CN103404368B - 人工繁育虫草菌种的复壮培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的人工繁育菌种的种性复壮方法，该方法主要的技术特征在于将已经持续使用多代的虫草菌种放置到野生环境中进行锻炼管理，并回收经过复壮的繁殖材料；该方法不仅有效的解决了人工繁育菌种的种性退化问题，更重要的是解决了虫草实际生产过程中人工繁育菌种的可持续生产的问题，为虫草的规模化可持续性生产提供了菌种保障。

Description

人工繁育虫草菌种的复壮培养方法

技术领域

本发明涉及一种菌种选育技术，更具体的说涉及一种人工繁育虫草菌种的复壮培养方法。

技术背景

虫草主要指冬虫夏草，同时也是其他以麦角菌科的真菌(虫草菌)与蝙蝠蛾科幼虫在特殊条件下形成的菌虫结合体，包括亚香棒虫草、凉山虫草和蛹虫草等；冬虫夏草，是我国特有珍稀名贵中药材。具有补肺益肾、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、阳痿遗精、病后体虚、老年慢性咳嗽等疾病。冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500-5200m局部高寒山区草甸地带。天然资源十分有限，近年来采挖过度造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。人工培养的关键是冬虫夏草菌能否侵染寄主昆虫，进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。野生冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫的的感染途径为，蝙蝠蛾属昆虫幼虫在野生环境中通过体表或食道感染中华被毛孢菌，但是上述方法，染菌率低，周期长，而且不能进行规模化生产。

目前寄主人工感染方法为将中国被毛孢孢子菌液采用涂抹于寄主体表、注射到寄主体内、灌注或通过饲料从寄主食道进入寄主体内。涂永勤等在期刊《食用菌》2010(3)中发表的《蝠蛾属幼虫感染冬虫夏草茵的实验研究》公开了多种以中华被毛孢孢子菌液作为冬虫夏草寄主感染的菌种材料。但是上述方法存在中华被毛孢菌种分离纯化难度大，且幼虫染菌率和染菌后存活率较低的问题。专利申请人在国家自然科学基金面上项目“冬虫夏草寄主幼虫适应饲料的机理及其生态适合度评估”(编号为81072997)、“冬虫夏草寄主昆虫拟青霉病的分子流行病学研究”(编号为81173479)和国家自然科学基金青年基金项目“人工繁育冬虫夏草寄主幼虫发育变异的影响因素研究”(项目批准号为30901964)的资助下对冬虫夏草寄主感染的菌种材料进行了研究。申请人在人工培养虫草研究的过程中发现，从经过数代人工培养后的冬虫夏草中采集子囊孢子、分生孢子和菌皮作为繁殖材料时，培养出的冬虫夏草的子囊孢子发育不完整，同时采集的繁殖材料对冬虫夏草寄主幼虫的感染率较野生资源获得的繁殖材料低。

虫草菌种在人工条件下繁育3-5代后就开始出现后代子囊发育不全或不发育以及菌种侵染力降低等较为明显的种性退化现象。而对于生产中虫草菌种种性退化的问题，传统的解决方法就是每年连续地从原生地环境中采集菌种。由于野生菌种资源有限，无节制地滥采滥挖不仅使菌种资源濒临灭绝，还将严重破坏自然生态环境，所以要实现菌种的永续自繁和虫草产业可持续性发展，必须采取人工繁育菌种的种性复壮技术。

发明内容

为解决人工繁育虫草菌种的种性退化问题，本发明提供了一种人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，包括以下步骤：

1)用人工繁育的第二代(或第三代、第四代、第五代以上等)虫草菌种对虫草寄主幼虫(人工或野生幼虫都可以)进行染菌，筛选最先恢复活力的感菌幼虫，继续培养1-2龄后，投放到复壮基地；

2)感菌幼虫适应野外环境的过渡期管理；

3)僵虫种性的锻炼期管理；

4)有性孢子和菌皮种性的复壮；

5)采集有性孢子和菌皮成熟的冬虫夏草，清洗虫菌复合体后，投放到经过消毒的培养基质中继续培养；

6)虫草的后熟；

7)采收虫草菌种。

筛选最先恢复活力的感菌幼虫。恢复活力的标准是开始进食和开始攻击其他同伴，以第一条恢复活力的幼虫开始到占整个待恢复活力寄主幼虫的40％的量作为复壮培养的虫草寄主幼虫。

步骤2)所述的过渡期管理为将恢复活力的感菌幼虫投放到原生环境后的最初1-2个月；在该时期应当将温度控制在5-25℃，土壤湿度控制在质量含水量50-80％，避免啮齿动物、飞禽对虫草寄主幼虫捕杀，避免畜牧对虫草寄主幼虫踩踏。

步骤3)所述僵虫种性的锻炼期管理为：在感菌幼虫投放地域要避免啮齿动物、飞禽对虫草寄主幼虫捕杀，但应当在感菌幼虫投放地域以放牧的方式挤压感菌幼虫生活的土壤基质，从而以紧实的土壤基质隔绝同伴或天敌的侵扰；保持植被基部裸露，增加土壤的供氧量和光照。

步骤4)所述的有性孢子和菌皮种性的复壮为控制土壤湿度为质量含水量60-80％；避免啮齿动物、飞禽对虫草寄主幼虫捕杀，避免畜牧踩踏，直至发育成有性孢子和菌皮成熟的虫草。

步骤6)所述虫草的后熟为将有性孢子成熟的虫草清洗后移栽到室内60-100℃高温消毒处理后的基质中，室内温度控制在8-25℃，采用60-100℃高温消毒处理后的冷水保湿，采用自然光周期和自然光强度培养7-15天，收集菌种材料。

有性孢子成熟的标志为子座开始出现白色的丝状物。

本发明的有益技术效果是：本发明提供的人工繁育菌种的种性复壮方法，不仅有效的解决了人工繁育菌种的种性退化问题，更重要的是解决了虫草实际生产过程中人工繁育菌种的可持续生产的问题，为虫草的规模化可持续性生产提供了菌种保障。

具体实施方式

实施例1染菌寄主幼虫的筛选考察

分别收集蝙蝠蛾人工饲养1-2个月的幼虫六组各1500条，分别给名为实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ、实验组Ⅳ和实验组Ⅴ。采集经过申请人提交的专利申请“一种冬虫夏草低海拔人工培养方法”(申请号:CN201210292550.6)记载的方法培养冬虫夏草，从该方法培养的冬虫夏草的子囊孢子、分生孢子和菌皮作为菌种材料，按该方法重复培养冬虫夏草；充分上述操作3次以上，采收得到的子囊孢子、分生孢子和菌皮作为繁殖材料，将这些繁殖材料混合作为人工扩繁繁殖材料。将人工扩繁繁殖材料转入空气洁净度要求不低于10万级的环境条件下接种；工作人员要求穿戴工作服、口罩和帽子。

分别对实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ、实验组Ⅳ和实验组Ⅴ进行人工扩繁繁殖材料感染处理。感染的方法参考“一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法”(申请号:CN201210338583.X)记载的方法。感染后不断收集染菌幼虫；筛选的标准是：1)寄主幼虫活跃度降低，2)不进食。每组挑选500条。对上述感染中华被毛孢菌的幼虫集中饲养，集中饲养期间除了提供常规的饲料用量外，需要提供足够的水分。通过喷洒方式接种的和通过灌喂方式接种的需要增加后续供水量；通过拌入饲料或混合入基质方式接种的需要增加饲料或基质的湿度。集约化饲养在8-18℃的温度条件下完成。在集中饲养期间，不断挑选活跃度恢复的幼虫，直到筛选到规定数量为止，判断的标准是：1)开始恢复进食；2)开始攻击其他的寄主幼虫。实验组Ⅰ筛选的量是100条，实验组Ⅱ筛选的量是150条，实验组Ⅲ筛选的量是200条，实验组Ⅳ筛选的量是250条，实验组Ⅴ筛选的量是300条。

分别将实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ、实验组Ⅳ、实验组Ⅴ投放到冬虫夏草产区地域进行培养，为防止牛羊等大型动物随时践踏，培养地域地四周用铁丝网围住。复壮基地坡度在10-30度之间为宜，沥水性好；有除草坪植物以外的其他灌木在内生长以避免高强度的日照和鸟类对成虫的危害。培养50天后统计各组寄主幼虫的存活率。具体如表1所示。

表1  不同筛选比例对寄主幼虫存活率的影响

表1中记载的内容证明，对寄主幼虫的选择高于40％后，寄主幼虫的存活率就大幅度的下降，因此筛选强壮幼虫的比例以40％为最佳。

将实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ、实验组Ⅳ、实验组Ⅴ的寄主幼虫投放的幼虫逐渐适应野外的生活环境，并开始从投放区域爬行到周边的原生腐殖土生活。这一阶段的幼虫将接受自然界温度、湿度和光照的自然锻炼，并产生对各类病害、虫害和鼠害的抗性，一直到幼虫发育为僵虫。当基地青草开始生长并逐渐覆盖地表时，可以适度允许牛、羊等食草动物进入基地啃食青草，以使草皮基部裸露在外为度，这将为地下生长发育的感菌幼虫提供充足的氧气条件，同时光照也将对幼虫生长发育产生积极的影响。种性复壮期要严禁牛、羊等大型动物进入基地践踏；要采取物理或化学措施防止鼠类和鸟类天敌对感菌幼虫的危害。僵虫形成到子座开始萌发期间要防止其生长的基质湿度不足，晴天的早晚要浇水，多少的标准以湿透僵虫所在的土层为宜。充足的水分条件不仅有利于子座的生长，也有利于生成更结实的菌皮。这一阶段的子座发育将接受自然界温度、湿度和光照的自然周期锻炼，和菌皮一起产生对各类病害的抗性。种性复壮期要严禁牛、羊等大型动物进入基地践踏；要采取物理或化学措施防止鼠类和鸟类天敌对感菌幼虫的危害，一直到发育为有性孢子(包括子囊孢子和分生孢子)成熟的冬虫夏草。当冬虫夏草的有性孢子和菌皮在种性复壮基地发育成熟后，需要经过一个后熟期来适应从野外回到室内的过程。操作时，用铁锹等工具将冬虫夏草移栽到菌种材料收集盘内进行后熟培养。移栽时去掉携带的基质或其他杂质。后熟期间用经过60-100℃高温消毒的冷水保湿，并置于5-25℃条件下，采用自然光周期和自然光强度培养。后熟约1个星期，复壮冬虫夏草的有性孢子(包括子囊孢子和分生孢子)和菌皮逐渐适应了室内环境。收集经过后熟周期的性孢子和菌皮混合，作为复壮菌种繁殖材料。

实施例2复壮菌种繁殖材料的活性考察

参考申请人提交的专利申请“一种冬虫夏草低海拔人工培养方法”(申请号:CN201210292550.6)记载的方法培养冬虫夏草；收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTuetMa幼虫，4000条虫六等分放于8个1m²干净的经消毒的搪瓷盘中，每组500条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d，使虫体恢复生长。然后清除剩余全部食用。停喂2～3d后，取上述任意3组饲喂人工扩繁繁殖材料混悬液喷淋过的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶，作为对照组；取任意4组饲喂实施例1得到的复壮菌种繁殖材料混悬液喷淋过的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶，作为实验组；每天清除剩余物，第2d用同样方法饲喂，连喂30d，观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮。活动敏捷，反应灵敏的虫，然后上覆1Ocm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在1～5℃，继续饲喂，分别在1个月、3个月、6个月和1年后，分别将实验组和对照组个一组挖出虫体，计算感染僵化的成活的和死亡的虫体数；得到混合饲料饲喂方法组数据。

按1个月、3个月、6个月和1年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取20头幼虫进行调查。将幼虫体表面消毒后，采用特制的工具在无菌条件下抽取微量的血淋巴制片，镜检观察，记录血淋巴内菌体的形态。追踪观察幼虫僵化情况。在对菌体进行观察的同时，抽取微量带菌血淋巴涂抹在灭菌PDA培养基平板上，置于18℃恒温箱内培养。每日一次取出培养皿镜检观察菌体生长发育的状态，或挑取菌体及其培养物制片观察。待涂布菌体处形成菌落，挑取菌落表面的菌丝体制片镜检观察；具体结果如表2所示。

表2  不同菌种材料幼虫的感染情况

结果表明,寄主幼虫感染冬虫夏草菌是一个复杂的过程，需要一定的时间，才能完成整个侵染过程。由表1可知，采用实施例1所述的复壮菌种繁殖材料，菌种对寄主幼虫的感染能力最强，寄主幼虫接种1个月后即可感染上冬虫夏草菌。接种6个月后感染达高峰，感染率为100％。

饲养一年左右，幼虫即可发病僵化，接着萌生出幼芽，成长为子实体。将本发明提供的菌种染菌培养的蝙蝠蛾幼虫的出土20天的虫草与野生感菌幼虫子囊壳发育成熟的虫以及人工扩繁繁殖材料感菌幼虫出土20天的虫草相对比；发现本发明得到的复壮菌种繁殖材料染菌得到的虫草和野生冬虫夏草的子囊果、子囊孢子被认为与冬虫夏草天然的子囊果、子囊孢子形态特征完全一样；与人工扩繁繁殖材料感染的幼虫子囊壳发育成熟的虫相对比，发现在子囊孢子的形态上和虫体上有较大的差异，与人工扩繁繁殖材料生产的冬虫夏草虫体较小，同时子囊孢子在子实体上存在不饱满的现象，各组冬虫夏草的产量如表3所示。

表3  菌种材料不同对冬虫夏草产量及形态的影响

研究证明，经过3-5代人工繁育的虫草菌种会出现种性退化的现象；表象是后代子囊发育不全或不发育以及菌种侵染力降低等较为明显的种性退化现象。采用本发明提供的方法复壮菌种，生产的虫草，虫草级别和子囊饱满率上都比较接近。

Claims (7)

1.人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）用人工繁育的2代以上的虫草菌种对虫草寄主幼虫进行染菌，筛选最先恢复活力的感菌幼虫，继续培养1-2龄后，投放到复壮基地；

2）感菌幼虫适应野外环境的过渡期管理；

3）僵虫种性的锻炼期管理；

4）有性孢子和菌皮种性的复壮；

5）采集有性孢子成熟的虫草，清洗虫菌复合体后，移栽到经过消毒的培养基质中继续培养；

6）虫草的后熟；

7）采收虫草菌种材料。

2.根据权利要求1所述的人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：恢复活力的标准是开始进食和开始攻击其他同伴；以第1条恢复活力的感菌幼虫开始至收集完占整个感菌幼虫的40%数量的幼虫为止，作为复壮培养的感菌幼虫。

3.根据权利要求1所述的人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：

步骤2）所述的过渡期管理为将恢复活力的感菌幼虫投放到原生环境后的最初1-2个月；在该时期应当将温度控制在8-25℃，土壤湿度控制在质量含水量50-80%，避免啮齿动物、飞禽对虫草寄主幼虫捕杀，避免畜牧对虫草寄主幼虫踩踏。

4.根据权利要求1所述的人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：步骤3）所述僵虫种性的锻炼期管理为：在感菌幼虫投放地域要避免啮齿动物、飞禽对虫草寄主幼虫捕杀，但应当在感菌幼虫投放地域以放牧的方式挤压感菌幼虫生活的土壤基质，从而以紧实的土壤基质隔绝同伴或天敌的侵扰；保持植被基部裸露，增加土壤的供氧量和光照。

5.根据权利要求1所述的人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：步骤4）所述的有性孢子和菌皮的种性复壮为控制土壤湿度为质量含水量60-80%；避免啮齿动物、飞禽对虫草的踩踏和取食，直至发育成有性孢子和菌皮成熟的虫草。

6.根据权利要求1所述的人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：步骤6）所述虫草的后熟为将有性孢子和菌皮成熟的虫草清洗后移栽到室内60-100℃高温消毒处理后的基质中，室内温度控制在8-25℃，采用60-100℃高温消毒处理后的冷水保湿，采用自然光周期和自然光强度培养7-15天，收集菌种。

7.根据权利要求5所述的人工繁育虫草菌种的种性复壮方法，其特征在于：有性孢子和菌皮成熟的标志为子座开始出现白色的丝状物。