CN103463632B - 牛羊肠毒血症的d型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，是利用D型产气荚膜梭菌菌种经过菌种复苏、增菌、培毒、灭活制备类毒素溶液；将类毒素溶液与白油佐剂乳化制得；使用时，对牛羊肌肉注射，每半年免疫一次，每次4ml,可有效的防止牛羊肠毒血症的发生。本发明根据该病的致病机理开发制备了效价全、免疫力强、针对性好、无毒副作用的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，用于动物的D型产气荚膜梭菌病的预防，控制D型产气荚膜梭菌病的流行。

Description

牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法

（一）技术领域

本发明涉及一种牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。

（二）发明背景

产气荚膜梭菌是人、畜消化道的正常菌群，广泛分布于自然界中，该菌能产生多种外毒素，目前已发现的外毒素达12种，其中α、β、ε和ι是主要的致死性毒素也是分型毒素，根据这四种毒素，产气荚膜梭菌分为A、B、C、D和E五个毒素型，每个毒素型均能感染人或畜禽引起特定的疾病。D型菌主要产生α、ε外毒素，能引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠等动物的肠毒血症。近年来黑龙江、青海、云南、宁夏等地均有D型菌导致牛肠毒血症的报道，成年牛和犊牛均有发生。除了感染畜禽外，D型菌引起国家珍稀动物肠毒血症例如上海动物园的国家二级保护动物青鹿的死亡。该病发病一般比较急、死亡率高、危害极大，要从根本上控制本病的传播，减少或避免给畜牧业生产带来的巨大经济损失，必须采取切实有效地预防措施。Mueller(1988)指出：“魏氏梭菌致病是由于它们形成分泌的毒素和代谢产物，无毒素产生就不会出现临床症状”；柴同杰(1999，2001)也提出同样的观点即产气荚膜梭菌感染导致的猝死症，是由于在某些应激条件下，这些病原菌在动物体内“爆炸性”繁殖，分泌产生的大量外毒素进入血液循环，导致肠源性毒血症，对组织器官发生毒害作用，造成快速死亡。根据上述致病机理，疫苗的预防重点也应当放在针对毒素引起的毒血症的免疫。应当在对魏氏梭菌外毒素研究的基础上研制类毒素疫苗魏氏梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。因此，根据魏氏梭菌的发病机理，制备D型魏氏梭菌毒素，将其灭活后做成类毒素疫苗，然后在此基础上制备抗毒素血清，用于畜禽预防和治疗，是能够达到确实可靠的免疫和治疗效果。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供给了一种牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。

一种牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，具体步骤如下:

(1)将D型产气荚膜梭菌菌种接种于5%绵羊血-1%葡萄糖-琼脂平板上，37℃厌氧（厌氧环境气体组成成分88%N₂、7%H₂、5%CO₂）培养36小时复苏；

（2）挑取复苏后的单个菌落接种于硫乙醇酸盐流体培养基FT45℃厌氧增菌10h；将FT增菌培养液按照接种量5%（体积比）接种厌氧肉肝汤，43℃厌氧培养6h；取厌氧肉肝汤菌液4℃10000r/min离心15min，蔡氏滤器过滤取上清得到毒素溶液；

（3）将毒素溶液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛使毒素溶液中甲醛浓度达到0.3%，充分振荡混匀，置37℃96h灭活，间隔5-6h振摇一次，即得类毒素溶液；

（4）将白油和Span-80按照94：6的体积比混合，再加入白油和Span-80混合液质量比2%的硬脂酸铝溶化混匀，121℃高压灭菌30分钟即为油相；取类毒素溶液，加入Tween-80s使Tween-80s在类毒素溶液中浓度达到2%,混匀，即为水相；将油相与水相按体积比1：1的比例乳化，乳化液中加入硫柳汞使硫柳汞终浓度为0.01%，即得牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗类毒素疫苗。

所述5%绵羊血-1%葡萄糖-琼脂平板成分为：1克葡萄糖、3.8克豆粉琼脂、5毫升绵羊血和100毫升去离子水；

使用时，对牛羊肌肉注射，每半年免疫一次，每次4ml,可有效的防止牛羊肠毒血症的发生。

有益效果

现在市场上预防牛羊肠毒血症疫苗都是灭活的全菌苗，对该病的流行有一定的控制作用，但也存在一些不足，由于灭活时甲醛浓度大，家畜接种反应较重。而本发明根据该病的致病机理开发制备了效价全、免疫力强、针对性好、无毒副作用的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，用于动物的D型产气荚膜梭菌病的预防，控制D型产气荚膜梭菌病的流行

（四）具体实施方式

实施例1牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗制备

菌种的复苏将D型产气荚膜梭菌种（NationalCollectionofTypeCultures英国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：NCTC8346）接种于5%绵羊血-1%葡萄糖-琼脂平板(1克葡萄糖、3.8克豆粉琼脂、5毫升绵羊血和100毫升去离子水)上，37℃厌氧（厌氧环境气体组成成分88%N₂、7%H₂、5%CO₂）培养36小时复苏；

细菌增菌挑取单个菌落接种于硫乙醇酸盐流体培养基（FT，购自青岛日水生物技术有限公司）45℃厌氧增菌10h后，取5mlFT增菌培养液加入到100ml厌氧肉肝汤（购自青岛日水生物技术有限公司）43℃厌氧培养6h，得到厌氧肉肝汤菌液；

毒素的制备将厌氧肉肝汤菌液4℃10000r/min离心15min，再用孔径0.22μm蔡氏滤器过滤取上清得到毒素溶液；

验证毒素α、ε的存在使用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测外毒素中存在α、ε；

毒素的灭活将上述毒素溶液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛使毒素溶液中甲醛浓度达到0.3%，充分振荡混匀，置37℃96h灭活，间隔5-6h振摇一次，即得类毒素溶液；

类毒素疫苗的制备将白油和Span-80按照94：6的体积比混合，再在白油和Span-80混合液中加入质量比2%的硬脂酸铝，使硬脂酸铝终浓度为2%，溶化混匀，121℃高压灭菌30分钟即为油相；在类毒素溶液加入Tween-80s使Tween-80s终浓度达到2%,混匀，即为水相；将油相与水相按1：1的体积比乳化，在乳化液中加入硫柳汞使硫柳汞终浓度为0.01%，即得类毒素疫苗。

实施2牛羊肠毒血症D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗效果检验

无菌检验硫乙醇酸盐培养基（T.G）用于厌氧性及需氧性细菌检验；酪胨琼脂（G.A）固体培养基用于需氧性细菌检验；葡萄糖蛋白胨汤（G.P）用于霉菌及腐生菌检验。类毒素脱毒过滤后，接种TG小管、GA斜面各两支，每支0.2ml,一支置25℃培养，一支置于37℃培养，另取0.2ml接种1支GP小管置25℃培养。均培养7日，无菌生长（主要参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》）

安全检验取1.5-2kg健康兔4只,分别肌肉接种5mlD型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，连续观察10天。观察无局部或全身异常反应（主要参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》）

绵羊的最小致死量（MLD）测定取6-12月龄、30-40kg的绵羊8只，2只一组，用4ml、8ml、12ml、16ml本发明制备的D型产气荚膜梭菌毒素溶液对绵羊进行静脉注射，观察24h.测的MLD为12ml。

免疫剂量确定取6-12月龄、30-40kg绵羊8只，每2只为一组(每组分别肌肉注射2ml、4ml、6ml、8mlD型产气荚膜梭菌类毒素疫苗)，21天后再均用一个MLD的产气荚膜梭菌毒素溶液进行静脉接种攻毒，观察72h，记录发病死亡情况。注射2ml的免疫组绵羊一只发病、一只死亡，4ml、6ml、8ml的免疫组绵羊无发病。因此免疫剂量为4ml。

效力检验用1-3岁的绵羊18只，分成3组，每组6只，其中每组的4只肌肉注射D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗4ml/只，另2只不注射疫苗作为对照。接种21天后，每组每只绵羊再注射1个MLD（12ml）的D型产气荚膜梭菌毒素溶液。对照组的绵羊全部死亡，注射疫苗的绵羊死亡一只，其余全部存活。

类毒素疫苗的抗体消长规律取6-12月龄、30-40kg左右的绵羊(未进行过魏氏梭菌菌苗免疫)4只，三只各肌肉注射4ml制备的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，一只肌肉注射相同剂量的生理盐水作为对照。分别于注射后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、17周、20周、22周、24周对四只绵羊进行颈静脉采血，应用间接ELISA试验检测其血清中的α、ε毒素抗体效价。根据测的抗体效价可知有效保护周期为6个月。

Claims (1)

1.一种牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗，其特征在于通过以下制备方法得到:

1)将D型产气荚膜梭菌菌种接种于5％绵羊血-1％葡萄糖-琼脂平板上，37℃厌氧培养36小时复苏；

2)挑取复苏后的单个菌落接种于硫乙醇酸盐流体培养基FT45℃厌氧增菌10h；将FT增菌培养液按照接种量5％体积比接种厌氧肉肝汤，43℃厌氧培养6h；取厌氧肉肝汤菌液4℃10000r/min离心15min，蔡氏滤器过滤取上清得到毒素溶液；

3)将毒素溶液用1MNaOH调pH至7.2，然后加入甲醛使毒素溶液中甲醛浓度达到0.3％，充分振荡混匀，置37℃96h灭活，间隔5-6h振摇一次，即得类毒素溶液；

4)将白油和Span-80按照94：6的体积比混合，再加入白油和Span-80混合液质量比2％的硬脂酸铝溶化混匀，121℃高压灭菌30分钟即为油相；取类毒素溶液，加入Tween-80s使Tween-80s在类毒素溶液中浓度达到2％,混匀，即为水相；将油相与水相按体积比1：1的比例乳化，乳化液中加入硫柳汞使硫柳汞终浓度为0.01％，即得牛羊肠毒血症的D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；

所述5％绵羊血-1％葡萄糖-琼脂平板成分为：1克葡萄糖、3.8克豆粉琼脂、5毫升绵羊血和100毫升去离子水。