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CN103391781A - 无/低副作用的抗结核病药物复方 - Google Patents

无/低副作用的抗结核病药物复方 Download PDF

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CN103391781A CN2011800683192A CN201180068319A CN103391781A CN 103391781 A CN103391781 A CN 103391781A CN 2011800683192 A CN2011800683192 A CN 2011800683192A CN 201180068319 A CN201180068319 A CN 201180068319A CN 103391781 A CN103391781 A CN 103391781A
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杨东和
熊正辉
张温良
石东原
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Abstract

本发明提供了一种无/低副作用的抗结核病的药物组合物，其中，包含药学有效量的选自异烟碱酰胺、立复霉素、丙基硫异烟酰胺和乙酰胺醇中的一种或多种，以及药学有效量的可降低抗结核病药物副作用的物质。

Description

无 /低副作用的抗结核病药物复方 技术领域
本发明涉及一种无 /低副作用的抗结核病药物复方。 背景技术
根据世界卫生组织 (WHOM古计， 全球大约有三分之一的人口感染肺结核， 每年约有八百 万新增病例； 而台湾新登记的肺结核病患人数最近几年也不停爬升， 每十万人口有六十多人 感染肺结核， 但其中只有大约四分之三的人接受完整治疗； 根据卫生署的统计， 台湾每天至 少有 4.2个人死于肺结核； 在这么多接受肺结核药物治疗的病患中， 临床上最常见的药物副 作用即为肝毒性和神经系统病变 (如： 听神经和视神经病变)， 其中又以肝毒性最为常见。 再 加上台湾又是 B型及 C型肝炎的盛行区， 感染肺结核的肝炎患者也不在少数， ―假设每年有 14,000名新增的肺结核病患，粗略估计至少有 2,000名到 3,000名慢性肝病患者需接受抗结核 药物治疗， 因此在这些病患身上所可能发生的肝毒性是吾人不可忽视的医源性疾病。
多数的第一线抗结核药物， 例如： 异烟碱酰胺 (isoniazid, 俗称敌痨克星)、 丙基硫异烟酰 胺 (pyrazinamide , 俗称敌痨新迈)及立复霉素 (rifampin)等都有导致肝毒性发生的潜在不良反 应； 其中异烟碱酰胺 (isoniazid)是目前最有效的单一抗结核药物， 也最容易引起服用者产生肝 毒性； 在 60年代末期陆续有异烟碱酰胺 (isoniazid)造成肝毒性的报告； 异烟碱酰胺 (isoniazid) 所造成具有临床症状的肝毒性约 0.1-1%，而在 10-20%的病患中，则可观察到无症状的肝功能 异常， 这些肝功能异常通常于服药后两个月内发生。
如图 1 所示， 异烟碱酰胺（isoniazid)在肝脏中主要经由氮-乙酰氨基转移酶 (N-acetyltransferase, NAT)的帮助而乙酰化，产生的中间产物乙酰化异烟碱酰胺 (acetylisoniazid) 迅速被水解成乙酰化联胺 (acetylhydrazine)； 乙酰化联胺可以再经由氮-乙酰氨基转移酶 (N-acetyltransferase)被乙酰化成无毒性的双乙酰化联胺 (diacetylhydrazine), 或者经由细胞色素 P450 2E1 (CYP 450 2E1)氧化成具有肝毒性的分子， 其中包括乙酰化偶氮 (acetyldiazene；)、 乙酰 铵离子 (acetylonium ion)、乙酰自由基 (acetylradical)、乙烯酮 (ketene)等，另外在有氧及 NADPH 存在时，乙酰化联胺会被细胞色素 P450 2E1反应生成自由基而造成氧化压力，导致细胞死亡； 此外， 异烟碱酰胺 (isoniazid)亦可经由酰胺水解酶 (amidase)直接水解成有毒性的联胺 (hydrazine)，或者由上述乙酰化联胺 (acetylhydrazine)经酰胺水解酶 (amidase)水解成有毒性的联 胺 (hydrazine)。
确 认 本 近来有研宄显示， 联胺 (而非异烟碱酰胺或乙酰化联胺)是在兔及鼠体内造成异烟碱酰胺 引起的肝毒性 (I H-induced hepatotoxicity)最可能的主因， 研究者认为异烟碱酰胺引起的肝毒 性的严重性与血浆中联胺的浓度成正相关； 1999年 Sarich等人的报导则认为对硝基苯酚磷酸 二酯 (bis-p-nitrophenyl phosphate, ΒΝΡΡ, 为一种酰胺水解酶的抑制剂)可预防异烟碱酰胺引起 的肝毒性的伤害， 其保护机制应是通过抑制异烟碱酰胺产生联胺。
细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)在肝脏中会持续的表现， 并负责许多异物质（如： 肝毒素四 氯化碳 (CC14)以及乙酰氨酚 (aeetaminophen;)) 的代谢生物反应； 然而， CYP2E1在异烟碱酰胺 引起的肝毒性中所扮演的角色并不明确， 异烟碱酰胺本身即为 CYP2E1的一种诱导物； 有些 研究认为肝脏内的 CYP2E1与异烟碱酰胺引起的肝毒性的机制有关。 在体外试验中， 双硫仑 (disulfiram, DSF)及其代谢物二乙基二硫代氨基甲酸 (diethyldithiocarbamate)均被确认为老鼠及 人类肝脏微粒体 CYP2E1的选择性抑制剂 (selective mechanism-based inhibitors), Brady等人的 试验则显示老鼠服用单一口服剂量的双硫仑 (DSF)后，会造成免疫反应肝容量 (immunoreactive hepatic content)以及 CYP2E1催化活性快速且完全的下降。
Sodhi等人则在 1997年的报导指出， 氧化压力是造成幼鼠体内异烟碱酰胺及立复霉素引 起的肝毒性的因素之一。 有许多的研宄想要找出适当的生物标记 (biomarker)以评估体内氧化 伤害的速率， 目前可能适用的生物标记可分为三类， 分别为对脂质、 蛋白质、 核酸氧化伤害 的标记； 8-异构前列腺素 F2a (8-iso-prostaglandin F2a, 8-iso-PGF2a)是一种自由基引起花生四 烯酸 (arachidonic acid)发生脂质过氧化作用的产物， 其化学性质稳定， 8-iso-PGF2ct含量可作 为判断活体内脂质过氧化的新指标， 该脂质过氧化反映可能与体内自由基的产生、 氧化性的 伤害 (oxidative damage)及抗氧化剂的缺乏 (antioxidant deficiency)有关； 目前有许多方法可用来 测量 8-iso-PGF2a 含量， 包括酵素免疫分析法 (enzyme immunoassay) 放射免疫分析法 (radioimmunoassay)、 气相层析质谱仪 (gas-chromatography mass spectrometry)以及液相层析质 谱仪 (liquid chromatography mass spectrometry)等； 此外， 人类尿液中的 8-iso-PGF2ot及其代谢 物 2,3-dinor-8-iso-PGF2a含量可利用 C18固相萃取 (C18 solid phase extraction, SPE)准备样品 后， 再以液相层析串联式质谱仪 (LC/MS/MS)分析。
利用侵入式及非侵入式方法测试大鼠 (rat)肝功能， 以监测肝损害的发展以及筛选肝脏疾 病， 其中最常使用的方法包含测量血清中的天门冬氨酸转胺酶 (aspartate aminotransferase, AST).丙氨酸转胺酶 (alanine aminotransferase, ALT)以及碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase)数值， 以及测量肝细胞产物如： 胆红素 (bilirubin)、 白蛋白 (albumin)， 以及利用量测前凝血素时间 (prothrombin time)来检测凝血因子 (coagulation factors)等； 肝功能定量测试是根据几乎只经过 肝脏代谢的受质在血清中的浓度而定， 这些受质的清除是依肝门静脉、 肝动脉血流量以及由 肝细胞对这些受质的作用而定， 肝脏血流量与提供给肝脏的受质量有关， 反之， 该受质的清 除则决定于肝脏代谢的能力。
半乳糖galactose)是一种具有高萃取率 (extraction ratio), 90%在肝脏中代谢的醣类， 在肝 脏中， 半乳糖是由半乳糖激酶 (galactokinase)经过差向立体异构化反应 (epimerization), 将之转 换成 1-磷酸葡萄糖 (Glucose-1-phosphate); 半乳糖激酶的作用反应为肝细胞中半乳糖代谢途径 的速率决定步骤 (mte-limiting step) c半乳糖的高萃取率使得依赖肝脏血流量及肝脏功能的半乳 糖代谢作用成为检测肝功能最主要的方式， 目前并无一定的规则来评估大鼠的残余肝功能 (residual liver function), 量测确切化合物 (如： 半乳糖)的代谢能力， 可推测肝脏中代谢作用的 速率决定步骤， 亦可能取得残余肝功能的代表数质。
以半乳糖清除能力 (galactose elimination capacity, GEC)作为人类肝功能定量测试己行之 有年， 然而， 半乳糖清除能力测试需取得多个血液样本以建立标准曲线， 在临床应用上有其 困难度， 因此有许多研究使用半乳糖单点法 (Galactose Single Point, GSP以评估人类肝功能； 本发明发明人以半乳糖单点法测试慢性肝炎、 肝硬化以及肝癌病患， 结果显示半乳糖单点法 可精确测出这些肝脏疾病； 半乳糖单点法己被成功的应用到测试肝病患者排除如丙嗪 (promazine)及抗生素头孢酮 (cefoperazone)等药物的剩余肝功能。 此外， 半乳糖单点法己在美 国食品药物管理局 (FDA)所出版的指南 (Guidance for Industry)中成为建议采用测试肝功能的 方法之一。
由此可见， 上述现有抗结核药物异烟碱酰胺 (isoniazid)仍有诸多缺失， 实非良好的设计， 而亟待加以改良。 发明内容
本发明的目的即在于提供一种无 /低副作用的抗结核病药物新复方药物组合， 内含药学有 效量的异烟碱酰胺 (isoniazid, INH), 或再并用药学有效量的立复霉素 (rifampin, RIF), 或再并 用药学有效量的丙基硫异烟酰胺 (pyrazinamide, PZA) , 或再并用药学有效量的乙酰胺醇 (Ethambutol, EMB), 或再并用药学有效量的其它复方药物， 合并使用药学有效量的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶 (amidase)抑制剂， 以降低由异烟碱酰胺 (INH)所引起 的肝毒性等副作用。
可达成上述发明目的的无 /低副作用的抗结核病药物新复方， 内含药学有效量的异烟碱酰 胺 (isoniazid, INH), 或再并用药学有效量的其它复方药物， 合并使用药学有效量的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶 (amidase)抑制剂， 其中 CYP2E1抑制剂或 amidase抑 制剂选自于下列化合物所组成群组： 正二羟愈疮酸 (Nordihydroguaiaretic acid), (-) -表儿茶素没 食子酸酯 -)-Epigallocetechin-3-gallate；)、 茵陈色原酮 (Capillarisin)、 山奈酚 (Kaempferol)、 根皮 素 (Phloretin)、 橙皮素 (Hesperetin)、 6-姜辣醇 (6-Gingerol)、 没食子酸 (gallic acid)、 异甘草素 (Isoliquritigenin) 柚皮素 (Narigenin)、 二氢化槲皮素 ((+)-Taxifolin)、 汉黄芩素 (Wongonin)、 原 儿茶酸 (Protocatechuic acid)、 儿茶素 ((+)-Catechin)、 β-奈黄酮（β-naphthoflavone)、 恩贝素 (Embelin)> 反式肉桂酸 (trans-Cinnamic acid)、 表儿茶酚 ((-)-Epicatechin)、 根皮苷 (Phloridzin)、 鲸蜡醇聚氧乙烯醚、 聚氧乙烯硬脂酸酯、 聚氧乙烯月桂醚、 聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸 酯、 聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、 聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、 聚乙二醇 PEG 2000、 聚 乙二醇 PEG 400、 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 PLURONIC F-68、 聚乙二醇 PEG 4000、 反式肉 桂醛 (Trans-Cinnamaldehyde)、大豆甘元 (Daidzein)、异牡荆素 (Isovitexin)、 β-香叶烯 (P-Myrcene)、 懈皮素 (Quercetin)、 （+)-柠檬烯 ((+)-Limonene)、 杨梅素 (Myricetin)、 獬皮 (Quercitrin)、 木犀草 素 -7-葡萄糖苷 (Luteolin-7-Glucoside)、 桑叶素 (Morin)、 新橙皮苷 (Neohesperidin)、 橙皮苷 (Hesperidin)、 （-) -表没食子儿茶素（(-)-Epigallocatechin)、 木犀草素（Luteolin)、 金丝桃苷 (Hyperoside), 十四垸酸乙酯 (Ethyl Myristate)、 柽柳素 (Tamarixetin；)、 黄芩素 (Baicalein；)、 芸香 素 (Rutin)、黄芩 (Baicalin)、芹菜素 (Apigenin)、（+)-表儿茶素 （(+)-Epicatechin)、（-) -表儿茶素没 食子酸酯（(-：) -Epicatechin-3-gallate)、 水飞蓟宾（Silybin)、 牡荆素（Vitexin)、 金雀异黄酮 (Genistein)> 异鼠李素 (Isorhamnetin)、 香叶木素 (Diosmin)、 葛根素 (Puerarin)、 或伞形花内酯 0Jmbelliferone)、 高良姜素 (Galangin；)、 非瑟酮 (fisetin)、 聚氧乙烯蓖麻油、 十二垸基硫酸钠、 微晶纤维素、 二水磷酸氢钙、甘露醇 Mannitol、 聚氧乙烯醚 (40)氢化蓖麻油、蔗糖素、 交联聚 乙烯吡咯烷酮、 羧甲基淀粉钠、 交联聚乙烯吡咯垸酮、 丙烯酸树脂 Eudragit S 100、 交联羧甲 基纤维素钠、 薄荷脑、 邻磺酰苯酰亚胺、 羟丙基纤维素、 预胶化淀粉、 葡萄糖结合剂、 柠檬 酸、 气相二氧化硅、 聚乙二醇 PEG 8000、 山梨酸、 柠檬油、 羟丙基纤维素、 苯甲酸钠、 乙酰 磺胺酸钾、 羟丙基甲基纤维素、 羟乙基甲基纤维素、 甲基纤维素、 环己氨基磺酸钠、 乳糖单 水合物、 麦芽糖糊精、 甘油二十二垸酸酯、 氧化铁红、 单硬脂酸甘油酯、 共聚维酮 K28、 淀 粉乙酸酯、 硬脂酸镁、 十二烷基硫酸钠、 聚维酮 Κ-30、 苯甲醇、 对羟基苯甲酸甲酯、 对羟基 苯甲酸丙酯、 聚乙二醇硬脂酸酯 15、 丁基羟基茴香醚。 ' 更进一步， 本发明的无 /低副作用的抗结核病药物新复方包括药学有效量的丙基硫异烟酰 胺 (ΡΖΑ)，或再并用药学有效量的其它复方药物，合并使用药学有效量的酰胺水解酶 (amidase) 抑制剂， 其中 amidase抑制剂选自于下列化合物所组成群组： 獬皮素 (QUerCetin)、 高良姜素 (Galangin) 桑叶素 (Morin)、非瑟酮 (fisetin)、异甘草素、杨梅素 (Myricetin)、木犀草素 (Luteolin)、 山奈酚 (Kaempferol)、 茵陈色原酮 (Capillarisin)、 聚氧乙烯蓖麻油、 十二烷基硫酸钠、 聚氧乙 烯去乙水山梨醇单月桂酸酯、鲸蜡醇聚氧乙烯醚， 以降低由丙基硫异烟酰胺 (PZA)所引起的肝 毒性等副作用。
本发明所提供的无 /低副作用的抗结核病药物新复方， 亦可加入药学上可接受的赋形剂至 该复方， 该赋形剂可为稀释剂、 填充剂、 结合剂、 崩解剂、 润滑剂等， 例如： 聚氧乙烯去乙 水山梨醇单月桂酸酯、 聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、 聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯、 聚 氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、 聚氧乙烯月桂醚、 鲸蜡醇聚氧乙烯醚、 聚氧乙烯硬脂酸酯、 聚氧 丙烯聚氧乙烯共聚物 PLURONIC F-68 、 聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 PLURONIC F-127、 聚乙 二醇 PEG 400、 聚乙二醇 PEG 2000、 聚乙二醇 PEG 4000、 山梨醇酐单硬脂酸酯、 山梨醇酐 单油酸酯、 S-40聚氧乙烯（40)单硬脂酸酯、 聚乙二醇 PEG 8000、 乙酰氨基磺酸钾、 气相二 氧化硅、 胶态二氧化硅、 丁基羟基茴香醚、 玉米淀粉、 交联聚乙烯吡咯垸酮、 交联羧甲基纤 维素钠、 二水磷酸氢钙、 乙二胺四乙酸二钠、 乳糖、 乳糖单水合物、 乳糖 S.G、 低取代羟丙 基纤维素、 麦芽糖糊精、 甘露醇 Mannitol、 薄荷脑、 对羟基苯甲酸丙酯、 对羟基苯甲酸甲酯、 微晶纤维素、瓜尔胶、黄原胶、预胶化淀粉、 聚维酮 K-30、竣甲基淀粉钠、十二垸基硫酸钠、 蔗糖素、 聚乙二醇硬脂酸酯 15、 聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯醚 (40)氢化蓖麻油、 环己氨基磺 酸钠、 聚维酮 K90F、 氧化铁红、 羟丙基甲基纤维素、 樱桃、 柠檬油、 山梨酸、 苯甲醇、 甘草 素、 苯甲酸钠、 淀粉乙酸酯、 柠檬酸、 山梨糖醇、 膜衣 Opadry white, 葡萄糖结合剂、 硬脂 酸镁、 褐藻酸、 丙烯酸树脂 E90、 丙烯酸树脂 E、 甘油二十二垸酸酯、 月桂酸聚乙二醇甘油 酯、 共聚维酮 K-28 、 氢氯酸、 羥乙基甲基纤维素、 羟丙基纤维素、 甲基纤维素、 丙烯酸树 脂 100、 麦芽糖、 丙烯酸树脂 S100、 聚乙二醇 PEG 1450、 共聚维酮 K-90、 磷酸 85%、 聚氧 乙烯醚 -40氢化蓖麻油 (RH 40) 、 聚氧乙烯 (35)蓖麻油 (EL 35) 、 憐酸二氢钠、 蔗糖素、 枸橼 酸三乙酯、 柠檬酸三钠或其余列于美国 FDA Generally Recognized as Safe (GRAS)中的常用成 分。
本发明发明人鉴于现有抗结核药物异烟碱酰胺 (isoniazid)所导致肝毒性等副作用的缺点， 以及承袭本实验室先前专利案（低副作用的 INH新复方， 案号 096101545)及 (含异烟碱酰胺 (Isoniazid, I H)的低副作用新复方 (2), 案号 097141522) 的发明。 另夕卜， 在本发明发明人先前 专利申请案， PCT申请案号 PCT/CS2008/001353 (低副作用的异烟碱酰胺新复方） 发明中， 虽已揭示 INH单方并用部分本实验室揭露的 CYP2E1抑制剂的药学组合物，可降低 INH所导 致肝毒性等副作用， 但后续发明人的研宄， 发现并不是任意的剂量组合都可以于体内达到去 除 INH肝毒性的效果,例如，在动物体内实验发现,小鼠每日合并使用山奈酚 (Kaempferol) 3.78 mg/kg与 INH RIF 50 I 100 mg/kg腹腔注射持续 3周， 可显着抑制 INH所导致的肝毒性， 控 制组 (INH/RIF 50 1 100 mg/kg)的相关肝功能指针 GOT、GPT和 GSP值为 571±295 U/L、364±192 U/L和 866±339 mg/L, 而并用山奈酚 3.78 mg/kg组的 GOT值则为 89±19 U/L、 48±21 U/L和 245±98 mg/L, 接近正常值， 然而山奈酚使用剂量调整为 1.89 mg/kg后， 各项相关肝功能指针 相较于控制组所下降的幅度均未达并用山奈酚 3.78 mg/kg所获得的成效。 由以上动物试验结 果可知当合并使用 CYP2E1抑制剂时， 对 INH所导致肝毒性确实具有改善效果， 但必须限定 其使用剂量， 因此基于实验结果， 本发明着重于抑制剂使用剂量的决定。
与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果：
1. 本发明所提供的含异烟碱酰胺 (ISOniazid，I H)的无 /低副作用新复方， 与单独使用异烟 碱酰胺 (I H), 异烟碱酰胺 (INH)和 /或立复霉素 Crifampin, RIF)、 异烟碱酰胺 (INH)和 /或丙基硫 异烟酰胺 (pyrazinamide, PZA)的试验结果相互比较时， 在生化分析 (ALT、 AST值)、 病理学分 析、 剩余肝功能的量测 (GSP值、 GEC值)以及氧化压力的指标 (血桨中 8-iso-PGF2c^浓度)等 各方面的分析结果， 都有明显减少使用异烟碱酰胺 (INH)所造成的肝毒性副作用的功效。
2.本发明所提供的含异烟碱酰胺 (ISOniazid, INH:»的无 /低副作用新复方， 其中亦提供可作 为细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶 (amidase)抑制剂的中药药引，相较现有细 胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂或酰胺水解酶 (amidase)抑制剂，本发明所提供者是从天然中 药药引萃取， 无生理、 化学毒性， 且对于人类肝脏的细胞色素 P450 2E1活性有明显的抑制活 性。 附图说明
图 1为异烟碱酰胺 0 H)在肝脏中的代谢途径图；
图 2为对照组、 INH组、 BNPP-INH组、 DSF-I H组以及 BNPP-DSF-I H组大鼠， 天门 冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性分析， 数值的计算为 mean ± SD， *表示各试验 组与对照组比较后 P < 0.05者；
图 3为对照组 (图 3A及 C)与 INH组 (图 3B及 D)大鼠肝脏切片： 图 3A， 对照组相对正常 肝组织的型态 (H E染色， 400X); 图 3B， INH组在周围中央静脉 (V)的肝细胞呈现碎裂及空泡 化 (H E染色, 400X); 图 3C, 以电子显微镜检视对照组大鼠肝切片， Nu: 细胞核 (9,000X); 图 3D, 以电子显微镜检视 I H组大鼠肝切片， 相较于图 3C对照组的肝细胞切片， INH组大鼠 肝细胞的粗内质网 (rER)明显增加， Nu: 细胞核 (9,000X); 图 4为 8-iso-PGF2a-d4 (A)与 8-iso-PGF2a (B)的分子结构以及子离子光谱； 图 5为含有 250pg 8-iso-PGF2a-d4(A)的内标准品溶液、 含有 lOOpg 8-iso-PGF2a (B)的标准 品溶液与空白样本 (C)， 在多重反应监测模式 (MRM)侦测下的液相层析串联式质谱仪 (LC/MS/MS)色谱，质荷比 (m/z) 357/197以及质荷比 (m/z) 353/193的离子偶 (ion pairs)分别被用 来监测 8-iso-PGF2a-d4 (A) (作为内标准品）以及 8-iso-PGF2a (B)(作为标准品）； 波峰 1 : 空白血 浆； 波峰 2: 注入标准品的空白血浆；
图 6为对照组、 INH组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组以及 BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中 8^0-?0?2(1的浓度， 数值的计算为 mean ± SD, *表示试验组与对照组比较后尸 < 0.001者； # 表示各试验组与 INH组比较后 P < 0.05者。
图 7为对照组、 INH组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组以及 BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖 单点法 (GSP)值， 数值的计算为 mean ± SD, *表示试验组与对照组比较后 P < 0.001者； #表示 各试验组与 I H组比较后 < 0.001者； 58表示各试验组与 I H组比较后 P < 0.005者；
图 8为对照组、 INH组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组以及 BNPP-DSF-INH组大鼠半乳糖 清除能力 (GEC)值， 数值的计算为 mean ± SD， *表示试验组与对照组比较后 P < 0.001者； # 表示各试验组与 INH组比较后 P < 0.005者； 表示各试验组与 I H组比较后 P < 0.05者； 图 9为对照组、 I H组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组以及 BNPP-DSF-INH组各组半乳糖 单点法 (GSP)值与血桨中 8-iso-PGF2a的浓度具有高度相关的统计图；
图 10为对照组、 INH组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组以及 BNPP-DSF-INH组各组半乳 糖单点法 (GSP)值与半乳糖清除能力 (GEC)值具有高度相关的统计图；
图 11为对照组、 PZA组、 BNPP-PZA组及 BNPP组大鼠， 天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙 氨酸转胺酶 (ALT)活性分析， 数值的计算为 mean ± SD， *表示各试验组与对照组比较后 P < 0.05者；
图 12为对照组 (图 12A)与 PZA组 (图 12B)大鼠肝脏切片： 图 12A, 对照组相对正常肝组 织的型态 ( H E染色, 400X);图 12B. PZA组在周围中央静脉 (V)的肝细胞呈现碎裂及空泡化 (H E染色， 400X);
图 13为 PZA组、 BNPP-PZA组大鼠半乳糖单点法 (GSP)值， 数值的计算为 mean ± SD; 图 14为对照组、 INH-RJF组、 INH-RIF-PZA组、 Kaempferol-INH-RIF组、 Quercetin-INH-RIF 组、, Kaempferol-INH-RIF-PZA组及 Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠， 天门冬氨酸转胺酶 (AST) 与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性分析， 数值的计算为 mean ± SD;
图 15为对照组、 I H-RIF组、 INH-RIF-PZA组、 Kaempferol-INH-RIF组、 Quercetin-INH-RIF 组、 Kaempferol-INH-RIF-PZA组及 Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠半乳糖单点法 (GSP)值， 数 值的计算为 mean ± SD; " 图 16 为空白对照组 (A)、 INH-RIF-PZA 控制组 (B；)、 Quercetin-INH-RIF-PZA 组 (C；)、 Kaempferol-INH-RIF-PZA组 (D)， 于实验 3周小鼠肝脏切片；
图 17 为空白对照组（A)、 I H-RIF 控制组（B)、 Quercetin-INH-RIF 组（C)、
Kaempferol-INH-RIF组 (D)， 于实验 3周小鼠肝脏切片；
图 18为对照组 (A)、 INH-RIF组 (B)、 MH-INH-RIF组 (C)、 MM-INH-RIF(D)组及 ML-INH-RIF 组 (E)， 于实验 3周小鼠肝脏切片；
图 19为 Chlorzoxazone + Rifamate并服或不并服甘露醇 Mannitol, Chlorzoxazone于健康 受试者血中浓度图； 实心方块为 Rifamate控制组， 给予 Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate (INH/RIF 150/300 mg);空心圆形为 HUCHE033实验组，给予 Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate (INH/RIF 150/300 mg) +甘露醇 Mannitol 100 mg;
图 20为 Chlorzoxazone + Rifamate并服或不并服甘露醇 Mannitol, Chlorzoxazone于健康 受试者血中浓度图； 实心方块为 Rifamate控制组， 给予 Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate (INH/RIF 150/300 mg);空心圆形为 HUCHE033实验组，给予 Chlorzoxazone (500mg) + Rifamate (INH/RIF 150/300 mg) +甘露醇 Mannitol 100 mg。 具体实施方式
本发明将就下列实施例作进一步说明， 然该等实施例仅为例示说明之用， 而不应被解释 为实施本发明的限制。
实施例 1 异烟碱酰胺 (I H)合并使用 CYP2E1 抑制剂双硫仑 (DSF)及 /或硝基苯酚磷酸二酯 (BNPP)的动物试验
一、 材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为 HPLC等级， 购自 Tedia有限公司 (Fairfield, OH, USA), INH, BNPP, DSF以及玉米油则购自 Sigma化学公司 (St. Louis, MO USA), 8-iso-PGF2a以及放射线标定的 8-iso-PGF2a-d4则得自 Cayman化学公司 (Ann Arbor, MI,USA), 半乳糖注射溶液由南光化学制 药股份有限公司制备， 是将 400克半乳糖 (Sigma)溶于 1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张 盐类的蒸镏水中， 供作注射使用。
2.试验动物 体重为 320-350公克的雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心 (台湾)，动物 实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有的大鼠均置于空气 /湿度调节环境下， 光照与黑暗 各 12小时， 水及饲料的供给不限， 在试验期间大鼠体重均持续监测， 所有的大鼠均以使用 50 毫克 /公斤体重剂量的戊巴比妥钠 (sodium pentobarbital)进行腹腔麻醉 (intraperitoneally anesthetized), 将聚乙烯导管置于大鼠右颈内静脉 (internal jugular vein)内以施打半乳糖， 导管 以切入穿剌 (cut-down technique)插入，该导管的末端置于大鼠颈后切口的皮肤下方，手术完成 后， 恢复期间使大鼠禁食一夜 (约 16小时)， 但水分照常供给。
3.试验处理
试验动物随机分成 5组，每组包括 3种处理，第一种处理为注射 25 mg/kg BNPP或 BNPP 的基剂 (vehicle, VEH1， 即食盐水)， BNPP溶于加热至 60°C的食盐水 (0.9% NaCl), 冷却后以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内； 第二种处理为则注射 100 mg/kg DSF或 DSF的基 齐 J (VEH2, 即玉米油)， DSF溶于玉米油中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内； 第三种处理为注射 150 mg/kg I H或 INH的基剂 (VEH3 , 即食盐水)， INH溶于食盐水 (0.9% NaCl)中，以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内；第一组 (BNPP或 VEH1)较第三组 (I H 或 VEH3)早 30分钟处理， 第二组 (DSF或 VEH2)比第三组 (INH或 VEH3)早 15分钟处理。
上述 5组试验共包含：
(1) 对照组 (normal control group, NC, n=12): 正常的大鼠每天注射 1次 VEH1、 VEH2以 及 VEH3(施行腹腔内注射)共 21天；
(2) INH组 (INH, n=7): 正常的大鼠每天注射 1次 I H、 VEH1以及 VEH2 (施行腹腔内注 射)共 21天；
(3) BNPP-INH组 (BNPP-INH, n=7):正常的大鼠每天注射 1次 BNPP、INH以及 VEH2 (施 行腹腔内注射)共 21天；
(4) DSF-INH组 (DSF-INH, n=7): 正常的大鼠每天注射 1次 DSF、 INH以及 VEH1 (施行 腹腔内注射)共 21天； 以及
(5) BNPP-DSF-I H组 (BNPP-DSF-INH, n=7): 正常的大鼠每天注射 1次 BNPP、 DSF以 及 I H (施行腹腔内注射；)共 21天；
半乳糖单点法于第 21天处理后 16小时进行测试。
4.血液样本
处理完毕后， 大鼠以乙醚麻醉牺牲， 血液由大鼠背部主动脉抽取， 置于含有 EDTA的试 管中， 血桨 (plasma)以 13,000g于 4°C离心 15分钟， 分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并置于 -80°C中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性以进行定 量， AST与 ALT活性是肝脏毒性常用的指标， 以 Synchron LXi 725 系统来量测 (Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析； 肝脏样本以 10%磷酸缓冲液配制的福尔马林 (phosphate-buffered formalin)固定， 随后脱水并包埋于石蜡 (paraffin)中， 以 5 μιη厚度切片， 切 片样本以苏木精 (hematoxylin)与伊红 (eosin)染色， 并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain, PAS), .染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液 (cacodykte buffer, 0.1 M pH 7.4)清洗， 以 20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定 1小时， 以 酒精连续脱水后包埋于 Spurr树脂 (Spurr resin)中， 并以钻石刀切取超薄切片， 以醋酸铀酰 (uranyl acetate)及柠檬酸铅 (lead citrate)作双重染色， 并以穿透式电子显微镜 (Transmission Electron Microscope, Hitachi 600, Hitachi Co., 日本)观察。
7. 8-iso-PGF2a的萃取与量测
所有 PGF2a的同分异构物 (isomers)均以适当体积的酒精溶解或稀释以制备原液， 并分装 于小管中储存于 -70°C， 取 0.5ml血浆至玻璃管中， 加入 10ng内标准品 (internal standard, 即 8-iso-PGF2a-d4),混匀后的血浆以 C18固相萃取管柱 (Solid-Phase Extraction cartridge, J.T. Baker, MA,美国)纯化，样本流洗液以氮气蒸发干燥后， 以 50μ1乙睛: 7j (acetonitrile: water, 15:85 v/v) 溶液回溶并震荡 30秒， 取 ΙΟμΙ回溶后的萃取物注射至 LC/MS/MS系统进行分析。
8.液相层析串联式质谱仪 (LC/MS/MS)分析
HPLC系统包括 2个岛津 LC-10ADvP泵 (Shimadzu LC-10ADvP pumps) 1个岛津系统控 制器 (Shimadzu system control)以及 1 个岛津自动样本机 (Shimadzu autosampler) (岛津科学仪 器， 日本)， 以 C18管柱 (颗粒大小 5-μπι， 内径 50 x 2.1mm)进行 HPLC分离，并使用含有 2mM 醋酸铵 (ammonium acetate)及乙睛 (acetonitrile, ACN)之梯度流洗液 (t = 0 min, 15% ACN; t = 6 min, 70% ACN; t = 7 min, 90% ACN; t = 8 min, 90% ACN; t = 8.5 min, 15% ACN)流洗， LC/MS/MS的流速均维持在 200 μΐ/min, 整个 HPLC进行时间为 13.5分钟； 该 HPLC系统 与一三层四极质谱仪 (triple stage quadrupole mass spectrometer, API3000, Applied Biosystem, Foster City, CA, 美国）介接， 配备有 TurboIonSpray离子源 (TurboIonSpray ionization source) , 并使用负电电喷雾 (negative electrospray)作为电离 (ionization)的方法； 该质谱仪通过扩散 200 ng/ml 8-iso-PGF2a 或 8 -iso-PGF2a-d4标准液以多重反应监测（multiple reaction monitoring, MRM)模式进行最佳化， m/z 353/193 以及 m/z 357/197 离子偶 (ion pair)则个别用来监测 8-iso-PGF2 以及 8-iso-PGF2a-d4 ;测量后，计算 6个 8-iso-PGF2a浓度 (C)的线性标准曲线 (linear calibration curve)对 8-iso-PGF2a比 8-iso-PGF2a-d4比值的区域 (Y)，得到相关系数 (r， correlation coefficient)值为 0.999； 血浆中 8-iso-PGF2a的线性范围在 0.1-2.5ng/ml之间， 其回归方程式 (regression equation)为 Y=-0.0517C + 0.823 ng/ml; 所测得的结果均对照重氢化 8-iso-PGF2a (deuterated 8-iso-PGF2a)内标准品计算， 标准曲线的批间精密度以及准确度是以标准浓度样品 分别测试 6次后， 经由反向计算法 (Back-Calculation)来评估， 其相对误差 (relative errors)范围 在一 5.06%至 3.13%之间。
9.肝功能的定量测试
所有的大鼠均进行半乳糖单点法 (GSP)及半乳糖清除能力 (GEC)测试， 大鼠接受在 30秒 内的快速静脉注射， 注射 0.4g/ml BW半乳糖溶液 0.5 g/kg; 自注射后 5、 10、 15、 30、 45以 及 60分钟各采血一次，血液样本取自尾部静脉； 以半乳糖脱氢酶比色法 (colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量， 测试浓度范围为 50 至 1,000 μ§/ιη1, 每个浓度的日内差异 (within-day variation)由标准偏差 (standard deviation)以及变异系数 (coefficient of variation, CV) 百分比计算，最大容许的变异系数为 10% CV; 日间差异 (day-to-day variation)则由比较校正曲 线 (calibration curves)的斜率及截距来检验； 半乳糖清除能力 (GEC)由下列公式计算， 该公式是 由 Tygstrup's方程式修改而来： D
GEC： (mg I kg · min)
Tc=0 + 7
其中 D为半乳糖注射量； TC=D为半乳糖浓度达到 0所需要的时间，是由注射 (通常为 2.22 mmol/1)后 20至 60分钟的血液浓度 -时间曲线的线性回归推得； 7为依经验法则修正体内不均 匀分布的校正值； 半乳糖单点法 (GSP)则为 30秒注射停止后 60分钟时血液中半乳糖浓度。
10.统计分析
所有的数据皆以平均 ±标准偏差 (SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (ANOVA)测试法 来计算是否具有统计上的显着差异， 使用 Statistical Package of the Social Science program (Version 13, SPSS Inc.)软件包来计算； 随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性 (least significant difference)方法做多重比较， 以确认族群间的显着差异； 族群平均的显着差异为 P<0.05。 二、 结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异； 生化分析结果如图 2所示，只有 INH组血浆中的天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT) 活性明显高于对照组 (对照组血浆中的 AST活性为 116±11 IU/L; I H组血浆中的 AST活性为 129±10 1O/L,p < 0.05； 对照组血浆中的 ALT活性为 44±6 IU/L; I H组血浆中的 ALT活性为 52 ± 3 lW p < 0.05), 显示 INH组产生生化上的肝损伤； 对照组、 BNPP-INH、 DSF-INH以 及 BNPP-DSF-INH组血清中转胺酶浓度则为正常。
2.组织病理学
经过为期三周施行腹腔注射 150 rag/kg/day INH的大鼠，其体内成功的产生肝毒性；相对 的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图 3A所示，对照组大鼠肝实质 (liver parenchyma) 内的肝细胞系排列于自肝小叶中央静脉辐射排列的网状平板内，肝血窦 (hepatic sinusoids)则在 两肝板 (anastomosing plates)之间被发现； I H组大鼠的组织切片则如图 3B所示， INH组大鼠 中央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化， 然而并无看到肝细胞坏死 (necrosis)的征兆； 以 电子显微镜观察的结果显示， 相较于对照组 (如图 3C所示)， INH组大鼠肝细胞内的粗内质网 (rER)明显增加 (如图 3D所示)。根据文献报导， INH是一个强效的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1) 的诱导物， 而 CYP2E1会导致超氧基 (superoxide)以及氢氧自由基 (hydroxyl radicals)的产生， 并且会引发内质网的增加， 因此本试验的结果与先前研究相符。 而其它试验组： BNPP-INH 组、 DSF-I H组、 BNPP-DSF-INH组大鼠的肝损害程度与对照组相较， 并无明显区别 (未显示 结果；)。
3.血液样本中 8-iso-PGF2a的量测
在负电电喷雾模式下， 8-iso-PGF2a最大量的分子离子为质荷比 (m/z)353 的离子， 8-iso-PGF2a-d4最大量的分子离子为质荷比 (m/z)357的离子， 这些负电荷分子离子经过大量碰 撞诱导而产生游离， 这两个目标化合物的分子结构以及产生的离子光谱如图 4 所示； 除了 8-iso-PGF2a-d4的子离子 (daughter ions)恒较 8-iso-PGF2a的子离子高四个单位之外， 8-iso-PGF2a 以及 8-iso-PGF2a-d4两者的碎裂模式 (fragmentation patterns)很相似， 这显示大多数稳定的子离 子是由 A链产生而来， 该 A链上标示有 4个氘原子 (deuterium atoms); 8-iso-PGF2a最密集的子 离子为质荷比 (m/z)193的离子， 8-iso-PGF2a-d4最密集的子离子为质荷比 (m/z)197之离子。 图 5 所示为在多重反应监测模式 (MRM)侦测下， 含有 100 pg 8-iso-PGF2a与 250 pg/ml 8-iso-PGF2a-d4的标准溶液， 以及血液样本的典型 LC/MS/MS色谱， 在注入 lng 8-iso-PGF2a-d4 作为内标准品后， 该标准溶液与该血液样本均经过相同的固相萃取 (SPE)纯化， 并以前述 LC/MS/MS规程分析。
4.血浆中 8-iso-PGF2a的浓度
血浆中的 8^0-?0?2(1是一种氧化压力 (oxidative stress)的指标， 如图 6所示， 相较于对照 组， I H组大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度明显增力 Π(ΙΝΗ组大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度为 151±26 pg/ml; 对照组大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度为 110±15 pg/ml, p < 0.001)； 与 INH组 相较， BNPP-INH组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组三组则明显降低由 I H引起肝脏的 8-iso-PGF2a产生 (BNPP-INH组大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度为 128±29 pg/ml; DSF-INH组大 鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度为 126±20 pg/ml; BNPP-DSF-INH组大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓 度为 123±17 pg/ml; INH组大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度为 151±26 pg/ml, p < 0.005); 值得 注意的是， 对照组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组四组之间， 大鼠血浆中 8-iso-PGF2a的浓度无显着差异， 与 BNPP-INH组及 DSF-INH组相较， INH合并施用 BNPP 与 DSF并不会进一步减少血浆中 8-^ 0?2(1的浓度。
5.剩余肝功能的量测
如图 7所示， 对照组与 INH组大鼠的半乳糖单点法 (GSP)值具有高度的显着差异 (对照组 大鼠的 GSP值为 384±69 g/ml; INH组大鼠的 GSP值为 565±87 g/ml, ρ < 0.001), 此外， BNPP-INH组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组大鼠之 GSP值各为 401±70 μ^ιηΚ 449±45 388±53 g ml， 与 INH组相较， BNPP-INH组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组大鼠 的 GSP值各与 INH组大鼠具有高度的显着差异 (其 p值各为 p < 0.001, p < 0.005, and p < 0.001)； 单独施用 INH的大鼠的 GSP值明显增加； 然而， 在 I H合并施用 BNPP或 DSF或 BNPP与 DSF的大鼠则可抵抗这种改变；另一方面，与 DSF-INH组相较， INH合并施用 BNPP 与 DSF显示可以降低 INH引起的肝毒性， 虽然两者之间的差异未达到统计上的差异 ( =0.1), 而对照组、 BNPP-INH组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组四组之间大鼠的 GSP值无显着差 异存在。
相似的结果在使用半乳糖清除能力 (GEC)方法上也可观察的到， 如图 8所示， 与对照组 相较， INH组大鼠的 GEC值明显减少 (INH组大鼠的 GEC值为 3.4±0.6 mg/min.kg; 对照组大 鼠的 GEC 值为 4.9±0.8 mg/min.kg, p < 0.001) , 此外， BNPP-INH 组、 DSF-INH 组、 BNPP-DSF-INH 组大鼠的 GEC 值各为 4.5±0.6 mg/min.kg、 4.3士0.4 mg/min.kg、 4.7±0.5 mg/min.kg; 与 INH组相较， BNPP-INH组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组大鼠的 GEC值 各与 INH组大鼠具有高度的显着差异 (其 值各为 /7 < 0.005, /7 < 0.05, and p < 0.005); 单独施 用 INH的大鼠之 GEC值明显减少； 然而， 在 I H合并施用 BNPP或 DSF或 BNPP与 DSF 的大鼠则可恢复这种改变； 与 DSF-I H组相较， INH合并施用 BNPP与 DSF者有增加 GEC 值的倾向 (DSF-INH组与 BNPP-DSF-INH组大鼠的 GEC值各为 4.3±0.4 mg/min.kg、 4.7±0.5 η¾/ηώ ¾， = 0.29); 此外， 对照组、 ΒΝΡΡ-ΙΝΗ组、 DSF-INH组、 BNPP-DSF-INH组四组之 间大鼠的 GEC值无显着差异存在。
为了确定 AST、 ALT, 血浆中 8-iso-PGF2a的浓度， 以及定量肝功能测试 (如： GSP以及 GEC)是否相关， 以数种相关分析计算后， 发现 GSP值与血浆中 8-iso-PGF2a的浓度具有高度 相关 (如图 9所示),相关系数为 0.836; GSP值与 GEC值具有高度相关 (如图 10所示） (p < 0.001) , 相关系数为- 0.822； GEC值也与血浆中 8-iso-PGF2a的浓度具有高度相关 (相关系数为- 0.743, ^ < 0.001， 如表 1所示)； 而 GSP值、 GEC值以及血浆中 8-iso-PGF2a的浓度则与 AST及 ALT 均无明显相关 (如表 1所示)。 表 1、 GSP、 GEC以及 8-iso-PGF2a与生化测试的相关性
GSP GEC 8-iso-PGF2a
AST r = 0.114 r = -0.111 r = 0.217
ALT r = 0.016 r = 0.039 r = 0.035
8-iso-PGF2a r = 0.836* r = -0.743 * r = l * 以皮尔森氏相关系数 (Pearson's correlation coefficient)作为统计计算， * <0.001 实施例 2 细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1 )抑制剂的筛选- cDNA合成微粒体细胞色素 P450 2E1。
一、 材料与方法
1. 试验材料
本实施例是使用细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选套组 (CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit, BD Bioscience,美国)针对 22种中药药引及 10种赋形剂进 行细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选； 该 CYP2E1抑制剂的筛选套组的作用原理为： 在含有细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)以及其荧旋旋光性受质 MFC (7- ethoxy-4-trifluoromethyl coumarin)的环境下加入测试样品作用后， 再侦测 CYP2E1 代谢物标准品 HFC (7-Hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin)的生成量， 并以对照组 (control)的 HFC生成量为基准， 计算测试样品的 CYP 2E1抑制率。 各测试样品均溶于乙腈 (acentoitrile), 测试不同浓度的中药药引 (66μΜ, 33μΜ, 16.5μΜ)及 赋形剂 (0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)对 CYP2E1的抑制率，所测试的中药药引及结果如表 3所 列， 所测试的赋形剂及结果如表 4所列。
另外， 本实施例使用的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选套组 (CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit, BD Bioscience,美国)所需的药剂如下：
(1) CYP2E1 + P450 Reductase + Cytochrome b5: 100 mM potassium phosphate (pH 7.4)含有 1.3 nmol P450 以及 p-Nitrophenol水解酶。
(2) Control Protein: 15 mg/mL Control Protei 溶于 100 mM Potassium Phosphate (pH 7.4)中。
(3) Buffer Solution: 0.5 M Potassium Phosphate (pH 7.4)。
(4) Stop Solution: 0.5 M Tris Base。
(5) Cofactors： 含有 1.3 mM NADP+、 66 mM MgCl2以及 66 mM Glucose 6-Phosphate。
(6) Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase: 40 units/ml溶于 5 mM Sodium Citrate Buffer (pH 7.5)。
(7) MFC (7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin): 焚旋旋光性受质 (fluorescence substrate)， 50 mM MFC溶于乙腈 (acetonitrile)。
(8) DDTC (Diethyldithiocarbamic acid): CYP2E1选择性抑制剂 (阳性对照组)， 20 mM DDTC溶于乙腈 (acentoitrile)。
(9) HFC (7-Hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin)： CYP2E1 代谢物标准品
(metabolite standard) , 0.25 mM HFC溶于 0.1 M Tris (pH 9.0)。
(10) NADPH-Cofactor Mix: 于 14.56 ml无菌水中加入 187.5 μΐ Cofactors、 150 μΐ G6PDH (Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及 100 μΐ Control Protein。
(11) Cofactor/ acetonitrile mix: 于 9.93 ml NADPH-Cofactor Mix中加入 66 μΐ Acetonitrile。
(12) Enzyme/Substrate Mix: 于 4ml Buffer Soultion中加入 5.94 ml无菌水、 50μ1 HTS-706(CYP2E1, 2 μΜ P450 content)以及 28 μΐ 50 mM MFC (7-Methoxy-4-trifluoromethyl coumarin, 荧旋旋光性受质)。
2.细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选
使用细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选套组 (CYP2E1 High Throughput Inhibitor Screening Kit, BD Bioscience，美国)进行中药药引及赋形剂的筛选， 实验步骤如下所述：
(1)制备对照组- a. 于 96孔盘上第 1孔井 (well)内加入 149 μΐ NADPH-Cofactor Mix以及 Ιμΐ 20mM DDTC并混合均匀；
b. 于该 96孔盘上第 2至 12孔井内各加入 100 μΐ Cofactor/ acetonitrile mix,第 1至 8 孔井为阳性对照组 (positive control); 第 9与第 10孔井为对照组 (control); 第 11与第 12孔井 为空白对照组 (blank);
c. 于该第 1至 8孔井内做连续稀释动作： 自第 1孔井内取 50 μΐ液体加入第 2孔井 内混勾， 再自第 2孔井内取 50 μΐ液体加入第 3孔井内混匀， 以此类推， 至第 8孔井时去除多 余的 50 μΐ液体， 以得到连续稀释浓度 66.6、 22.2、 7.4、 2.47、 0.82、 0.27、 0.091、 0.03 μΜ。
(2) 制备试验组- a. 于 96孔盘上第 1行的第 1及第 2孔井内各加入 149 μΐ NADPH-Cofactor Mix, 以 及 Ιμΐ 20mM中药药引测试样品或 Ιμΐ 25% (w/v)赋形剂测试样品， 并混合均勾；
b. 再自该第 1行的第 1及第 2孔井内各取 50 μΐ液体加入第 3孔井内混匀 (即每一测 试样品均为三重复)；
(3) 反应起始与终止：
a. 将上述对照组与试验组置于 37°C静置 10分钟；
b. 除了该空白对照组之外， 其它孔井内均加入 100 μΐ Enzyme/Substrate Mix混匀； c. 将所有对照组与试验组置于 37'C静置 40分钟；
d. 所有的孔井内均加入 75 μΐ Stop Solution混匀；
e. 紧接着于该空白对照组内加入 100 μΐ Enzyme/Substrate Mix混匀；
f. 将所有对照组与试验组以萤冷光仪（Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron Corporation, 芬兰)读取结果， 所使用的激发光 (excitation)波长为 405 nm， 发散光 (emission)波 长为 538 ran。
(4)结果分析： 测得的荧光讯号数值换算成为 CYP2E1代谢物标准品 HFC生成量 (pmol) 后， 以对照组 (control)为基准， 即对照组的 CYP 2E1抑制率为 0%, 以下列公式计算各阳性对 照组及试验组的 CYP 2E1抑制率： 样品的 HFC生成量
CYP 2E1抑制率(％) = 1 - 对照组 (control)的 HFC生成量 二、 结果
1. 阳性对照组
阳性对照组 (DDTC)所测出的 CYP 2E1抑制率如表 2所示， 由表 2可知当 DDTC的浓度 为 66.6 μΜ (即为 0.167 %， w/v)时， CYP 2E1抑制率可达 97.55%， 是以 66.6 μΜ作为中药药引 最高测试浓度， 以 0.167 % (w/v)作为赋形剂最高测试浓度。
表 2 阳性对照组的 CYP 2E1抑制率
DDTC浓度 （μΜ) HFC生成量（pmol) CYP 2E1抑制率 (%)
0 (对照组） 222.00 0
0.03 256.00 -
0.091 202.00 8.71
0.27 151.71 31.52
0.82 126.14 43.06
2.47 55.18 75.09
7.4 21.08 90.49
22.2 15.10 93.19
66.6 5.42 97.55
2.试验组 CYP 2E1抑制率
中药药引所测出的 CYP 2E1抑制率如表 3所示，由结果可知各中药药引于不同浓度 (66μΜ, 33μΜ, 16.5μΜ)的条件下， 对细胞色素 Ρ450 2E1具有不同程度的抑制效果， 其中以 66 μΜ正 二羟愈疮酸 (Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果最佳 (97.99±0.66 %)。
表 3 中药药引的 CYP 2E1抑制率 中药药引 CYP 2E1抑制率 （％) 最小有效 测试浓度 66 μΜ 33 μΜ 16.5 μΜ 剂量 * (mg) 对照组 0 0 0 _ 阳性对照组 (DDTC) 97.55±1.862 - 中药药引 CYP 2E1抑制率（％) 最小有效 测试浓度 66 μΜ 33 μΜ 16.5 μΜ 剂量 * (mg) 正二羟愈疮酸 17
97.99±0.66 92.36±2.20 76.52±3.86
(Nordihydroguaiaretic acid)
(-) -Epigallocetechin-3 -gallate 97.56±0.18 96.47±0.64 92.56±0.46 25 茵陈色原酮 17
76.12±1.89 60.54±5.91 49.05±5.18
(Capillarisin)
山奈酚 16
70.63±2.53 70.04±3.75 71.87±1.14
(Kaempferol)
根皮素 15
66.84±4.79 54.69±2.84 42.04±3.63
(Phloretin)
双硫仑 17
66.54±2.55 60.55±5.70 57.89±3.91
(disulfiram)
橙皮素 33
54.75±1.37 43.29±0.82 32.10±5.80
(Hesperetin)
6-姜辣醇 16
51.89±3.33 39.83±2.32 30.13±2.67
(6-Gingerol)
没食子酸 9
48.24±4.20 42.74±7.36 35.59±10.03
(gallic acid)
异甘草素
47.83±5.36 46.27±3.28 39.08±2.75 18 (Isoliquritigenin)
柚皮素
41.84±3.51 36.82±3.97 25.11±7.60 9
(Narigenin)
二氢化槲皮素
34.54±3.47 23.80±5.84 22.58±11.69 17
((+)-Taxifolin)
汉黄芩素
23.48±2.59 21.87±1.90 15.64±7.82 16 (Wongonin)
原儿茶酸
22.75±4.07 19.95±8.95 25.66±12.74 8 (Protocatechuic acid)
儿茶素
16.45±9.67 33.83±8.76 41.53±7.62 16 ((+)-Catechin) 中药药引 CYP 2E1抑制率 (%) 最小有效 测试浓度 66 μΜ 33 μΜ 16.5 μΜ 剂量 * (mg) β-奈黄酮
15.40±12.94 16.83±0.96 6.52±6.64 15
(β-naphthoflavone)
恩贝素
13.54±11.64 12.30士 10.24 5.95±7.48 16 (Embelin)
反式肉桂酸
7.10±6.95 4.66±6.50 5.71±10.53 8 (trans-Cinnamic acid)
表儿茶酚
2.57±11.60 15.02±5.50 18.27±9.34 16 ((-)-Epicatechin)
根皮苷
1.42±9.28 3.76±3.58 1.25±7.90 24
(Phloridzin)
-12.86±2.75 -4.64±3.47 0.43±2.31 23
(Puerarin)
伞形花内酯
-1081.56±168.00 -571.97±117.56 -280.41±19.48 9 (Umbelliferone)
*最小有效剂量： 最低筛选浓度 （mg/L) X人肝肠体积 (3L) 赋形剂所测出的 CYP 2E1抑制率如表 4所示， 由结果可知各赋形剂于不同浓度 (0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)的条件下，对细胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中 0.167% 鲸蜡醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳 (97.75±0.66%)。
赋形剂的 CYP 2EI抑制率
'中药药引 CYP 2E1抑制率（％) 最小有效剂 测试浓度（w/v) 0.167% 0.08% 0.042% 量 * (mg) 对照组 0 - 阳性对照组 (DDTC) 97.55±1.862 - 鲸蜡醇聚氧乙烯醚 97.75±0.66 96.58±0.40 96.02士 0.17 1260 聚氧乙烯硬脂酸酯 97.56±1.02 96.87土 1.00 94.76±0.47 1260 中药药引 CYP 2E1抑制率（％) 最小有效剂 测试浓度（w/v) 0.167% 0.08% 0.042% 量 * (mg)
93.33±0.82 89.45±0.68 76.21±7.37
聚氧乙烯月桂醚 (测试浓度 (测试浓度 (测试浓度 180
0.025%) 0.013%) 0.006%)
聚氧乙烯去乙水山
87.20±1.29 82.80±1.71 71.77±4.48 1260 梨醇单月桂酸酯
聚氧乙烯山梨醇酐
73.92±4.71 65.45±2.50 64.02±12.54 1260 单油酸酯
聚氧乙烯山梨糖醇
58.97±3.29 47.05±6.48 44.79±2.49 1260 酐单棕榈酸酯
PEG 2000 44.33±2.75 40.13±3.06 35.81±3.26 1260
PEG 400 42.33±5.25 39.10±0.73 31.98±5.97 1260 聚氧丙烯聚氧乙烯
共聚物 PLURONIC 41.72±5.34 42.98±3.24 37.11±10.35 1260
F-68
PEG 4000 37.21±1.91 41.22±0.97 37.18±10.52 1260
*最小有效剂量： 最低筛选浓度 （mg/L) X人肝肠体积 (3L) 实施例 3 细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选-人肝微粒体细胞色素 P450 2E1
一、材料与方法
1.试验材料
本实施例是使用人类肝脏所制备微粒体， 针对细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)与 39种中药 药引及 10种赋形剂进行细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选， 以筛选出对于人类肝脏 的细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)有效抑制剂； 该 CYP2E1抑制剂的筛选作用原理为： 利用人 类肝脏所制备微粒体中细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)与其受质 Chlorzoxazone反应， 加入测试 样品作用后， 再侦测 CYP2E1代谢物标准品 6-OH-CZX (6-Hydroxy-Chlorzoxazone)的生成量， 并以对照组 (control)的 6-OH-CZX生成量为基准， 计算测试样品的 CYP 2E1抑制率。
各测试样品均溶于 10%甲醇 (methanol)或是二次水中， 测试不同浓度的中药药引 (66μΜ, 33μΜ, 16.5 1^1)及赋形剂(0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)对 CYP2E1的抑制率， 所测试的中药药 引及结果如表 6所列， 所测试的赋形剂及结果如表 7所列。
本实施例所利用人类肝脏细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂筛选所需的药剂如下：
(1) CYP2E1： 100 mM potassium phosphate ( H 7.4)含有 10 mg/ml P450 protein concentration
(2) Control Protein: l O mg/mL P450 Protein溶于 100 mM Potassium Phosphate (pH 7.4)中。
(3) Buffer Solution: 0.5 M Potassium Phosphate (pH 7.4)。
Stop Solution: ice-acetonitrile。
(4) Cofactors: 含有 100 mM NADP+以及 10 mM Glucose 6-Phosphate。
(5) Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase: 2000 units/ml溶于无菌水。
(6) Chlorzoxazone : 受质（substrate) , 16 mM Chlorzoxazone溶于 10% 甲醇 (Methanol)。
(7) DDTC (Diethyldithiocarbamic acid) : CYP2E1 选择性抑制剂（阳性对照组）， 20 mM DDTC容于 10% 甲醇 (Methanol)。
(8) NADPH-regenerating System:于 3.42 ml中加入 530 μΐ Cofactors、40 μΐ G6PDH (Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及 100 μΐ Control Protein。
2. 细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制剂的筛选
使用人类肝脏微粒体细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)进行细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)抑制 剂筛选的实验步骤如下所述：
(1)在 4°C冰浴环境下， 0.1M憐酸缓冲液（pH = 7.4)包含 0.5 mg/ml人肝微粒体、 5 mM MgCl2静置 15分钟；
(2)此时实验组加入细胞色素 P450 2E1反应基质药物 16 mM Chlorzoxazone 以及浓缩中 药药引萃取液； 对照组以甲醇： 无菌水 =1 : 1取代中药药引； 阳性对照组则以 DDTC取代；
(3)最后加入辅酶 1 mM NADP+、 10 mM G6P与 2 IU G6PD。 将反应液转移至 37°C水浴 预温（pre-incubation) 1分钟， 活性测试实验的反应时间为 30分钟；
(4) 反应完后以 500L acetonitrile终止反应， 样品静置 1分钟后加入内部标准品 C5g/mL
4-hydroxy-tobutamide) , 离心后取上层液 20L以甲醇： 无菌水作稀释十倍动作， 取 5L回溶液 注入 LC/MS/MS系统进行分析。
(5) 结果分析： 将 LC/MS MS 测得的讯号数值换算成为 CYP2E1 代谢物标准品 6-Hydroxy-Chlorzoxazone生成量 (pmol)后， 以对照组 (control)为基准， 即对照组的 CYP 2E1抑 制率为 0%, 以下列公式计算各阳性对照组及试验组的 CYP 2E1抑制率： 实验组的 6-OH-CZX生成量
CYP 2E1抑制率(％) = 1 - - 对照组 (control)的 6-OH-CZX生成量
二、 结果
1. 阳性对照组
阳性对照组 (DDTC)所测出的 CYP 2E1抑制率如表 5所示， 由表 5可知当 DDTC的浓度 为 ΙΟΟ μΜ时， CYP 2E1抑制率可达 87.56%。
表 5 阳性对照组的 CYP 2E1抑制率
DDTC浓度 (μΜ) 6-OH-CZX生成量 (pmol) CYP 2E1抑制率 （％)
0 (对照组） 3207.5 0
50 1644.5 48.66
100 431.2 87.56
2.试验组 CYP 2E1抑制率
中药药引所测出的 CYP 2E1抑制率如表 6所示，由结果可知各中药药引于不同浓度 (66μΜ, 33μΜ, 16.5μΜ)的条件下， 对细胞色素 Ρ450 2E1具有不同程度的抑制效果， 其中以 66 μΜ正 二羟愈疮酸 (Nordihydroguaiaretic acid)抑制效果 (96.98±0.19 %)及 66 μΜ 反式肉桂醛 (Trans-Cinnamaldehyde)抑制效果 (92.81±0.53 %)最佳。 '
表 6 中药药引的 CYP 2E1抑制率 中药药引 CYP 2E1抑制率（％) 最小有
效剂量 测试浓度 66 μΜ 33 μΜ 16.5 μΜ
(mg) 对照组 0 0 0 - 正二羟愈疮酸
96.98±0.19 67.68.±2.24 49.81±2.42 17
(Nordihydroguaiaretic acid)
反式肉桂醛
92.81±0.53 89.56±1.52 60.79±3.00 7
(Trans-Cinnamaldehyde)
大豆甘元
86.77±1.04 76.33±2.28 73.55±1.74 14
(Daidzein)
异牡荆素
81.82±1.34 67.60±3.24 59.82±1.41 24
(Isovitexin)
中药药引 CYP 2E1抑制率 (%) 最小有 效剂量 测试浓度 66 μΜ 33 μΜ 16.5 μΜ
(mg) 木犀草素
53.23±1.78 43.40±4.74 39.15±3.42 16
(Luteolin)
十四烷酸乙酯
51.95±2.38 41.04±4.76 22.08±0.78 14 (Ethyl Myristate)
柽柳素
50.91±3.12 47.79±2.81 37.40±1.96 17 (Tamarixetin)
根皮素
50.90±2.09 39.78±3.28 29.60±3.21 15 (Phloretin)
50.13±5.11 47.79±3.40 35.32±1.51 15
(Baicalein)
黄^^
49.30±2.26 35.61±3.09 22.51±2.24 24 (Baicalin)
47.51±3.66 36.80土 1.98 28.89±1.54 15
(Apigenin)
柚皮素
45.16±4.43 28.45±2.21 19.50±2.02 9
(Naringenin)
橙皮素
44.56±2.35 34.28±2.03 25.74±2.45 17
(Hesperetin)
(+)-Epicatechin 44.32±1.25 52.32±1.59 66.71±1.79 16 芸香素
43.51±3.09 30.13±1.62 30.00±0.81 33 (Rutin)
(-) -Epicatechin-3 -gallate 42.92±0.65 34.84±1.72 30.31±1.27 24 异甘草素
41.12±0.92 31.48±1.24 21.18±1.96 18
(Isoliquritigenin)
水飞蓟宾
38.96±1.19 37.14±1.15 59.48±2.34 26 (Silybin)
牡荆素
38.70±1.62 30.65±0.78 23.12±1.19 24 (Vitexin) 中药药引 CYP 2E1抑制率（°/。） 最小有
效剂量 测试浓度 66 μΜ 33 μΜ 16.5 μΜ
(mg) 金雀异黄酮
36.88±1.56 30.91士 1.62 43.90±2.06 15
(Genistein)
异鼠李素
36.31±1.59 18.68±1.22 12.06±1.06 14 (Isorhamnetin)
没食子酸
27.96±1.56 18.79±2.03 10.50±1.12 9
(gallic acid)
香叶木素
21.56±1.19 43.12±3.57 60.00±1.96 33 (Diosmin)
6-姜辣醇
19.08±1.36 11.51±1.02 7.84±0.92 16 (6-Gingerol)
*最小有效剂量： 最低筛选浓度 （mg/L) X人肝肠体积 (3L) 赋形剂所测出的 CYP 2E1抑制率如表 7所示，由结果可知各赋形剂于不同浓度 (0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)的条件下，对细胞色素 P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以 0.167% 鲸蜡醇聚氧乙烯醚的抑制效果最佳 (91.24±1.33 %)。
赋形剂的 CYP 2E1抑制率 赋形剂 CYP 2E1抑制率 (%) 最小有效 剂量 测试浓度（w/v) 0.167% 0.08% 0.042%
(mg)* 对照组 0 ― 鲸蜡醇聚氧乙烯醚 91.24±1.33 80.50±1.14 62.57±2.10 1260 聚氧乙烯硬脂酸酯 86.15±1.02 75.71±1.61 68.99±3.77 1260
78.5±2.1 51.2 ± 0.9 29.4 ± 2.7
邻磺酰苯酰亚胺 10
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
77.28±1.02 64.17±1.71 42.37±1.78
聚氧乙烯月桂醚 18
(测试浓度 0.025%) (测试浓度 0.013%) (测试浓度 0.006%) 赋形剂 CYP 2E1抑制率（％) 最小有效 剂量 测试浓度（w/v) 0.167% 0.08% 0.042%
(mg)* 聚氧乙烯去乙水山梨
75.38±3.64 70.44±0.93 55.38±1.95 1260 醇单月桂酸酯
PEG 400 64.17±1.53 54.78±3.53 26.42±1.81 1260
60.2±4.1 54.4±3.8 48.8±0.2
微晶纤维素 180
(测试浓度 0.025%) (测试浓度 0.013%) (测试浓度 0.006%)
60.1±0.3 56.8±2.2 31.2±2.9
二水磷酸氢钙 9
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
55.8 ± 2.0 45.8 ± 4.0 37.1 ± 2.8
蔗糖素 22
(：测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
54.5±4.2 51.2±2.1 44.8±1.8
甘露醇 Mannitol 10
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM) 聚氧乙烯醚 (40)氢化
50.4±1.1 43.2±3.1 30.2±2.8 1260 蓖麻油
34.7 ± 1.3
羧甲基淀粉钠 50.3 ± 1.9 51.3 ± 2.2 158
(测试浓度 0.00525%)
PEG 4000 47.11±0.92 23.94±0.92 8.70±0.77 1260
PEG 2000 47.06±1.53 41.43±1.60 22.25±1.93 1260
34.8 ± 1.1
交联聚乙烯吡咯垸酮 44.1±0.9 40.3±2.1 158
(测试浓度 0.00525%) 聚氧乙烯山梨糖醇酐
46.34±3.06 33.43±2.10 16.88±1.17 1260 单棕榈酸酯
聚氧乙烯山梨醇酐单 23.1 ± 3.0
39.14±2.40 40.56±3.85 158 油酸酯 (测试浓度 0.00525%) 赋形剂 CYP 2E1抑制率 （％) 最小有效 剂量 测试浓度（wA 0.167% 0.08% 0.042%
(mg)* 丙烯酸树脂 Eudragit 10.2 ±0.3
38.1 ±0.1 35.6 ±2.4 158 S100 (测试浓度 0.00525%)
4.3士 0.3
交联羧甲基纤维素钠 35.4 ±0.8 30.3 ±2.4 158
(测试浓度 0.00525%) 聚氧丙烯聚氧乙烯共
31.46士 1.60 17.39±1.07 7.93±0.27 1260 聚物 PLURONIC F-68
薄荷脑 30.8 ±0.3 20.8 ±2.1 10.5土 0.4 8
22.1 ±0.4 20.3 ± 1.1 17.5 ±0.9
羟丙基纤维素 158
(测试浓度 0.025°/。） (测试浓度 0.013%) (测试浓度 0.006%)
10.2 ±2.3
预胶化淀粉 18.3 ± 1.1 12.8 ±0.2 158
(：测试浓度 0.00525%)
10.6± 1.5
葡萄糖结合剂 19.2± 1.1 14.4 ±3.2 158
(测试浓度 0.00525%)
20.5 ± 1.8 15.5 ±0.0 9.9 ±3.1
柠檬酸 10
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
2.4士 0.3
聚氧乙烯蓖麻油 19.2 ±0.5 15.2 ±2.2 158
(测试浓度 0.00525%)
4.3 ±0.1
气相二氧化硅 15.4± 1.1 17.8±2.1 158
(测试浓度 0.00525%)
Myrj 52 18.1 ±2.6 15.7 ±2.7 14.6± 1.8 1260
PEG 8000 21.1 ±3.4 14.2 ±3.3 9.4 ± 0.2 1260
14.8 ±0.1 10.9 ±2.1 8.4 ± 1.6
山梨酸 6
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
2.2 ± 0.4
柠檬油 7.8 ± 0.3 9.8 ±0.4 158
(；测试浓度 0.00525%) 赋形剂 CYP2E1抑制率（％) 最小有效 剂量 测试浓度 （w/v) 0.167% 0.08% 0.042%
(mg)*
Span 60 17.4 ±0.9 13.9 ±0.7 12.4 ±2.3 1260
4.4 ± 1.7
Sorbitol 16.1 ±0.7 5.6 ±0.5 158
(测试浓度 0.00525%) 苯甲酸钠 15.8 ±0.9 7.8士 4.1 7.1 ±2.0 9 乙酰磺胺酸钾 14.5 ± 1.9 7.1 ±2.3 3.9 ±2.7 10
6.1 ±0.3
羟丙基甲基纤维素 13.9 ±2.2 13.6 ±2.6 158
(测试浓度 0.00525%)
1.7 ±0.2
羟乙基甲基纤维素 11.6±0.9 13.2 ±0.6 158
(测试浓度 0.00525%)
4.1 ± 1.9
甲基纤维素 10.2 ± 1.7 5.5 ±0.5 158
(测试浓度 0.00525%)
Span 80 10.1 ±2.1 6.2 ±0.4 5.9 ±0.3 1260
9.1 ±2.6 5.7± 4.7 9.4 ±2.7
环己氨基磺酸钠 10
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
8.7 ±3.8 3.9 ±2.3 7.8 ±2.2
乳糖单水合物 18
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
7.2 ± 1.2
麦芽糖糊精 8.5 ±2.8 5.9 ±2.1 158
(测试浓度 0.00525%)
8.2 ± 2.0 3.1 ±2.5 3.1 ±0.3
甘油二十二烷酸酯 52
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
8.0 ±5.8 10.3 ±5.3 10.7 ±4.5
氧化铁红 34
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
5.8 ± 1.7
单硬脂酸甘油酯 6.9 ±3.8 7.4 ±2.9 158
(测试浓度 0.00525%) 赋形剂 CYP 2E1抑制率 （％) 最小有效 剂量 测试浓度（w/v) 0.167% 0.08% 0.042%
(mg)*
6.4 ± 0.5
共聚维酮 K28 6.1 ± 0.7 4.5 ± 0.5 158
(测试浓度 0.00525%)
4.9 ± 1.4
淀粉乙酸酯 5.3 ± 0.7 4.9 ± 1.2 158
(测试浓度 0.00525%)
5.0 ± 1.6 3.0 ± 0.7 2.0 ± 1.0
硬脂酸镁 29
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
4.9 ± 1.6 6.4 ± 0.9 4.6 ± 1.1
十二烷基硫酸钠 14
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
3.2 ± 0.2 2.2 ± 0.1 4.7士 1.0
聚维酮 K-30 6
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
7.7 ± 2.6
苯甲醇 -10.3 ± 6.3 6.7 ± 1.0 158
(测试浓度 0.00525%)
-21.5 ± 2.0 -14.0 ± 2.2 4.6 ± 3.2
对羟基苯甲酸甲酯 8
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
-27.3 ± 3.7 -17.2 ± 2.4 -4.1 ± 1.2
对羟基苯甲酸丙酯 9
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (：测试浓度 16.5 uM)
-21.0 ± 4.8 -9.3士 0.8 2.7 ± 0.3
聚乙二醇硬脂酸酯 15 158
(测试浓度 0.084%) (测试浓度 0.042%) (测试浓度 0.00525%)
-85.5 ± 3.9 -47.1 ± 5.1 -16.8 ± 0.5
丁基羟基茴香醚 9
(测试浓度 66 uM) (测试浓度 33 uM) (测试浓度 16.5 uM)
*最小有效剂量： 最低筛选浓度 （mg/L) X人肝肠体积 (3L) 实施例 4酰胺水解酶 (amidase)抑制剂的筛选-鼠肝微粒体酰胺水解酶 (amidase)
一、材料与方法 .
i. 试验材料 Isonicotinic acid以高效能液相层析仪 (HPLC-UV)分析定量。 所有的有机溶剂均为 HPLC 等级，购自 Tedia有限公司 (Fairfield, OH, USA), isoniazid、 isonicotinic acid与 nicotinic acid (内 在标准品， internal standard)购自 Sigma化学公司（St. Louis, MO USA)。
2. 试样处理
本实验拟以鼠肝微粒体溶液作为 amidase酵素来源， isoniazid作为 amidase代谢模式药物， 定量 isoniazid经 amidase代谢生成的代谢物 isonicotinic acid (IN A), 作为 amidase活性测量的 标的，建立 amidase体外活性抑制剂筛选平台， HPLC系统包括 1个岛津 LC-10AD泵 (Shimadzu LC-10AD pump)、 1 个岛津系统控制器 (Shimadzu system controiy以及 1 个岛津自动样本机 (Shimadzu autosampler) (岛津科学仪器，日本)，以 C18管柱 (颗粒大小 5 μηι,内径 50 χ 4.6 mm, 25 cm) 并使用含有 70%甲醇和 30%甲酸铵 (50 mM, pH=2.5)的移动相进行 HPLC分离，实验步 骤简述如下-
(1)鼠肝酵素微粒体溶液制备及蛋白浓度测定。
(2)取鼠肝微粒体溶液 150 μL加入 100 μL isoniazid溶液 (3 mM溶于） 35 67 mM磷酸 钾缓冲溶液 (KH2P03, pH=7)及 15 amidase抑制剂 (控制组加入去离子水)混合均匀。
(3)置于 37 °C水浴槽反应 30分钟。
(4)加入 300 乙晴 (acetonitrile, ACN)混匀后静置 6分钟。
(5)加入 30 过氯酸混匀后静置 6分钟。
(6)以 13000g的转速离心 6分钟。
(7)取 100 μL离心后上清液注射入 HPLC。
(8)以甲醇 ： 甲酸铵(50 ^ 11=2.5) = 70 : 300 ^)为移动相， 控制流速为 1 ml/min， 以 波长 270 nm紫外光检测。
(9)结果分析： 将 HPLC-UV测得的讯号数值换算成为 amidase代谢物标准品 isonicotinic acid生成量 (ng/mL)后， 以对照组 (control)为基准， 即对照组的 amidase抑制率为 0%, 以下列 公式计算各阳性对照组及试验组的 amidase抑制率： 实验组的 isonicotinic acid生成量
amidase |φ制率(％) = 1 - 对照组 (control)的 isonicotinic acid生成量 二、 结果
中药纯成份及赋形剂所测出的 Amidase抑制率如表 8及表 9所示， 由结果可知各中药纯 成分及赋形剂于不同浓度的条件下，对 Amidase酵素具有不同程度的抑制效果，其中以 100 μΜ HUCHE033抑制效果最佳 (75.5±2.2 %)»
表 8体外筛选中药纯成份所测出的 Amidase抑制率 最小有效 筛选成分\抑制浓度 . Amidase活性抑制率(％)
剂量（mg)
100 uM 10 uM 1 uM
Positive Control (BNPP) 92.1 士 8.7
獬皮素
75.5 ± 2.2 62.3 士 4.4 48.1 ± 15.0 0.8 (Quercetin)
ί¾良姜素
61.5 ± 2.7 32.8 ± 4.4 9.6 士 9.9 0.5 (Galangin)
59.8 ± 5.1 9.1 ± 1.7 -16.6 ± 4.8 0.9
(Morin)
异甘草素
57.2 ± 8.5 17.7 ± 8.3 -18.7 ± 26.0 0.8 (Isoliquirtigenin)
杨梅素
56.4 ± 1.5 37.8 ± 8.4 8.0 ± 4.9 0.9 (Myricetin)
非瑟酮
56.4 ± 2.9 38.3 ± 2.0 -9.2 ± 2.5 0.9 (Fisetin)
双硫仑
50.2 士 9.1 42.1 ± 4.1 44.1 ± 1.0 0.9 (Disulfiram)
山奈酚
49.1 ± 8.6 25.3 ± 7.8 7.3 ± 8.2 1.0 (Kaempferol)
木犀草素
47.5 ± 6.2 23.0 士 6,0 6.1 ± 9.1 0.6
(Luteolin)
茵陈色原酮
45.7 士 4.2 18.2 ± 3.7 -4.1 士 8.1 0.4 (Capillarisin)
α-萘黄酮
36.9 ± 2.7 19.3 ± 3.7 7.3 ± 7.9 1.8 (α-Naphthoflavone)
双氢槲皮素
36.4 ± 3.4 32.2 ± 5.8 36.8 ± 11.5 1.3 ((+)-Taxifolin) 最小有效 筛选成分\抑制浓度 Amidase活性抑制率(％；)
剂量 （mg)
100 uM 10 uM 1 uM
黄芩
34.8 ± 10.2 15.2 ± 6.3 2.1 ± 7.5 1.4
(Baicalin)
伞形酮
33.5 ± 8.2 -1.0 ± 13.2 24.1 士 11.6 0.9 (Umbelliferone)
圣草次苷
32.8 ± 1.9 19.0 ± 3.0 -16.1 ± 12.8 0.8
(Eriocitrin)
异鼠李素
31.3 ± 1.3 20.0 士 4.6 13.8 ± 1.0 1.3
(Isorhamnetin)
根皮素
29.9 ± 8.1 9.8 ± 5.4 16.5 ± 14.3 0.8
(Phloretin)
恩贝酸
29.1 ± 1.2 6.6 ± 8.6 5.3 ± 5.2 1.4 (Embelin)
柽柳素
28.9 ± 4.2 27.9 ± 6.3 3.5 ± 10.5 1.8 (Tamarixetin)
齐墩果酸
24.5 ± 4.0 14.8 ± 3.4 20.3 ± 5.2 0.8
(Oleanolic Acid)
甘草酸
24.4 ± 12.7 4.3 ± 11.3 -1.3 ± 3.1 1.3
(Glycyrrhizin)
柚皮素
24.2 ± 7.6 13.5 士 9.4 11.2 ± 6.5 1.0
(Nariagenin)
金圣草黄素
23.2 ± 1.2 24.9 ± 11.2 7.7 ± 7.1 0.9
(Chrysoeriol)
桉油醇
22.9 ± 10.4 -4.7 ± 4.9 -16.5 ± 17.5 1.8 (Cineole)
6-姜辣醇
22.6 ± 3.4 0.5 ± 0.7 -8.2 ± 9.0 1.8 6-Gingerol
圣草酚
22.3 ± 4.7 6.5 士 11.3 9.0 ± 4.7 1.4 (Eriodictyol)
异野樱素 22.2 ± 7.3 -8.9 ± 11.2 -8.0 ± 10.5 1.2 最小有效 筛选成分\抑制浓度 Amidase活性抑制率(％)
剂量（mg)
100 uM 10 uM 1 uM
(Isosakuranetin)
白杨素
21.5 ± 2.1 24.7 ± 2.2 3.5 ± 6.1 1.1 (Chrysin)
金松双黄酮
20.6 土 19.3 20.7 士 6.0 10.3 土 3.8 1.3 (Sciadopitysin)
异槲皮苷
19.6 ± 5.9 5.1 ± 3.6 -3.7 ± 1.4 0.4
(Isoquercitrin)
橙皮素
19.0 ± 3.6 5.4 士 2.5 -40.5 ± 24.8 1.7 (Hesperetin)
异荭草素
18.0 ± 2.6 3.5 ± 0.9 7.4 土 3.8 0.5 (Homoorientin)
葛根素
17.9 ± 7.2 33.0 ± 3.3 40.9 士 3.6 0.8 (Puerarin)
枸橘苷
17.3 ± 5.8 8.1 士 11.7 10.8 ± 3.8 0.9 (Poncirin)
大豆苷元
16.2 ± 12.6 1.0 ± 7.4 -12.1 ± 6.3 1.4 (Daidzein)
原儿茶酸
15.7 ± 8.1 10.9 ± 2.0 11.5 ± 4.0 0.9 (Protocatechuic acid)
15.6 ± 1.0 5.7 ± 2.6 2.8 ± 15.1 0.9
(Baicalein)
木犀草素 -7-葡萄糖甙
12.9 ± 3.1 8.7 土 1.9 3.2 ± 0.8 0.8 (Luteolin-7-Glucoside)
肉桂酸
12.6 土 1.7 -1.4 士 0.6 -11.9 士 2.3 0.9 (Trans-Cinnamic Acid)
甘草甙
12.5 ± 8.3 -7.5 ± 13.4 2.5 ± 2.9 0.8
(Liquiritin)
佩兰素
12.0 ± 7.4 7.5 士 0.7 0.9 ± 2.8 0.8
(Eupatorin) 最小有效 筛选成分\抑制浓度 Amidase活性抑制率 (°/。）
剂量（mg)
100 uM 10 uM 1 uM
牡荆素
11.5 士 1.0 6.3 士 5.0 1.3
(Vitexin)
兀花素
11.3 ± 1.3 2.1 ± 10.0 1.6 ± 3.4 0.8
(Genkwanin)
刺芒柄花素
9.8 ± 5.2 5.0 ± 0.4 -2.1 ± 5.0 0.5
(Formononetin)
甜橙黄酮
9.7 ± 0.9 6.6 ± 0.5 -0.8 ± 3.0 1.1 (Sinensetin)
9.7 ± 6.0 16.1 ± 0.4 16.9 ± 11.0 1.1
(Curcumin)
金丝桃甙
8.4 ± 3.7 3.8 ± 4.4 4.6 ± 2.7 1.3
(Hyperoside)
大豆甙 ρ
7.4 ± 6.3 1.1 士 5.4 3.6 ± 3.0 0.9 (Daidzin)
根皮甙
7.1 士 13.9 -3.1 ± 3.4 -3.2 ± 11.0 1.3 (Phloridzin)
(+)-柠檬烯
6.2 ± 3.8 3.2 ± 8.6 5.1 ± 0.4 0.5 ((+)-Limonene)
金雀异黄酮
5.8 ± 6.8 1.8 ± 7.6 -2.1 ± 46.2 0.5 (Genistein)
月桂烯
5.8 士 2.7 6.6 士 4.1 1.7 士 1.3 0.9 (β-Myrcene)
芸香素
5.7 士 8.2 -4.7 ± 4.7 -5.2 ± 1.2 0.9 (Rutin)
松油醇
4.4 ± 5.2 7.0 ± 4.6 -0.7 ± 5.0 1.7 (Terpineol)
月桂醇
4.1 士 4.3 -0.7 士 1.5 2.2 士 3.1 1.8 (Lauryl Alcohol)
(-) -Epicatechin 3.6 ± 4.3 -4.8 ± 10.5 -25.8 ± 6.2 1.4 最小有效 筛选成分\抑制浓度 Amidase活性抑制率 (％；)
剂量（mg)
100 uM 10 uM 1 uM
(-) -Epigallocatechin 2.2 ± 4.1 -7.3 ± 7.6 -1.2 ± 2.1 0.9 香叶木素
1.6 ± 5.1 -0.7 士 7.7 0.3 士 8.1 1.2 (Diosmin)
懈皮
1.6 ± 4.4 -14.4 ± 5.3 -14.1 ± 12.1 1.3 (Quercitrin)
儿茶素
1.3 ± 6.3 -11.8 ± 20.2 -2.1 ± 1.1 0.8
((+)-Catec in)
异牡荆
1.1 土 7.1 5.8 ± 2.7 13.9 士 2.3 2.5 (Isovitexin)
麦角固醇
0.4 ± 3.6 -0.4 ± 10.7 4.3 士 10.7 1.9 (Ergosterol)
没食子酸
-20.2 ± 26.5 20.0 ± 5.1 12.0 ± 5.5 1.3 (Gallic Acid)
黄素
13.2 土 3.4 -10.2 士 20.3 1.2 (Apigenin)
*最小有效剂量： 最低筛选浓度 （mg/L) X人肝肠体积 (3L) 表 9体外筛选赋形剂所测出的 Amidase抑制率
Acesulfame Potassium 24.3 ± 4.9 -167.2 ± 167.3 -12.4 士 27.4 17
Brij76 21.0 ± 6.2 1.2 ± 6.6 -10.8 ± 5.7 17 聚氧乙烯山梨醇酐单油酸
16.7 ± 6.7 -3.3 ± 9.9 11.9 ± 2.1 ' 17 酯
聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕
15.4 ± 8.1 7.2 ± 7.4 3.1 ± 4.2 17
Mryi52 4.0 ± 6.5 1.5 士 3.9 17 甘露醇 Mannitol 1.9 ± 6.0 52.8 ± 7.6 58.3 ± 4.3 17
Pluronic F68 1.2 ± 9.1 1.7 ± 6.8 -1.0 ± 4.7 17
PEG400 0.3 ± 5.9 -2.7 ± 7.9 1.0 ± 4.2 17
PEG2000 -7.0 ± 7.1 9.2 ± 2.8 2.5 ± 12.8 17 聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂
-10.2 ± 17.4 -19.0 ± 23.3 4.1 ± 8.1 17 酸酯
Pluronic F127 -13.7 ± 3.1 -8.0 ± 5.1 -4.5 ± 2.2 17
n r
PEG300 -19.8 ± 3.2 -24.7 ± 6.1 2.7 ± 9.7 17
H -
*最小有效剂量： 最低筛选浓度 （mg/L) X人肝肠体积 (3L) 实施例 5 丙基硫异烟酰胺 (PZA)合并使用酰胺水解酶 (amidase)抑制剂硝基苯酚磷酸二酯 (BNPP)的动物试验
一、 材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为 HPLC等级， 购自 Tedia有限公司 (Fairfield, OH, USA), PZA, BNPP 则购自 Sigma化学公司 (St. Louis, MO USA), 硝基苯酚磷酸二酯 (BNPP)为文献普遍使用的酰 胺水解酶 (amidase)抑制剂， 半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有限公司制备， 是将 400克 半乳糖 (Sigma)溶于 1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸馏水中， 供作注射使用。
2.试验动物
体重为 320-350公克的雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠购自国家实验动物中心 (台湾)，动物 实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有的大鼠均置于空气 /湿度调节环境下， 光照与黑暗 各 12小时， 水及饲料的供给不限， 在试验期间大鼠体重均持续监测。 3.试验处理
试验动物随机分成 3组，每组包括 2种处理，第一种处理为注射 50 mg/kg BNPP或 BNPP 的基剂 (vehicle, VEH1， 即食盐水)， BNPP溶于加热至 60°C的食盐水 (0.9°/。NaCl), 冷却后以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至大鼠体内； 第二种处理为注射 500 mg/kg PZA或 PZA的基剂 (VEH2, 即食盐水)， PZA溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至大 鼠体内； 第一种处理 (BNPP或 VEH1)较第二种处理 (PZA或 VEH2)早 15分钟处理。
上述 3组试验共包含：
(1) 对照组 (normal control group, NC, n=10): 正常的大鼠每天注射 1次 VEH1及
VEH2施行腹腔内注射)共 49天；
(2) PZA组 (INH, n=10):正常的大鼠每天注射 1次 PZA及 VEH1 (施行腹腔内注 射)共 49天；
(3) BNPP-PZA组 (BNPP-PZA, n=10):正常的大鼠每天注射 1次 BNPP及 PZA (施 行腹腔内注射；)共 49天；
半乳糖单点法于第 49天处理后 16小时进行测试。
4.血液样本
处理完毕后， 大鼠以乙醚麻醉牺牲， 血液由大鼠背部主动脉抽取， 置于含有 EDTA的试 管中， 血衆 (plasma)以 13，000g于 4°C离心 15分钟， 分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并置于 -80°C中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性以进行定 量， AST与 ALT活性是肝脏毒性常用的指标， 是以 Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
大鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析； 肝脏样本以 10%磷酸缓冲液配制的福尔马林 (phosphate-buffered formalin)固定， 随后脱水并包埋于石蜡 (paraffin)中， 以 5 μιη厚度切片， 切 片样本以苏木精 (hematoxylin)与伊红 (eosin)染色， 并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain, PAS),染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液 (cacodylate buffer, O.lM pH 7.4)清洗， 以 20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定 1小时， 以 酒精连续脱水后包埋于 Spurr树脂 (Spurr resin)中， 并以钻石刀切取超薄切片， 以醋酸铀酰 (uranyl acetate)及柠檬酸铅 (lead citrate)作双重染色， 并以穿透式电子显微镜 (Transmission Electron Microscope, Hitachi 600, Hitachi Co., 日本)观察。
7.肝功能的定量测试
所有的大鼠均进行半乳糖单点法 (GSP)测试， 大鼠接受在 30秒内的快速静脉注射， 注射 0.4g/ml BW半乳糖溶液 0.5 g kg; 自注射后 60分钟采血一次， 血液样本取自尾部静脉； 以半 乳糖脱氢酶比色法 (colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量， 测试浓度范围为 50 至 1 ,000 μ^ιηΐ, 每个浓度的日内差异 (within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以 及变异系数 (coefficient of variation, CV)百分比计算， 最大容许的变异系数为 10% CV; 日间差 异 (day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点 法 (GSP)为 30秒注射停止后 60分钟时血液中半乳糖浓度。
8.统计分析
所有的数据皆以平均 ±标准偏差 (SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (ANOVA)测试法 来计算是否具有统计上的显着差异， 使用 Statistical Package of the Social Science program (Version 13, SPSS Inc.)软件包来计算； 随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性 (least significant difference)方法做多重比较， 以确认族群间的显着差异； 族群平均的显着差异为 P<0.05。
一、 结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验动物的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异； 生化分析结果如图 11所示， PZA组血浆中的天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT) 活性明显高于对照组 (对照组血浆中的 AST活性为 109±27 IU/L; PZA组血浆中的 AST活性 为 179±10 IU/L, p < 0.005； 对照组血浆中的 ALT活性为 43±9 IU/L; PZA组血桨中的 ALT活 性为 91±11 lWL, p < 0.005), 显示 PZA组产生生化上的肝损伤； BNPP-PZA血清中转胺酶浓 度则显着低于 PZA组。
2.组织病理学
经过为期 7周施行腹腔注射 500 mg/kg/day PZA的大鼠， 其体内成功的产生肝毒性； 相对 的，在对照组大鼠体内的肝结构则较正常，如图 12A所示，对照组大鼠肝实质 (liver parenchyma) 内的肝细胞排列于自肝小叶中央静脉辖射排列的网状平板内， 肝血窦 (hepatic sinusoids;)则在两 肝板 (anastomosing plates)之间被发现； PZA组大鼠的组织切片则如图 12B所示， PZA组大鼠中 央静脉周围的肝细胞则呈现碎裂及空泡化， 然而并无看到肝细胞坏死 (necrosis)的征兆。 而 BNPP-PZA组大鼠的肝损害程度与对照组相较， 并无明显区别 (未显示结果)。 3.剩余肝功能的量测
如图 13所示， 对照组与 PZA组大鼠的半乳糖单点法 (GSP)值具有高度的显着差异 (对照 组大鼠的 GSP值为 260±50 g/ml; PZA组大鼠的 GSP值为 776±65 g/ml, ? < 0.005)， 此外， BNPP-PZA组大鼠的 GSP值为 293±61 g/ml，与 PZA组相较，具有高度的显着差异 (p < 0.005)； 单独施用 PZA的大鼠的 GSP值明显增加； 然而， 在 PZA合并施用 BNPP的大鼠则可抵抗这 种改变； 而对照组与 BNPP-PZA组之间大鼠的 GSP值无显着差异存在。 实施例 6异烟碱酰胺 (INH)及 /或立复霉素 (RIF)及 /或丙基硫异烟酰胺 (PZA)合并使用 CYP2E1 抑制剂山奈酚 (Kaempferol)或酰胺水解酶 (amidase)抑制剂槲皮素 (Quercetin)的动物试验
一、 材料与方法
1. 试验材料
所有的有机溶剂均为 HPLC等级， 购自 Tedia有限公司 (Fairfield, OH, USA), INH、 RIF、 PZA, Kaempferol > Quercetin购自 Sigma化学公司（St. Louis, MO USA)， 半乳糖注射溶液由南 光化学制药股份有限公司制备， 是将 400克半乳糖 (Sigma)溶于 1公升含有适当缓冲溶液系统 以及等张盐类的蒸馏水中， 供作注射使用。
2.试验动物
体重为 18-25公克的 129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授 Dr. Gonzalez (美国)，引 进公鼠 3只， 母鼠 4只后， 自行配对繁殖， 动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有 的小鼠均置于空气 /湿度调节环境下， 光照与黑暗各 12小时， 水及饲料的供给不限， 在试验 期间小鼠体重均持续监测， 所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉， 并以眼窝方式进行半乳糖注 射给药， 60分钟后由尾静脉采血测 GSP值。
3.试验处理
试验动物随机分成 7组， 每组包括 5种处理， 第一种处理为注射 Kaempferol 3.78 mg/kg 或其基剂 (vehicle, VEH1 , 即食盐水)， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内； 第二种 处理为则注射 Quercetin 3.02 mg kg或其基剂（VEH2, 即食盐水)， Quercetin溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内； 第三种处理为注射 50 mg/kg INH或 INH的基剂 (VEH3 , 即食盐水)， INH溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔 内注射至小鼠体内； 第四种处理为注射 100 1^/1¾ 1 ^或其基剂0^114， 即食盐水)， RIF溶于 食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内； 第五种处理为注射 250 mg/kg PZA或其基剂 (VEH5 , 即食盐水)， PZA溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积 进行腹腔内注射至小鼠体内。
上述 5组试验共包含：
(1) 对照组 (normal control group, NC, n=10): 正常的小鼠每天注射 1次 VEH1、
VEH2, VEH3、 VEH4以及 VEH5(施行腹腔内注射)共 21天；
(2) INH-RIF组 (INH-RIF, n=10): 正常的小鼠每天注射 1次 INH、 RIF、 VEH1、
VEH2以及 VEH5 (施行腹腔内注射)共 21天；
(3) Kaempferol-INH-RIF组 (Kaempferol-INH-RIF， n=10): 正常的小鼠每天注射 1 次 Kaempferol、 INH、 RIF、 VEH2以及 VEH5 (施行腹腔内注射)共 21天；
(4) Quercetin-INH-RIF组 (Quercetin-INH-RIF, n=10) : 正常的小鼠每天注射 1次 Quercetin, INH、 RIF、 VEH1以及 VEH5(施行腹腔内注射)共 21天；
(5) INH-RIF-PZA组 (I H-RIF-PZA, n=10) :正常的小鼠每天注射 1次 I H、 RIF、 PZA、 VEH1以及 VEH2 (施行腹腔内注射)共 21天；
(6) Kaempferol-INH-RIF-PZA组 (Kaempferol-INH-RIF-PZA， n=10) : 正常的小鼠 每天注射 1次 Kaempferol、 INH、 RIF、 PZA以及 VEH2 (施行腹腔内注射)共 21天；
(7) Quercetin-I H-RIF-PZA组 (Quercetin-INH-RIF-PZA, n=l 0)：正常的小鼠每天 注射 1次 Quercetin、 INH、 RIF、 PZA以及 VEH1 (施行腹腔内注射)共 21天；
4.血液样本
处理完毕后，， 小鼠以乙醚麻醉， 血液由小鼠心脏采血， 置于含有 Heparin的试管中， 血 浆 (plasma)以 13,000g于 4°C离心 10分钟，分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并 置于 -80。C中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性以进行定 量， AST与 ALT活性是肝脏毒性常用的指标， 是以 Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
小鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析； 肝脏样本以 10%磷酸缓冲液配制的福尔马林 (phosphate-buffered formalin)固定， 随后脱水并包埋于石蜡 (paraffin)中， 以 5 μιη厚度切片， 切 片样本以苏木精 (hematoxylin)与伊红 (eosin)染色， 并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain, PAS) ,染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液 (cacodylate buffer, 0.1M pH 7.4)清洗， 以 20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定 1小时， 以 酒精连续脱水后包埋于 Spurr树脂 (Spurr resin)中， 并以钻石刀切取超薄切片， 以醋酸铀酰 (uranyl acetate)及柠檬酸铅 (lead citrate)作双重染色， 并以穿透式电子显微镜 (Transmission Electron Microscope, Hitachi 600, Hitachi Co., 日本)观察。
7.肝功能之定量测试
所有的小鼠均进行半乳糖单点法 (GSP)测试， 小鼠接受在 30秒内的快速眼窝注射， 注射
0.4g/ml BW半乳糖溶液 0.5 g/kg; 自注射后 60分钟采血一次， 血液样本取自尾部静脉； 以半 乳糖脱氢酶比色法 (colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量， 测试浓度范围为 50 至 1 ,000 μ^τχύ, 每个浓度的日内差异 (within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以 及变异系数 (coefficient of variation, CV)百分比计算， 最大容许的变异系数为 10% CV; 日间差 异 (day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点 法 (GSP)为 30秒注射停止后 60分钟时血液中半乳糖浓度。
8.统计分析
所有的数据皆以平均 ±标准偏差 (SD)表示,试验结果以单因子变异数分析 (ANOVA)测试法 来计算是否具有统计上的显着差异， 使用 Statistical Package of the Social Science program (Version 13, SPSS Inc.)软件包来计算； 随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性 (least significant difference)方法做多重比较， 以确认族群间的显着差异； 族群平均的显着差异为 P<0.05 o
二、 结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验小鼠的体重及相对肝重量， 与对照组动物相较之下并无显着差异； 生化分析结果如 (图 14及表 10)所示， 当小鼠以 50/100 mg/kg/day连续给予 3周 I H/RIF后， INH/RIF控制组血浆中的天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性明显高于空白对 照组 (空白对照组血浆中的 AST活性为 90±15 IU/L; INH/RIF控制组血浆中的 AST活性为 571 ± 295 IU/L, p < 0.001； 空白对照组血浆中的 ALT活性为 40 ± 5 IU/L; INH/RIF控制组血浆中 的 ALT活性为 364 ± 192 IU/L, < 0.001) ,显示 INH/RIF的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤； 而以 50/100/250 mg/kg/day连续给予 3周 INH/RIF/PZA的小鼠， INH/RIF/PZA控制组血桨中 的 AST和 ALT活性分别为 702 ± 172 IU/L及 464 ± 72 IU/L , 显着高于空白对照组及 INH/RIF 控制组， 显示 INH/RIF/PZA的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤， 且损伤程度高于 INH/RIF 造成的伤害； 同时给予 CYP2E1 抑制剂 Kaempferol 或酰胺水解酶抑制剂 Quercetin 的 Quercetin-INH-RIF> Kaempferol-INH-RIF > Quercetin-INH-RIF-PZA , Kaempferol-INH-RIF-PZA 实验组血清中转胺酶浓度则接近正常值。
表 10对照组、 INH-RIF组、 KH-I H-RIF组、 KM-I H-RIF组、 KL-INH-RIF组、 MH-I H-RJF 组、 MM-INH-RIF组及 ML-INH-RIF组 Total HAI score、 天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙 氨酸转胺酶 (ALT)活性分析， 数值的计算为 mean ± SD。
Liver function parameters AST (IU/L) ALT (IU/L) Total HAI
score
Normal control (n=9) 80 + 13 46 + 10 0.0 ± 0.0
INH-RIF (n=8) 420 + 66 358 ± 67 5.3 ± 2.2
KH-INH-RIF (n=8) 93 + 12*** 60 + 12*** 1.8 ± 0.7*
KM-INH-RIF (n=6) 96 + 15*** 77 + 30*** 1.7 + 0.8*
KL-INH-RIF (n=6) 111 + 27*** 128士 36*** 2.8 + 1.3*
MH-INH-RIF (n=8) 93土 12 *** 54 ± 18*** 0.8 ± 0.5***
MM-INH-RIF (n=6) 85 + 16*** 52 + 12*** 0.7 + 0.8***
ML-INH-RIF (n=6) 154 ± 62* 119 + 55** 2.0士 0.6*
Data are shown as mean土 SD.
<0.05, **/7<0.01, ***/ θ·005: Study compare to control group.
2.组织病理学
经过为期三周施行腹腔注射 50/100 mg/kg/day I H/RIF 及 50/100/250 mg/kg/day INH/RIF/PZA的小鼠， 其体内确实成功的产生肝毒性； 相对的， 在空白对照组小鼠体内的肝 结构则较正常； 相较于 INH-RIF-PZA 组， Kaempferol-INH-RIF 组、 Quercetin-I H-RIF、 Kaempferol-INH-RIF-PZA组和 Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠中央静脉周围肝细胞较为完整， 空泡明显较少， 发炎细胞亦较少。
在评估肝脏病理组织切片严重程度的 HAI-score 方面， 小鼠在连续给予 INH/RIF 或 INH/RIF/PZA 3周后，确实在 Intralobular Degeneration and Focal Necrosis与 Inflammatio 这两 个项目得到积分， 且在 INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制组中发现有 Piecemeal necrosis, 而 Kaempferol-INH-RIF 组 、 Quercetin-I H-RIF 、 Kaempferol-INH-RIF-PZA 组 和 Quercetin-INH-RIF-PZA组与 INH/RIF控制组相比则有明显的改善 (图 16、 图 17)。
1. 剩余肝功能的量测
INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制组的半乳糖单点法 (GSP)值有随着 INH/RIF给药时间愈长 而愈高的趋势； 空白对照组与 INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制组小鼠的 GSP值具有高度的显 着差异 (空白对照组小鼠的 GSP值为 177 ± 22 mg/L; 给药 3周后， INH-RIF及 INH-RIF-PZA 小鼠的 GSP值各为 866 士 339 mg/L, p < 0.001与 858 ± 172 mg/L, p < 0.001， 此外， 在 Kaempferol-INH-RIF 组 、 Quercetin-I H-RIF 、 Kaempferol-INH-RIF-PZA 组 和 Quercetin-INH-RIF-PZA组小鼠之 GSP值为 401士 178 mg/L、 203 ± 76 mg/L、 273 ± 61 mg/L、 216 ± 67 mg/L, 与 INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制组小鼠具有高度的显着差异 (p < 0.001); 显 示施用 INH-RIF及 INH-RIF-PZA控制组小鼠的 GSP值明显增加； 然而， 并用 Kaempferol或 Quercetin的小鼠则可抵抗这种改变， 空白对照组与 Kaempferol或 Quercetin实验组相比时， 小鼠之间的 GSP值无显着差异存在 (图 15)。 实施例 7 异烟碱酰胺 (I H)及立复霉素 (RIF)合并使用 CYP2E1抑制剂山奈酚 (Kaempferol)、 甘露醇 Mannitol、 邻磺酰苯酰亚胺、 蔗糖素、 Dicalcium phosphate、 交联聚乙烯吡咯垸酮的动 物试验
一、 材料与方法
1.试验材料
所有的有机溶剂均为 HPLC等级， 购自 Tedia有限公司 (Fairfield, OH, USA)， INH, RIF. Kaempferol, 甘露醇 Mannitol、 邻磺酰苯酰亚胺、 蔗糖素、 Dicalcium phosphate、 交联聚乙烯 吡咯烷酮购自 Sigma化学公司 (St. Louis, MO USA), 半乳糖注射溶液由南光化学制药股份有 限公司制备， 是将 400克半乳糖 (Sigma)溶于 1公升含有适当缓冲溶液系统以及等张盐类的蒸 馏水中， 供作注射使用。
2.试验动物
体重为 18-25公克的 129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授 Dr. Gonzalez (美国)，引 进公鼠 3只， 母鼠 4只后， 自行配对繁殖， 动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有 的小鼠均置于空气 /湿度调节环境下， 光照与黑暗各 12小时， 水及饲料的供给不限， 在试验 期间小鼠体重均持续监测， 所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉， 并以眼窝方式进行半乳糖注 射给药， 60分钟后由尾静脉采血测 GSP值。
3.试验处理
试验动物随机分成 13组，每组包括 3种处理，第一种处理为口服 Kaempferol 1.67 mg/kg， 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或为口服 Kaempferol 4.27 mg/kg， 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或为口 月艮 Kaempferol 8.33 mg/kg, 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或为口服甘露醇 Mannitol 0.17 mg/kg， 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或为口服甘露醇 Mannitol 0.83 mg/kg， 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或 为口服甘露醇 Mannitol 1.67 mg/kg, 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或为口服邻磺酰苯酰亚胺 0.83 mg/kg, 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或为口服蔗糖素 1.67 mg/kg， 以 0.1 ml/kg的体积给药； 或 为口服邻磺酰苯酰亚胺 0.83 mg/kg+甘露醇 Mannitol 0.83 mg/kg , 或为口服 Dicalcium phosphate 0.83 mg/kg, 或处理为口服交联聚乙烯吡咯垸酮 2.83 mg/kg, 第二种处理为注射 50 mg/kg I H或 I H的基剂 (VEH1， 即食盐水)， I H溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的 体积进行腹腔内注射至小鼠体内； 第三种处理为注射 100 mg/kg RIF或其基剂(VEH2， 即食盐 水 RIF溶于食盐水 (0.9% NaCi;i中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内。
上述 5组试验共包含：
(I) 对照组 (normal control group, NC, n=10): 正常的小鼠每天注射 1次 VEH1、 VEH2 (施行腹腔内注射)共 21天；
(2) I H-RIF组 (I H-RIF, n-10): 正常的小鼠每天注射 1次 INH、 RIF (施行腹腔 内注射)共 21天；
(3) KL-I H-RIF组 (n=8): 正常的小鼠每天口服一次 Kaempferol 1.67 mg/kg， 注 射 1次 INH、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(4) KM-I H-RIF组 (n=6) : 正常的小鼠每天口服一次 Kaempferol 4.17 mg/kg，注 射 1次 INH、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(5) KH-INH-RIF组 (n=6): 正常的小鼠每天口服一次 Kaempferol 8.33 mg/kg， 注 射 1次 INH、 RIF (施行腹腔内注射;)共 21天；
(6) ML-INH-RIF组 (n=8)：正常的小鼠每天口服一次甘露醇 Mannitol 0.17 mg/kg , 注射 1次 INH、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(7) MM-INH-RIF 组 (n=6) : 正常的小鼠每天口服一次甘露醇 Mannitol 0.83 mg/kg， 注射 1次 I H、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(8) MH-INH-RIF 组 (n=6) : 正常的小鼠每天口服一次甘露醇 Mannitol 1.67 mg/kg, 注射 1次 I H、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天：
(9) SA-I H-RIF 组 (n=4) : 正常的小鼠每天口服一次邻磺酰苯酰亚胺 0.83 mg/kg, 注射 1次 I H、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(10) SU-INH-RIF组 (n=4): 正常的小鼠每天口服一次蔗糖素 1.67 mg/kg， 注射 1 次 I H、 RIF (施行腹腔内注射；)共 21天；
(I I) SAM-I H-RIF 组 (n=4) : 正常的小鼠每天口服一次邻磺酰苯酰亚胺 0.83 mg/kg+甘露醇 Mannitol 0.83 mg/kg, 注射 1次 I H、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(12) D-INH-RIF 组 (n=4) : 正常的小鼠每天口服一次 Dicalcium phosphate 0.83 mg/kg, 注射 1次 INH、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
(13) C-INH-RIF 组 (n=4): 正常的小鼠每天口服一次交联聚乙烯吡咯垸酮 2.83 mg/kg, 注射 1次 INH、 RIF (施行腹腔内注射)共 21天；
圖血液样本
处理完毕后， 小鼠以乙醚麻醉， 血液由小鼠心脏采血， 置于含有 Heparin的试管中， 血 浆 (plasma)以 13，000g于 4Ό离心 10分钟，分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并 置于 -80°C中储存。
5.生化分析
肝细胞损伤以量测血浆中天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性以进行定 量， AST与 ALT活性是肝脏毒性常用的指标， 是以 Synchron LXi 725系统来量测 (Beckman Instruments,美国)。
6.光学显微镜与电子显微镜
小鼠牺牲后肝脏随即进行组织学分析； 肝脏样本以 10%磷酸缓冲液配制的福尔马林 (phosphate-buffered formalin)固定， 随后脱水并包埋于石蜡 (paraffin)中， 以 5 μηι厚度切片， 切 片样本以苏木精 (hematoxylin)与伊红 (eosin)染色， 并进行肝糖染色试验 (Periodic acid Schiff stain, PAS),染色后以光学显微镜进行组织学观察；另外，肝脏切片以二甲胂缓冲液 (cacodylate buffer, O.lM pH 7.4)清洗， 以 20%四氧化锇水溶液 (aqueous osmium tetroxide)后固定 1小时， 以 酒精连续脱水后包埋于 Spurr树脂 (Spurr resin)中，. 并以钻石刀切取超薄切片， 以醋酸铀酰 (uranyl acetate)及柠檬酸铅 (lead citrate)作双重染色， 并以穿透式电子显微镜 (Transmission Electron Microscope, Hitachi 600, Hitachi Co., 日本)观察。
7.肝功能的定量测试
所有的小鼠均进行半乳糖单点法 (GSP)测试， 小鼠接受在 30秒内的快速眼窝注射， 注射 0.4g/ml BW半乳糖溶液 0.5 g/kg; 自注射后 60分钟采血一次， 血液样本取自尾部静脉； 以半 乳糖脱氢酶比色法 (colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量， 测试浓度范围为 50 至 1 ,000 g/ml， 每个浓度的日内差异 (within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以 及变异系数 (coefficient of variation, CV)百分比计算， 最大容许的变异系数为 10e/。CV; 日间差 异 (day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点 法 (GSP)为 30秒注射停止后 60分钟时血液中半乳糖浓度。
8.统计分析
所有的数据皆以平均 ±标准偏差 (SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (ANOVA)测试法 来计算是否具有统计上的显着差异， 使用 Statistical Package of the Social Science program (Version 13, SPSS Inc.)软件包来计算； 随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性 (least significant difference)方法做多重比较， 以确认族群间的显着差异； 族群平均的显着差异为 P<0.05。
二、 结果
1.生化分析结果
试验结束时，测量试验小鼠的体重及相对肝重量，与对照组动物相较之下并无显着差异； 生化分析结果如表 11所示， 当小鼠以 50/100 mg/kg/day连续给予 3周 INH/RIF后， I H/RIF 控制组血浆中的天门冬氨酸转胺酶 (AST)与丙氨酸转胺酶 (ALT)活性明显高于空白对照组 (空 白对照组血浆中的 AST活性为 80±13 IU/L; INH/RIF控制组血桨中的 AST活性为 420 ± 66 KS/ , p < 0.001；空白对照组血桨中的 ALT活性为 46 ± 10 IU/L; INH/RIF控制组血浆中的 ALT 活性为 358 ± 67 IU/L, p < 0.001), 显示 INH/RIF的确对小鼠造成生化程度上的肝损伤； 同时 给予 CYP2E1抑制剂 Kaempferol、 甘露醇 Mannitol各剂量实验组、 血清中转胺酶浓度皆显着 低于 INH/RIF控制组。
2.组织病理学
经过为期三周施行腹腔注射 50/100 mg/kg/day INH/RIF的小鼠， 其体内确实成功的产生 肝毒性； 相对的， 在空白对照组小鼠体内的肝结构则较正常； 相较于 I H-RIF 组， 甘露醇 Mannitol各剂量实验组小鼠中央静脉周围肝细胞较为完整，空泡明显较少，发炎细胞亦较少 (图 18)。
在评估肝脏病理组织切片严重程度的 HAI-score方面， 小鼠在连续给予 INH/RIF 3周后，
KaempferoK 甘露醇 Mannitol各剂量实验组与 INH/RIF控制组相比则有明显的改善。
3.剩余肝功能的量测
INH-RIF控制组的半乳糖单点法 (GSP)值有随着 INH/RIF给药时间愈长而愈高的趋势；空 白对照组与 INH-RIF控制组小鼠的 GSP值具有高度的显着差异 (空白对照组小鼠 3周的 GSP 值为 192 ± 18 mg/L;给药 3周后， INH-RIF小鼠的 GSP值为 666 ± 126 mg/L, j9 < 0.001 ,然而， KaempferoK 甘露醇 Mannitol、 邻磺酰苯酰亚胺、 蔗糖素、 Dicalcium phosphate各剂量实验组 的小鼠则可抵抗这种改变，其中空白对照组与 KH-INH-RIF组、 KM-INH-RIF组、 MH-I H-RIF 组、 MM-I H-RJF组、 SU-I H-RIF组相比时， 小鼠之间的 GSP值无显着差异存在 (如表 11)。 表 11、为对照组、 INH-RIF组、 KH-INH-RIF组、 KM-INH-RIF组、 KL-I H-RIF组、 MH-INH-RIF 组、 MM-INH-RIF组、 ML-INH-RIF组、 SA-INH-RIF组、 SU-INH-RIF组、 SAM-INH-RIF组、 D-INH-RIF组及 C-INH-RIF组小鼠半乳糖单点法 (GSP)值， 数值的计算为 mean ± SD。
GSP (mg/L) 0 weeks 2 weeks 3 weeks Anova and LSD
0-2 0-3 2-3
Normal control (n=4) 197 ± 16 186 + 19 192 ± 18 ND ND ND
INH-RIT (n=8) 201 ± 23 472土 128 666 ± 126 < 0.005 < 0.005 < 0.01
KH-INH-RIF (n=8) 199 ± 19 195 + 41 254 ± 34 ND ND ND
KM-INH-RIF (n=6) 195 ± 26 221 ± 17 262 ± 33 ND ND ND
KL-INH-RIF (n=6) 212 ± 34 290 + 43 327土 50 < 0.005 < 0.005 ND
MH-INH-RIF (n=8) 196 ± 22 208 ± 26 252土 24 ND ND ND
MM-INH-RIF (n=6) 201 ± 17 240 + 29 237士 30 ND ND ND
ML-INH-RIF (n=6)
188 + 26 287 ± 28 300土 40 < 0.01 < 0.01 ND
SA-INH-RIF(n=4) 199 ± 21 269 ± 40 258士 28 ND ND ND
SU-INH-RIF(n=4) 203士 19 300 ± 31 399 ± 22 < 0.005 < 0.005 < 0.05
SAM-INH-RIF(n=4) 196 ± 22 240 ± 38 223士 29 ND ND ND
D-INH-RIF(n=4) 208 ± 25 249 ± 35 366士 77 ND < 0.005 < 0.01
C-INH-RIF(n=4) 193 + 7 330 ± 56 459土 76 < 0.005 < 0.005 ND
Data are shown as mean土 SD.
* 7<0.05, ** θ.01, *** ;<0.005: Study compare to control group. 实施例 8 异烟碱酰胺 (INH)及立复霉素 (RIF)及丙基硫异烟酰胺PZA)合并使用 CYP2E1抑制剂 甘露醇 Mannitol的动物试验
一、 材料与方法
1. 试验材料
所有的有机溶剂均为 HPLC等级， 购自 Tedia有限公司 (Fairfield, OH, USA), I H、 RIF、 PZA、 甘露醇 Mannitol购自 Sigma化学公司 (St. Louis, MO USA), 半乳糖注射溶液由南光化 学制药股份有限公司制备， 是将 400克半乳糖 (Sigma)溶于 1公升含有适当缓冲溶液系统以及 等张盐类的蒸馏水中， 供作注射使用。
2.试验动物
体重为 18-25公克的 129/sv小鼠是购自美国国家卫生研究院教授 Dr. Gonzalez (美国)，引 进公鼠 3只， 母鼠 4只后， 自行配对繁殖， 动物实验是遵照国卫院动物实验指南进行， 所有 的小鼠均置于空气 /湿度调节环境下， 光照与黑暗各 12小时， 水及饲料的供给不限， 在试验 期间小鼠体重均持续监测， 所有的小鼠均以使用乙醚进行麻醉， 并以眼窝方式进行半乳糖注 射给药， 60分钟后由尾静脉采血测 GSP值。
3.试验处理 试验动物随机分成 3组， 每组包括 4种处理， 第一种处理为口服为口服甘露醇 Mannitol 1.67 mg/kg,以 0.1 ml/kg的体积给药；第二种处理为注射 50 mg/kg INH或 INH的基剂 (VEH1 , 即食盐水)， I H溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内； 第三种处理为注射 100 mg/kg RIF或其基剂 (VEH2， 即食盐水)， RIF溶于食盐水 (0.9% NaCl) 中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至小鼠体内；第四种处理为注射 250 mg/kg PZA或其基 剂 (VEH3， 即食盐水)， PZA溶于食盐水 (0.9% NaCl)中， 以 1 ml/kg的体积进行腹腔内注射至 小鼠体内。
上述 3组试验共包含：
(1) 对照组 (normal control group, NC, n=10): 正常的小鼠每天注射 1次 VEH1、 VEH2、 VEH3 (：施行腹腔内注射)共 21天；
(2) INH-RIF-PZA组 (INH-RIF，n=6): 正常的小鼠每天注射 1次 INH、 RIF, PZA (施行腹腔内注射)共 21天；
(3) M-I H-RIF-PZA组 (n=6): 正常的小鼠每天口服一次甘露醇 Mannitol 1.67 mg/kg， 注射 1次 I H、 RIF、 PZA (施行腹腔内注射)共 21天。
4.血液样本
处理完毕后，， 小鼠以乙醚麻醉， 血液由小鼠心脏采血， 置于含有 Heparin的试管中， 血 (plasma)以 13,000g于 4°C离心 10分钟，分离后的血浆分装到微量小管 (Eppendorf tube)中并 置于 -80'C中储存。
5.肝功能的定量测试
所有的小鼠均进行半乳糖单点法 (GSP)测试， 大鼠接受在 30秒内的快速眼窝注射， 注射
0.4g/ml BW半乳糖溶液 0.5 g/kg; 自注射后 60分钟采血一次， 血液样本取自尾部静脉； 以半 乳糖脱氢酶比色法 (colorimetric galactose dehydrogenase)量测半乳糖含量， 测试浓度范围为 50 至 1,000 g/ml, 每个浓度的日内差异 (within-day variation)是由标准偏差 (standard deviation)以 及变异系数 (coefficient of variation, CV)百分比计算， 最大容许的变异系数为 10% CV; 日间差 异 (day-to-day variation)则由比较校正曲线 (calibration curves)的斜率及截距来检验；半乳糖单点 法 (GSP)为 30秒注射停止后 60分钟时血液中半乳糖浓度。
6.统计分析
所有的数据皆以平均 ±标准偏差 (SD)表示，试验结果以单因子变异数分析 (ANOVA)测试法 来计算是否具有统计上的显着差异， 使用 Statistical Package of the Social Science program (Version 13, SPSS Inc.)软件包来计算； 随后使用事后比较 (post hoc test)最小差异显着性 (least significant difference)方法做多重比较， 以确认族群间的显着差异； 族群平均的显着差异为 P<0.05。
二、 结果
1. 剩余肝功能的量测
INH-RIF-PZA控制组的半乳糖单点法 (GSP)值有随着 INH/RIF给药时间愈长而愈高的趋 势； 空白对照组与 INH-RIF-PZA控制组小鼠的 GSP值具有高度的显着差异 (空白对照组小鼠 3周的 GSP值为 570 ± 293 mg/L;给药 3周后， INH-RIF-PZA小鼠的 GSP值为 948 ± 236 mg/L, /? < 0.001 , 然而， 甘露醇 Mannitol实验组的小鼠则可抵抗这种改变 (如表 12)。
表 12、 为对照组、 INH-RIF-PZA组、 M-INH-RIF-PZA组小鼠半乳糖单点法 (GSP)值， 数值的计算为 mean ± SD。
NC INH-RIF-PZA M-INH-RIF-PZA
GSP(mg/L)
(n=6) (n=8) (n=6)
0 weeks 344 ± 196 372 + 172 356士 144
2 weeks 381士 157 431 ± 103 283士 178
3 weeks 570土 293 948 ± 236 296 ± 102***
Data are shown as mean ± SD.
* 0.05, **p<0M, ***p<0.005: Study compare to control group.
实施例 9低副作用 INH/RIF剂型于健康受试者体内对 I H相关代谢酶的影响研究
一、 材料与方法
1. 试验处理
利用 CYP2E1 phenoytping 药物 Chlorzoxazone 500 mg 与 Rifamate (Isoniazid 150 mg/Rifampin 300 mg)并服 CYP2E1抑制剂甘露醇 Mannitol 100 mg, 于健康受试者进行药动学 比较研宄。 试验过程中， 监测受试者血浆中 Chlorzoxazone (CZX)及其代谢物的变化情形， 并 掌握 ALT、AST及 GSP值等生化值变化，进而评估健康受试者在有无并服 CYP2E1抑制剂下， 研宄 CYP2E1在健康受试者体内的活性变化情形。
2. 试验分组
本试验全程于三军总医院临床研究中心执行， 试验共有 2次阶段性给药， 每次试验间隔 一周。 第 1 次给药， 口服给予国外原厂 Rifamate (Isoniazid 150 mg/Rifampin 300 mg)与 Chlorzoxazone (500 mg), 第 1次给药后一周， 同一批受试者进行第 2次给药， 给予国外原厂 Rifamate (Isoniazid 150 mg/Rifampin 300 mg) +甘露醇 Mannitol (100 mg)与 Chlorzoxazone (500 mg)。
3. 评估及统计方法
受试者的试验数据及统计分析结果将会作一个整合性概述， 药物动力学数据以平均值及 标准差描述，试验中所得到的药动学参数及数据上的显着差异，将会以 ONE WAYANOVA或 其它更适切的统计分析方法进行分析。
二、 结果
1. 血液分析结果
己完成 18人次临床试验，控制组 (Chlorzoxazone 500 mg + Isoniazid 300 mg) 9人次与实验 组 (Chlorzoxazone 500 mg + Isoniazid 300 mg + HUCHE033 180 mg) 9人次。 结果显示， 并用
HUCHE033组， Chlorzoxazone原型药的药物动力学参数未有显着影响，但其经 CYP2E1代谢 的代谢物 6-OH Chlorzoxazone的 Cmax显着较低， 其 6-OH-Chlorzoxazone/ Chlorzoxazone代 谢比亦显着低于控制组 （图 19、 图 20及表 13)。 '
表 13 Chlorzoxazone + Rifamate并服或不并服甘露醇 Mannitol, Chlorzoxazone及其代谢物 6-OH Chlorzoxazone于健康受试者的药物动力学参数， 数值的计算为 mean ± SD
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上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明， 该实施例并非用以限制本发明的 专利范围， 凡未脱离本发明的等效实施或变更， 例如： 异烟碱酰胺 (INH)、 细胞色素 P450 2E1 抑制剂、酰胺水解酶 (amidase)抑制剂施用的浓度及比例， 以及细胞色素 P450 2E1抑制剂或酰 胺水解酶 (amidase)抑制剂选用的种类等变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (1)

  1. 权利 要求书
    1. 一种无 /低副作用的抗结核病药物复方， 其特征在于， 包含:
    (a)抗结核病药物， 其是异烟碱酰胺、 或立复霉素、 或丙基硫异烟碱酰胺、 或乙酰胺醇、 或前述任两种以上的组合； 以及
    (b) 至少一种医药上可接受的降低抗结核病药物副作用的物质。 -
    2. 如权利要求 1所述的抗结核病药物复方，其特征在于， 所述降低抗结核病药物副作用 的物质选自于下列化合物所组成的群组： 正二羟愈疮酸，所述正二羟愈疮酸的含量为 17毫克 至 10克、 （-) -表没食子儿茶素， 所述 (-) -表没食子儿茶素的含量为 25毫克至 10克、 茵陈色原 酮， 所述茵陈色原酮的含量为 17毫克至 10克、 山奈酚， 所述山奈酚的含量为 16毫克至 10 克、根皮素， 所述根皮素的含量为 15毫克至 10克、 橙皮素， 所述橙皮素的含量为 17毫克至 10克、 6-姜辣醇， 所述 6-姜辣醇的含量为 16毫克至 10克、 没食子酸， 所述没食子酸的含量 为 9亳克至 10克、 异甘草素， 所述异甘草素的含量为 18亳克至 10克、柚皮素， 所述柚皮素 的含量为 9毫克至 10克、二氢化槲皮素， 所述二氢化槲皮素的含量为 17毫克至 10克、汉黄 芩素， 所述汉黄芩素的含量为 16毫克至 10克、 原儿茶酸， 所述原儿茶酸的含量为 8毫克至 10克、 儿茶素， 所述儿茶素的含量为 16毫克至 10克、 β-奈黄酮， 所述 β-奈黄酮的含量为 15 毫克至 10克、恩贝素， 所述恩贝素的含量为 16毫克至 10克、反式肉桂酸， 所述反式肉桂酸 的含量为 8毫克至 10克、表儿茶酚， 所述表儿茶素的含量为 16毫克至 10克、 根皮苷， 所述 根皮苷的含量为 24毫克至 10克、反式肉桂醛， 所述反式肉桂醛的含量为 7毫克至 10克、大 豆苷元， 所述大豆苷元的含量为 14毫克至 10克、异牡荆素， 所述异牡荆素的含量为 24毫克 至 10克、 β-香叶烯， 所述 β-香叶烯的含量为 8毫克至 10克、 懈皮素， 所述槲皮素的含量为 0.9毫克至 10克、（+)-柠檬烯， 所述 (+)-柠檬烯的含量为 7毫克至 10克、杨梅素， 所述杨梅素 的含量为 17毫克至 10克、懈皮，所述懈皮的含量为 24毫克至 10克、木犀草素 -7-葡萄糖苷， 所述木犀草素 -7-葡萄糖苷的含量为 24毫克至 10克、 桑叶素， 所述桑叶素的含量为 16毫克 至 10克、新橙皮苷， 所述新橙皮苷的含量为 33毫克至 10克、橙皮苷， 所述橙皮苷的含量为 33毫克至 10克、 （-) -表没食子儿茶素， 所述 (-) -表没食子儿茶素的含量为 17毫克至 10克、木 犀草素， 所述木犀草素的含量为 16毫克至 10克、金丝桃苷， 所述金丝桃苷的含量为 25毫克 至 10克、 柽柳素， 所述柽柳素的含量为 17毫克至 10克、 黄芩素， 所述黄芩素的含量为 15 毫克至 10克、 芸香素， 所述芸香素的含量为 15毫克至 10克、 黄芩， 所述黄芩的含量为 24 毫克至 10克、芹菜素， 所述芹菜素的含量为 15毫克至 10克、（+)-表儿茶素， 所述 (+)-表儿茶 素的含量为 16毫克至 10克、 （-) -表儿茶素没食子酸酯， 所述 (-) -表儿茶素没食子酸酯的含量 为 24毫克至 10克、 水飞蓟宾， 所述水飞蓟宾的含量为 26毫克至 10克、 牡荆素， 所述牡荆 素的含量为 24毫克至 10克、 金雀异黄酮， 所述金雀异黄酮的含量为 15毫克至 10克、 异鼠 李素， 所述异鼠李素的含量为 14毫克至 10克、香叶木素， 所述香叶木素的含量为 33毫克至 10克、 葛根素， 所述葛根素的含量为 23毫克至 10克、 或伞形花内酯， 所述伞形花内酯的含 量为 9毫克至 10克、 高良姜素， 所述高良姜素的含量为 0.8毫克至 10克、 非瑟酮， 所述非 瑟酮的含量为 0.8毫克至 10克、 鲸蜡醇聚氧乙烯醚， 所述鲸蜡醇聚氧乙烯醚的含量为 1.4克 至 10克、 聚氧乙烯硬脂酸酯， 所述聚氧乙烯硬脂酸酯的含量为 1.4克至 10克、 聚氧乙烯月 桂醚， 所述聚氧乙烯月桂醚的含量为 18毫克至 10克、 聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯， 所述聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯的含量为 1.4克至 10克、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯， 所述聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯的含量为 170毫克至 10克、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯， 所述聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯的含量为 1.4克至 10克)、 聚乙二醇 PEG 2000， 所述聚 乙二醇 PEG 2000的含量为 1.4克至 10克、 聚乙二醇 PEG 400, 所述聚乙二醇 PEG 400的含 量为 1.4克至 10克、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 PLURONIC F-68,所述聚氧丙烯聚氧乙烯共聚 物 PLURONIC F-68的含量为 1.4克至 10克)、 聚乙二醇 PEG 4000, 所述聚乙二醇 PEG 4000 的含量为 1.4克至 10克、 十四垸酸乙酯， 所述十四垸酸乙酯的含量为 14毫克至 10克、 聚氧 乙烯蓖麻油， 所述聚氧乙烯蓖麻油的含量为 17毫克至 10克、 十二垸基硫酸钠， 所述十二垸 基硫酸钠的含量为 17毫克至 10克、微晶纤维素，所述微晶纤维素的含量为 190毫克至 10克、 二水磷酸氢钙， 所述二水磷酸氢钙的含量为 9毫克至 10克、 聚氧乙烯醚 (40)氢化蓖麻油， 所 述聚氧乙烯醚 (40)氢化蓖麻油的含量为 1.26克至 10克、交联聚乙烯吡咯烷酮， 所述交联聚乙 烯吡咯烷酮的含量为 158毫克至 10克、羧甲基淀粉钠， 所述羧甲基淀粉钠的含量为 158毫克 至 10克、 丙烯酸树脂 Eudragit S100, 所述丙烯酸树脂 Eudragit S100的含量为 158毫克至 10 克、 交联羧甲基纤维素钠， 所述交联羧甲基纤维素钠的含量为 158毫克至 10克、 薄荷脑， 所 述薄荷脑的含量为 8毫克至 10克)、 羟丙基纤维素， 所述羟丙基纤维素的含量为 158毫克至 10克、 预胶化淀粉， 所述预胶化淀粉的含量为 158毫克至 10克、 甘露醇 Mannitol, 所述甘 露醇 Mannitol的含量为 0.1毫克至 10克、葡萄糖结合剂， 所述葡萄糖结合剂的含量为 158毫 克至 10克、柠檬酸， 所述柠檬酸的含量为 10毫克至 10克、 气相二氧化硅， 所述气相二氧化 硅的含量为 158毫克至 10克、 聚乙二醇 PEG 8000， 所述聚乙二醇 PEG 8000的含量为 1.26 克至 10克、 山梨酸， 所述山梨酸的含量为 6毫克至 10克、柠檬油， 所述柠檬油的含量为 158 毫克至 10克、 苯甲酸钠， 所述苯甲酸钠的含量为 9毫克至 10克、 乙酰磺胺酸钾， 所述乙酰 磺胺酸钾的含量为 10毫克至 10克、 羟丙基甲基纤维素， 所述羟丙基甲基纤维素的其含量为 158毫克至 10克、 羟乙基甲基纤维素， 所述羟乙基甲基纤维素的含量为 158毫克至 10克、 邻磺酰苯酰亚胺， 所述邻磺酰苯酰亚胺的含量为 0.1毫克至 10克、 甲基纤维素， 所述甲基纤 维素的含量为 158毫克至 10克、 环己氨基磺酸钠， 所述环己氨基磺酸钠的含量为 10毫克至 10克、 乳糖单水合物， 所述乳糖单水合物的含量为 18毫克至 10克、 麦芽糖糊精， 所述麦芽 糖糊精的含量为 158毫克至 10克、 甘油二十二垸酸酯， 所述甘油二十二垸酸酯的含量为 52 毫克至 10克、氧化铁红， 所述氧化铁红的含量为 34毫克至 10克、 单硬脂酸甘油酯， 所述单 硬脂酸甘油酯的含量为 158毫克至 10克、 共聚维酮 K28, 所述共聚维酮 K28的含量为 158 毫克至 10克、 淀粉乙酸酯， 所述淀粉乙酸酯的含量为 158毫克至 10克、 硬脂酸镁， 所述硬 脂酸镁的含量为 29毫克至 10克、十二烷基硫酸钠，所述十二烷基硫酸钠的含量为 14毫克至 10克、聚维酮 K-30, 所述聚维酮 K-30的含量为 6毫克至 10克、蔗糖素， 所述蔗糖素的含量 为 0.22毫克至 10克、 苯甲醇， 所述苯甲醇的含量为 158毫克至 10克、 对羟基苯甲酸甲酯， 所述对羟基苯甲酸甲酯的含量为 8毫克至 10克、对羟基苯甲酸丙酯，所述对羟基苯甲酸丙酯 的含量为 9毫克至 10克、 聚乙二醇硬脂酸酯 15 , 所述聚乙二醇硬脂酸酯 15的含量为 158毫 克至 10克、 丁基羟基茴香醚， 所述丁基羟基茴香醚的含量为 9毫克至 10克。
    3. 如权利要求 1所述的抗结核病药物复方，其特征在于， 所述抗结核病药物复方还加入 药学上可接受的赋形剂。
    4. 如权利要求 3所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述赋形剂为稀释剂、填充剂、 结合剂、 崩解剂或润滑剂。
    5. 如权利要求 1所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方的剂型 为口服锭剂、 胶囊剂、 散剂、 溶液剂、 悬浮剂、 乳剂、 芳香水剂、 糖浆剂、 醑剂、 酏剂、 酊 剂、 流浸膏剂、 软膏、 乳霜剂、 糊剂、 注射剂或栓剂。
    6. 一种无 /低副作用的抗结核病药物复方， 其特征在于， 包含：
    (a)抗结核病化合物， 其选自于由异烟碱酰胺、 立复霉素、 丙基硫异烟碱酰胺以及乙酰胺 醇所组成的群组； 以及
    (b)至少一种医药上可接受的降低抗结核病药物副作用的物质。
    7. 如权利要求 6的抗结核病药物复方，其特征在于， 所述降低抗结核病药物副作用的物 质选自于下列化合物所组成的群组： 正二羟愈疮酸， 所述正二羟愈疮酸的含量为 17毫克至 10克、 （-) -表儿茶素没食子酸酯， 所述 (-) -表儿茶素没食子酸酯的含量为 25毫克至 10克、 茵 陈色原酮， 所述茵陈色原酮的含量为 17毫克至 10、 山奈酚， 所述山奈酚的含量为 16毫克至 10克、 根皮素， 所述根皮素的含量为 15毫克至 10克、 橙皮素， 所述橙皮素的含量为 17毫 克至 10克、 6-姜辣醇， 所述 6-姜辣醇的含量为 16毫克至 10克、 没食子酸， 所述没食子酸的 含量为 9毫克至 10克、 异甘草素， 所述异甘草素的含量为 18毫克至 10克、柚皮素， 所述柚 皮素的含量为 9毫克至 10克、 二氢化槲皮素， 所述二氢化槲皮素的含量为 17毫克至 10克、 汉黄芩素， 所述汉黄芩素的含量为 16亳克至 10克、 原儿茶酸， 所述原儿茶酸的含量为 8毫 克至 10克、 儿茶素， 所述儿茶素的含量为 16毫克至 10克、 β-奈黄酮， 所述 β-奈黄酮的含量 为 15毫克至 10克、 恩贝素， 所述恩贝素的含量为 16毫克至 10克、 反式肉桂酸， 所述反式 肉桂酸的含量为 8毫克至 10克、表儿茶素，所述表儿茶素的含量为 16毫克至 10克、根皮苷, 所述根皮苷的含量为 24毫克至 10克、反式肉桂醛，所述反式肉桂醛的含量为 7毫克至 10克、 大豆苷元， 所述大豆苷元的含量为 14毫克至 10克、异牡荆素， 所述异牡荆素的含量为 24毫 克至 10克、 β-香叶烯， 所述 β-香叶烯的含量为 8毫克至 10克、 獬皮素， 所述獬皮素的含量 为 0.9毫克至 10克、 （+)-柠檬烯， 所述 (+)-柠檬烯的含量为 7毫克至 10克、 杨梅素， 所述杨 梅素的含量为 17毫克至 10克、 獬皮， 所述懈皮的含量为 24毫克至 10克、 木犀草素 -7-葡萄 糖苷， 所述木犀草素 -7-葡萄糖苷的含量为 24毫克至 10克、 桑叶素， 所述桑叶素的含量为 ί6 毫克至 10克、新橙皮苷， 所述新橙皮苷的含量为 33毫克至 10克、橙皮苷， 所述橙皮苷的含 量为 33毫克至 10克、 （-) -表没食子儿茶素， 所述 (-) -表没食子儿茶素的含量为 17毫克至 10 克、 木犀草素， 所述木犀草素的含量为 16亳克至 10克、 金丝桃苷， 所述金丝桃苷的含量为 25毫克至 10克、 柽柳素， 所述柽柳素的含量为 17毫克至 10克、 黄芩素， 所述黄芩素的含 量为 15毫克至 10克、 芸香素， 所述芸香素的含量为 15毫克至 10克、 黄芩， 所述黄芩的含 量为 24毫克至 10克、芹菜素，所述芹菜素的含量为 15毫克至 10克、（+)-表儿茶素，所述 (+)- 表儿茶素的含量为 16毫克至 10克、 （-；) -表儿茶素没食子酸酯， 所述 (-) -表儿茶素没食子酸酯 的含量为 24毫克至 10克、 水飞蓟宾， 所述水飞蓟宾的含量为 26毫克至 10克、 牡荆素， 所 述牡荆素的含量为 24毫克至 10克、金雀异黄酮，所述金雀异黄酮的含量为 15毫克至 10克、 异鼠李素， 所述异鼠李素的含量为 14毫克至 10克、香叶木素， 所述香叶木素的含量为 33毫 克至 10克、 葛根素， 所述葛根素的含量为 23毫克至 10克、 或伞形花内酯， 所述伞形花内酯 的含量为 9毫克至 10克、 高良姜素， 所述高良姜素的含量为 0.8毫克至 10克、 非瑟酮， 所 述非瑟酮的含量为 0.8毫克至 10克、鲸蜡醇聚氧乙烯醚，所述鲸蜡醇聚氧乙烯醚的含量为 1.4 克至 10克、 聚氧乙烯硬脂酸酯， 所述聚氧乙烯硬脂酸酯的含量为 1.4克至 10克、 聚氧乙烯 月桂醚，所述聚氧乙烯月桂醚的含量为 18毫克至 10克、聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯， 所述聚氧乙烯去乙水山梨醇单月桂酸酯的含量为 1.4克至 10克、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯， 所述聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯的含量为 170毫克至 10克、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯， 所述聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯的含量为 1.4克至 10克、聚乙二醇 PEG 2000,所述聚乙 二醇 PEG 2000的含量为 1.4克至 10克、 聚乙二醇 PEG 400, 所述聚乙二醇 PEG 400的含量 为 1.4克至 10克、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 PLURONIC F-68,所述聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物 PLURONIC F-68的含量为 1.4克至 10克、 聚乙二醇 PEG 4000, 所述聚乙二醇 PEG 4000的 含量为 1.4克至 10克、 十四垸酸乙酯， 所述十四烷酸乙酯的含量为 14毫克至 10克、 聚氧乙 烯蓖麻油， 所述聚氧乙烯蓖麻油的含量为 17毫克至 10克、 十二垸基硫酸钠， 所述十二烷基 硫酸钠的含量为 17毫克至 10克、 微晶纤维素， 所述微晶纤维素的含量为 190毫克至 10克、 二水磷酸氢钙， 所述二水磷酸氢钙的含量为 9毫克至 10克、 聚氧乙烯醚 (40)氢化蓖麻油， 所 述聚氧乙烯醚 (40)氢化蓖麻油的含量为 1.26克至 10克、 交联聚乙烯吡咯垸酮， 所述交联聚乙 烯吡咯垸酮的含量为 158毫克至 10克、羧甲基淀粉钠，所述羧甲基淀粉钠的含量为 158毫克 至 10克、 丙烯酸树脂 Eudragit S100, 所述丙烯酸树脂 Eudmgit S100的含量为 158毫克至 10 克、交联羧甲基纤维素钠， 所述交联羧甲基纤维素钠的含量为 158毫克至 10克、 薄荷脑， 所 述薄荷脑的含量为 8毫克至 10克、 羟丙基纤维素， 所述羟丙基纤维素的含量为 158毫克至 10克、 预胶化淀粉， 所述预胶化淀粉的含量为 158毫克至 10克、 甘露醇 Mannitol, 所述甘 露醇 Mannitol的含量为 0.1毫克至 10克、葡萄糖结合剂， 所述葡萄糖结合剂的含量为 158毫 克至 10克、柠檬酸， 所述柠檬酸的含量为 10亳克至 10克、 气相二氧化硅， 所述气相二氧化 硅的含量为 158毫克至 10克、 聚乙二醇 PEG 8000, 所述聚乙二醇 PEG 8000的含量为 1.26 克至 10克、 山梨酸， 所述山梨酸的含量为 6毫克至 10克、柠檬油， 所述柠檬油的含量为 158 毫克至 10克、 苯甲酸钠， 所述苯甲酸钠的含量为 9毫克至 10克、 乙酰磺胺酸钾， 所述乙酰 磺胺酸钾的含量为 10毫克至 10克、羟丙基甲基纤维素，所述羟丙基甲基纤维素的含量为 158 毫克至 10克、 羟乙基甲基纤维素， 所述羟乙基甲基纤维素的含量为 158毫克至 10克、 邻磺 酰苯酰亚胺， 所述邻磺酰苯酰亚胺的含量为 0.1毫克至 10克、 甲基纤维素， 所述甲基纤维素 的含量为 158毫克至 10克、环己氨基磺酸钠，所述环己氨基磺酸钠的含量为 10毫克至 10克、 乳糖单水合物， 所述乳糖单水合物的含量为 18毫克至 10克、 麦芽糖糊精， 所述麦芽糖糊精 的含量为 158毫克至 10克、 甘油二十二烷酸酯， 所述甘油二十二垸酸酯的含量为 52毫克至 10克、 氧化铁红， 所述氧化铁红的含量为 34毫克至 10克、 单硬脂酸甘油酯， 所述单硬脂酸 甘油酯的含量为 158毫克至 10克、 共聚维酮 K28， 所述共聚维酮 Κ28的含量为 158毫克至 10克、 淀粉乙酸酯， 所述淀粉乙酸酯的含量为 158毫克至 10克、 硬脂酸镁， 所述硬脂酸镁 的含量为 29毫克至 10克、十二垸基硫酸钠，所述十二垸基硫酸钠的含量为 14毫克至 10克、 聚维酮 Κ-30， 所述聚维酮 Κ-30的含量为 6毫克至 10克、 蔗糖素， 所述蔗糖素的含量为 0.22 毫克至 10克、 苯甲醇， 所述苯甲醇的含量为 158毫克至 10克、 对羟基苯甲酸甲酯， 所述对 羟基苯甲酸甲酯的含量为 8毫克至 10克、对羟基苯甲酸丙酯， 所述对羟基苯甲酸丙酯的含量 为 9毫克至 10克、聚乙二醇硬脂酸酯 15，所述聚乙二醇硬脂酸酯 15的含量为 158毫克至 10 克、 丁基羟基茴香醚， 所述丁基羟基茴香醚的含量为 9毫克至 10克。
    8. 如权利要求 6所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述抗结核病药物复方还加入 药学上可接受的赋形剂。
    9. 如权利要求 8所述的抗结核病药物复方，其特征在于，所述赋形剂为稀释剂、填充剂、 结合剂、 崩解剂或润滑剂。
    10.如权利要求 6所述的抗结核病药物复方， 其特征在于， 所述抗结核病药物复方的剂型 为口服锭剂、 胶囊剂、 散剂、 溶液剂、 悬浮剂、 乳剂、 芳香水剂、 糖浆剂、 醑剂、 酏剂、 酊 剂、 流浸膏剂、 软膏、 乳霜剂、 糊剂、 注射剂或栓剂。.
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