，CD3+/CD8+细胞比例为60-80%。传统方法制备的CIK中CD3+/CD56+细胞比例为10-30%，CD3+/CD8+细胞比例为40-65%。

（3）CIK细胞杀瘤活性

用BDCalibur流式细胞仪检测分别由本发明的方法（实施例2）和传统方法（对比实施例1）制备的CIK的杀瘤活性，检测结果见图8。本发明的方法制备的CIK细胞杀瘤率为70-80％，传统方法的CIK细胞杀瘤率为40-60％。

本发明提供的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法采用了本发明的新型融合蛋白，其显著增加了外周血单个核细胞体外扩增效率及CIK细胞中CD3/CD56双阳性细胞所占比例，同时也提高了CIK细胞中CD3/CD8细胞的比例，并增强了CIK细胞的杀瘤活性，从而提高了细胞免疫治疗的效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为人细胞间粘附分子-l功能结构域和人纤连蛋白功能结构域的融合蛋白，且所述人细胞间粘附分子-1功能结构域包含人细胞间粘附分子-1胞外第I、II结构域，所述人纤连蛋白功能结构域包含人纤连蛋白的细胞结合域、肝磷脂域和CS-1结构域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中人细胞间粘附分子-1功能结构域与人纤连蛋白功能结构域是通过柔性肽连接；

优选地，所述柔性肽氨基酸序列为SEQ ID NO: l。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白在制备人细胞因子诱导的杀伤细胞中的用途。

5.一种人细胞因子诱导的杀伤细胞，其特征在于，所述杀伤细胞通过包括以下步骤的制备方法制得：

在人细胞因子诱导的杀伤细胞的前体细胞培养前，用含有有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白和人CD3单克隆抗体的包被液包被细胞培养瓶。

6.根据权利要求5所述的杀伤细胞，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中，在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体；并且所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

7.根据权利要求5或6所述的杀伤细胞，其特征在于，所述制备方法包括：

1）用有效量的重组ICAM-FN和人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶，然后用该细胞培养瓶培养经分离得到的人外周血单个核细胞；

2）在所述人外周血单个核细胞培养过程中，于细胞培养液中加入人CD3单克隆抗体进行持续刺激，且人CD3单克隆抗体在细胞培养液中的浓度小于所述包被液中的浓度；和

3）检测由诱导人外周血单个核细胞得到的CIK细胞的各项指标；

8.一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：在所述人细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导及培养全过程中，在细胞培养液中添加人CD3单克隆抗体；并且所述人CD3单克隆抗体在所述细胞培养液中的浓度低于在所述包被液中的浓度。

10.根据权利要求8或9所述的杀伤细胞，其特征在于，所述制备方法包括：