CN103430840B - 一种选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法，包括选取品种、抗性培养、选育扦插、性状稳定性与一致性的选育以及连续两年进行品比试验、生产试验和病害统计，确定上述性状的白菊花的抗病品种NJK-1。本发明的优点以筛选抗病品种为对象，综合产量、内在质量及菊花性状等指标进行了研究，培育出性状稳定、品质好的白菊花抗病品种。由于抗病性提高、病虫害减少，使得菊花产量至少增加了44％，同时节约了防治病害的药剂和人工等生产成本约500元/亩，产生了很好的经济效益和社会效益。农药施用量的减少，减少了对环境的二次污染，减弱了对人体健康的慢性损害，同时，本发明的选育方法操作方便、简单易行、容易实现。
Description
技术领域
本发明涉及一种菊花的选育方法，尤其涉及一种选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法，属于品种选育领域。
背景技术
白菊花(Dendranthema morifolium)属菊科菊属，既是我国传统常用的中药材，又是重要的出口药材之一，其性寒，味甘、苦，具有疏风散热、平肝明目等功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛和眼目昏花等。菊花入药在我国有悠久的历史，我国第一部药物学专著《神农本草经》将其列为上品。李时珍对菊花功效大加赞赏，“菊花可蔬，叶可啜，花可饵，根实可药，囊之可枕，酿之可饮”，是群芳中的上品。最新研究还发现，药用菊花还具抗癌、抗艾滋病毒的功效，同时白菊花中主要含有黄酮类、挥发油类、绿原酸等有益成分，应用现代生物工程技术，可以从白菊花中提取更多具有药用价值的成份。
近年来，随着国内外医药、食品和饮料加工业的迅猛发展，作为药食两用的菊花，其社会需求量和用量急剧增加，每年国内外市场总量为6000～7000吨，其中我国约40％左右产量供出口。随着菊花的多年连续种植，病虫害逐年积累，尤其是顽强的土传病害，严重影响着菊花的产量和品质。为防治病虫害而大量使用化学药剂，不仅大幅度的提高生产成本，而且严重污染生态环境，残留毒素损害人体健康。因此，如何培育抗病虫的菊花品种是目前亟待解决的问题。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种通过遗传改良、减少化学药剂的使用量、提高白菊花抗病性的一种选育方法。
技术方案：本发明所述的选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法，包括如下顺序步骤：
(1)选取品种：在白菊花病害高感区的栽培群体中选取抗病性好的、健壮无病虫害的单株留种；
(2)抗性培养：将所选菊花植株根越冬，第二年采集越冬根上分蘖出来的菊苗进行扦插并建立株行圃，然后选择抗性好的单株依次进行花瓣愈伤组织培养和抗性细胞系筛选，其中，愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 3mg/L+NAA0.5mg/L，向其中添加菊花白绢病毒素和枯萎病毒素诱导抗性细胞系，不定芽诱导培养基NAA0.2mg/L+KT2mg/L，不定芽生根培养基1/2MS；
(3)选育扦插：生根后对组培苗进行沙培，炼苗结束后进行栽培，选择具有株高53～70cm，茎绿色，叶卵圆形，羽状深裂，叶片长5.8～8.0cm、宽4.8～7.0cm、平展、绿色，头状花序花头数168～248个、直径5.2～6.0cm，舌状花花瓣数54～70个、颜色本白，管状花花心直径0.9～1.2cm、桔黄色，花香味稍淡的扦插苗培育；
(4)性状稳定性与一致性的选育：选择经过烘箱干燥后菊花总黄酮含量为13.5～19.7％(重量比)，绿原酸含量为0.20～0.27％(重量比)，挥发油呈蓝色、含量为每100g中含0.2～0.35ml的单株200～300个，连续进行2～3年培育选择，直到步骤(3)和本步骤中的性状稳定出现，一致性达到90％；
(5)连续两年进行品比试验、生产试验和病害统计，确定上述性状的白菊花的抗病品种NJK-1。
其中，步骤(3)中，所述株高为58～65cm，叶片长6.64～7.50cm、宽5.2～6.66cm，头状花序花头数180～228个，直径5.3～5.8cm，舌状花花瓣数56～68个，管状花花心直径0.99～1.11cm。
在步骤(4)中，所述菊花总黄酮含量按重量比为15.5～18.6％，绿原酸含量按重量比为0.22～0.26％，挥发油含量为每100g中含0.22～0.34ml。
发明原理：本发明采用现代生物技术通过在培养基中添加菊花白绢病毒素和枯萎病毒素进行遗传改良，通过组培方式筛选的方法把抗性较弱的细胞系淘汰掉，保留抗性较强的细胞系，同时在筛选的过程中会有一定的有益突变，诱导愈伤组织产生抗性筛选突变体，选育抗性较强的细胞系培育成再生植株，同时通过分子水平的鉴定确定为突变体，该有益突变即使在正常情况下也会保持相对较高的抗性，进行多年大田实验确保遗传稳定性。其产量和表型等指标已达药典规定，抗病品种NJK-1绿原酸含量与常规品种相当，而总黄酮含量明显高于常规品种，据研究表明酚类和总黄酮是与植物抗病性有关的苯丙烷类次生代谢物质,能够抑制病原微生物的活性和毒性。因此，通过该方法选育出的抗病品种NJK-1在遭遇病害时可保持较高的抗性。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：
(1)本发明在多年研究基础上，以筛选抗病品种为对象，综合产量、内在质量(黄酮类、绿原酸和挥发油类含量)及菊花性状(花瓣颜色、花心颜色、花香味)等指标进行了研究，培育出性状稳定、品质好的白菊花抗病品种。
(2)由于抗病性提高、病虫害减少，使得菊花产量至少增加了44％，同时节约了防治病害的药剂和人工等生产成本、约500元/亩，产生了很好的经济效益和社会效益。
(3)农药施用量的减少，减少了对环境的二次污染，减弱了对人体健康的慢性损害，同时，本发明的选育方法操作方便、简单易行、容易实现。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
(一)选育方法
江苏省射阳县是我国白菊花的主产区之一，已有近50年的栽培历史，多年的栽植，使菊花病害逐年加重，尤其是白绢病和枯萎病，造成这一问题的原因主要是多年连作，该镇几乎所有土地均为菊花重茬地，10％～20％的土地已无法再种植菊花，其他地块也在逐年加重。南京农业大学对药用菊花抗病品种进行选育，以当地地方栽培品种新白菊花瓣为外植体，以菊花白绢病和枯萎病毒素为诱导抗病细胞系，培养试管苗，而后将其在洋马镇种植。连续两年栽培，考察其白绢病和枯萎病的发病情况。
首先，在白菊花栽培群体大田中，对当地栽培抗性较好的新白菊按植株的株高、茎色、叶形、叶片大小和皱度、叶色、头状花序的花头数和直径、舌状花瓣数和颜色、管状花花心直径和颜色、花香味等性状进行单株选育健壮无病虫害单株10株；
采花后保留所选的菊花植株根越冬，第二年将所选各单株越冬根上分蘖出来的菊苗扦插育苗后进行田间比较试验，建立株行圃，观察它们各自的性状表现及抗性。选择其中抗病性最好的单株进行花瓣组织培养和抗性细胞系筛选。愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 3mg/L+NAA0.5mg/L，然后向培养基中添加毒素，诱导抗性细胞系，不定芽诱导培养基NAA0.2mg/L+KT2mg/L。不定芽生根培养基1/2MS。生根后对组培苗进行沙培，炼苗结束后，移入原产地，按大田密度进行栽培。选择具有株高53～70cm，茎绿色，叶卵圆形，羽状深裂，叶片长5.8～8.0cm、宽4.8～7.0cm、平展、绿色，头状花序花头数168～248个、直径5.2～6.0cm，舌状花花瓣数54～70个、颜色本白，管状花花心直径0.9～1.2cm、桔黄色，花香味稍淡的扦插苗培育。
结合对其有效成分黄酮类、绿原酸和挥发油类含量进行测定。选择经过烘箱干燥后菊花总黄酮含量为13.5％～19.7％(重量比)、绿原酸含量为0.20％～0.27％(重量比)，挥发油呈蓝色、含量为每100g中含0.2～0.35ml的单株200～300个，连续进行2～3年培育选择，直到所述性状稳定出现，一致性达到90％；
此后，进行连续2年品比试验、生产试验及病害统计，性状稳定后进行连续2年的品比试验和生产试验及病害统计，确定株高为53～70cm，茎绿色，叶卵圆形，羽状深裂，叶片长5.8～8.0cm、宽4.8～7.0cm、平展、绿色，头状花序花头数168～248个、直径5.2～6.0cm，舌状花花瓣数54～70个、颜色本白，管状花花心直径0.9～1.2cm、桔黄色，花香味稍淡，烘箱干燥后菊花总黄酮含量为13.5％～19.7％(重量比)、绿原酸含量为0.20％～0.27％(重量比)，挥发油呈蓝色、含量为每100g中含0.2～0.35ml的白菊花品种为抗病品种NJK-1。
(二)样品采集：实验数据采用随机抽样，在试验小区内随机选取20株计算其平均值，多次重复，与普通品种红心菊比较如下：
表1 NJK-1与红心菊主要植物学性状比较(平均值)单位：cm
注：分枝数为二级分枝数
表2 NJK-1与红心菊几个感官性状比较
表3 2010～2012年4个地点的NJK-1与红心菊品比试验结果(产量)鲜重单位：kg
注：4个重复分别在洋马镇的百药园、友盟、药材和东移四个地点进行。
由表3得出，连续三年不同地点的品比试验结果表明：抗病品种NJK-1较原有品种红心菊品质优良，性状稳定，适应性强，符合品种选育和遗传改良目标。
(三)绿原酸测定
1、仪器:岛津LC-AT20型高效液相色谱仪，Q50DB型超声波机(昆山市超声仪器有限公司)
2、试剂:绿原酸对照品(纯度98％，中国药品检验所，生产批号39350)、甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)
3、对照品溶液的制备：取绿原酸对照品、适量，精密称定，加甲醇(70％)制成每1mL含绿原酸35μg的溶液，即得(10℃以下保存，置棕色瓶中)。
4、供试品溶液的制备：取本品粉末(过一号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率45kHz)40min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm滤膜过滤，即得。
5、测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。
表4 NJK-1与红心菊的绿原酸含量比较(％DW，n＝5)
(四)总黄酮测定
1、仪器:岛津2501型紫外可见分光光度计、岛津LC-AT20型高效液相色谱仪，Q50DB型超声波机(昆山市超声仪器有限公司)
2、试剂:芦丁对照品(中国药品生物制品研究所，生产批号0080-9705)，无水乙醇(12082111381)，硝酸铝(20110713)，亚硝酸钠，氢氧化钠(南京化学试剂有限公司13071511002)
3、标准溶液的制备：准确称取芦丁标准品22.0mg，用30％乙醇溶解，并转入50mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.44mg·mL-1的标准溶液。
4、供试品溶液的制备：精密称取过60目的菊花粉末约1g，准确加入70％乙醇20mL，称重，于60℃条件下超声提取30min，称重，补足重量。离心，取上清液作供试品。准确移取2mL供试品溶液，加入5％NaNO2溶液0.3mL，摇荡均匀，放置6min；加入10％Al(NO3)3溶液0.3mL，振荡均匀，放置6min；加入4％NaOH溶液4mL，用30％乙醇定容至10mL，摇匀，放置15min。
5、含量测定：在510nm处测定吸光度值A，计算含量。
表5 白NJK-1与红心菊的总黄酮含量比较(％DW，n＝5)
由表5可知，本发明的选育花抗病品种NJK-1较普通品种红心菊，其总黄酮含量大大提高，而总黄酮是与植物抗病性有关的苯丙烷类次生代谢物质,能够抑制病原微生物的活性和毒性。
(五)挥发油测定
1、仪器：电恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)索氏提取器，RE-52A旋转蒸发器(上海伊利仪器制造有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。
2、试剂：石油醚(南京化学试剂有限公司，批号12101811774)，无水Na2SO4(南京化学试剂有限公司，批号13060410800)，水为超纯水。
3、含量测定：取一定粉碎度的菊花100g，精密称定，置2000mL圆底烧瓶中，浸泡10h。参照《中华人民共和药典》2010年版一部附录XD并作改进，加一定量饱和氯化钠溶液与数粒玻璃珠，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，再从冷凝管上端加入2mL石油醚，然后将烧瓶置电热套中加热至沸，调温并保持微沸，连续提取13h后停止加热，放置片刻，开启测定器下端活塞将水缓缓放出，收集挥发油，无水硫酸钠脱水，50℃水浴3h挥去石油醚，得到淡黄色挥发油，精密称重，计算提取率。
挥发油提取率(％)＝菊花中挥发油含量/菊花重量×100％
表6 NJK-1与红心菊的挥发油含量比较(％V/DW，n＝5)
(六)NJK-1的抗病性体现
表7 白绢病发病情况比较
表8 枯萎病发病情况比较
由表7、8可知，本发明选育的菊花抗病品种NJK-1较常规品种红心菊，白绢病和枯萎病的发病率明显降低。
Claims (3)
1.一种选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法，其特征在于包括如下顺序步骤：
(1)选取品种：在白菊花病害高感区的栽培群体中选取抗病性好的、健壮无病虫害的单株留种；
(2)抗性培养：将所选菊花植株根越冬，第二年采集越冬根上分蘖出来的菊苗进行扦插并建立株行圃，然后选择抗性好的单株依次进行花瓣愈伤组织培养和抗性细胞系筛选，其中，愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 3mg/L+NAA0.5mg/L，向其中添加白绢病毒素和枯萎病毒素诱导抗性细胞系，不定芽诱导培养基NAA0.2mg/L+KT2mg/L，不定芽生根培养基1/2MS；
(3)选育扦插：生根后对组培苗进行沙培，炼苗结束后进行栽培，选择具有株高53～70cm，茎绿色，叶卵圆形，羽状深裂，叶片长5.8～8.0cm、宽4.8～7.0cm、平展、绿色，头状花序花头数168～248个、直径5.2～6.0cm，舌状花花瓣数54～70个、颜色本白，管状花花心直径0.9～1.2cm、桔黄色，花香味稍淡的扦插苗培育；
(4)性状稳定性与一致性的选育：选择经过烘箱干燥后菊花总黄酮含量按重量比为13.5～19.7％，绿原酸含量按重量比为0.20～0.27％，挥发油呈蓝色、含量为每100g中含0.2～0.35ml的单株200～300个，连续进行2～3年培育选择，直到步骤(3)和本步骤中的性状稳定出现，一致性达到90％；
(5)连续两年进行品比试验、生产试验和病害统计，确定上述性状的白菊花的抗病品种NJK-1。
2.根据权利要求1所述的一种选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述株高为58～65cm，叶片长6.64～7.50cm、宽5.2～6.66cm，头状花序花头数180～228个，直径5.3～5.8cm，舌状花花瓣数56～68个，管状花花心直径0.99～1.11cm。
3.根据权利要求1所述的一种选育抗白绢病和枯萎病的白菊花品种的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述菊花总黄酮含量按重量比为15.5～18.6％，绿原酸含量按重量比为0.22～0.26％，挥发油含量为每100g中含0.22～0.34ml。
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