CN103389356A

CN103389356A - 饲料中聚醚类抗生素的检测方法

Info

Publication number: CN103389356A
Application number: CN2013103411699A
Authority: CN
Inventors: 陈明; 龚兰; 邵明诚; 魏瑞成
Original assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Current assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Priority date: 2013-08-07
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2013-11-13

Abstract

本发明涉及一种饲料中聚醚类抗生素的检测方法，通过混合酸性流动相同时使拉沙洛菌素、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素在色谱分离柱上分离；即：提取饲料样品滤液；将混合酸性流动相经脱气机去除空气后通过液相泵经安全开关流入高效液相色谱仪，通过加样器加入样品滤液；经色谱柱分离后的物质进行荧光检测，获得拉沙洛菌素的检测结果；将检测后的混合液通过反流保护器导入反应器A中，在反应器A中加入衍生试剂A，反应温度为室温；然后将反应后的混合液引入反应器B中加入衍生剂B，反应温度为90℃；反应后溶液进行检测，获得莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素检测结果。

Description

饲料中聚醚类抗生素的检测方法

技术领域

本发明属于抗生素的检测领域，特别涉及一种一次性同时定量测定多种聚醚类抗生素的方法。

背景技术

拉沙洛西钠、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素同属聚醚类抗生素，是由放线菌发酵液产生的离子载体类抗生素。是目前家禽养殖中使用最广泛的抗球虫药物，主要添加于饲料中使用，可以增加饲料利用率，预防球虫病。但随着其在动物防病中的应用不断深入，球虫耐药性不断增强，因此用药量也不断增大，导致畜禽产品中的残留不断增加。因此有必要对饲料中聚醚类抗生素药物的添加量进行监测，保证人民群众的身体健康。

目前普遍采用液相色谱法进行抗生素检测。聚醚类抗生素中拉沙洛西钠自身含荧光基团，可在中性流动相中直接用荧光检测器检测。而聚醚类抗生素莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素均无发色团，在紫外吸收光谱中呈末端吸收，不能直接检测。但它们结构中含有羧基和羟基，可与芳醛发生羟醛缩合反应，生成有色化合物后用紫外检测器检测。但这种反应都需要在高温高酸的环境下进行，目前文献报道所采用的流动相都是：甲醇或乙腈与甲酸或冰醋酸、磷酸溶液的酸性混合相溶液。而拉沙洛西钠在这种反应环境下会产生分解并且不能反应得到理想的发色基团，造成不能检测。目前未见一次性同时检测饲料样品中聚醚类抗生素拉沙洛西钠、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素含量的相关文献报道，实际操作中这四种聚醚类抗生素是采用不同方法将样品分别检测，此方法步骤繁琐且增大检测工作量。

发明内容

本发明确定了一种新的酸性流动相，并串联了高效液相色谱器和柱后衍生反应设备、荧光检测器、紫外检测器，可同时一次性分析检测饲料中拉沙洛西钠、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素的含量。此检测方法灵敏度高、特异性强、快速易于操作，可用于微量检测。

一种饲料中聚醚类抗生素的检测方法，其特征在于，通过混合酸性流动相可同时使拉沙洛西钠、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素在色谱分离柱上分离；具体检测步骤如下：

1）向2g粉末状饲料样品中加入10ml体积比为10%的甲醇溶液，于涡旋混合器上震荡5min，静置10min后以5200r/min转速离心10min，取上清液，重复上述提取步骤一次，将两次所得上清液用氮气吹干得残渣，用1ml体积比为9:1的甲醇与水的混合液溶解所述残渣后过0.22μm微孔滤膜，得到样品滤液；

2）混合酸性流动相经脱气机去除空气后通过液相泵经安全开关流入高效液相色谱仪，流速为0.7ml/min，柱温40℃，通过加样器加入步骤1所述样品滤液10μl；

3）对步骤2中经色谱柱分离后的物质进行荧光检测，设定荧光检测器激发波长为310nm，发射波长为420nm，获得拉沙洛西钠的检测结果；

4）将步骤3经荧光检测后的混合液通过反流保护器导入体积为0.1ml的反应器A中；

5）在反应器A中，通过衍生泵A以0.3ml/min的速度向步骤3所述混合液中加入衍生试剂A，反应温度为室温，所述衍生剂A为浓硫酸与甲醇按体积比4：96混合所得；

6）在体积为1.4 ml的反应器B中通过衍生泵B以0.3ml/min的速度向步骤5所述混合液中加入衍生剂B，反应温度为90℃，所述衍生剂B为香兰醛与甲醇按重量/体积比6:95混合所得；

7）将紫外检测器波长设为520nm，对步骤6所述反应后溶液进行检测，获得莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素检测结果，检测后的混合液经背压调节器，流入废弃液收集瓶。

本发明优选为所述混合酸性流动相为甲醇与5%的乙酸以体积比为9:1混合所得。

优选为步骤2所采用的色谱分离柱为Z0RBAX SB-C18型填充柱。

优选为安全开关设置在510psi时开启。

优选所述背压调节器设定为100psi。

本发明的优点在于：

1）本发明使用的混合酸性流动相同时使拉沙洛西钠、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素在色谱分离柱上分离，满足一次性同时定量定性测定饲料样品中多种聚醚类抗生素含量要求，减少采用不同检测方法，分开处理检测样品的工作量，节约时间，检测结果准确可靠；

2）采用安全装置保护色谱仪，所述安全开关只有在色谱仪的分析柱前端压力达到一定压力时，才允许柱后反应系统启动操作；反流保护器为单向阀，防止在泵关闭状态时出现试剂虹吸返流损害色谱仪；

3）紫外检测器后接背压调节器，防止反应器B中温度较高的流动相在检测器的流通池内爆沸或产生气泡，确保反应安全。

附图说明

图1 为本发明实施例的检测流程框图。

图2 为实施例1中莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛西钠混标色谱分离检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 标准工作曲线的建立

（1）反应试剂的配制

莫能菌素标准储备溶液配制：准确称取一定量的莫能菌素标样，用甲醇溶解并定容混匀，使莫能菌素浓度为1mg/ml；

盐霉素标准储备溶液配制：准确称取一定量的盐霉素标样，用甲醇溶解并定容混匀，使盐霉素浓度为1mg/ml；

甲基盐霉素标准储备溶液配制：准确称取一定量的甲基盐霉素标样，用甲醇溶解并定容混匀，使得甲基盐霉素浓度为1mg/ml；

拉沙洛西钠标准储备溶液配制：直接使用所购浓度为100μg/ml标准品，或者有其他浓度标准对照品也可以使用；

混合标准工作液的配制：分别吸取适量上述四种标准储备溶液，加入体积比为9:1的甲醇/水溶液，稀释混合，使得配成的混合标准品工作液中莫能菌素,盐霉素和甲基盐霉素的浓度分别为5、10、20、30、50、60、100μg/ml,拉沙洛西钠的浓度对应为5、10、20、30、40、60、80μg/ml；

混合酸性流动相的配制：取5ml色谱级乙酸用水定容至100ml，再取100ml上述乙酸水溶液加入至1000ml容量瓶中用甲醇定容，混匀；

衍生试剂A的配制：取40ml浓硫酸缓慢加入装有甲醇的容量瓶中，用甲醇定容至1000ml，混匀；

衍生试剂B的配制：称取60g香兰醛，用950ml甲醇溶解，混匀。

（2）实验步骤

a）打开高效液相色谱仪器，将混合酸性流动相经脱气机去除流动相溶液中空气，液相泵流速设定为0.7ml/min。当高效液相色谱仪的分析柱前端压力达到510psi时，安全开关允许启动柱后反应系统操作。通过进样器将所配制的混合标准工作液进样10μl。采用Z0RBAX SB-C18色谱分离柱(4.6mmX250mm,i.d,5μm)，柱温设定为40℃；

b）对流经色谱柱分离后的组份物质进行荧光检测，设定荧光检测器激发波长为310nm，发射波长为420nm，获得拉沙洛西钠的检测结果；

c）将步骤b经荧光检测后的混合液通过反流保护器导入体积为0.1ml的反应器A中；

d）在反应器A中，通过衍生泵A以0.3ml/min的速度向步骤b所述混合液中加入衍生试剂A，反应温度为室温；

e）在体积为1.4 ml的反应器B中通过衍生泵B以0.3ml/min的速度向步骤d所述混合液中加入衍生剂B，反应温度为90℃；

f）将紫外可见光检测器检测波长设定为520nm，对步骤e所述反应后溶液进行检测，获得莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素检测结果；经检测后的混合液通过100psi背压调节器，流入废弃液收集瓶。

（3）实验结果

按照步骤（2）所述方法对混合标准品溶液进行测定（每个浓度重复三次），其平均峰面积值如表1所示：

表1 不同浓度聚醚类抗生素平均峰面积（n=3）

以平均峰面积（Y）和浓度（X）关系绘制标准工作曲线。莫能菌素标准工作曲线为：Y=10.013X+2.1019，相关系数r=0.9968；盐霉素标准工作曲线为：Y=1.9833X+0.6064，相关系数r=0.9997；甲基盐霉素标准工作曲线为：Y=1.8796X+1.6667，相关系数r=0.9996；拉沙洛西钠标准工作曲线为：Y=0.6966X+0.318，相关系数r=0.9996。

莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛西钠混标色谱如图2所示，四种药物在分析检测中都能彻底分离，说明在本发明方法检测条件下，四种聚醚类抗生素药物能一次性同时得到有效的分离检测。

实施例2 验证、添加回收检测实验

将不含莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛西钠的饲料样品作为空白样品，粉碎成粉末状。称取2g样品于50ml离心管中，分别添加适当的莫能菌素、盐霉素、甲基盐霉素和拉沙洛西钠标准品溶液制成混合饲料样品，使得四种抗生素在混合饲料样品最终滤液中的浓度分别为10，20,60μg/ml。换算成混合饲料样品中浓度分别为5、10、30 mg/kg。

向上述混合饲料样品中加入10ml体积比为10%甲醇溶液中，于涡旋混合器上震荡5min，静置10min后以5200r/min转速离心10min，取上清液，再重复上述提取步骤一次。合并两次上清液用氮气吹干得残渣，用1ml体积比为9:1的甲醇与水的混合液溶解所述残渣后，过0.22μm微孔滤膜，得样品滤液。按实施例1所述方法上机检测，所得结果如表2所示：

表2 聚醚类抗生素添加回收率实验结果

实验结果表明：当空白饲料样品中添加浓度为10，20,60μg/ml三种浓度时。莫能菌素回收率为73.41-75.51%，盐霉素回收率为75.85-87.01%，甲基盐霉素回收率为78.29-98.38%，拉沙洛西钠回收率为79.24-99.87%。可以满足饲料中药物含量检测的技术要求。

Claims

1.一种饲料中聚醚类抗生素的检测方法，其特征在于，通过混合酸性流动相同时使拉沙洛菌素、莫能菌素、盐霉素和甲基盐霉素在色谱分离柱上分离；具体检测步骤如下：

1）向2g粉末状饲料样品中加入10ml体积比为10%的甲醇溶液，于涡旋混合器上震荡5min，静置10min后以5200r/min转速离心10min，取上清液，重复上述提取步骤一次；将两次所得上清液用氮气吹干得残渣，用1ml体积比为9:1的甲醇与水的混合液溶解所述残渣后过0.22μm微孔滤膜，得到样品滤液；

3）对步骤2中经色谱柱分离后的物质进行荧光检测，设定荧光检测器激发波长为310nm，发射波长为420nm，获得拉沙洛菌素的检测结果；

4）将步骤3中经荧光检测后的混合液通过反流保护器导入体积为0.1ml的反应器A中；

2.根据权利要求1所述的一种聚醚类抗生素检测方法，其特征在于所述混合酸性流动相为甲醇与5%的乙酸以体积比为9:1混合所得。

3.根据权利要求1所述的一种聚醚类抗生素检测方法，其特征在于：步骤2采用的色谱分离柱为Z0RBAX SB-C18型填充柱。

4.根据权利要求1-3所述一种聚醚类抗生素检测方法，其特征在于所述安全开关设置在510psi时开启。

5.根据权利要求4所述一种聚醚类抗生素检测方法，其特征在于所述背压调节器设定为100psi。