CN103451193B - 欧美杨PdHSP70基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个欧美杨（Populus deltoides×Populus nigra）的逆境相关基因PdHSP70，该基因在植物抗盐过程中有重要作用，本发明将提供的HSP基因命名为PdHSP70，其具有与序列表中的SEQ ID NO：3所示的碱基序列。本发明的抗逆相关基因PdHSP70在构建到表达载体pCAMBIA1304中时，在其转录起始核苷酸前加上启动子，同时加入可选择标记GFP以便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，携带有本发明的逆境相关基因PdHSP70的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，用于培育抗盐的植物品种；本发明所述的基因在培育抗盐植物中具有广泛的应用前景。

Description

欧美杨PdHSP70基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来自欧美杨（Populus deltoides×Populusnigra）的PdHSP70基因及其应用。

背景技术

欧美杨（Populus deltoides×Populus nigra）是中纬度地区最适合种植的短轮伐期工业用材集约经营树种之一。近年来我国引进了许多优良的欧美杨无性系用于营造大面积的速生丰产林并取得很好的经济和社会效益。但高盐等限制了其进一步的推广。因此，要将其引入高盐缺水地区时，筛选和培育抗盐的品系是前提。随着分子生物学的发展，利用分子生物学技术研究欧美杨抗盐分子机制已成为解决这一问题的重要途径，目前已有多个基因被发现与提高杨树的抗逆性有关。热激蛋白（heat shock protein,HSP）作为转录因子在真核生物中普遍存在，在植物中参与种子成熟、花的发育、抗逆与抗病虫的防卫反应。近年来多种植物的HSP基因被广泛研究，但该基因在欧美杨的研究还未见报道。

发明内容

本发明为解决现有技术中存在的上述问题，提供欧美杨中一种与逆境相关的bZIP基因，该基因在欧美杨中克隆，是HSP基因家族的一员，命名为PdHSP70。其在抗盐反应中具有重要作用。

本发明公开的欧美杨（Populus deltoides×Populus nigra）逆境相关基因PdHSP70，它具有如SEQ ID NO：3所示的碱基序列。其序列由1968个碱基组成，自5’端第1到第1948位残基为该基因的开放阅读框序列，其表达受到盐胁迫的诱导。

本发明的另一方面在于公开上文所述基因，具有如SEQ ID NO：3所示的碱基序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：3编码的蛋白具有相同活性的碱基序列；或者是与SEQ ID NO：3具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的碱基序列。

本发明的另一方面在于公开上文所述基因的扩增引物，具有如SEQ ID NO：1～2所示的碱基序列。

本发明的另一方面在于公开上文所述欧美杨（Populus deltoides×Populus nigra）的PdHSP70基因编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸残基序列，其是有656个氨基酸残基组成的蛋白质。

本发明的另一方面在于公开上文所述蛋白质的衍生蛋白质，其特征在于：具有如SEQ IDNO：4所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNO：4编码的蛋白具有相同活性的氨基酸残基序列。

本发明的另一方面在于公开含有上文所述基因的表达载体。本发明所提供的抗逆相关基因PdHSP70，使用一种可以引导外源基因在植物表达中的表达载体转化植株，可获得对干旱胁迫抗逆性增强的转基因植株。优选的情况下，所述表达载体为质粒pCAMBIA1304。本发明的抗逆相关基因PdHSP70在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导性启动子均可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。携带有本发明的逆境相关基因PdHSP70的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，用于培育抗盐的植物品种。

本发明的另一方面在于公开一种含有本发明上文所述基因的细胞系。在优选的技术方案中，上文所述细胞系为大肠杆菌Top10细胞或农杆菌EH105细胞。

本发明的另一方面在于公开上文所述的基因在培育抗盐植物中的应用。所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。本发明实施例中列举了农杆菌介导的拟南芥转化方法，并获得了转基因植株，试验结果有力的证明了转PdHSP70基因拟南芥具备更强的耐盐能力。

本发明的创新特征是：本发明成功的扩增了正碱性亮氨酸拉链(basic-domainleucine-zipper，bZIP)转录因子PdHSP70基因，其可以显著提高下游抗逆基因的表达进而可广泛用于杨树抗盐品种的培育等领域。

附图说明

图1为PdHSP70基因的表达示意图，其中：横坐标为时间（0、2、4、6h），纵坐标为相对表达量，从图示结果可以看到PdHSP70基因在盐胁迫下表达量显著提高，且在不同时间点表达量不一致。此结果证明PdHSP70基因在盐胁迫被诱导表达。

图2为PdHSP70基因电泳图，其中：1是PdHSP70基因的电泳条带；M是DNA marker DL2000，从图示结果显示通过PCR扩增，可以得到欧美杨PdHSP70基因的全长（对照DNA marker，电泳条带大小为1968bp），此结果证明PdHSP70基因片段长度是正确的。

图3为菌液PCR法筛选重组质粒，泳道1-8是用PdHSP70基因阳性克隆的结果；M是DNA marker DL2000，从图示结果显示PdHSP70基因已成功连接到pCAMBIA1304表达载体上（对照DNA marker，电泳条带大小为1968bp）。

图4为测定叶片的最大光化学效率结果图。在200mmol·L^-1NaCl处理48h后，野生型和转基因株系的最大光化学效率都降低了，但转基因株系的最大光化学效率相对野生型降低较少。其中野生型的最大光化学效率降低了62.5%，T₂-1降低了56%，T₂-6降低了37.5%，T₂-10降低了40%。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

试验中使用试剂如T4-DNA连接酶、大肠杆菌感受态Top10、pGEM-T克隆载体以及DNA凝胶回收试剂盒均购自天根生物公司，ExTaq酶及RNA反转录试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)工程公司，常用试剂购自拜尔迪公司。PCR仪购自Biometra，离心机购自SIGMA公司，紫外凝胶成像仪购自Bio-rad公司，超低温冰箱购自三洋公司，引物合成和测序由北京六合华大基因公司完成。

本发明使用的试验方法中，如无特殊说明，均为本领域技术人员的公知常识，各种缓冲溶液，检测试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得或者由常规实验方法制备获得。

实施例1总RNA的提取

一.本发明所用欧美杨107材料取自河北保定，是一年生插条扦插于北京林业大学苗圃培养，扦插后为保持土壤湿润每三天浇一次透水，待长出新叶后，将长势类似的（生长3个月）欧美杨苗用250mM NaCl喷洒处理，并分别在0、2、4、6h摘取顶端叶置于液氮中，然后在-80℃超低温冰箱中保存备用。用于进行总RNA的提取和cDNA的合成。

二.利用CTAB方法从250mM NaCl胁迫的欧美杨叶片中提取总RNA的流程：

(1)提取RNA前在2×CTAB缓冲液中加入0.1mM终浓度的DTT，65℃预热。

(2)将0.5g液氮研磨好的材料置于2mL的Eppendorf管中，加入900μL预热的提取缓冲液，充分摇匀，65℃水浴15min，期间震荡2-3次。

(3)将Eppendorf管取出冷却至室温，加三氯甲烷900μL，振荡10min。4℃，12000r.min^-1离心15min。

(4)取约600μL上清，加等体积的三氯甲烷振荡6min。4℃，12000r.min^-1离心15min。

(5)取约400μL上清，加1/4体积即100μL的LiCl溶液，轻轻混匀，-20℃放置3h。取出，4℃，12000r·min^-1离心15min。

(6)弃上清，然后加70%乙醇700μL、500μL分别洗涤2次。完全吸掉乙醇，室温吹干后溶于20～30μLddH₂O中备用。

三.以上述方法获得的叶片总RNA为模板，使用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒使用说明书的操作进行反转录，合成cDNA第1链，作为模板用于荧光定量PCR或PCR扩增的分析。

实施例2利用荧光定量PCR法检测欧美杨PdHSP70基因在逆境中的表达

根据欧美杨PdHSP70基因的保守序列，设计特异引物上游引物：PdHSP701（SEQ ID NO.1）和下游引物：PdHSP702（SEQ ID NO.2）。

引物名称	序列名称	碱基序列（5’--3’）
			PdHSP701	SEQ ID NO.1	AGAATGCGGT CGTTACGGTG CCTGCTT
PdHSP702	SEQ ID NO.2	ACTTTGGGGA TTCTTGTTGA ACCAC

将按实施例1方法，分别在0、2、4、6h摘取顶端叶所制备的cDNA样品，以其作为模板，以PdHSP701（SEQ ID NO.1）和PdHSP702（SEQ ID NO.2）为引物，分别进行荧光定量PCR分析。

所述荧光定量PCR反应体系(20μL)：

荧光定量PCR反应共分为三步，分别是：变性阶段，循环阶段，解链曲线阶段，具体反应步骤为：95℃10min；95℃15s；60℃1min（共40个循环）；95℃15s；60℃1h；95℃15s。

结果如图1PdHSP70基因的表达示意图所示，其中：横坐标为时间（0、2、4、6h），纵坐标为相对表达量，证明在250mM NaCl胁迫处理时，PdHSP70基因被诱导表达明显，当处理4h时表达量达到最大值，约为对照值的6倍。

实施例3利用PCR法克隆欧美杨PdHSP70基因

根据欧美杨PdHSP70基因的保守序列，设计特异引物上游引物：PdHSP701（SEQ ID NO.1）和下游引物：PdHSP702（SEQ ID NO.2）。

引物名称	序列名称	碱基序列（5’--3’）
			PdHSP701	SEQ ID NO.1	ATGGCATCAA AGCCCGAAGG CAAATTCATT
PdHSP702	SEQ ID NO.2	TCAATCAACT TCCTCAATCT TAGGTCCG

以实施例1所述方法制备合成的cDNA作为模板，以PdHSP701（SEQ ID NO.1）和PdHSP702（SEQ ID NO.2）为引物，进行PCR反应；

所述PCR反应体系为（25μl）：

所述PCR反应程序如下：95℃预变性5min后进行35个循环，每个循环为95℃变性50s，63℃退火90s，72℃延伸2min，最后，样品在72℃延伸10min。将获得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对1968bp大小的目标条带进行割胶，利用试剂盒完成纯化回收，送测序公司测序。测序结果如SEQ ID NO.3，其对应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.4。

实施例4欧美杨PdHSP70基因表达载体的构建

将实施例2获得的PdHSP70基因片段与pMD18-T Vector连接，将此连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞、提取质粒，利用引物PdHSP701（SEQ ID NO.1）和PdHSP702（SEQID NO.2）进行PCR和酶切检测，筛选出正向插入的阳性克隆，命名为pMD18-T-PdHSP70阳性克隆，用BglII和SpeI限制性内切酶同时对pMD18-T-PdHSP70和pCAMBIA1304进行酶切并连接，将连接获得的阳性克隆转化EH105农杆菌(购自大连宝生物公司)中。具体操作步骤如下：

一.转化大肠杆菌（即将PdHSP70基因片段与pMD18-T Vector的连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞）

（1）从超低温冰箱中取出大肠杆菌TOP10感受态细胞置于冰上融化；

（2）用提前冷却的无菌吸头将细胞悬液分装到新的预冷的离心管中，分装量为每管50μl；

（3）向离心管中加入连接产物10μl的pMD18-T-PdHSP70，轻旋混匀，冰上放置30min；

（4）将离心管放到42℃水浴锅中热激90s，不要摇动；

（5）快速将离心管放到冰上，使细胞冷却2-3min；

（6）在超净工作台上向每管中加入500μl灭菌的LB培养基，置于37℃摇床上，180rpm，振荡培养45min；

（7）取30μl X-gal均匀涂抹于含有卡那霉素的LB琼脂培养基上；

（8）待X-gal完全吸收后，取120μl已转化的感受态细胞转移到含有卡那霉素的LB琼脂培养基上，用涂布器轻轻将细胞均匀涂开；

（9）将平板放置在室温下几分钟使液体被培养基完全吸收；

（10）倒置平板，于37℃下培养12-16h；挑取大肠杆菌阳性克隆，利用引物PdHSP701（SEQ ID NO.1）和PdHSP702（SEQ ID NO.2）进行PCR鉴定（PCR体系如实施例3），将获得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对目标条带进行割胶，利用试剂盒完成纯化回收，并送上海生工生物公司测序。测序结果与SEQ ID NO.3一致，从而证明目的基因PdHSP70转化大肠杆菌TOP10中。

二.提取质粒操作步骤如下：

（1）取含表达载体pCAMBIA1304菌液（购自上海北诺生物科技有限公司）和上述方法一制备的转化完大肠杆菌的目的基因PdHSP70的菌液各5mL，12000rpm室温离心30s收集菌体，尽量吸除上清；利用天根质粒小提中量试剂盒进行以下操作。

（2）向离心管中加入500μL溶液P1，剧烈震荡使菌体完全破碎；

（3）向离心管中加入500μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分溶解，此时溶液变清亮；

（4）向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时离心管中会出现白色的絮状沉淀；

（5）将混匀的上述溶液在12000rpm室温离心10min；

（6）向吸附柱CP4中加入500μL平衡液BL，12000rpm室温离心1min，倒掉收集液，将吸附柱放回收集管中；

（7）将上清用移液器分次转入吸附柱CP4中，12000rpm离心1min；

（8）向吸附柱中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，然后倒掉收集液，将吸附柱重新放回收集管中；

（9）向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集液，将吸附柱重新放回收集管中；

（10）向吸附柱中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集液，将吸附柱重新放回收集管中；

（11）将离心管放在离心机中12000rpm空离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；

（12）将收集管放入一个干净的1.5mL的离心管中，37℃培养箱中开盖放置10min，目的是使酒精完全挥发干净；

（13）向收集管中加入50μL的去离子水，静置2min，12000rpm离心2min，收集质粒pMD18-T-PdHSP70和pCAMBIA1304备用。

三.用BglII和SpeI限制性内切酶同时对按步骤二方法提取的质粒pMD18-T-PdHSP70和pCAMBIA1304进行酶切并连接，酶切及连接操作步骤如下：

（1）酶切体系（20μl）

酶切反应温度为37℃，酶切时间为4-6h。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。PdHSP70基因酶切结果电泳图，如图2：其中的泳道1是用BglII和SpeI限制性内切酶同时对质粒酶切的结果；泳道M是DNA marker DL2000，从图示结果显示通过双酶切，可以得到欧美杨PdHSP70基因的全长（对照DNA marker DL2000，电泳条带大小为408bp），此结果证明PdHSP70基因片段成功连接到克隆载体pCAMBIA1304上。

（2）连接体系（10μl），16℃反应10h。

质粒pMD18-T-PdHSP70酶切获得的回收产物       4μl

Ligation SolutionⅠ                         5μl

pCAMBIA1304酶切后的回收产物                 1μl

四.方法三获得的连接产物的PCR检测

将由方法三获得的连接产物按照热激法转化大肠杆菌感受态细胞Top10，转化产物涂布在含有100mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃培养约12时后，挑取白色单菌落，用菌液PCR法筛选重组质粒，结果如图3，泳道1-9是用PdHSP70基因阳性克隆的结果；M是DNA markerDL2000，从图示结果显示PdHSP70基因已成功连接到pCAMBIA1304表达载体上（对照DNAmarker，电泳条带大小为1968bp），将鉴定出的阳性克隆送北京六合华大基因公司进行DNA序列的测序，筛选测序结果正确的阳性克隆。表达载体命名为

pCAMBIA1304-35S:PdHSP70:GFP。

本发明制备的表达载体pCAMBIA1304-35S:PdHSP70:GFP，可以通过多种方法转化植物宿主，可以培育抗盐的植物品种。所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。

本发明制备了表达载体pCAMBIA1304-35S:PdHSP70:GFP及其转化大肠杆菌Top10细胞的阳性克隆，从而在抗逆相关基因PdHSP70转录起始核苷酸前加上35s强启动子和GFP荧光探针，从而使得其在制备对干旱胁迫抗逆性增强的转基因植株中（例如：杨树抗盐品种的培育等）有广泛的应用前景，且能够便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选。

实施例5欧美杨PdHSP70基因的功能验证

一.含有植物表达载体的EH105农杆菌的制备，操作步骤如下：

（1）挑取农杆菌EH105菌落并接种于5mlYEB液体培养基（含利福平Rif80mg/L）中，200r/min，28℃振荡培养过夜；

（2）取2ml菌液接种到50mlYEB液体培养基（含利福平Rif80mg/L）继续培养直至OD600=0.5，冰浴30min；

（3）每次取2.5ml离心，共离心两次，条件为4℃，5000r/min，10min，弃去上清，收集菌体；

（4）用10ml预冷过的浓度为0.15mol/L NaCl溶液悬浮、收集菌体；

（5）再用1ml预冷过的浓度为20mmol/L CaCl2溶液重悬菌体；

（6）以每管200μl的菌液进行分装到1.5ml离心管中(冰上操作)，液氮速冻1min后放置-80℃备用；

（7）取感受态细胞在冰上慢慢融化；

（8）取20μl的pCAMBIA1304-35S:PdHSP70:GFP质粒DNA加入到200μl农杆菌感受态细胞中，充分混匀后冰浴30min；

（9）然后在液氮中速冻1min后，迅速置于37℃水浴保温5min，然后再冰浴2min；

（10）加入800μl空YEB液体培养基，200r/min，28℃，培养4-5h；

（11）12000r/min，室温离心30s，去除部分上清；

（12）将收集的菌体均匀的涂布在YEB固体选择培养基（卡那霉素和利福平）上；

（13）在28℃黑暗条件下培养2-3d，获得含有植物表达载体的EH105农杆菌。

二.农杆菌介导的拟南芥转化，具体方法如下：

（1）制备转化悬浮液，500ml蒸馏水中加入25g蔗糖，使蔗糖的浓度为50g/l，高压灭菌，转化前向转化悬浮液中加入MES0.25g，Silwet L-77100μl。

（2）转化前一天给拟南芥(植物来源于北京林业大学尹伟伦院士实验室)浇足水，将果荚剪掉。

（3）从-80℃冰箱中取出按照步骤一方法制备的、含有植物表达载体的EH105农杆菌，接种于YEB固体培养基（加入100mg/L Km80mg/L Rif）上，28℃，暗培养36-48h。

（4）挑取单菌落，接种于的5ml YEB（含有100mg/L Km80mg/L rif）中，置于摇床上，转速200r/min，28℃，暗培养36-48h。

（5）取5ml菌液加入到500mlYEB培养基中，置于摇床上，转速200转/min，28℃，暗培养，培养至对数生长期，OD₆₀₀为0.8-1.5。

（6）将菌液置于50mL无菌离心管中，5000转/min，离心15min。

（7）除去液体，将离心沉淀的菌体用悬浮液进行悬浮，振摇混匀，待悬浮的菌液OD₆₀₀为1.0-1.5时用于转化。

（8）将拟南芥花器浸入农杆菌悬浮液中约2min，掸掉过多的菌液，并用滤纸吸附，然后用保鲜膜将拟南芥植株包裹保湿，植株平放于黑暗处24h。

（9）24h后置于人工气候室中培养，2-3d后将保鲜膜去除，用木棍支撑下垂的枝条，注意保持土壤湿润，按正常规律浇水。

（10）种子成熟后，即为T1种子，将拟南芥地上部分剪下，捋下果荚，过细目筛去除果皮等杂质，放入37℃烘箱3-4d干燥，然后置于4℃冰箱保存。

三.卡那霉素抗性筛选

利用上述步骤二的方法，将农杆菌介导转化拟南芥后，将获得的转基因植株放入人工气候箱里培养。待其结种子后，收获T1种子，用70%酒精消毒5min，再用2.6%的次氯酸钠消毒10min，最后用灭菌水冲洗3—4次，再接种至1/2MS筛选培养基中（卡那霉素浓度为60mg/ml），进行抗生素筛选，置于光照培养箱，控制温度25℃/15℃（昼/夜），光照时间为16h/8h（昼/夜），培养2周，筛选出具有卡那抗性的转基因拟南芥。获得的T2代（T2-3、T2-6、T2-14）作为后续生理指标最大光化学效率（Fv/Fm）检测的材料。

四.最大光化学效率（Fv/Fm）检测

以生长60d的T2代3个株系和野生型（wild type，WT）拟南芥为材料并以200mmol·L-1NaCl处理，采用英国PP Systems公司生产的CIRAS-2便携式光合作用测定系统，在室温（25℃）和大气CO2浓度下测定叶片的最大光化学效率（Fv/Fm），光强为800μmol·m-2·s-1，每个处理测定3次重复，结果如下表和图4所示：

	对照（contral）Fv/Fm	盐处理（200mmol·L-1NaCL）Fv/Fm
			野生型（wild type）	0.8	0.3
T2-3	0.8	0.35
			T2-6	0.8	0.5
T2-14	0.8	0.4

在200mmol·L^-1NaCl处理48h后，野生型和转基因株系的最大光化学效率都降低了，但转基因株系的最大光化学效率相对野生型降低较少。其中野生型的最大光化学效率降低了62.5%，T₂-1降低了56%，T₂-6降低了37.5%，T₂-10降低了40%。试验结果有力的证明了转PdHSP70基因拟南芥具备更强的耐盐能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围不仅限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.欧美杨（Populus deltoides×Populus nigra）的PdHSP70基因，其特征在于：为SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

2.一种扩增权利要求1所述基因的引物，为SEQ ID NO：1~2所示的碱基序列。

3.如权利要求1所述基因编码的蛋白质，为SEQ ID NO：4所示的氨基酸残基序列。

4.含有权利要求1所述基因的表达载体。

5.含有权利要求1所述基因的细胞系，其特征在于：所述细胞系为大肠杆菌Top10细胞或农杆菌EH105细胞。

6.权利要求1所述的基因在培育杨树抗盐品种中的应用。