CN103408787B - 淡水鱼源胶原蛋白海绵材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淡水鱼源胶原蛋白海绵材料及其制备方法，该方法包括以下步骤：1）用稀酸溶液溶解淡水鱼源胶原蛋白，得到胶原溶液；2）向胶原溶液中加入磷酸盐缓冲溶液，并将pH调节为6.0~6.5；3）进行超声波处理并将经超声波处理后的溶液pH调节至7.0~7.6，置于25~33℃和20~28℃水浴中，各静置2~10小时，形成浑浊的胶原胶；4）对浑浊的胶原胶进行离心处理，得到浓缩胶原胶；5）将得到的浓缩胶原胶经洗涤、离心后倒入模具中，经超声波处理、冷冻干燥，得到淡水鱼源胶原蛋白海绵材料。本发明方法制备的胶原蛋白海绵材料具有较高的密度、胶原分子之间以重组纤维的形式紧密结合，产品具有较好的性能一致性和体内稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种淡水鱼源胶原蛋白海绵材料及其制备方法，属于医学生物材料技术领域。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是多细胞生物中含量最丰富、分布最广泛的蛋白质种类之一。在生物体内，胶原蛋白与聚多糖等成分一起形成精密有序的细胞间网络结构——细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，对机体细胞的发育、迁移以及机体组织的形成和功能发挥等均产生重要作用。目前已知的胶原蛋白种类超过27种，分别被命名为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等。由于胶原蛋白具有良好的生物相容性并能促进机体细胞的生长、迁移和增生，因此被广泛应用于生物医学材料、医学组织工程和医学美容等领域。如胶原海绵在创伤修复、快速止血中的应用；胶原胶在面部皮肤除皱、靶向药物制备及药物缓释中的应用；胶原复合材料在人造血管、人造皮肤和骨骼、人工眼角膜移植等医学组织工程中的应用。
目前，用于快速止血、创伤修复和空腔填充的商品化医用胶原海绵材料主要来自于哺乳动物中提取的胶原蛋白。但是，哺乳动物来源的胶原蛋白资源有限且胶原蛋白提取、纯化程序繁琐，医用胶原产品价格昂贵，极大的限制了其应用范围。此外，由于存在人畜共患疾病(如疯牛病、口蹄疫等)的潜在风险，这类来源的胶原蛋白产品在生物安全性方面也受到使用者的质疑。近年来，鱼类胶原蛋白资源正逐步受到关注。与传统的哺乳动物胶原相比，鱼类胶原在来源的广泛性、生物安全性和产品成本等方面均具有更大的优势。因此，围绕鱼源胶原蛋白的性能研究及其在生物医学材料领域中的应用备受瞩目。中国发明专利公开说明书CN 1239712C提供了一种深海鱼鱼皮组织工程胶原蛋白的制备方法。该发明通过碱溶液和限制性酶处理鱼皮，得到纯度高，相容性好的胶原蛋白。中国授权发明专利CN 101137669 B公开了一种海洋生物胶原蛋白的纯化方法及多孔海绵的制备方法。该发明通过化学处理步骤纯化胶原蛋白，从而改善其气味和产品外观并在此基础上制备具有多孔结构的海生胶原海绵。与海洋鱼类相比，淡水鱼类胶原蛋白具有更大的实际应用价值。一方面，中国是世界淡水鱼资源最丰富的国家之一，这为淡水鱼胶原的提取和开发利用提供了充足的原料供给；另一方面，淡水鱼胶原比海洋鱼类胶原蛋白具有更好的热稳定性能，更适合用于需要具备完整三螺旋分子结构的胶原医用生物材料的制造。尽管如此，作为快速止血、创伤修复和空腔填充作用的淡水鱼类胶原海绵材料，与哺乳动物胶原相比，在热稳定性、体内降解稳定性以及体内材料形态学稳定性等方面仍存在明显不足：如在人体温度条件下易出现热变性、吸水溶胀后材料固有形态丧失以及体内快速降解等现象而不能充分发挥其生物功能。而这些性能的提高又与胶原材料的密度大小和胶原分子间结合的紧密程度密切相关。因此，利用技术手段提高淡水鱼类胶原海绵材料的密度和胶原分子间结合的紧密程度进而提高材料性能以满足应用需要成为拓展淡水鱼类胶原应用领域的当务之急。
将胶原蛋白配置成胶原溶液后直接进行冷冻干燥或进行纤维重组后再进行冷冻干燥制备胶原海绵材料是目前的常用方法。由于受胶原蛋白溶解度的限制，冷冻干燥前的胶原溶液或胶原胶中含有大量的水或溶剂，导致冻干的胶原海绵材料密度较小且易形成较大的、不均一海绵孔径，因此产品机械性能较差且在使用过程中出现易降解、快速溶胀而丧失海绵原始形态以及细胞附着面积较小等问题。
由于采用交联技术对胶原海绵材料性能进行改性存在这样或那样的问题：如物理交联方法(热交联法、紫外交联法等)往往效果不理想或导致胶原分子的三螺旋结构部分破坏；而化学交联则存在化学试剂残留或胶原材料体内降解后化学试剂的体内释放等问题，因此，纤维重组技术成为改进胶原海绵材料性能的理想技术手段。纤维重组是指天然胶原蛋白单分子能在适宜的体外条件下，经过有规则的分子重排，形成具有与生物体内结构类似的胶原纤维。纤维重组后，胶原或胶原材料的生物稳定性可以显著提高。中国授权发明专利CN100372579C提供了一种含有自体组织化磷灰石-胶原复合体的交联磷灰石-胶原多孔体及其制备方法。该方法利用纤维重组技术制备哺乳动物胶原和磷灰石的复合材料，可用于骨组织工程；中国发明专利CN102341436 A公开了一种取向胶原凝胶的制备方法。该方法利用纤维重组技术结合流体力学作用制备具有高度取向的胶原凝胶；中国授权发明专利CN101323670 B公开了一种医用级重建胶原交联改性的方法。该方法利用纤维重组技术改进胶原的性能并应用于医用生物材料。但是，胶原的体外纤维重组受诸多因素的影响，如pH、温度、离子种类和离子强度、胶原浓度等。不同种类或来源的胶原蛋白具有不同的最适体外纤维重组条件；不同条件下，重组胶原纤维的粒径和粒径分布有较大差异。而重组胶原纤维的粒径及其粒径分布与胶原材料性能密切相关。重组胶原纤维粒径越大、粒径分布越均一，则胶原的热稳定性能、耐酶降解性能以及材料形态稳定性能越好。胶原的体外纤维重组分为成核、纤维成长和平衡三个阶段。发明人研究发现，不同的胶原纤维重组阶段有不同的最适条件。在已公布的上述利用纤维重组技术制造胶原海绵材料的方法中均采用单一条件进行胶原的体外纤维重组，然后直接进行冷冻干燥以获取胶原海绵材料，不仅很难获得理想的重组纤维粒径，而且纤维粒径分布范围较宽，部分胶原甚至仍以单体分子或微纤维等小分子的形式存在，从而导致胶原海绵产品整体性能的不一致性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种淡水鱼源胶原蛋白海绵材料及其制备方法，该方法制备的胶原蛋白海绵材料具有较高的密度、胶原分子之间以重组纤维的形式紧密结合，产品具有较好的性能一致性和体内稳定性。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
1)用酸溶液溶解淡水鱼胶原蛋白制备胶原溶液，并用磷酸盐缓冲溶液(即PBS)和酸溶液调节胶原溶液pH，得到胶原浓度为1～5mg/mL、pH为6.0～6.5的胶原溶液；
2)将胶原溶液温度调节至20～25℃，然后进行超声波处理5～60分钟，超声波的频率为20～60Hz，功率为60～180W；
3)将步骤2)处理后的胶原溶液的pH调节至7.0～7.6，置于25～33℃水浴中，静置2～10小时；然后将水浴温度调节至20～28℃，继续静置2～10小时，形成浑浊的胶原胶；
4)对步骤3)得到的浑浊的胶原胶进行低温离心处理，离心条件为：离心力5000～20000×g、离心温度4～15℃，离心时间3～10min；离心后弃去上清液，得到浓缩胶原胶；
5)向步骤4)得到的浓缩胶原胶中添加1～3倍体积的去离子水，5～15℃静置5～10min后离心，离心条件同步骤4)，离心后弃去上清液；该离心处理步骤为1～3次；
6)将步骤5)得到的浓缩胶原胶倒入模具中，在4～10℃条件下超声波处理10～30min后，冷冻干燥，得到淡水鱼源胶原海绵；所述超声波的频率为40～100Hz，功率为40～300W。
所述淡水鱼为草鱼、鲤鱼、鳙鱼、青鱼、罗非鱼或乌鳢。
本发明具有以下优点：
1、由于胶原的体外纤维重组分为成核、纤维成长和平衡三个阶段，针对淡水鱼胶原不同的纤维重组阶段采用不同的、与其阶段相适应的条件，例如pH调节为6.0～6.5后、将温度调节为20～25℃，有利于淡水鱼胶原纤维核的快速、大量地形成；并且发明人发现该阶段的超声波处理不仅能够使纤维核的大小更加均一而且不会在短时间内由于纤维核的相互作用而抑制新核的形成；而在pH为7.0～7.6、温度为25～33℃的情况下则更有利于淡水鱼胶原纤维的成长；达到重组平衡时，将体系温度降低至20～28℃可以促进重组纤维的再聚集，进一步提高重组纤维粒径。经过以上步骤处理后，获得的重组纤维粒径较大，粒径分布范围较窄，胶原的热稳定性能、耐酶降解性能以及材料形态稳定性能显著改善。
2、胶原体外纤维重组后，采用多次离心的方法获得浓缩胶原胶，不仅可有效降低冻干前胶原胶中的水分含量还可以清除胶原胶中残余的微纤维或胶原分子单体，从而有效提高胶原海绵材料性能的一致性、增加材料密度进而提高胶原海绵材料的生物稳定性能。
3、胶原胶注模后采用超声波处理的方法进行脱气和均一化处理，能够有效改善胶原海绵材料的均一性和孔隙结构及分布。
附图说明
图1为实施例1制备所得到的胶原海绵的扫描电镜图谱。
图2为对比例1制备所得到的胶原海绵的扫描电镜图谱。
图3为对比例2制备所得到的胶原海绵的扫描电镜图谱。
图4为对比例3制备所得到的胶原海绵的扫描电镜图谱。
图5为对比例4制备所得到的胶原海绵的扫描电镜图谱。
图6为对比例5制备所得到的胶原海绵的扫描电镜图谱。
图7为实施例1制备得到的胶原胶经固定、脱水后用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。
图8为对比例1制备得到的胶原胶经固定、脱水后用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。
图9为对比例2制备得到的胶原胶经固定、脱水后用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。
图10为对比例3制备得到的胶原胶经固定、脱水后用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。
图11为对比例4制备得到的胶原胶经固定、脱水后用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。
图12为实施例1胶原纤维粒径分布统计图。
图13为对比例1胶原纤维粒径分布统计图。
图14为对比例2胶原纤维粒径分布统计图。
图15为对比例3胶原纤维粒径分布统计图。
图16为对比例4胶原纤维粒径分布统计图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
新鲜草鱼鱼皮人工去除附着的鱼肉和鱼鳞后洗涤干净并切成小块。向处理后的鱼皮原料中添加15倍体积的0.1mol/L的NaOH溶液浸泡24h，随后用去离子水充分洗涤至中性并用15倍体积的10％的正丁醇溶剂浸泡脱脂24h。脱脂鱼皮用去离子水反复洗涤、沥干后用含有2％胃蛋白酶的0.5mol/L的乙酸溶液(1:40，w/v)搅拌提取，重复提取2次，每次24h，分离并合并上清液。向上清液中添加NaCl至盐浓度为0.9mol/L，静置盐析24h后过滤，滤得的胶原沉淀用0.5mol/L的乙酸溶液复溶并依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析，最后冷冻干燥得到草鱼皮胶原蛋白样品。(以上所有操作均在低于15℃的条件下进行)
在4℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解300mg草鱼胶原蛋白并将溶液定容到50mL，得到浓度为6mg/mL的胶原溶液。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入等体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，然后用0.1mol/L的盐酸将pH调节至6.5，由于用于调节pH的0.1mol/L的盐酸体积可忽略不计，此时得到的胶原溶液浓度为3mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。
随后在25℃条件下对该胶原溶液进行超声波处理30分钟，超声波频率40Hz，功率为60W。超声波处理后，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至7.2，然后置于30℃水浴中，静置10小时，然后将水浴温度调节至25℃，继续静置10小时。将得到的浑浊胶原胶进行低温离心处理，控制离心力12000×g、离心温度控制在4℃，离心时间8min；离心后弃去上清液，并向剩余的浓缩胶原胶中添加2倍于浓缩胶原胶体积的去离子水，5℃静置10min后离心，离心条件同上，离心后弃去上清液并再次添加2倍体积的去离子水，静置并离心，离心条件同上，离心后弃去上清液；将浓缩胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在4℃条件下用频率60Hz、功率为120W的超声波处理30分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
实施例2
以新鲜青鱼鱼皮为原料提取、纯化酶溶性胶原蛋白，具体方法同实施例1。
在5℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解150mg青鱼胶原蛋白并将溶液定容到50mL。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入0.5倍体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，然后用0.2mol/L的盐酸将pH调节至6.0，由于用于调节pH的0.2mol/L的盐酸体积可忽略不计，此时得到的胶原溶液浓度为2mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。
随后在22℃条件下对该胶原溶液进行超声波处理20分钟，超声波频率为45Hz，功率为60W。超声波处理后，用0.05mol/L的氢氧化钾溶液调节胶原混合溶液pH至7.0，然后置于33℃水浴中，静置8小时，然后将水浴温度调节至23℃，继续静置8小时。将得到的浑浊胶原胶进行低温离心处理，控制离心力10000×g、离心温度控制在6℃，离心时间5min；离心后弃去离心上清液，并向剩余的浓缩胶原胶中添加3倍体积的去离子水，5℃静置8min后离心，离心条件同上，离心后弃去上清液得到浓缩胶原胶；将浓缩胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在10℃条件下，用频率为80Hz、功率为300W的超声波处理10分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
实施例3：
以新鲜鳙鱼鱼皮为原料提取、纯化酶溶性胶原蛋白，具体方法同实施例1。
在10℃条件下，用0.1mol/L的醋酸溶解400mg鳙鱼胶原蛋白并将溶液定容到50mL，得到浓度为8mg/mL的胶原溶液。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入等体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，然后用0.5mol/L的醋酸将pH调节至6.3。由于用于调节pH的0.5mol/L的醋酸体积可忽略不计，此时得到的胶原溶液浓度为4mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。
随后在24℃条件下对该胶原溶液进行超声波处理50分钟，超声波频率28Hz，功率为100W。超声波处理后，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至7.5，然后置于28℃水浴中，静置6小时，然后将水浴温度调节至20℃，继续静置6小时。将得到的浑浊胶原胶进行低温离心处理，控制离心力8000×g、离心温度控制在10℃，离心时间10min；离心后弃去上清液，并向剩余的浓缩胶原胶中添加2倍体积的去离子水，8℃静置10min后离心，离心条件同上，离心后弃去上清液并再次添加2倍体积的去离子水，静置并离心，离心条件同上，离心后弃去上清液；将浓缩胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在8℃条件下用频率为40Hz、功率为200W的超声波处理15分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
对比例1
在4℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解300mg草鱼胶原蛋白(草鱼胶原蛋白的制备方法同实施例1)并将溶液定容到50mL，得到浓度为6mg/mL的胶原溶液。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入等体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，然后用0.1mol/L的盐酸将pH调节至6.5。由于用于调节pH的0.1mol/L的盐酸体积可忽略不计，此时得到的胶原溶液浓度为3mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。将该胶原溶液置于水浴25℃条件下静置30分钟，然后用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至7.2，并将水浴温度调节至30℃，继续静置10小时后，将水浴温度调节至25℃，继续静置10小时。将得到的浑浊胶原胶体进行低温离心处理，控制离心力12000×g、离心温度控制在4℃，离心时间8min；离心后弃去离心上清液，并向剩余的浓缩胶原胶中添加2倍体积的去离子水，5℃静置10min后离心，离心条件同上，离心后弃去上清液并再次添加2倍体积的去离子水，静置并离心，离心条件同上，离心后弃去上清液；将浓缩胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在4℃条件下用频率60Hz、功率为120W的超声波处理30分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
对比例2
在4℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解300mg草鱼胶原蛋白(草鱼胶原蛋白的制备方法同实施例1)并将溶液定容到50mL，得到浓度为6mg/mL的胶原溶液。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入等体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，此时得到的胶原溶液pH为7.2，浓度为3mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。随后在30℃条件下对该胶原溶液进行超声波处理30分钟，然后置于30℃水浴中，静置20小时。将得到的浑浊胶原胶进行低温离心处理，控制离心力12000×g、离心温度控制在4℃，离心时间8min；离心后弃去离心上清液，并向剩余的浓缩胶原胶中添加2倍体积的去离子水，5℃静置10min后离心，离心条件同上，离心后弃去上清液并再次添加2倍体积的去离子水，静置并离心，离心条件同上，离心后弃去上清液得到浓缩胶原胶；将浓缩胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在4℃条件下用频率60Hz、功率为120W的超声波处理30分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
对比例3
在4℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解300mg草鱼胶原蛋白(草鱼胶原蛋白的制备方法同实施例1)并将溶液定容到50mL，得到浓度为6mg/mL的胶原溶液。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入等体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，然后用0.1mol/L的盐酸将pH调节至6.5，由于用于调节pH的0.1mol/L的盐酸体积可忽略不计，此时得到的胶原溶液浓度为3mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。随后在25℃条件下对该胶原混合溶液进行超声波处理30分钟，然后置于25℃水浴中，静置20小时。将得到的浑浊胶原胶进行低温离心处理，控制离心力12000×g、离心温度控制在4℃，离心时间8min；离心后弃去离心上清液，并向剩余的浓缩胶原胶中添加2倍体积的去离子水，5℃静置10min后离心，离心条件同上，离心后弃去上清液并再次添加2倍体积的去离子水，静置并离心，离心条件同上，离心后弃去上清液得到浓缩胶原胶；将浓缩胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在4℃条件下用频率60Hz、功率为120W的超声波处理30分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
对比例4
在4℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解300mg草鱼胶原蛋白(草鱼胶原蛋白的制备方法同实施例1)并将溶液定容到50mL，得到浓度为6mg/mL的胶原溶液。在冰浴条件下，向上述胶原溶液中缓慢加入等体积的0.01mol/L的PBS(pH7.4)，然后用0.1mol/L的盐酸将pH调节至6.5，由于用于调节pH的0.1mol/L的盐酸体积可忽略不计，此时得到的胶原溶液浓度为3mg/mL。所述0.01mol/L的PBS(pH7.4)的配备方法如下：Na2HPO4·12H2O：3.473g；NaH2PO4·12H2O：0.226g；NaCl：9.0g；三蒸水：1000mL。随后在25℃条件下对该胶原溶液进行超声波处理30分钟，超声波频率40Hz，功率为60W。超声波处理后，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节胶原溶液pH至7.2，然后置于30℃水浴中，静置10小时，然后将水浴温度调节至25℃，继续静置10小时。将得到的浑浊胶原胶均匀地铺在圆形模具中，在4℃条件下，用频率60Hz、功率为120W的超声波处理30分钟后，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
对比例5
在4℃条件下，用0.01mol/L的盐酸溶解300mg草鱼胶原蛋白(草鱼胶原蛋白的制备方法同实施例1)并将溶液定容到100mL，得到浓度为3mg/mL的胶原溶液。将得到的胶原溶液均匀地铺在圆形模具中，冷冻干燥，得到淡水鱼胶原海绵。
表1为实施例1和对比例1～5制备所得到的胶原海绵的各项性能指标测定结果。其中，胶原海绵‘密度’测定方法为：将胶原海绵裁剪成正方形，用游标卡尺精确测定海绵长、宽、厚度后并精密称量海绵质量并依据海绵体积和质量计算海绵密度；‘纤维平均粒径’和‘海绵平均孔径’根据扫描电镜图谱经图像分析软件测定；‘热变性温度’采用差示量热扫描仪测定(测定前样品在PBS缓冲溶液中溶胀48小时)；‘24小时体外酶降解率’采用将胶原海绵置于含0.1mg/mL胶原蛋白酶的Tris-HCl缓冲溶液(PH7.4)中，37℃酶解24小时后测定胶原蛋白的降解率；‘海绵形态完整率’采用将已知重量(W1)的胶原海绵置于PBS缓冲溶液中(PH7.4，25℃)，24小时后取出尚具有完整形态的胶原海绵，冷冻干燥至恒重后称重(W2)，按以下公式计算海绵形态完整率：海绵形态完整率％＝100×W2/W1；‘纤维重组程度’测定方法为：胶原纤维重组后离心、洗涤再离心，收集离心上清液，测定上清液中总羟脯氨酸含量并计算纤维重组程度，纤维重组程度％＝(1－b/a)×100，其中，a为纤维重组前胶原样品中的羟脯氨酸总量(mg)；b是纤维重组后样品上清液中的羟脯氨酸总量(mg)。
相对于本发明，对比例1取消了超声波辅助处理工序。可以发现，与实施例1相比，对比例1的胶原纤维重组程度明显下降(表1)，说明超声波处理有利于胶原核的生成而大幅提高胶原纤维重组程度；同时，对比例1胶原海绵空隙的均一性(图2)、纤维粒径大小及粒径分布的均一性(图8、13)、海绵材料的热稳定性、降解稳定性和形态完整率等指标也低于实施例(表1，图1、7、12)。
相对于本发明，对比例2和3取消了分段纤维重组技术(纤维重组条件分别为单一的pH7.2、30℃和pH6.5、25℃)。可以发现，在单一的纤维重组条件下，胶原纤维重组程度(表1)、纤维粒径(图9、10)与粒径分布均一性(图14、15)、海绵结构致密性(图3、4)以及材料热稳定性、降解稳定性和形态完整率等指标均低于实施例1(表1，图1、7、12)，说明分段纤维重组技术有利于提高胶原纤维重组程度、优化纤维形态从而提高胶原海绵材料性能。
相对于本发明，对比例4取消了胶原胶的离心浓缩和洗涤工序。可以发现，与对比例相比，在这种条件下虽然胶原纤维重组程度有所提高(表1)，但是获得的胶原纤维粒径大小和粒径分布均一性明显下降(图12、16)，胶原海绵密度也明显减小，海绵材料热稳定性、降解稳定性和形态完整率等指标均低于实施例1(表1)，说明胶原胶的离心浓缩和洗涤技术有利于提高胶原海绵材料密度和产品性能的均一性。
对比例5是采用酸溶解胶原后直接冷冻干燥的方法制备胶原海绵材料。从图2中可以看到，所得的胶原海绵为空隙尺寸较大且空隙大小高度不均一的多孔海绵结构，由于没有实施优化后的纤维重组、离心浓缩等技术，所得胶原海绵材料的各项性能指标均明显低于实施例1(表1)。
表1胶原海绵各项性能指标
Claims (4)
1.一种淡水鱼源胶原蛋白海绵材料的制备方法，包括用酸溶液溶解淡水鱼胶原蛋白制备胶原溶液的步骤、用磷酸盐缓冲溶液和酸溶液调节胶原溶液pH的步骤，其特征在于：经以上步骤处理后，所得胶原溶液浓度为1～5mg/mL、pH为6.0～6.5；然后再进行以下步骤：
1)将胶原溶液温度调节至20～25℃，然后进行超声波处理5～60分钟，所述超声波的频率为20～60Hz，功率为60～180W；
2)将步骤1)处理后的胶原溶液的pH调节至7.0～7.6，置于25～33℃水浴中，静置2～10小时；然后将水浴温度调节至20～28℃，继续静置2～10小时，形成浑浊的胶原胶；
3)对步骤2)得到的浑浊的胶原胶进行低温离心处理，离心条件为：离心力5000～20000×g、离心温度4～15℃，离心时间3～10min；离心后弃去上清液，得到浓缩胶原胶；
4)向步骤3)得到的浓缩胶原胶中添加1～3倍体积的去离子水，5～15℃静置5～10min后离心，离心条件同步骤3)，离心后弃去上清液；该离心处理步骤为1～3次；
5)将步骤4)得到的浓缩胶原胶倒入模具中，在4～10℃条件下超声波处理10～30min后，冷冻干燥，得到淡水鱼源胶原海绵；所述超声波的频率为40～100Hz，功率为40～300W；
所述淡水鱼为草鱼、鲤鱼、鳙鱼、青鱼、罗非鱼或乌鳢。
2.根据权利要求1所述的淡水鱼源胶原蛋白海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，超声波的频率为28～50Hz，功率为60～120W。
3.根据权利要求1或2所述的淡水鱼源胶原蛋白海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，将步骤1)处理后的胶原溶液的pH调节至7.0～7.6，置于28～33℃水浴中，静置2～10小时；然后将水浴温度调节至20～25℃，继续静置2～10小时，形成浑浊的胶原胶。
4.权利要求1～3任一项所述的方法制备的淡水鱼源胶原蛋白海绵材料。
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