CN103411816B - 一种用于富集纯化病原微生物的纳米材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于病原微生物快速富集纯化的纳米材料及其制备方法，所述纳米材料的化学结构表示为SiO₂@Fe₃O₄@SiO₂@CdTe@CMCS，所述纳米材料是兼具靶向运输、荧光标记和特异结合能力的核壳型多功能磁性纳米材料，在进行现场传染病诊断时能够快速、高效地富集病原微生物。

Description

一种用于富集纯化病原微生物的纳米材料及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米生物医学材料领域，涉及一种用于病原微生物快速富集纯化的纳米材料及其制备方法。

背景技术

目前生物检测的手段种类繁多，但样品的前期处理是决定检测效率与鉴定结果的关键。虽然基于生物传感器等现代技术的出现和应用大大促进了传染病病原的快速检测，但仍不能完全满足现场快速检测的需求。呼吸道和肠道等传染病病原所在的复杂体系，如呼出气、咽拭子和粪便等，对传感器检测性能的干扰是一个较为普遍的现象，主要表现在：一是传染病病原介质中存在的无机或有机等非目标物含量通常远大于目标物，严重干扰了目标物与传感器敏感界面的结合，影响检测的特异性和灵敏度，而对样品的前处理要求较高，又延长了整个检测时间，传染病病原的介质为土壤、血液、尿液等混合体系，需要经过离心、萃取等冗繁的处理步骤才能用于生物传感器检测，这个过程至少需要2-3小时；二是多依赖于标记技术，通常为酶或荧光标记，而传染病病原通常带有自发荧光，容易带来背景干扰，影响了检测灵敏度。

量子点(quantum dots，ODs)又称半导体纳米微晶，是由II-VI族或 III-V族元素组成，经特定激发波激发后可发射荧光的纳米颗粒。量子点三个维度的尺寸都在100nm以下，外观恰似一个极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限。量子点的特殊结构导致其具有表面效应、量子尺寸效应、介电限域效应和宏观量子隧道效应，从而展现出许多不同于宏观块体材料的物理化学性质和独特的发光特性，使其在生物荧光标记、生物成像等领域有着广阔的应用前景。另一方面由于量子点的生物相容性差、毒性大，使其在生物领域仍然难以得到有效应用。

核壳型纳米粒子是以一个尺寸在纳米级的球形颗粒为核，在其表面包覆数层均匀纳米薄膜而形成的一种复合多相结构，核与壳之间通过物理或化学作用相互连接。具有特殊核壳结构的纳米复合材料，可通过改变增加壳层材料的组成与组分赋予核壳多功能复合特性。

针对目前传染病病原现场检测中存在的样本前处理要求较高、背景干扰大和依赖标记技术等诸多问题，本发明欲通过核壳型纳米粒子技术，提供能够应用于病原微生物前处理过程中样品的快速富集纯化的多功能纳米复合材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于病原微生物快速富集纯化的核壳型多功能磁性纳米材料及其制备方法。

为实现上述目的，本发明首先公开了一种用于富集病原微生物的纳米材料，其特征是：所述纳米材料名称为羧甲基壳聚糖包覆碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅核壳型复合纳米球，所述纳米材料的结构表示为SiO₂@Fe₃O₄@SiO₂@CdTe@CMCS，其中@是包覆的意思，如SiO₂@Fe₃O₄表示在二氧化硅纳米球外面包覆一层纳米四氧化三铁。

本发明还公开了一种上述纳米材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)以四氧化三铁包覆单分散的二氧化硅纳米球(单分散是指粒子品种单一且粒径分布很窄)；

(2)再以单分散的二氧化硅包覆步骤(1)获得的产物；

(3)再以碲化镉量子点包覆步骤(2)获得的产物；

(4)最后以羧甲基壳聚糖包覆步骤(3)获得的产物。

在本发明一个优选的技术方案中，步骤(1)中所述的单分散的二氧化硅纳米球是以法制备的，并且步骤(1)是以热沉积法进行的。

在本发明一个优选的技术方案中，步骤(2)是以法进行的。

在本发明一个优选的技术方案中，步骤(3)是以化学合成法进行的。

在本发明一个优选的技术方案中，步骤(4)是通过二氧化硅表面的羟基与羧甲基壳聚糖表面的羧基通过缩合反应来实现的。

在本发明一个优选的技术方案中，步骤(1)中所述热沉积法的反应溶液为体积比为3∶1的去离子水和乙二醇的混合溶液，反应温度为40 -100℃，反应时间为1-10小时。

在本发明一个优选的技术方案中，步骤(3)中所述化学合成法的反应溶液pH值为5-14，反应温度为50-300℃，反应时间为1-10小时。

本发明还提供了所述纳米材料在病原微生物快速富集纯化中的应用。

优选地，所述纳米材料用于压电电化学免疫传感器。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开的的核壳型多功能磁性纳米材料，具有超顺磁性、荧光性和特异亲和性，具体而言，本发明的磁性微粒的粒径小，比表面积大，便于高效地与目标产物偶联；纳米四氧化三铁具有超顺磁性，在外加磁场的作用下分离十分简单，使其非常便于分离；碲化镉量子点具有良好的水溶性、特殊的发荧光特性以及光化学稳定性，具有荧光；最外层的羧甲基壳聚糖具有无毒性，良好的水溶性、良好的生物相容性，与重金属存在螯合作用并且表面富含大量功能基团，便于偶联生物分子，其既可以保护碲化镉量子点不会泄露，又使所得材料具有很好的生物相容性，可以在其表面修饰其他基团，赋予核壳型多功能材料特异亲和性。因此本发明的纳米材料可以将传染病病原从复杂样本介质中分离、富集和纯化，实现病原样本的快速前处理，整个前处理过程大约需要0.5小时，且其分离富集效率可达70-80％。

附图说明

图1 核壳型多功能磁性纳米材料制备示意图；

图2 核壳型多功能磁性纳米材料用于病原微生物快速富集纯化的示意图；

图3为待测样品实时荧光定量PCR结果图；

图4为依据图3绘制的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所限定的范围构成进一步的限定。

实施例1：制备实施例

(1)采用法制备单分散的二氧化硅纳米球 (参考文献：W. ，A.Fink.Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron sizerange[J].J.Colloid Interface Sci.，1968，26(1)：62-69)；

(2)采用热沉积法制备四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，具体制备过程如下：将0.25g法制得的二氧化硅纳米球加入至含有50ml乙二醇和150ml水的混合溶液中，待超声分散均匀后将反应液转移至三口烧瓶中，在45℃的水浴中，机械搅拌。15分钟后向反应体系中加入0.25g 氯化亚铁，在45℃的水浴中机械搅拌5小时。反应完毕后，将所得黑色溶液离心，并依此用去离子水和乙醇清洗3次，制得核壳型的四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，将所得产物在60℃烘箱干燥待用；

(3)采用法制备单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球；

(4)将0.1g制备的二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球超声分散在100ml去离子水中，加入5ml氯化镉溶液、5ml巯基丙酸，并用1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为8.0。随后加入0.8g亚碲酸钠，并在60℃机械搅拌2小时，制得核壳型的碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，将所得产物用丙酮、水清洗，在60℃烘箱干燥待用；

(5)首先，取0.025g羧甲基壳聚糖钠盐滴加1.5mol/L、5ml盐酸至该钠盐溶解，酸化0.5小时，然后向溶液中滴加无水乙醇，静置12小时后将羧甲基壳聚糖沉淀出来，15000rpm离心10分钟，用无水乙醇离心洗涤7-8次，每次10分钟，得产物羧甲基壳聚糖CMCS。取0.1g制得核壳型的碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，向其中滴加含0.025gEDC的PB(磷酸盐缓冲液，0.2mol/L，pH＝6)4ml超声10分钟，然后加入1ml含羧甲基壳聚糖的PB(0.2mol/L，pH＝6，0.025g/ml)，超声1小时，用磁铁吸附后去掉剩余溶液，所得产物依此用去离子水和乙醇清洗3次，得到羧甲基壳聚糖包覆碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅核壳型复合纳米球。

图1是本发明所公开的核壳型多功能磁性纳米材料制备示意图；其中1为二氧化硅；2为四氧化三铁包覆二氧化硅；3为二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅；4为碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅；5为羧甲基壳聚糖包覆碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅。

实施例2应用实施例

图2是本发明制备的纳米材料用于病原微生物快速富集纯化的示意图。图中显示，纳米磁珠经特异性抗体修饰后可与目标抗原特异性结合，经富集分离后获得的抗原抗体免疫复合物可用于下一步的检测。

取100ml小烧杯，将预先制好的已知病原微生物浓度的模拟样本与复杂介质稀释液一起倒入烧杯中待用，将上述制备的核壳型多功能磁性纳米材料(以下简称为磁珠)修饰可以特异识别目标病原微生物的抗体，而后将修饰后的磁珠投入烧杯中与待测样品室温下共同孵育0.5小时，使复杂介质中流感病毒或腺病毒等呼吸道传染病病原与磁珠表面抗流感病毒或腺病毒等呼吸道传染病病原的多克隆抗体充分结合，而后在磁场作用下将烧杯中的磁珠全部分离出来，至此完成一个从复杂介质中分离富集病原微生物样品的前处理过程。将结合有抗原的磁珠转移至100ml酸性缓冲液中，释放表面抗原并测定其浓度，与模拟样本病原的原始浓度相比，获得磁珠对该病原的分离富集效率。

分离富集效率通过Real Time-PCR的方法验证：

1.标准曲线的建立：制备标准样品，倍比稀释后，制作出标准曲线。

2.评价分离富集效率：将压电传感器晶振片表面结合好的磁珠用PBS溶液洗脱下来，测定其中病原微生物的含量，而后与模拟样本中已知病原微生物的总量的比值即为本发明所述材料的分离富集效率。

采用美国BIO-RAD公司IQ5实时荧光定量PCR仪对标准样品及待测样品进行测定。图3为梯度稀释的待测样品实时荧光定量PCR结果图 (共8个梯度浓度，每个浓度做3个平行实验)；图4为依据图3Ct阈值和梯度浓度关系绘制的标准曲线。通过两个浓度的比值算出本发明所述材料对样品的分离富集效率，经过计算得出分离富集效率可达70-80％，说明本发明所述材料在保证具有较高分离富集效率的基础上实现从复杂介质中分离富集病原微生物样品的快速前处理过程。

Claims (3)

1.一种用于富集病原微生物的纳米材料，其特征在于：所述纳米材料的化学结构表示为SiO₂@Fe₃O₄@SiO₂@CdTe@CMCS；

所述纳米材料的制备方法具体为：

(1)采用法制备单分散的二氧化硅纳米球；

(2)采用热沉积法制备四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，具体制备过程如下：将0.25g所述二氧化硅纳米球加入至含有50ml乙二醇和150ml水的混合溶液中，待超声分散均匀后将反应液转移至三口烧瓶中，在45℃的水浴中，机械搅拌；15分钟后向反应体系中加入0.25g氯化亚铁，在45℃的水浴中机械搅拌5小时；反应完毕后，将所得黑色溶液离心，并依此用去离子水和乙醇清洗3次，制得核壳型的四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，将所得产物在60℃烘箱干燥待用；

(3)采用法制备单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球；

(4)将0.1g制备的二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球超声分散在100ml去离子水中，加入5ml氯化镉溶液、5ml巯基丙酸，并用1mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为8.0；随后加入0.8g亚碲酸钠，并在60℃机械搅拌2小时，制得核壳型的碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，将所得产物用丙酮、水清洗，在60℃烘箱干燥待用；

(5)首先，取0.025g羧甲基壳聚糖钠盐滴加1.5mol/L、5ml盐酸至该钠盐溶解，酸化0.5小时，然后向溶液中滴加无水乙醇，静置12小时后将羧甲基壳聚糖沉淀出来，15000rpm离心10分钟，用无水乙醇离心洗涤7～8次，每次10分钟，得产物羧甲基壳聚糖CMCS；取0.1g制得核壳型的碲化镉包覆二氧化硅包覆四氧化三铁包覆二氧化硅纳米球，向其中滴加含0.025gEDC的pH＝6，0.2mol/L磷酸盐缓冲液4ml，超声10分钟，然后加入1ml含羧甲基壳聚糖的pH＝6，0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中含有所述羧甲基壳聚糖为0.025g/ml，超声l小时，用磁铁吸附后去掉剩余溶液，所得产物依此用去离子水和乙醇清洗3次，得到SiO₂@Fe₃O₄@SiO₂@CdTe@CMCS纳米材料。

2.根据权利要求1所述纳米材料在病原微生物快速富集纯化中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纳米材料用于压电电化学免疫传感器。