CN103439399B - 一种甲胎蛋白标准物质定值的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种甲胎蛋白标准物质定值的方法，甲胎蛋白是一种肝癌肿瘤诊断标志物，在临床诊断、疾病筛查中具有重要意义。甲胎蛋白标准物质是量值的载体，是实现溯源体系的关键要素，是保证测量结果在时间和空间上的准确性和可比性的重要基础，也是实现有效测量即准确、可比、可溯源测量的根本保证。但是对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种甲胎蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
Description
技术领域
本发明涉及一种标准物质的定值方法，尤其是一种肝癌肿瘤诊断标志物甲胎蛋白的标准物质定值方法。
背景技术
对通过均匀性、稳定性检验合格样料的特性值进行测量，在标准物质技术领域称为表征化(原文为characterize，即对材料特性进行测量)；由计量权威部门对表征化获得的样料特性的量值进行计量学溯源性(以下简称溯源性)确认和相应测量不确定度评定合理性确认，在标准物质技术领域称为定值(原文为certify，即对测量获得的结果进行认证确认，在其它技术领域一般称为认证)。因此，对有证标准物质的定值，实际上应分为两步：首先是对经过均匀性、稳定性检验合格的样料特性值进行测量，也就是表征化；然后是对测量结果的溯源性和测量不确定度评定的合理性进行有效性确认。
甲胎蛋白是人胚胎期血清中的主要蛋白成分，它是一种糖蛋白，相对分子质量约70000。在正常的情况下，这种蛋白主要来自于胚胎的肝细胞。在胎儿出生大约两周后，甲胎蛋白会从血液中消失，所以正常人的血清中甲胎蛋白的含量不足20μg/L。当肝细胞发生癌变时，会恢复产生这种蛋白的功能，并且它在血清中的含量会随着病情的恶化而急剧增加，因此甲胎蛋白就成为诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。另外，它在睾丸非精原生殖细胞肿瘤及卵巢生殖细胞肿瘤等患者血清中亦可出现不同程度的升高，因此甲胎蛋白作为一种重要的肿瘤标志物应用于临床检测。
甲胎蛋白检验结果的准确性直接影响着肝癌等疾病的诊断、治疗及预防，因此，得到准确且具有跨时空可比性的临床检验结果，是防病治病和提高人类健康水平的基本需要。而实现检验结果准确的最有效方法是建立和保证检验结果的溯源性。因此实现蛋白质含量测定结果溯源到SI单位是蛋白质计量追求的最终目标之一。标准物质是量值的载体，是实现溯源体系的关键要素，是保证测量结果在时间和空间上的准确性和可比性的重要基础，也是实现有效测量即准确、可比、可溯源测量的根本保证。在实际检测工作中，一般是由试剂厂家来提供校准品,这使得不同厂家产品对同一样本检测结果不一致,而且对于其标准物质定值是否准确的研究现在还很少。目前甲胎蛋白没有标准物质与相关的检测参考方法，这使得甲胎蛋白检测的标准化还无法实现。由此可见，为了保证甲胎蛋白分析检测结果的准确性和可比性，研制甲胎蛋白标准物质，对于其检验的标准化具有重要的意义。
发明内容
本发明所解决的技术问题是填补上述技术空白，提供一种甲胎蛋白标准物质定值的方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。
本发明采用的技术方案是：以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对甲胎蛋白标准物质进行准确定量。
本发明所述的方法，具体步骤可以为：
（1）取甲胎蛋白标准物质20μL于安瓶中，稀释10倍，按约1:1的比例分别加入亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标记溶液，真空干燥；
（2）加入800μL6mol/L的HCl，混合均匀后通氮除氧密封，在110℃烘箱中进行水解，每隔12小时涡旋混匀一次；水解48小时后取出，氮气吹干，用含有0.1%盐酸的水溶液复溶，溶液经过0.22μm滤膜过滤后上质谱仪测定；
（3）根据质谱所得目标样品与同位素标记氨基酸的比例及配制标准氨基酸与内标氨基酸比例的标准曲线；计算溶液中蛋白含量，根据蛋白的分子量计算每20μL溶液中甲胎蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
本发明所述的方法，所述步骤（1）中甲胎蛋白标准物质的制备过程为：配制pH7.7Tris缓冲液，用于溶解经过纯化的甲胎蛋白，配制浓度为1mg／甲胎蛋白溶液；将甲胎蛋白溶液分装至尖底冻存管中，每只冻存管中分装20μL溶液，分装好的标准物质在-80摄氏度冰箱中冷冻保存。
采用上述技术方案，本发明可以达到的技术效果是：
（1）采用同位素稀释质谱基准方法对甲胎蛋白含量进行测定，保证了定值结果的准确。
（2）在采用同位素稀释质谱法对标准肽段定量时同时选用多个氨基酸定量结果的平均值；在采用同位素稀释质谱法对甲胎蛋白定量时，同时选用四种同位素标记氨基酸内标定量结果的平均值，提高了定值结果的可靠性。
（3）标准物质定值结果可最终溯源到SI单位。
（4）采用pH7.7的Tris缓冲液用于溶解经过纯化的甲胎蛋白，制备甲胎蛋白标准物质，提高了甲胎蛋白溶解度，保证了标准物质的均匀性。
附图说明
图1是电泳结果图；
图2是不同水解时间上机测定氨基酸的相对比例结果图；
图3-6是样品同位素稀释质谱的结果带入标准曲线计算后的结果图。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
实施例：
一、甲胎蛋白标准物质制备过程：
配制pH7.7Tris缓冲液，用于溶解经过纯化的甲胎蛋白。配制浓度为1mg／甲胎蛋白溶液。将甲胎蛋白溶液分装至尖底冻存管中，每只冻存管中分装20μL溶液，分装好的标准物质在-80摄氏度冰箱中冷冻保存。
二、电泳测定标准样品的分子量：
1.主要试剂
蛋白质预制胶：伯乐公司，美国
Tris base：Angus公司，美国
甘氨酸：Solarbio公司，中国
SDS：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，中国
甲醇：J.T Baker公司，美国
冰醋酸：北京试剂公司，中国
蛋白银染试剂盒：康为世纪公司，中国
彩虹预染宽分子量蛋白Marker（10-260KD）：中科泰瑞公司，中国
2.仪器设备
垂直电泳槽：伯乐公司，美国
分析天平：Sartorius BS323S型，最大称量为320g，精度为0.001g，德国
超低温冰箱：Deep Freezer VXE570型，Thermo Electron Corporation,法国
摇床：KS260型，IKA公司，德国
超纯水系统:Milli-Q型，MILLIPORE公司，美国
3.实验步骤
样品准备：将样品AFP（甲胎蛋白）配制为浓度1μg/ml溶液，待用。
电泳：将蛋白质预制胶放入垂直电泳槽内，倒入电泳缓冲液，充分浸泡预制胶后，将样品和上样缓冲液以10:10的比例加入1.5ml离心管，混匀，离心。在100℃水浴锅中煮10分钟，取出离心。将彩虹预染宽分子量蛋白Marker从-20℃取出，放至室温，离心待用。
加入样品和蛋白Marker后，设置电泳条件：电压100V，时间50分钟。电泳跑完后，按照蛋白银染试剂盒说明书进行银染，结果如图1所示。
由图1可知AFP分子量约为60-70KD。
三、以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和/或苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对甲胎蛋白进行准确定量：
1.主要试剂
乙腈：J.T Baker公司，美国
三氟乙酸：DikmaPure公司，中国
全氟庚酸：Sigma-Aldirich公司，美国
盐酸：优级纯，北京化学试剂公司，中国
脯氨酸、缬氨酸亮、氨酸、苯丙氨酸标准物质由中国计量科学研究院研制
脯氨酸同位素标记物：Cambridge Isotope,美国
缬氨酸同位素标记物：Cambridge Isotope,美国
亮氨酸同位素标记物：Cambridge Isotope,美国
苯丙氨酸同位素标记物：Cambridge Isotope,美国
2.仪器设备
Aglient6410：安捷伦公司，美国
涡旋混匀器：MS2型，IKA公司，德国
烘箱:UFE500，Memmert公司，德国
移液器（10,20,200,1000μl）：Thermo公司，德国
天平：ME235S型，感量0.01mg，Satorius公司，德国
超纯水系统:Milli-Q型，MILLIPORE公司，美国
3.实验步骤
取甲胎蛋白20ul于安瓶中，稀释10倍，按约1:1的比例分别加入亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标记溶液，真空干燥。
加入800μL6mol/L的HCl，混合均匀后通氮除氧密封，在110℃烘箱中进行水解，每隔12小时涡旋混匀一次。水解48小时后取出（由图2可以看出，水解48小时最好），氮气吹干，用含有0.1%盐酸的水溶液复溶，溶液经过0.22μm滤膜过滤后上机测定。
根据质谱所得目标样品与同位素标记氨基酸的比例及配制标准氨基酸与内标氨基酸比例的标准曲线；计算溶液中蛋白含量，根据蛋白的分子量计算每20μL溶液中甲胎蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
同位素稀释质谱分析：
样品水解后用Aglient6410三重串联四级杆质谱进行测定，测定条件如下：
流动相A：水（含0.8mM全氟庚酸和0.05%三氟乙酸）
流动相B：乙腈
流速：0.2mL/min
质谱信号采用单反应检测模式，对于苯丙氨酸的检测，分别监测166-＞120（Phe）和174-128（标记Phe）的离子对；对于脯氨酸的检测，分别监测116-＞70（Pro）和121-＞74（标记Pro）的离子对；对于缬氨酸的检测，分别监测118-＞72（Val）和123-＞76（标记Val）的离子对；对于亮氨酸的检测，分别监测132-＞86（Leu）和142-＞96（标记Leu）的离子对。结果见图3-图6。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种甲胎蛋白标准物质定值的方法，其特征在于：是以亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质为标准，以同位素标记亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸为内标，采用同位素稀释质谱法对甲胎蛋白标准物质进行准确定量；具体步骤为：
(1)取甲胎蛋白标准物质20μL于安瓶中，稀释10倍，按1:1的比例分别加入亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标记溶液，真空干燥；
(2)加入800μL 6mol/L的HCl，混合均匀后通氮除氧密封，在110℃烘箱中进行水解，每隔12小时涡旋混匀一次；水解48小时后取出，氮气吹干，用含有0.1％盐酸的水溶液复溶，溶液经过0.22μm滤膜过滤后上质谱仪测定；
(3)根据质谱所得目标样品与同位素标记氨基酸的比例及配制标准氨基酸与内标氨基酸比例的标准曲线；计算溶液中蛋白含量，根据蛋白的分子量计算每20μL溶液中甲胎蛋白的浓度作为标准物质的定值结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中甲胎蛋白标准物质的制备过程为：配制pH7.7Tris缓冲液，用于溶解经过纯化的甲胎蛋白，配制浓度为1mg/ml甲胎蛋白溶液；将甲胎蛋白溶液分装至尖底冻存管中，每只冻存管中分装20μL溶液，分装好的标准物质在-80摄氏度冰箱中冷冻保存。
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