CN103409547A - 漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，更为具体的说是涉及漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法及其应用。本发明的目的在于对治理富营养化水体过程中的漂浮植物根系表面附着的反硝化细菌的丰度的绝对定量方法进行研究，进而研究根系表面反硝化细菌nirK的变化规律，为后续漂浮植物在治理富营养化水体过程的应用及优化提供监测数据。本发明公开了一种漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，通过取样、PCR扩增、实时荧光定量PCR检测准确获得反硝化细菌数量。与传统技术相比，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及生物技术在水处理领域的应用，更为具体的说是涉及漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法及其应用。
背景技术
近年来，以漂浮植物（以凤眼莲为例）为主要水生生物的大水面生态修复工程得到了较为广泛的应用,在利用凤眼莲消减富营养化水体中氮、磷的规模化生态修复实践中取得了良好效果。但是之前大量关于漂浮植物修复富营养化水体的研究主要侧重于植物直接吸收N对消减水体氮的贡献，也就是说关注点仅在于植物对营养元素N的吸收。然而在原位研究过程中，水体中除了植物吸收的部分N之外，仍有相当一部分通过反硝化作用以终产物N2O和N2形式去除的氮贡献率并不明确，而漂浮植物根系在水中为反硝化细菌提供了大量的附着表面和营养物质，是反硝化作用发生的绝佳场所。以往的研究由于忽视了根系表面附着的反硝化细菌对水体净化的贡献，因此导致水体生态修复过程中氮去除途径并不完全清楚，对水处理的控制力减弱。
因此，对于漂浮植物根系附着的反硝化细菌的研究具有重要意义，但目前国内外对漂浮植物根系附着反硝化细菌的定量研究较少。
反硝化细菌属以NO2 ﹣或NO3 ﹣为电子受体，以有机物为电子供体来还原氮，产生反硝化作用，从而将NO2 ﹣或NO3 ﹣转变为N2O或N2的方式从水体中去除，反硝化作用涉及到的功能基因包括硝酸盐还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还原酶（Nor）、一氧化二氮还原酶（Nos），其中nirK（nirS）基因是将亚硝酸盐还原成气态产物NO的关键基因，因此常常被作为分子标记用于检测反硝化作用的微生物。
传统的稀释平板计数法或者MPN（Mostprobablenumber）等方法，只可以估算样品中反硝化细菌中很少一部分数量，因此对于需要定量检测漂浮植物根系表面附着反硝化细菌的实时检测需求来说，传统的稀释平板计数法和MPN方法都无法满足我们的需要。
近年来，采用荧光定量PCR(Real-Time quantitative polymerase chain reaction，Real-Time PCR) 技术为环境微生物监测提供了全新的方法，和传统方法相比，具有敏感性高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点，它可以通过检测目标序列PCR扩增产物的荧光信号强度达到实时监控的目的。
然而对水体生态修复过程中漂浮植物根系附着反硝化细菌功能基因nirK的丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于：对治理富营养化水体过程中的漂浮植物根系反硝化细菌的丰度的绝对定量方法进行研究，旨在建立漂浮植物反硝化细菌nirK基因丰度的实时荧光定量PCR的方法，进而研究根系表面反硝化细菌nirK的变化规律，为后续漂浮植物在治理富营养化水体过程的应用及优化提供监测数据。
具体来说，本发明公开了一种漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，包括以下步骤：
a）在待检测河流的漂浮植物种植区域建立对角线5点采集点并标记为采样点，在采样点采集植物根系样品，汇总后混合均匀；用无菌水清洗数次，吸干水分，随机选取2g新鲜根系，放入装有无菌去离子水的无菌三角瓶中，并加入灭菌的玻璃珠，超声5~15 s，剧烈震荡15~30 min，过滤，取滤液；滤渣再用无菌去离子水反复冲洗，冲洗液过滤，两次滤液合并，经0.22μm的微孔滤膜抽滤，滤膜放入Eppendorf管中，保存于-80℃；分别在每个采样点进行四次采样，并重复上述步骤，得到多个采样样本；
b)将滤膜在无菌条件下剪成1-2mm的碎屑，通过E.Z.N.A.?WaterDNAKit试剂盒分别提取样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH2O中，以nirK基因的特异性通用引物对SEQIDNo.2和SEQIDNo.3对每个样本DNA进行PCR扩增，获得大小在500bp的特异性片段；PCR扩增产物经TA克隆构建质粒后进行测序，确定引物的特异性及PCR扩增产物为目标片段；提取经测序后的阳性克隆作为标准质粒测定DNA浓度并换算为拷贝数，按10倍梯度稀释后用以绘制标准曲线；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出样本DNA中nirK基因的丰度。
进一步地，我们公开了所述的特异性片段测序为SEQIDNo.1；所述的标准曲线为Y1＝-3.491X1+41.693，R2＝0.999，其中Y1为荧光时实定量PCR反应的Ct值，X1为nirK基因构建的标准质粒拷贝数对数值。
更进一步地，我们公开了所述Real-time PCR扩增的反应体系为20μL，其中包括样品模板1μL，所述样品模板为样品DNA或1μL质粒标准品DNA，Mix10μL，引物对各0.4μL，Rox0.4μL，以无菌超纯水补足体积；每次定量PCR反应中均设置阴性对照，所述阴性对照中样品模板采用1μLddH2O，定量PCR程序为：94°C热启动1min；94°C变性5s，58°C退火30s，72°C延伸30s，在72°C延伸时收集荧光，循环35次。
作为一种充分性公开说明，我们进一步公开所述的荧光定量PCR仪为ABI公司或Stratagene公司或Eppendorf公司或BioRad公司生产的荧光定量PCR仪。
最后，我们公开了所述的漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法的河流中漂浮植物根系表面附着反硝化细菌变化规律的确定方法，包括以下步骤：
a）在待检测河流的漂浮植物种植地区域建立对角线5点采集点并标记为采样点，在采样点采集植物根系样品，汇总后混合均匀；用无菌水清洗数次，吸干水分，随机选取2g新鲜根系，放入装有无菌去离子水的无菌三角瓶中，并加入灭菌的玻璃珠，超声5~15s，剧烈震荡15~30min，过滤，取滤液；滤渣再用无菌去离子水反复冲洗，冲洗液过滤，两次滤液合并，经0.22μm的微孔滤膜抽滤，滤膜放入Eppendorf管中，保存于-80℃；分别在每个采样点进行四次采样，并重复上述步骤，得到多个采样样本；
b)将滤膜在无菌条件下剪成1-2mm的碎屑，通过E.Z.N.A.?WaterDNAKit试剂盒分别提取样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH2O中，以nirK基因的特异性通用引物对SEQIDNo.2和SEQIDNo.3对每个样本DNA进行PCR扩增，获得大小在500bp的特异性片段；PCR产物经TA克隆构建质粒进行测序，确定引物的特异性及PCR产物为目标片段，同时提取经测序后的阳性克隆作为标准质粒测定DNA浓度换算拷贝数，按10倍梯度稀释作为标准曲线；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出样本DNA中nirK基因的丰度；
c）分别采集不同河流的漂浮植物根据样本，并对其上附着的反硝化细菌nirK基因的丰度进行统计，分析在不同环境参数条件下种植的漂浮植物根系表面反硝化细菌nirK基因丰度的变化规律。
本发明所公开的技术方案与传统技术相比，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点。
附图说明
图1为凤眼莲根系附着微生物总DNA的扩增结果；
图2为实时荧光定量分析扩增曲线；
图3为实时荧光定量分析标准曲线；
图4为实时荧光定量分析标准品熔解曲线；
图5为实时荧光定量分析样品熔解曲线；
图6为根系附着微生物总DNA中nirK基因的拷贝数。
具体实施方式
在本发明中，基因拷贝数、基因丰度、基因数量代表同样的数值与概念。
Real-timePCR、qPCR、实时荧光定量PCR均表示同样的概念。
本发明中ddH2O是指双蒸水。
实施例1
以凤眼莲作为用于水处理的漂浮植物。
选择反硝化细菌功能基因nirK的特异性引物，该引物序列出自 Hallin, Sara和Lindgren, Per-Eric（PCRdetectionofgenesencodingnitritereductaseindenitrifyingbacteria.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,Vol65（4），pp.1652-1657,April1999.）
SEQIDNo.2：nirK-F:5’-ATCATGGTSCTGCCGCG-3’
SEQIDNo.3：nirK1622R:5’-GCCTCGATCAGRTTGTGGTT-3’
在滇池入湖河道选取11条河流中种植的凤眼莲根系作为研究对象进行样品采集：在每一条河流种植凤眼莲的区域建立对角线5点采集植物根系样品，选取的凤眼莲根系汇总后混合均匀，用无菌水清洗数次，吸干水分，随机选取2g新鲜根系，于含100mL无菌去离子水的总容积为250mL的无菌三角瓶中，并加入500 mg灭菌的玻璃珠，超声5~15s，剧烈震荡15~30min（18.3Hz,ThermomixerEppendorf），过滤，粗滤掉根系，取滤液；滤渣继续用100 mL无菌去离子水反复冲洗根系(CrumpandKoch，2008;Hempeletal.，2008)，将滤液以及冲洗液合并，合并后液体经0.22μm的微孔滤膜抽滤后，将滤膜在无菌条件下剪成1-2mm的碎屑，放入Eppendorf管中，保存于-80℃。
按照OMEGABio-Tek水体DNA提取试剂盒E.Z.N.A.? Water DNA Kit (OMEGABio-TekInc., Doraville, GA,USA)的操作步骤说明提取根系附着微生物总DNA溶于50μL ddH2O中。
用以构建TA克隆质粒的普通PCR反应体系：
PCR反应体系为30μL，反应体系如下：3μL样品DNA模板(约100ngDNA，阴性对照以无菌超纯水为模板)，3μL10×PCRBuffer，2 μL dNTP mixture，两种引物各0.5μL(10 pmol)，1.5U TaqDNA聚合酶(大连宝生物工程公司)，其余体积以无菌超纯水补足；反应体系轻柔混合，于梯度PCR仪（C1000，Bio-rad，USA）进行扩增反应。
PCR程序为：94°C热启动2min，10个循环为94°C变性30s，58°C退火30s(?0.5°C/循环)，72°C延伸1min；30个循环为94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸1min；最后72°C延伸10min。
将PCR产物进行琼脂糖电泳分析，电压150V，25分钟后在紫外灯光下进行产物观察，结果如图1显示，可以扩增出单一条带，片段的大小在500 bp左右。
扩增结果(见附图1)所示，M为DL2000分子量标准，1为根系附着微生物总DNA的扩增产物，扩增条带较清晰，无引物二聚体影响。其中附图上部的简称代表不同的取样河流，XBX（新宝象河）、H（海河）、XB（虾坝河）、YA（姚安河）、JJ（金家河）、GP（广谱沟）、PLJ（盘龙江）、XBH（西坝河）、CF（船房河）、DG（大观河）和XYL（新运粮河）扩增的序列经克隆、测序后，在GenBank中进行核酸同源性的比对，结果显示，获得的序列与GenBank中反硝化细菌nirK基因(HM235849)的序列同源性为99％。说明引物及扩增产物都正确，可用于下一步实验研究。将特异性片段进行凝胶回收后，进行克隆转化，将获得的阳性克隆交由上海英俊生物技术有限公司进行测序分析。
SEQ ID No.1：
ATCATGGTGCTGCCGCGTGAAGGCCTGAAAGACCACAAGGGCAATGATCTGCCTTATGACAAGGTATACTATGTCGGCGAGCAGGACTTTTATGTCCCCAAGGATGCTGACGGCAACTACAAGAAGTATGAGAGTGCCGGCGATGCCTATTCGGACGTGCTCGAAGTGATGAACACGCTGACCCCGAGCCACATCGTCTTCAATGGTGCTGTCGGAGCTCTGACAGGCGACAATGCTATGACGGCAGAAGTCGGCGACCGGGTCTTGATCCTGCATTCGCAGGCCAATCGCGATACCCGTCCTCACCTGATCGGTGGCCACGGTGATTATGTCTGGGCGACGGGCAAGTTTGCCAACCCGCCGGAGCTCGACCAGGAAACCTGGTTCATCCCTGGTGGTGCTGCGGGCGCTGCCTACTACACCTTCCGGCAGCCGGGCATCTACGCCTATGTCAACCACAACCTGATCGAGGCA
该序列与Zhang,Q.F.等(Zhang,Q.F.,Zhu,Y.G.andYu,S..Using nitrite reductase genes to investigate denitrifiers diversity in Jiulong River estuarine sediment. Submitted(17-MAY-2010) Urban Wetland Ecology and Environment，2010.) uncultured bacterium获得的nirK基因序列(HM235849)的同源性为99％。说明获得的序列正确。
实施例2荧光定量PCR体系的建立及检测分析
特异性引物对与实施例1相同
(1)制作标准曲线所需质粒DNA模板的制备
将实施例1获得的产物进行琼脂糖凝胶回收后连接pMD-19T载体(TaKaRa，大连)，克隆筛选后进行测序分析，测序结果(SEQIDNo.1)显示与GenBank中多个反硝化细菌nirK基因的序列99％同源，说明所获得序列正确，阳性质粒可用于质粒标准品的制作。使用超微量紫外分光光度仪测定该标准品质粒DNA浓度为141.6 μg/mL，将初始标准品质粒溶液进行10倍系列梯度稀释。
(2)标准质粒浓度的计算
提取经过测序验证的阳性克隆的质粒，将获得的质粒DNA浓度换算成拷贝数。质粒拷贝数的计算方法为：
质粒拷贝数(copy/μL)＝质粒浓(μg/μL)×6.023×1023(copy/μL)/MW(g/mol)
(其中MW＝(克隆载体长度+目的片段长度)(bp))×660g/mol/bp)。
已知：cDNA=141.6μg/mL。质粒pMD19-T序列长度为2692bp, nirK基因插入片段长度为474bp；单个碱基的平均摩尔质量为660g/mol，计算公式为：
分子量（MW）=(2692+474)×660=2.09×106g/mol.
拷贝浓度:6.02×1023×(141.6×10-9)÷(2.09×106)=4.08×1010copies/μL.
将上述已知拷贝浓度的质粒溶液作为标准品质粒，在进行qPCR标准曲线制作时按10倍梯度稀释（浓度范围为4.08×101-4.08×109 copies/μL）。
将已知拷贝数的质粒进行109-101copy/μl系列梯度稀释，获得质粒标准品。
以稀释好的质粒(109-101copy/μl)为模板，qPCR反应采用qPCR试剂盒SYBR? PremixExTaqTM (TIiRNaseHPlus)（大连宝生物公司），反应体系为20μL：1μL质粒DNA模板，10μLMix，引物对各0.4μL，Rox 0.4μL，以无菌超纯水（ddH2O）补足体积。每次qPCR反应中均设置阴性对照（模板为1μLddH2O），qPCR程序为：94°C热启动1min；94°C变性5s，58°C退火30s，72°C延伸30s，在72°C延伸时收集荧光，循环35次。
标准曲线及所有待测样品均设置3个平行反应。反应在ABI7500定量PCR仪（美国Life Technologies）中进行，利用ABI7500软件（Version2.0.6）检测和收集荧光信号，并进行数据分析。
ABI7500软件（Version2.0.6）实时荧光定量分析软件自行绘制出反应的扩增曲线(见附图2)。扩增曲线显示，从左至右5条曲线依次代表标准品的107，106，105，104，103的梯度稀释液的扩增曲线，5个质粒标准品扩增曲线较光滑，呈现典型的S型曲线，且各循环阈值(Ct值)间隔均匀。
根据扩增曲线提供的标准品各梯度浓度及反应的循环阈值(Ct值)，ABI7500软件自行绘制出反应的标准曲线(见附图3)。该标准曲线的相关系数R2＝0.999，斜率为-3.491，计算其扩增效率Eff %＝93.39％，符合ABI7500荧光定量分析对标准曲线的要求。
测定各浓度稀释梯度的标准品及样品在PCR过程中的溶解温度并绘制溶点曲线(见附图4，图5)。标准品及样品的熔解曲线峰型单一，且标准品及样品熔解温度相同(91.7±0.4℃)，表明扩增反应产物熔解温度较均一，特异性好且无引物二聚体。
实施例3：
滇池流域不同河流中种植的凤眼莲根系反硝化细菌nirK基因拷贝数变化规律分析
采用实施例1的荧光定量PCR体系
荧光定量PCR仪采用Life Technology公司(USA)生产的ABI7500荧光定量PCR进行。
分别于11条河流中采集根系样品，提取DNA，利用实施例1提供的特异引物对采用实施例2的扩增体系进行扩增，根据标准曲线计算即可获得根系附着微生物总DNA中nirK基因的拷贝数（图6）。结果显示在不同的河流中，因为河流水源和环境条件不同，因此各河流水质参数不同，导致各河流中种植的凤眼莲根系表面附着的反硝化细菌nirK基因的丰度不同，其中同一起源不同支流的XB和YA两条河流的nirK基因丰度最高，由此可见，反硝化细菌nirK基因的丰度和水质及其源头具有较大的关联。
Claims (5)
1.漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，其特征在于:所述的实时检测方法为荧光实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：
a）在待检测河流的漂浮植物种植区域建立对角线5点采集点并标记为采样点，在采样点采集植物根系样品，汇总后混合均匀；用无菌水清洗数次，吸干水分，随机选取2g新鲜根系，放入装有无菌去离子水的无菌三角瓶中，并加入灭菌的玻璃珠，超声5~15s，剧烈震荡15~30min，过滤，取滤液；滤渣再用无菌去离子水反复冲洗，冲洗液过滤，两次滤液合并，经0.22μm的微孔滤膜抽滤，滤膜放入Eppendorf管中，保存于-80℃；分别在每个采样点进行四次采样，并重复上述步骤，得到多个采样样本；
b)将滤膜在无菌条件下剪成1-2 mm的碎屑，通过E.Z.N.A.? Water DNA Kit试剂盒分别提取样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH2O中，以nirK基因的特异性通用引物对SEQIDNo.2和SEQIDNo.3对每个样本DNA进行PCR扩增，获得大小在500bp的特异性片段；PCR扩增产物经TA克隆构建质粒后进行测序，确定引物的特异性及PCR扩增产物为目标片段；提取经测序后的阳性克隆作为标准质粒测定DNA浓度并换算为拷贝数，按10倍梯度稀释后用以绘制标准曲线；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出样本DNA中nirK基因的丰度。
2.根据权利要求1所述的漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，其特征在于：所述的特异性片段测序为SEQIDNo.1；所述的标准曲线为Y1＝-3.491X1+41.693，R2＝0.999，其中Y1为荧光时实定量PCR反应的Ct值，X1为nirK基因构建的标准质粒拷贝数对数值。
3.根据权利要求1或2所述的漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为20μL，其中包括样品模板1μL，所述样品模板为样品DNA或1μL质粒标准品DNA，Mix10μL，引物对各0.4μL，Rox 0.4μL，以无菌超纯水补足体积；每次Real-time PCR反应中均设置阴性对照，所述阴性对照中样品模板采用1μLddH2O，定量PCR程序为：94°C热启动1min；94°C变性5s，58°C退火30s，72°C延伸30s，在72°C延伸时收集荧光，循环35次。
4.根据权利要求3所述的漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR仪为ABI公司或Stratagene公司或Eppendorf公司或BioRad公司生产的荧光定量PCR仪。
5.一种应用权利要求1至4中所述的漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法的河流中漂浮植物根系表面附着反硝化细菌变化规律的确定方法，其特征在于包括以下步骤：
a）在待检测河流的漂浮植物种植地区域建立对角线5点采集点并标记为采样点，在采样点采集植物根系样品，汇总后混合均匀；用无菌水清洗数次，吸干水分，随机选取2g新鲜根系，放入装有无菌去离子水的无菌三角瓶中，并加入灭菌的玻璃珠，超声5~15s，剧烈震荡15~30min，过滤，取滤液；滤渣再用无菌去离子水反复冲洗，冲洗液过滤，两次滤液合并，经0.22μm的微孔滤膜抽滤，滤膜放入Eppendorf管中，保存于-80℃；分别在每个采样点进行四次采样，并重复上述步骤，得到多个采样样本；
b)将滤膜在无菌条件下剪成1-2mm的碎屑，通过E.Z.N.A.? Water DNA Kit试剂盒分别提取样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH2O中，以nirK基因的特异性通用引物对SEQIDNo.2和SEQIDNo.3对每个样本DNA进行PCR扩增，获得大小在500bp的特异性片段；PCR产物经TA克隆构建质粒进行测序，确定引物的特异性及PCR产物为目标片段，同时提取经测序阳后的性克隆作为标准质粒测定DNA浓度换算拷贝数，按10倍梯度稀释作为标准曲线；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出样本DNA中nirK基因的丰度；
c）分别采集不同河流的漂浮植物根据样本，并对其上附着的反硝化细菌nirK基因的丰度进行统计，分析在不同环境参数条件下种植的漂浮植物根系表面反硝化细菌nirK基因丰度的变化规律。
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