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CN103370076A - 治疗毛发脱落疾病的方法 - Google Patents

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CN103370076A
CN103370076A CN2011800637870A CN201180063787A CN103370076A CN 103370076 A CN103370076 A CN 103370076A CN 2011800637870 A CN2011800637870 A CN 2011800637870A CN 201180063787 A CN201180063787 A CN 201180063787A CN 103370076 A CN103370076 A CN 103370076A
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stat2
cells
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CN2011800637870A
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A·M·克里斯蒂亚诺
R·克莱内斯
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Columbia University in the City of New York
Original Assignee
Columbia University in the City of New York
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Abstract

本发明提供通过给予JAK/STAT抑制剂治疗对象中毛发脱落疾病的方法。

Description

治疗毛发脱落疾病的方法
本申请要求2010年11月2日提交的美国临时申请号61/409,509的优先权，其通过引用全文纳入本文。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全文纳入本文。这些出版物的公开内容通过引用全文纳入本文。
本发明包含受到著作权保护的内容。著作权所有人不反对任何人对美国专利商标局存档或记录的该专利文件或专利公开进行复制，但另外保留任何和所有任何著作权。
政府权利
本发明在国立卫生研究院/国立关节肌肉骨骼及皮肤病研究所授予的RO1AR56016的政府资助下完成。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术
斑秃（AA）是最常见的自身免疫疾病之一，该疾病引起由毛囊免疫赦免破坏和后续自身免疫损伤导致的毛发脱落。AA是导致头皮和其它部位毛发脱落的皮肤病。一些严重的情况下，该疾病发展成头或身体毛发的全部脱落。虽然据信斑秃由自身免疫引起，但几乎从未报道过其基因水平诊断和治疗。AA的遗传基础很大程度上未知。
发明内容
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予参与细胞因子信号转导的蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是Jak1和/或Jak2抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是Stat1和/或Stat2抑制剂。在另一个实施方式中，所述抑制剂是INCB018424。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导所述患有毛发脱落疾病的对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1或Jak2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak1或Jak2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在另一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Stat1或Stat2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Stat1或Stat2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在一个实施方式中，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。在另一个实施方式中，所述小分子是WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月-6月;25(3B):1841-50））、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯(Berlex)的福达华滨（Fludara））、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素（hyperforin）。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:2、4、6或8的人核酸序列。在一些实施方式中，所述针对Jak1基因的siRNA是表11所列的任一序列。在其它实施方式中，所述针对Stat1基因的siRNA是表12所列的任一序列。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的参与细胞因子信号转导的蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是Jak/Stat抑制剂。在另一些实施方式中，所述抑制剂是INCB018424。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1或Jak2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak1或Jak2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在另一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Stat1或Stat2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Stat1或Stat2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在一个实施方式中，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。在另一个实施方式中，所述小分子是WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月－6月；25(3B):1841-50）、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯的福达华）、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:2、4、6或8的人核酸序列。在一些实施方式中，所述针对Jak1基因的siRNA是表11所列的任一序列。在其它实施方式中，所述针对Stat1基因的siRNA是表12所列的任一序列。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Jak1抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:1的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak1蛋白的基因的siRNA；或小分子。在一个实施方式中，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:2的人核酸序列。在一些实施方式中，所述针对Jak1基因的siRNA是表11所列的任一序列。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Jak1抑制剂，从而控制所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:1的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak1蛋白的基因的siRNA；或小分子。在一个实施方式中，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:2的人核酸序列。在一些实施方式中，针对Jak1基因的所述siRNA是表11所列的任一序列。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Jak2抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:3的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在一个实施方式中，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:4的人核酸序列。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Jak2抑制剂，从而调控所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:3的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在一个实施方式中，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:4的人核酸序列。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Stat1抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:5的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Stat1蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Stat1蛋白的基因的siRNA；或小分子。在另一个实施方式中，所述小分子是WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月－6月；25(3B):1841-50）、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯的福达华）、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:6的人核酸序列。在其它实施方式中，所述针对Stat1基因的siRNA是表12所列的任一序列。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Stat1抑制剂，从而调控所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:5的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Stat1蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Stat1蛋白的基因的siRNA；或小分子。在另一个实施方式中，所述小分子是WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月－6月；25(3B):1841-50）、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯的福达华）、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:6的人核酸序列。在其它实施方式中，所述针对Stat1基因的siRNA是表12所列的任一序列。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Stat2抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:7的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Stat2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Stat2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在另一个实施方式中，所述小分子是WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月－6月；25(3B):1841-50）、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯的福达华）、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:8的人核酸序列。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Stat2抑制剂，从而调控所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:7的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。在一个实施方式中，所述方法还包括步骤(b)通过与使用所述抑制剂处理之前的所述对象毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的所述对象的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂是特异性抑制编码Stat2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Stat2蛋白的基因的siRNA；或小分子。在另一个实施方式中，所述小分子是WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月－6月；25(3B):1841-50）、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯的福达华）、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素。在另一个实施方式中，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:8的人核酸序列。
在另一个实施方式中，所述给予包括皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射；输注；口服、鼻内或局部递送；或其组合。在一些实施方式中，所述给予每日、每周、每周两次、每月、每月两次或每年进行。
附图说明
图1是AA临床表现的照片。上图（图1A-B）中是多发性AA患者。图1B中，患者处于重新生长期。对于全身脱毛患者，存在完全缺失体毛和头皮毛发（图1C），而全秃患者仅缺失头皮毛发（图1）。图1D中，观察到顶骨区域的毛发重新生长，而在枕骨或颞骨区域无明显的毛发再生长。
图2显示斑秃（AA）潜在的炎症反应。
图3显示斑秃（AA）潜在的炎症反应。
图4A中的照片显示分离自患AA的C3H小鼠（上部）和对照小鼠（底部）的淋巴结和脾脏。
图4B显示携带NKG2D的CD8和Th1细胞在鼠AA皮肤淋巴结中扩增的FACS分析结果。
图4C的柱状图显示相比对照小鼠，患有AA的C3H小鼠的细胞因子生成细胞的数目增加6倍。.
图5A是C3H小鼠中脱毛皮肤的RNA特性。热图显示排名前20的未调节基因中16个是干扰素响应基因。排名前20的未调节基因中16个是干扰素响应基因(IFNγ提高，而非I型IFN)。
图5B显示AA皮肤的转录概况分析。所产生列表中拣选单个基因的qPCR检验显示3次实验的平均倍数改变。
图6图显示AA靶标。
图7显示干扰素γ通路。
图8A-B显示两种基因作图方法。图8A显示家族谱系分析。图8B显示群组的相关性分析。
图9显示AA中的全基因组关联研究（GWAS）。
图10A-B显示危险信号：对照个体（图10A）和AA患者毛囊中的ULBP3表达。
图11A-B显示AA由“蜂群（swarm of bees）”引起：杀伤CD8T细胞被NKG2DL吸引。图11A显示AA中“2010前”的蜂群。图11B显示蜜蜂的“2012”鉴定（(m)CD8染色；(n)NKG2D染色；和(o)NKG2和DCD8共同定位）。
图12显示AA潜在的炎症反应。
图13显示INCB18424-202：用局部INCB18424会减少Th1和Th17转录本标记物和角蛋白16，所述INCB18424是一种JAK1和JAK2Th1抑制剂。
图14显示INCB18424-203的关键总损伤分数（Key Total Lesion Score）。所述结果显示所有剂量组的总损伤分数≥2x的载剂降低量，控制多样性后达到显著性。
图15A-B显示用INCB018424治疗显著降低表皮增厚和真皮炎症。没有观察到病理学皮肤变薄。
图16中的示意图显示用于干扰AA发病机制的临床前战略旨在干扰CD8T细胞的诱导和效应物功能并包括阻断IFNγ信号。
图17显示CD8+NKG2D+T细胞浸润小鼠和人的AA毛囊。上图：人斑秃（Pethukova等，2010,Nature,466(7302):113-7）；下图-C3H/HeJ斑秃。
图18显示脱毛C3H小鼠中的CD8+NKG2D+T细胞。
Figure BDA00003444511500081
αβ+NKG2D+T细胞在脱毛C3H小鼠的皮肤、淋巴结和血液中大量扩增。（NKG2D+γδT细胞存在于受影响和未影响的皮肤中）。
图19显示脱毛C3H小鼠中的CD8+NKG2D+T细胞。门控LN CD8α+NKG2D+群的免疫表型显示它们是均一的CD8αβ+CD44+CXCR3+DX5+NKG2A/C/E+IFN-γ生成记忆T细胞。
图20显示皮肤和LN中C3H T细胞的谱型分析：总皮肤和分选的CD8+NKG2D+LN T细胞共有相似TCR库，鉴定其为相关效应物。
图21A-B显示产生IFN-γ的CD8T细胞主导人和小鼠AA。图21A:人：获自AA皮肤活检中T细胞脱出物(crawl-out)的T细胞是均一的CD8+NKG2D+细胞且在PMA/伊屋诺霉素刺激后产生IFN-γ。图21B：小鼠：来自脱毛小鼠经C3H/HeJ刺激的淋巴结细胞含有的产生IFN-γ的CD8和CD4T细胞三倍于未受影响小鼠。
图22显示I和II型IFN在C3H小鼠AA皮肤中上调：3个受影响和3个未受影响C3H/HeJ小鼠间干扰素基因表达的倍数改变（归一化至18S），利用干扰素信号转导和应答qPCR阵列（Stellarray龙沙公司（Lonza）目录号#00189608）。
图23显示人AA中血清趋化因子和细胞因子提高。干扰素γ和IFN诱导的趋化因子（如IP-10/CXCL10）在人AA中血清中提高，一些情况下与疾病严重度相关，即斑病（AAP）对比全身脱毛（AU）。
图24是鲁米耐克斯分析，其显示人AA对象血清中IL-13提高，在一些情况下与疾病严重度相关，即斑病（AAP）对比全身脱毛（AU）。
图25显示LSRII上收集的流式细胞术数据，在一个管中使用以下mAb来染色整个C3H真皮细胞群，所述细胞采集自经30分钟胶原酶消化的0.5cm x2cm脱毛皮肤块：（MHC II、CD11b、CD11c、CD19、120G8、CD3、CD4、CD8、DX5、NKG2D）。鉴定γδNKG2D阳性细胞和CD8+DX5+NKG2D+群。这些细胞也是CD3+细胞，其
Figure BDA00003444511500082
表达比CD8+NK+T细胞中观察到的高100倍。占到大于95％的总CD3阳性细胞。
图26显示来自四个AA对象的PBMC评估。NKG2D表达在淋巴细胞子集中提高。
图27显示C3H-HeJ小鼠中的谱型。RNA分离自皮肤活检和C3H-HeJ小鼠皮肤淋巴结的分选NKG2D-和NKG2D+CD8+T细胞。谱型分析显示几个Vβ家族中的CDR3长度偏移。皮肤和NKG2D+淋巴结CD8+T细胞群共有一些倾斜性的Vβ家族（例如Vβ2,Vβ5.2,Vβ20），而额外的Vβ家族在皮肤中有倾斜（反映CD4+T细胞群）。
图28的示意图显示获自对照或AA受影响个体的人头皮皮肤可用于建立皮肤和毛囊中单个细胞群的原代培养物。
图29显示T细胞“爬出”实验，其中获自钻取皮肤活检的经培养人真皮用作流式细胞术分析的源材料。从脱毛损伤和非损伤区域获得三等份6mm皮肤活检的皮肤钻取活检。去除脂肪后，细碎的皮肤轻压在Cellfoam基质中，然后皮肤面朝上移至24孔板的孔中，该孔含有2ml皮肤T（Skin T）培养基以及IL-2(6ng/ml)和IL-15(10ng/ml)。移去基质3天后，T细胞如图29A所示爬出。也显示这些细胞的流式细胞术（图29B-C）和谱型（图29D）。
图30显示人外周血单核细胞（PBMC），上组或鼠脾细胞在高剂量IL-2（1000/ml）中培养以产生淋巴因子活化的杀伤（LAK）细胞。CFSE绿色荧光标记的LAK细胞与人毛囊器官培养物（上组）或来自非损伤区域（左下两张图）或损伤的小鼠毛囊培养物（下组）一起孵育。
图31显示C3H-HeJ小鼠中未受影响和受影响的AA皮肤的免疫组化（IHC）染色。
发明详述
本发明提供通过Jak/Stat通路抑制剂（包括Jak1和Jak2，Stat1和Stat2）来治疗毛发脱落疾病的方法（例如，斑秃（AA），毛发脱落的一种常见自身免疫形式）。对AA的临床研究已落后于更大量研究的“姐妹”自身免疫疾病（例如，类风湿性关节炎（RA）、1型糖尿病（T1D）、多发性硬化（MS）），其中已涉及该基因。本发明提供了之前未在AA中测试的治疗，其可告知人们该通路在AA和相关疾病中的临床相关性。
体被和毛细胞概述
体被（或皮肤）是身体最大的器官，并且是覆盖在身体外部表面的高度复杂器官。其在各种体孔与消化道和其他管道的黏膜合并。体被行使许多必需功能，例如，通过调节体温和水分流失来维持恒定的内部环境；通过汗腺排泄；但主要作为保护屏障来抵抗物理、化学和生物介质对更深处组织的作用。皮肤具有弹性，除了例如脚底、手心和耳朵的一些区域，其松散地附着于下方组织。其厚度可变，变化范围从眼睑（“薄皮”）的0.5mm（0.02英寸）至手心和脚底（“厚皮”）的4mm（0.17英寸）或更厚（Ross MH，Histology:A text and atlas（《组织学：文本和图谱》）， 第三版，Williams和Wilkins，1995:第14章；Burkitt HG等，Wheater’s Functional Histology（《惠特功能组织学》），第三版，丘吉尔-利文斯顿出版社（ChurchillLivingstone），1996:第9章）。
皮肤由两层构成：a)表皮和b)真皮。表皮为外层，相对较薄（0.1mm）。其为几个细胞的厚度并由5层构成：生发层、棘层、颗粒层、透明层（限于厚皮肤）、和角质层。最外层的表皮层（角质层）由死细胞组成，所述细胞不断从表面脱落并由下面的单一基底层细胞（称为生发层）取代。表皮主要由角质形成细胞组成，占所述细胞群的95％以上。基底层（生发层）的角质形成细胞不断分裂，且子细胞相继地向上和向外移动，并在其中经历分化期，并最终从表面脱落。其余的表皮细胞群包括树突细胞例如朗格汉斯细胞和黑素细胞。表皮基本上是细胞且非血管性的，除了角质形成细胞的基底层下方的胶原和其他蛋白层，其几乎不含胞外基质（Ross MH，Histology:A text and atlas（《组织学：文本和图谱》），第三版，Williams和Wilkins，1995：第14章；Burkitt HG等，,Wheater’s Functional Histology（《惠 特功能组织学》），第三版，丘吉尔-利文斯顿出版社1996:第9章）。
真皮是皮肤内层并由胶原胞外物质、血管、神经和弹性纤维的网络组成。真皮中是带有其相关的皮脂腺的毛囊（总称为毛囊皮脂腺单位）和汗腺。除了薄皮，表皮和真皮的界面极不规则且不均匀。在沿着表皮-真皮界面的基底表皮细胞下方，专门胞外基质组成称为基膜的独特结构（Ross MH，Histology:A text and atlas（《组 织学：文本和图谱》），第三版，Williams和Wilkins，1995:第14章；Burkitt HG等，Wheater’s Functional Histology（《惠特功能组织学》），第三版，丘吉尔-利文斯顿出版社，1996:第9章）。
哺乳动物毛纤维由角质细胞组成并从毛囊发育。毛囊是一种源自表皮向下生长的组织，其紧邻于皮肤表面的下方。毛囊远端直接延续于外部皮肤表皮。虽然是小结构，毛囊含有以同轴多层方式排列的可识别不同层的高度有组织系统。活性毛囊向下延伸穿过真皮、下皮（结缔组织的松散层）并进入脂肪或皮下脂肪层（Ross MH，Histology:A text and atlas（《组织学：文本和图谱》），第三版，Williams和Wilkins，1995:第14章；Burkitt HG等，Wheater’s Functional Histology（《惠特功能组织学》）， 第三版，丘吉尔-利文斯顿出版社，1996:第9章）。
毛球位于活性毛囊底部。毛球由真皮细胞体组成，称为真皮乳头，其包含在称为表皮基质的表皮细胞倒杯结构中。无论何种毛囊类型，在该表皮基质极底部的生发表皮细胞与数层支持表皮层一起产生毛纤维。真皮鞘最低处与乳头基底茎毗邻，所述鞘从该处围着所有毛基质表皮层外部弯曲以作为薄组织覆盖。然后，就毛囊长度而言真皮鞘最低部分继续作为囊套或囊管（Ross MH，Histology:A text and atlas（《组织学：文本和图谱》），第三版，Williams和Wilkins，1995:第14章；Burkitt HG等，Wheater’s Functional Histology（《惠特功能组织学》），第三 版，丘吉尔-利文斯顿出版社，1996:第9章）。
皮肤附件例如毛发和毛囊的发育取决于皮肤的两层，即表皮和真皮间的相互作用。在胚胎发育中，这两层间信息的连续交换支持一系列复杂的形态发生过程，从而形成成人毛囊结构。然而，相比一般的皮肤真皮和表皮细胞，某些毛囊细胞群在成熟后保持其胚型相互作用、诱导和生物合成性质。这些特性可能来自于周期产生性毛囊的极动态本质，其中重复的组织重塑必需高水平的真皮-表皮交互式联通，这对胚胎发育很关键并在其他形式的组织重构中需要。
毛纤维以极快速度在活性毛囊的底部产生。例如，人头皮中的毛囊以每天0.4mm的速度产生毛纤维，并在大鼠鼻毛或胡须中高达每天1.5mm，这意味着毛囊表皮中的细胞增殖在成人组织中列为最快（Malkinson FD和JT Kearn，Int J Dermatol1978,17:536-551）。毛发循环生长。毛发生长初期是生长期，其中认为高至90％的毛囊处于毛发生长初期；毛发生长中期是渐长期或退化期，约占1-2%的毛囊；终止期是循环的静止或静态期，约占10–14％的毛囊。循环时间随着不同的身体部分而变化。
毛囊形成和循环受到抑制和刺激信号的平衡调控。信号转导暗号受到作为TGFβ-BMP家族成员的生长因子强化。TGFβ-BMP家族成员的主要拮抗剂是滤泡抑素。滤泡抑素是通过结合所述蛋白抑制各种BMP（例如BMP-2、-4、-7和-11）和活化素作用的分泌蛋白，且据称在毛囊发育中发挥作用（Nakamura M等，FASEB J，2003，17(3):497-9；Patel K Intl J Biochem Cell Bio，1998，30:1087-93；Ueno N等，PNAS，1987,84:8282-86；Nakamura T等，Nature，1990，247:836-8；Iemura S等，PNAS，1998，77:649-52；Fainsod A等，Mech Dev，1997，63:39-50；Gamer LW等，Dev Biol，1999，208:222-32）。
深入包埋的终球（其中局部真皮-表皮相互作用驱动活性纤维生长）是包含一群称为真皮乳头（DP）的间质细胞的毛囊信号中心。该相同区域同样也对组织重塑和涉及毛纤维或附属物在生长期和退化期之间精确改变的发育变化关键。这些活性中的关键物质DP似乎协调了从原代生发表皮细胞来源中鉴定毛纤维形成的复杂分化程序（Oliver RF，J Soc Cosmet Chem，1971，22:741-755；Oliver RF和CA Jahoda，Biology of Wool and Hair（《羊毛和毛发生物学》）（Roger等编），1971，剑桥大学出版社（Cambridge University Press）:51-67；Reynolds AJ和CA Jahoda，Development，1992，115:587-593；Reynolds AJ等，J Invest Dermatol，1993，101:634-38）。
最低处真皮鞘（DS）在乳头基底茎部下方出现，其从该处向外和向上弯曲。然后真皮鞘从外部包围表皮毛发基质层作为组织薄层，并就毛囊长度向上持续。来自表皮的外根鞘（ORS）也就毛囊长度延续，其位于两层间紧邻于真皮鞘内部，并形成称为玻璃膜的特殊基膜。外根鞘在低毛囊中构成稍多于表皮单层，随着其趋向表面逐渐变厚。内根鞘（IRS）形成毛干发育的的模子。其包含三部分：亨勒（Henley}层、赫胥黎（Huxley）层和角质层（cuticle），其中角质层为接触发干的最内层部分。IRS表皮层为单个细胞厚度且维护紧邻发干。其与毛纤维表皮层紧密交错。赫胥黎层可含多至4个细胞层。IRS亨勒层是紧邻ORS层的单细胞层（《组织学： 文本和图谱》），第三版，Williams和Wilkins，1995:第14章；Burkitt HG等，Wheater’s Functional Histology（《惠特功能组织学》），第三版，丘吉尔-利文斯顿出版社，1996:第9章）。
斑秃
斑秃（AA）是最常见的自身免疫疾病之一，仅在美国就影响了大约460万人，其中包括所有民族的男性和女性，终生风险为1.7％(1)AA中发生针对毛囊的自身免疫，导致一开始为斑块的无疤痕毛发脱落，所述斑块可融合并进而覆盖整个头皮（全秃，AT）或最终整个身体（全身脱毛，AU）（图1）。AA一开始在公元30年由Cornelius Celsu记载，使用意思为“蛇”的术语“匐行性脱发（ophiasis）”，因为脱发随着沿头皮缓慢扩散而呈弯曲路径。起初希波克拉底使用希腊词“alopekia”（fox mange），索瓦在其于法国里昂1760年出版的Nosologica Medica中第一次使用现代术语“斑秃（alopecia areata）”。
奇怪地是，AA优选影响毛发周期中毛发生长初期（生长期）的有色毛囊，当AA斑块中的毛发重新生长时，其经常长回白色或无色。因此把“毛发突然变白”现象归因于AA的急性发作，并在历史上记载为影响数名沉浸在深切悲痛、压力或害怕中的杰出个人。示例包括沙迦罕（Shahjahan），其在1631年妻子去世时经历急性毛发变白，且在悲痛中建造了泰姬陵以纪念其妻。乌托邦的作者托马斯莫尔先生，据称在其1535年执刑的前夜变为“白色的胡子和头发”。据信毛发突然变白是由于有色毛囊受到急性攻击而留下了未损伤的白色毛发。
AA在几个临床方面仍然无法解释但可持有趋向理解发病机理的重要线索。AA仅围绕被紧密淋巴细胞群包围的毛囊底部攻击毛发，从而产生特殊病症“蜂群”的组织学外观。基于观察，假定有色毛发生长初期毛囊中发出引起针对毛囊较低端急性或慢性免疫应答的信号，其引起毛发周期干扰、急性毛发脱落、毛干异常和毛发破损。尽管毛囊中有这些显著干扰，但没有永久性器官损坏且如果免疫赦免能恢复则毛发有可能维持重新生长。
历史上认为AA有时是由压力或焦虑引起的神经疾病，或由传染原，或甚至荷尔蒙功能障碍所引起。遗传决定性自身免疫机理的概念作为AA的基础根据众多证据出现于20世纪。毛囊展现了有活化Th、Tc和NK细胞的免疫浸润（3，4）以及具有从抑制（Th2）到自身免疫（Th1）细胞因子应答的转变。AA的人源化模型（涉及将AA患者头皮向免疫缺陷型SCID小鼠的转移）说明了该疾病的自身免疫特性，因为供体T细胞转移仅在与毛囊或人黑素瘤匀浆物共同培养下才引起毛发脱落（5，6）。观察到用来维持免疫耐受的调节T细胞在AA组织中数量较少（7），这些细胞向C3H/HeJ小鼠的转移会引起对AA的抗性（8）。虽然长时期将AA仅视作T细胞调节疾病，但近年来推测有另一种疾病机理。毛囊定义为体内几个选择性免疫赦免位点之一，其特征是存在胞外基质屏障以阻碍免疫细胞运输，缺少抗原递呈细胞，以及通过局部产生免疫抑制因子来抑制NK细胞活性并降低MHC I类表达水平（9）。因此，关于“免疫赦免破坏”的概念已作为可能引起AA的部分机理。用于AA的遗传基础支持来自许多证据，包括在一级亲属（10，11）、双胞胎研究（12）和我们最近在家系连锁研究（13）结果中观察到的遗传力。
毛发脱落疾病的治疗
本发明提供了以下发现：可使用已知治疗，例如参与细胞因子信号转导的蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂如JAK/STAT蛋白Jak1、Jak2、Stat1或Stat2（例如，INCB018424；因塞特）治疗毛发脱落疾病。毛发脱落疾病的非限制性示例包括：雄激素性秃发、斑秃、静止期脱发、斑秃、全秃或全身脱毛。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予参与细胞因子信号转导的蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是Jak/Stat抑制剂。在另一个实施方式中，所述抑制剂是INCB018424。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的参与细胞因子信号转导的蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是Jak/Stat抑制剂。在其他实施方式中，所述抑制剂是INCB018424。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Jak1抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:1的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Jak1抑制剂，从而控制所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:1的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Jak2抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:3的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Jak2抑制剂，从而控制所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:3的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Stat1抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:5的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Stat1抑制剂，从而控制所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:5的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。
本发明的一方面包括一种在所需哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Stat2抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂是针对SEQ ID NO:7的抗体或抗体片段。在另一个实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。
本发明的一方面提供一种诱导对象中毛发生长的方法，其中所述方法包括向所述对象给予有效量的Stat2抑制剂，从而控制所述对象中的毛发生长。在一个实施方式中，所述抑制剂包括特异性结合于含有SEQ ID NO:7的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述对象患有毛发脱落疾病。在其它实施方式中，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。在一些实施方式中，所述调节化合物还可抑制毛发生长，因而其可用于治疗毛发生长疾病，例如多毛症。
DNA和氨基酸操作方法及其纯化
本发明使用本领域普通技术人员可用的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。该技术为本领域技术人员所熟知并在文献中有完整说明。参见例如，Maniatis、Fritsch和Sambrook的“Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子 克隆：实验室手册》）”(1982):“DNA Cloning:A Practical Approach（《DNA克 隆：实践方法》）”卷I和II（D.N.Glover编，1985）；“Oligonucleotide Synthesis（《寡核苷酸合成》）”（M.J.Gait编，1984)；“Nucleic Acid Hybridization（《核 酸杂交》）”（B.D.Hames和S.J.Higgins编，1985）；“Transcription and Translation （转录和翻译）”（B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984）；“Animal Cell Culture （《动物细胞培养》）”（R.I.Freshney编，1986）；“Immobilized Cells and Enzymes （《固定细胞和酶》）”(IRL出版社（IRL Press），1986):B.Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning（《分子克隆实践指南》）”(1984)，和Sambrook等，“Molecular Cloning:a Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》）”(1989)。
本领域技术人员可用数种方法得到蛋白，其包括但不限于：通过生化方法分离蛋白或通过遗传工程改造方法表达编码感兴趣蛋白的核苷酸序列。
蛋白由核酸（包括例如，基因组DNA、互补DNA（cDNA）、合成DNA以及任何形式的对应RNA）编码。例如，其可由基因的重组核酸编码。本发明的蛋白可从多种来源获得并可按多种本领域已知技术生成。例如，编码蛋白的核酸可通过筛选DNA文库或从天然来源扩增获得。蛋白可为片段或其部分。编码蛋白的核酸可通过重组DNA技术生成，且该重组核酸可通过传统技术制备，所述技术包括化学合成、遗传工程、酶技术或其组合。例如，Jak1蛋白是由具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的核酸所编码的多肽。Jak1多肽的一个示例具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。Jak2蛋白是由具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸所编码的多肽。Jak2多肽的一个示例具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，Stat1蛋白是由具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的核酸所编码的多肽。Stat1多肽的一个示例具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。Stat2蛋白是由具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的核酸所编码的多肽。Stat2多肽的一个示例具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
人Jak1多肽序列示于SEQ ID NO:1。人Jak1核苷酸序列示于SEQ ID NO:2。有关Jak1的序列信息可通过GenBank登录号NP_002218（蛋白质）和NM_002227.2（核酸）在公共数据库得到。
SEQ ID NO：1是对应于Jak1（残基1–1154）的人野生型氨基酸序列：
Figure BDA00003444511500171
SEQ ID NO:2是对应于Jak1（核苷酸1-5053）人野生型核苷酸，其中带下划线的粗体“ATG”表示开放阅读框的起始位点：
Figure BDA00003444511500172
Figure BDA00003444511500181
Figure BDA00003444511500191
人Jak2多肽序列示于SEQ ID NO:3。人Jak2核苷酸序列示于SEQ ID NO:4。有关Jak2的序列信息可通过GenBank登录号NP_004963（蛋白质）和NM_004972.3（核酸）在公共数据库得到。
SEQ ID NO：3是对应于Jak2（残基1-1132）的人野生型氨基酸序列：
Figure BDA00003444511500192
SEQ ID NO:4是对应于Jak2（核苷酸1-5285）人野生型核苷酸，其中带下划线的粗体“ATG”表示开放阅读框的起始位点：
Figure BDA00003444511500193
Figure BDA00003444511500201
Figure BDA00003444511500211
人Stat1多肽序列示于SEQ ID NO:5。人Stat1核苷酸序列示于SEQ ID NO:6。有关Stat1的序列信息可通过GenBank登录号ADA59516（蛋白质）和GU211347.1（核酸）在公共数据库得到。
SEQ ID NO：5是对应于Stat1（残基1-750）的人野生型氨基酸序列：
Figure BDA00003444511500212
SEQ ID NO:6是对应于Stat1（核苷酸1-2353）人野生型核苷酸，其中带下划线的粗体“ATG”表示开放阅读框的起始位点：
Figure BDA00003444511500213
Figure BDA00003444511500221
人Stat2多肽序列示于SEQ ID NO:7。人Stat2核苷酸序列示于SEQ ID NO:8。有关Stat2的序列信息可通过GenBank登录号AAA98760（蛋白质）和U18671.1（核酸）在公共数据库得到。
SEQ ID NO：7是对应于Stat2（残基1-851）的人野生型氨基酸序列：
Figure BDA00003444511500222
SEQ ID NO:8是对应于Stat2（核苷酸1-18648）人野生型核苷酸，其中带下划线的粗体“ATG”表示开放阅读框的起始位点：
Figure BDA00003444511500223
Figure BDA00003444511500231
Figure BDA00003444511500241
Figure BDA00003444511500251
Figure BDA00003444511500261
Figure BDA00003444511500271
蛋白质变体：蛋白质变体可包含氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰分为下列三类中的一种或多种：取代、插入或缺失变体。插入可包括氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入一个或多个氨基酸残基。插入一般为比那些氨基或羧基末端融合小的插入，例如约1-4个残基。缺失特征为从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。这些变体通常通过编码蛋白的DNA中的核苷酸定点突变来制备，因此产生编码所述变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达DNA。
在有已知序列的DNA中预定位点产生取代突变的技术已熟知，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代可以是单个残基，但可以在许多不同位点一次性发生。在一个非限制性实施方式中，插入可以是约1-10个氨基酸残基，而缺失可以是约1-约30个残基。缺失或插入可在相邻对（例如，缺失约2个残基或插入约2个残基）中产生。可联合取代、缺失、插入或其任何组合以获得最终构建体。这些突变不能将序列置于阅读框以外且不应产生可生成二级mRNA结构的互补区域。取代变体是去除至少一个残基并在其位置插入不同残基的那些变体。
通过选择残基来产生功能或免疫特性上的实质改变，所述残基在维持以下方面的效果上差异更显著：(a)所述取代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构型，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或者(c)侧链容量。可产生蛋白特性最大变化的取代中（a）亲水残基例如丝氨酰或苏氨酰取代（或被其取代）疏水残基，例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰；（b）半胱氨酸或脯氨酸取代（或被其取代）任何其他残基；（c）具有带正电侧链的残基如赖氨酰、精氨酰或组氨酰取代（或被其取代）带负电残基，如谷胺酰基或天冬氨酰；或（d）具有较大侧链的残基如苯丙氨酸取代（或被其取代）无侧链的残基，如甘氨酸，该情况下，（e）增加硫酸化和/或糖基化位点数目。
本发明提供蛋白质氨基酸序列中的小变化。氨基酸序列的变化可以是所述序列与SEQ ID NO:1、3、5或7保持至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的相同性。例如，可使用保守性氨基酸取代。保守性取代是在侧链中相关氨基酸家族内发生的取代，其中残基的互换性具有相似侧链。
遗传编码的氨基酸通常分为几个家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它氨基酸家族包括(i)具有脂族-羟基侧链的氨基酸组，如丝氨酸和苏氨酸；(ii)具有含酰胺侧链的氨基酸组，如天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)具有脂族侧链的氨基酸组，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(iv)具有芳族侧链的氨基酸组，例如苯丙氨酸、酪氨酸和苏氨酸，和(v)具有含硫侧链的氨基酸组，例如半胱氨酸和甲硫氨酸。有用的保守性氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
例如，一个氨基酸残基被另一个生物和/或化学上相似的氨基酸残基取代对于本领域技术人员而言是保守性取代。例如，保守性取代能用一个疏水性残基取代另一个，或用一个极性残基取代另一个。所述取代包括组合，例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gin；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。可采用取代或缺失诱变以就N-糖基化（Asn-X-Thr/Ser）或O-糖基化（Ser或Thr）插入位点。也需要半胱氨酸或其它不稳定残基的缺失。例如，潜在蛋白质水解位点如Arg的缺失或取代，通过缺失一个碱性残基或由谷氨酰胺酰或组氨酸残基取代来实现。
细菌和酵母表达系统细菌系统中，可选择许多表达载体。例如，诱导抗体需要由诸如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2等基因编码的大量蛋白时，可使用指导易纯化蛋白高水平表达的载体。该载剂的非限制性示例包括多功能大肠杆菌（E.coli）克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT（司查塔基公司（Stratagene））。也可使用pIN载体或pGEX载体（威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司（Promega,Madison,Wis.））来表达外来多肽分子作为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并容易通过以下方法由裂解细胞纯化：吸附于谷胱甘肽琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱。此类系统产生的蛋白质可设计成包括肝素、凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，从而感兴趣的克隆多肽可按需从GST部分释放出来。
植物和昆虫表达系统如使用植物表达载体，可用任何数目的启动子驱动编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的序列表达。例如，病毒启动子（例如CaMV的35S和19S启动子）可单独使用或与来自TMV的ω前导序列联用。或者，可使用植物启动子，例如RUBISCO小亚基或热激启动子。这些构建体可通过DNA直接转化或病原体介导的转染来引入植物细胞。
也可使用昆虫系统表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白。例如，在一种所述系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病病毒(AcNPV)用作在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉夜蛾属（Trichoplusia）幼虫中表达外来基因的载体。编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2多肽的序列可克隆到所述病毒的非必要区域，例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入核苷酸序列例如与基因（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因）对应的序列，会使多角体蛋白失活并产生缺少外壳蛋白的重组病毒。然后所述重组病毒可用于感染草地贪夜蛾细胞或粉夜蛾属幼虫，在其中能表达所述蛋白或其变体。
哺乳动物表达系统表达载体可包括编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2多肽的核苷酸序列，所述序列以允许在宿主细胞中表达所述核苷酸序列的方式与至少一种调节序列连接。可使用许多基于病毒的表达系统在哺乳动物宿主细胞中表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或其变体。例如，当使用腺病毒作为表达载体时，将蛋白编码序列连接到含晚期启动子和三重前导序列的腺病毒转录/翻译复合物中。插入对病毒基因组非必需的E1或E3区域能用于得到活病毒，所述病毒可在感染宿细胞中表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白。也可使用转录增强子如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子，以增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
调节序列为本领域技术人员所熟知，并可选择来指导感兴趣蛋白或多肽在合适宿主细胞中的表达，如Goeddel的Gene Expression Technology:Methods in Enzymology（《基因表达技术：酶学方法》）185，学术出版社（Academic Press），加利福尼亚圣地亚哥(1990)所述。调节序列的非限制性例子包括：
多聚腺苷酸化信号、启动子（例如CMV、ASV、SV40或其他病毒启动子，如来自牛乳头瘤、多瘤病毒和腺病毒2病毒的那些（Fiers等，1973,Nature273:113；Hager GL等，Curr Opin Genet Dev，2002，12(2):137-41））增强子，和其它表达控制元件。
增强子区即在非编码DNA区域中启动子区上游或下游发现的那些序列，也为本领域已知对优化表达重要。若需要，可采用病毒来源的复制起点，例如若利用原核宿主来引入质粒DNA。然而在真核生物中，染色体整合是DNA复制的常用机制。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，一小部分细胞可将引入的DNA整合至其基因组。所用的表达载体和转染方法可以是有助于整合事件成功的因素。对于所需蛋白的稳定扩增和表达，含编码感兴趣蛋白的DNA的载体稳定整合到真核细胞（例如哺乳动物细胞，如来自毛囊终球的细胞）基因组中，产生转染基因的稳定表达。可通过同源重组将外源核酸序列引入细胞（例如哺乳动物细胞，原代或次生细胞），如美国专利5,641,670所公开，其内容通过引用纳入本文。
编码选择标记（例如耐受抗生素或药物，如氨苄西林、新霉素、G418和潮霉素）的基因可与感兴趣基因一起引入宿主细胞，以鉴定和选择稳定表达感兴趣蛋白编码基因的克隆。编码选择标记的基因可在与感兴趣基因相同的质粒上引入宿主细胞，或可在单独质粒上引入。含感兴趣基因的细胞可通过药物筛选鉴定，其中掺入选择标记的细胞能在所述药物存在的情况下存活。未掺入所述选择标记基因的细胞死亡。然后可就生成所需蛋白分子（例如，由诸如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2等基因编码的蛋白）筛选存活细胞。
细胞转染
也可使用真核表达载体来转染细胞以产生所述载体核苷酸编码的蛋白。哺乳动物细胞（例如从毛球分离的细胞，例如真皮鞘细胞和真皮乳头细胞）可通过本领域已知方法向合适宿主细胞引入表达载体来包含表达载体（例如，含有编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽的基因的载体）。
可根据宿主细胞株调节插入序列表达的能力或以所需方式加工由基因（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因）编码的表达多肽的能力对其进行选择。这类多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。也可采用切割多肽“前体”形式的翻译后加工以促进正确的插入、折叠和/或功能。可从美国典型培养物保藏中心（ATCC；弗吉尼亚州玛纳萨斯(20110-2209)的大学大道10801号）获得具有特殊细胞机理和翻译后活性的特征性机制的不同宿主细胞（例如CHO、HeLa、MDCK、HEK29和WI38），且可进行选择以确保对外来蛋白正确的修饰和加工。
可通过多种本领域已知技术将外源性核酸引入细胞，所述技术例如脂质转染、显微注射、磷酸钙或氯化钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔。电穿孔在能使DNA构建体进入感兴趣细胞（例如毛囊的终球细胞，如真皮乳头细胞或真皮鞘细胞）的近似电压和电容下进行。其它转染方法还包括改良的磷酸钙沉淀、聚凝胺沉淀、脂质体融合和受体介导的基因递送。
遗传工程改造的细胞可以是从各种组织获得的原代和次生细胞，并包括可在培养物中维持和增殖的细胞类型。原代和次生细胞的非限制性示例包括上皮细胞（例如，真皮乳头细胞、毛囊细胞、内根鞘细胞、外根鞘细胞、皮脂腺细胞、上皮基质细胞）、神经细胞、内皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、肌细胞（例如成肌细胞）、角质形成细胞、血液有形成分（例如淋巴细胞、骨髓细胞）和这些体细胞类型的前体。
脊椎动物组织可通过本领域技术人员已知的方法获得，所述方法例如，钻取活检或其它获得感兴趣原代细胞类型组织来源的手术方法。在一个实施方式中，可使用钻取活检或移除以获得角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞或间充质细胞（例如，毛囊细胞或真皮乳头细胞）来源。在另一个实施方式中，移除毛囊可用于获得成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞或间充质细胞（例如，毛囊细胞或真皮乳头细胞）来源。可使用本领域易操作的方法从组织获得原代细胞混合物，所述方法例如外植或酶消化（例如使用酶，如链霉蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和糜蛋白酶）。活检方法也描述于美国专利申请公开2004/0057937和PCT申请公开WO2001/32840，且其通过引用纳入本文。
原代细胞可从给予经遗传工程改造的原代或次生细胞的个体获得。然而除了受体以外，原代细胞还可从相同种类的供体获得。所述细胞还可从另一种类（例如兔、猫、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、狗、马、牛、禽类或猪）获得。原代细胞还可包括附着组织培养底物（例如烧瓶或培养皿）生长或悬浮生长的经分离脊椎动物组织来源的细胞，细胞存在于源自组织的外植物中；第一次平板培养上述两种类型细胞；且细胞培养物悬液来自这些平板培养的细胞。除了来自后续传代的细胞外，次生细胞还可以是从培养底物中移出并重新接种或传代的平板培养原代细胞。次生细胞可传代一次或多次。这些原代或次生细胞可含有表达载体，所述载体具有编码感兴趣蛋白（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽）的基因。
细胞培养：
可采用多种与所培养宿主细胞有关的培养参数。哺乳动物细胞的合适培养条件为本领域熟知（Cleveland WL等，J Immunol Methods，1983，56(2):221-234）或可由本领域技术人员测定（参见例如，Animal Cell Culture:A Practical Approach（《动 物细胞培养：实践方法》）第二版，Rickwood,D和Hames，B.D.编，（牛津大学出版社（Oxford University Press）：纽约，1992））。细胞培养条件可根据选择的宿主细胞类型变化。可采用市售可得的培养基。培养基的非限制性示例包括但不限于：极限必需培养基（Minimal Essential Medium）（MEM，密苏里州圣路易斯的西格玛公司（Sigma））；达氏修正伊氏培养基（Dulbecco's Modified EaglesMedium）（DMEM，西格玛公司）；Ham's F10培养基（Ham's F10Medium）（西格玛公司）；海克隆细胞培养基（HyClone cell culture medium）（犹他州洛根的海克隆公司（HyClone））；RPMI-1640培养基（RPMI-1640Medium）（西格玛公司）；化学限定（CD）培养基，其配制用于多种细胞类型，例如CD-CHO培养基（CD-CHO Medium）（加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司（Invitrogen））。
必要时用补充成分或组分补充细胞培养基，所述补充成分或组分包括必要或需要时具有合适浓度或含量的可选组分。细胞培养基溶液提供至少一种来自以下一类或多类的组分：(1)能量来源，通常以碳水化合物的形式，例如葡萄糖；(2)所有必需氨基酸，并通常是20种氨基酸加上半胱氨酸的基本组合；(3)低浓度的维生素和/或其它所需有机化合物；(4)游离脂肪酸或脂质，例如亚油酸；以及(5)痕量元素，其中痕量元素定义为以极低浓度需要的（通常是微摩尔范围）无机化合物或天然产生的元素。
也可用来自以下任何类别的一个或多个组分选择性补充所述培养基：(1)盐，例如镁、钙和磷；(2)激素和其它生长因子，例如血清、胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；(3)蛋白和组织水解物，例如可从自纯化明胶、植物材料或动物副产品获得的蛋白胨或蛋白胨混合物；(4)核苷和碱基，例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；(5)缓冲液，例如HEPES；(6)抗生素，例如庆大霉素或氨苄西林；(7)细胞保护剂，例如普流罗尼克多元醇；和(8)半乳糖。在一个实施方式中，可向培养基加入可溶因子。
可用于本发明的哺乳动物细胞培养物在适于所培养细胞类型的培养基中制备。在一个实施方式中，所述细胞培养基可为之前讨论过的并补充有哺乳动物来源血清（例如胎牛血清（FBS））的任何培养基（例如，MEM）。在另一实施方式中，所述培养基可以是以维持上皮细胞或来自毛囊毛球的细胞（例如真皮乳头细胞或真皮鞘细胞）生长的条件培养基。例如，上皮细胞可根据Barnes和Mather的Animal Cell Culture Methods（《动物细胞培养方法》）（学术出版社，1998）培养，其通过引用全文纳入本文。在其它实施方式中，上皮细胞或毛囊细胞可用DNA载体转染，所述载体含有编码感兴趣多肽或蛋白（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽）的基因。在本发明其它实施方式中，细胞在有效量酶存在下于悬浮培养物（例如，三维培养物如悬滴培养物）中生长，其中，所述酶底物是悬浮培养物中的胞外基质分子。例如，所述酶可以是透明质酸酶。上皮细胞或毛囊细胞可根据本领域所实践的方法培养，所述方法例如PCT申请公开WO2004/044188和美国专利申请公开号2005/0272150所述的方法，或如Harris在Handbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture（《实用动物细胞生物学手册：上皮细胞培养》） （英国剑桥大学出版社；1996；参见第8章）中所述的方法，其通过引用纳入本文。
悬浮培养是一类培养，其中细胞或细胞聚集体（例如DP细胞聚集体）在悬浮于液体培养基中时增殖。包括哺乳动物细胞的悬浮培养物可用于维持不粘附的细胞类型或使细胞体现出粘附形式中未观察到的特殊细胞特性。一些悬浮培养物类型可包括三维培养物或悬滴培养物。悬滴培养物是待培养物质接种在附着平坦表面（例如盖玻片、载玻片、皮氏培养皿、烧瓶等）的液滴中的培养物，并可倒置在空心表面上。悬滴中的细胞由于重力作用可向液滴悬挂中心聚集。然而，根据本发明的方法，在降解胞外基质的蛋白（例如，胶原酶、软骨素酶、透明质酸酶）存在下培养的细胞会变得更紧密并在悬滴培养物中聚集，因为ECM的降解会使存在的ECM变少因而使细胞彼此更紧密。也可参见PCT国际公开号WO2007/100870，其通过引用纳入。
从毛囊毛球中获得的细胞（例如真皮乳头细胞或真皮鞘细胞）也可以培养成悬滴培养物中的单个或均一群（例如，包含DP细胞）以产生DP细胞聚集体。细胞也可以培养成悬滴培养物中的异质群（例如，包含DP和DS细胞）以产生DP和DS细胞嵌合聚集体。上皮细胞可以根据本领域实践单层培养直至融合。该培养方法可基本上根据以下所述方法实施：Handbook in Practical Animal Cell Biology:Epithelial Cell Culture（《实用动物细胞生物手册：上皮细胞培养》）(英国剑桥大学出版社；1996)第8章；Underhill CB，J Invest Dermatol，1993，101(6):820-6)；Armstrong和Armstrong，(1990)J Cell Biol110:1439-55；或Animal Cell Culture Methods（《动物细胞培养方法》）(学术出版社，1998)，其通过引用全文纳入本文。，_
三维培养物可形成自琼脂（例如Gey琼脂）水凝胶（例如基质胶、琼脂糖等；Lee等，(2004)Biomaterials25:2461-2466）或交联聚合物。这些聚合物可包含天然聚合物及其衍生物、合成聚合物及其衍生物或其组合。天然聚合物可以是阴离子聚合物、阳离子聚合物、两亲性聚合物或中性聚合物。阴离子聚合物的非限制性示例包括透明质酸、海藻酸（海藻盐）、角叉菜胶、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖和果胶。阳离子聚合物的一些示例包括但不限于壳聚糖或聚赖氨酸。（Peppas等，(2006)Adv Mater.18:1345-60；Hoffman,A.S.，(2002)Adv Drug Deliv Rev.43:3-12；Hoffman,A.S.,(2001)Ann NY Acad Sci944:62-73）。两亲性聚合物的示例可包括但不限于胶原、明胶、纤维蛋白和羧甲基壳多糖。中性聚合物的非示例性示例可包括右旋糖苷、琼脂糖或支链淀粉。（Peppas等，(2006)Adv Mater.18:1345-60；Hoffman,A.S.，(2002)Adv Drug Deliv Rev.43:3-12；Hoffman,A.S.，(2001)Ann NY Acad Sci944:62-73）。.
适于根据本发明所述方法培养的细胞可包含引入的表达载体，例如质粒。所述表达载体构建体可通过转化、微注射、转染、脂质转染、电穿孔或感染引入。所述表达载体可含有编码表达和生成蛋白的编码序列或其部分。含有编码所生成蛋白和多肽以及合适转录和翻译控制元件的序列的表达载体可通过本领域技术人员已知和实践的方法产生。这些方法包括合成技术、体外DNA重组技术和体内遗传重组，所述方法描述于：J.Sambrook等，2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual （《分子克隆，实验室手册》），纽约州普莱恩维尤的冷泉港出版社（Cold SpringHarbor Press）和F.M.Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology（《新 编分子生物学实验指南》），纽约州纽约的约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons)。
获得并纯化多肽
由基因如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或其变体编码的多肽分子可通过体外或体内表达编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽的核酸序列从人细胞纯化获得，所述人细胞表达由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的蛋白或多肽；或通过直接化学合成获得。
检测多肽表达含有编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽的核酸并随后表达由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的蛋白的宿主细胞可通过本领域技术人员已知的多种方法鉴定。这些方法包括但不限于：DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物试验或免疫试验技术，所述技术包括用于检测和/或定量分析核酸或蛋白的基于膜、溶液或芯片的技术。例如，编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽的核酸的存在可通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或用编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽的探针或核酸片段进行扩增来检测。在一个实施方式中，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的核酸片段可包含SEQ ID NO:2、4、6或8中至少约8个连续核苷酸的任何部分。在另一实施方式中，所述片段可包含SEQ ID NO:2、4、6或8中至少约10个连续核苷酸、至少约15个连续核苷酸、至少约20个连续核苷酸或至少约30个连续核苷酸。片段可包括约8-约100个氨基酸的所有可能核苷酸长度，例如约15-约100个核苷酸长度或约20-约100个核苷酸长度。基于核酸扩增的试验包括使用选自编码由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的序列的寡核苷酸来检测含有编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽的核酸的转化子。
可使用对所述多肽特异的多克隆或单克隆抗体充分确立检测和测定由诸如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2等基因编码的多肽表达的操作方案。非限制性示例包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射性免疫(RIA)和荧光激活的细胞分选(FACS)。可使用基于双位点单克隆免疫试验，所述试验采用与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽上的两个非干扰表位有反应性的单克隆抗体，也可使用竞争性结合试验。
多种标记和偶联技术为本领域技术技术人员已知并可用于多种核酸和氨基酸实验。用于检测编码蛋白如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2的核酸序列相关序列的标记杂交或PCR探针的生成方法包括但不限于使用经标记核苷酸进行寡聚物标记、缺口平移、末端标记或PCR扩增。或者，编码基因（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因）所编码多肽的核酸序列可克隆到用于产生mRNA探针的载体中。此类载体为本领域所知并可市售获得，且可通过加入标记的核苷酸和合适RNA聚合酶（如T7、T3或SP6）用于体外合成RNA探针。可利用多种市售试剂盒(安法马西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)、普洛麦格公司(Promega)和美国生物化学公司，US Biochechemical))进行这些步骤。易于检测的合适报告分子或标记可包括放射性核素、酶、和荧光物质、化学发光物质或发色剂以及底物、辅因子、抑制剂和/或磁性颗粒等。
表达和纯化多肽用编码多肽（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2）的核酸序列转化的宿主细胞可在适于表达和回收来自细胞培养物的蛋白的条件下培养。根据所用序列和/或载体，由转化细胞产生的多肽可分泌出或包含于胞内。含有编码多肽（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2）的核酸序列的表达载体可设计成含有指导基因（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2）或其变体所编码可溶多肽分子分泌穿过原核或真核细胞膜的信号序列，或指导Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或其变体编码的多肽分子膜结合膜插入的信号序列。
也可用其它构建将编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2多肽的基因序列连接到编码促进纯化可溶蛋白的多肽结构域的核苷酸序列。此类纯化促进结构域包括但不限于：能在固化金属上进行纯化的金属螯合肽（如组氨酸-色氨酸模块）、能在固定免疫球蛋白上进行纯化的蛋白质A结构域、以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统（英姆纳克斯公司（Immunex Corp.），华盛顿州西雅图）中所用的结构域。纯化结构域和Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码的多肽之间包含可切割接头序列（即对Xa因子或肠激酶特异的序列（加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司））也可用来促进纯化。一种此类表达载体能够表达一种融合蛋白，所述融合蛋白包含Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽和硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前的6个组氨酸残基。所述组氨酸残基通过固化金属离子亲和色谱促进纯化，而所述肠激酶切割位点提供纯化Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的方法。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2多肽可从表达所述多肽的任何人或非人类细胞纯化，包括用表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的表达载体转染的那些。纯化的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白可通过本领域实践的方法从其它化合物中分离，所述化合物通常在细胞中与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的蛋白结合，例如某些蛋白、碳水化合物或脂质。非限制性方法包括：尺寸排阻色谱、硫酸铵分级分离、离子交换层析、亲和层析和制备性凝胶电泳。
化学合成包含基因（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因）、编码多肽的核酸序列并可通过本领域已知方法整体或部分合成。或者，可使用化学方法生成多肽（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2）以合成其氨基酸序列，例如通过使用固相技术的直接肽合成。可采用人工技术或自动方法进行蛋白合成。可采用例如应用生物系统431A肽合成仪（帕金埃尔默公司（Perkin Elmer））来实现自动合成。任选地，可单独合成Jak1、Jak2、Stat1或Stat2多肽片段并采用化学方法组合以产生全长分子。在一个实施方式中，含有Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的核酸片段可包含SEQ ID NO:2、4、6或8中至少约8个连续核苷酸的任何部分。在一个实施方式中，所述片段可包含SEQ ID NO:2、4、6或8中至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸或至少约30个核苷酸。片段包括在约8-约100个核苷酸的所有可能核苷酸长度，例如约15-约100个核苷酸长度或约20-约100个核苷酸长度。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2片段可以是蛋白片段，例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2。例如，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2片段可包括SEQ ID NO:1、3、5或7中至少约8个连续氨基酸的任何部分。所述片段可包括SEQ ID NO:1、3、5或7中至少约10个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸或至少约75个连续氨基酸。片段包括约8-约100个氨基酸的所有可能氨基酸长度，例如约10-约100个氨基酸、约15-约100个氨基酸、约20-约100个氨基酸、约35-约100个氨基酸、约40-约100个氨基酸、约50-约100个氨基酸、约70-约100个氨基酸、约75-约100个氨基酸或约80-约100个氨基酸的长度。
合成肽可通过高效液相色谱（HPLC）基本纯化。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2的合成多肽组成可通过氨基酸分析或测序确定。另外，包含Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白的氨基酸序列的任何部分可在直接合成过程中改变且/或使用化学方法与来自其它蛋白的序列组合以产生变体多肽或融合蛋白。
鉴定Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物
本发明提供了用于控制和/或调节对象中毛发生长（例如，毛发密度）或毛发着色的化合物的鉴定方法。本发明提供了鉴定本文中所列基因为与毛发脱落疾病相关的基因，本发明还提供调节Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因和/或蛋白表达或活性的化合物的鉴定方法。另外，本发明提供可用于治疗毛发脱落疾病的化合物的鉴定方法。本发明还提供了可用于治疗稀毛症（例如遗传性单纯稀毛症（HHS））的化合物的鉴定方法。毛发脱落疾病的非限制性示例包括：雄激素性秃发、斑秃、静止期脱发、斑秃、全秃或全身脱毛。所述方法可包括鉴定能结合于多肽分子的测试化合物或试剂（例如，肽（如抗体或其片段）、小分子、核酸（如siRNA或反义RNA）或其它试剂），所述多肽分子由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码并/或对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白的生物活性或其表达有刺激或抑制效应，并随后确定这些化合物是否可在对象中调节毛发生长或在体内实验中对毛发脱落疾病相关的症状是否有作用（即检测毛发生长的增加或减少）。
本文所用的“Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物”指与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或多肽相互作用的化合物并调节其活性和/或其表达。所述化合物可提高Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白的活性或表达。相反，所述化合物可降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白的活性或表达。所述化合物可以是Jak1、Jak2、Stat1或Stat2激动剂或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2拮抗剂（例如，Jak1抑制剂、Jak2抑制剂、Stat1抑制剂或Stat2抑制剂）。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物的一些非限制性示例包括肽（例如包含Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的肽片段，或其抗体或片段）、小分子和核酸（例如对包含Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的核酸特异的siRNA或反义RNA）。与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白结合时，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白激动剂可以是提高或延长Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性的分子。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2激动剂包括但不限于活化Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的蛋白、核酸、小分子或任何其它分子。与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白结合时，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白拮抗剂可以是降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白含量或活性持续时间的分子。拮抗剂包括降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性的蛋白、核酸、抗体、小分子或任何其它分子。
本文中出现的术语“调节”指Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或蛋白的活性或表达变化。例如，调节可引起Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的蛋白活性、结合特性或任何其它生物、功能或免疫特性的提高或降低。
在一个实施方式中，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可以是结合于所述蛋白的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白肽片段。例如，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2多肽可包含SEQ ID NO:1、3、5或7中至少约8个连续氨基酸的任何部分。所述片段可包括SEQ ID NO:1、3、5或7中至少约10个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、或至少约75个连续氨基酸。片段包括约8-约100个氨基酸的所有可能氨基酸长度，例如约10-约100个氨基酸、约15-约100个氨基酸、约20-约100个氨基酸、约35-约100个氨基酸、约40-约100个氨基酸、约50-约100个氨基酸、约70-约100个氨基酸、约75-约100个氨基酸或约80-约100个氨基酸的长度。这些肽片段可以市售获得或通过液相或固相合成方法合成获得（Atherton等，(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach （《固相肽合成：实践方法》）.英国牛津的IRL出版社）。所述Jak1、Jak2、Stat1或Stat2肽片段可从天然来源分离、遗传工程改造或化学方法制备。这些方法为本领域熟知。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可以是蛋白，例如针对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的抗体（单克隆、多克隆、人源化、嵌合或全人抗体）或其结合片段。抗体片段还可以是全长形式以外的抗体形式，并且除了经工程改造的抗体片段外还包括存在于全长抗体中的部分或组分。抗体片段可包括但不限于，单链Fv（scFv）、双抗体、Fv和(Fab′)2、三抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、四抗体、双功能杂交抗体、构架区、恒定区等（参见Maynard等，(2000)Ann.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402）。抗体可市售获得、定制生成或根据本领域已建立的方法针对感兴趣抗原合成（Janeway等，(2001)Immunobiology（《免疫生物学》）第5版，加兰出版公司（Garland Publishing））。在一个实施方式中，所述抗体或其结合片段针对SEQ ID NO:1、3、5或7。抗体可市售获得、定制生成或根据本领域已建立的方法针对感兴趣抗原合成（Janeway等，(2001)Immunobiology（《免疫 生物学》）第5版，加兰出版公司）。例如，针对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2的抗体可从阿柏堪穆公司（Abcam）、圣克鲁斯生物技术公司（Santa CruzBiotechnology）、亚诺法公司（Abnova Corp.）、BD生物科学公司（BD Biosciences）、安替基尼克斯美国公司（Antigenix America Inc）等购得。针对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2的人抗体（例如，单克隆、人源化或嵌合抗体）可用于人类中的抗体治疗应用。
对编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的RNA的抑制可有效调节Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因（所述RNA根据其转录）表达。抑制剂选自下组：siRNA；干扰RNA或RNAi；dsRNA；RNA聚合酶III转录的DNA；核酶；和反义核酸，其可以是RNA、DNA或人工核酸。
反义寡核苷酸包括反义DNA、RNA和DNA/RNA分子，其通过与靶标mRNA结合直接阻断mRNA翻译并阻止蛋白翻译。例如，具有至少约15个碱基并与编码由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的DNA序列独特区域互补的反义寡核苷酸可通过例如常规磷酸二酯技术（Dallas等，(2006)Med.Sci.Monit.12(4):RA67-74；Kalota等，(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173:173-96；Lutzelburger等，(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173:243-59）合成。反义核苷酸序列包括但不限于：吗啉代、2'-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。
siRNA包含具有约15-约50个碱基对的双链结构，例如约21-约25个碱基对，并具有与细胞中表达的靶基因或RNA相同或几乎相同的核苷酸序列。所述siRNA包含通过标准沃森-克里克碱基对相互作用退火在一起的正义RNA链和互补反义RNA链。所述正义链包含与靶miRNA分子所含核酸序列基本相同的核酸序列。与靶mRNA所含靶序列“基本相同”指与靶序列差异3％或更低的核酸序列。siRNA的正义和反义链可包含两条互补的单链RNA分子，或可包含单个分子，其中两个互补部分是碱基配对的，并且由单链“发夹”区域共价连接。也可参见，McMnaus和Sharp(2002)Nat Rev Genetics，3:737-47，及Sen和Blau(2006)FASEB J.，20:1293-99，其全部公开内容通过引用纳入本文。
通过加入、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸，siRNA可以是不同于天然所产生RNA的经改变RNA。此类改变可包括加入非核苷酸物质例如至siRNA末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸，或者修饰使siRNA具有核酸酶消化抗性，或者用脱氧核糖核苷酸取代siRNA中的一个或多个核苷酸。siRNA的一条或两条链还可包括3'突出。本文所用的“3'突出”指从RNA双链体的3'端延伸出至少一个未配对的核苷酸。例如，所述siRNA可包含长度为1-约6个核苷酸、或1-约5个核苷酸、或1-约4个核苷酸、或约2-约4个核苷酸的3'突出(包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。例如，siRNA的每条链包含双胸苷酸(“T”)或双尿苷酸(“uu”)3'突出。
可通过化学或生物学方法产生siRNA，或从重组质粒或病毒载体中表达（例如，参见美国专利号7,294,504和美国专利号7,422,896，其全部公开内容通过引用纳入本文）。产生和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gerwirtz的美国专利申请号2002/0173478、Hannon等的美国专利申请公开号2007/0072204、及Reich等的美国专利申请公开号2004/0018176，其全部公开内容通过引用纳入本文。
在一个实施方式中，针对含有Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的人核酸序列的siRNA可针对SEQ ID NO:2、4、6或8中的任何序列产生。在另一实施方式中，针对含Jak1基因的人核酸序列的siRNA可包含表11所列的任一序列。在另一实施方式中，针对含Stat1基因的人核酸序列的siRNA可包含表12所列的任一序列。
在另一实施方式中，针对Jak1的siRNA列于表11。
Figure BDA00003444511500411
Figure BDA00003444511500421
在另一实施方式中，针对Stat1的siRNA列于表12。
Figure BDA00003444511500422
Figure BDA00003444511500431
RNA聚合酶III转录的DNA含有启动子，例如U6启动子。可在细胞中转录这些DNA以产生能作为siRNA发挥功能的小发夹RNA或作为反义RNA发挥功能的线性RNA。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成核苷酸或任何适合的组合从而抑制靶RNA和/或基因。另外，这些形式的核酸可以是单链、双链、三链或四链。（参见例如，Bass(2001)Nature，411，428429；Elbashir等(2001)Nature，411，494498；和PCT公开号WO00/44895，WO01/36646，WO99/32619，WO00/01846，WO01/29058，WO99/07409，WO00/44914）。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可以是与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白结合的小分子且破坏其功能，或者相反，增强其功能。小分子是通常具有低分子量的一组多样的合成和天然物质。它们可从天然来源（例如植物、真菌、微生物等）中分离，市售获得和/或作为库或集合可得，或合成。调节Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的候选小分子可通过计算机模拟筛选或高通量（HTP）筛选组合文库来鉴定。大多数传统药物（例如阿司匹林、青霉素和许多化疗）是小分子，可市售获得，可化学合成或可如下文所述从随机或组合文库中获得（Werner等，(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic5(1):32-6）。
Jak1/Jak2抑制剂的非限制性示例包括：AG490（Caceres-Cortes，AnticancerAgents Med Chem.2008年10月；8（7）:717-22）；CYT387（Pardanani等，Leukemia.2009年8月；23（8）:1441-5；Monaghan等，Leukemia.2011年7月26日.doi:10.1038/leu.2011.175.[电子出版先于印刷出版]）；SB1518（William等，J Med Chem.2011年7月14日；54（13）:4638-58；Hart等，Leukemia.20116月21日.doi:10.1038/leu.2011.148.[电子出版先于印刷出版]）；LY3009104（INCB28050）（因赛特（Incyte）和礼来（Lilly））；TG101348（Wernig等，Cancer Cell.2008年4月；13（4）:311-20；Pardanani等，J Clin Oncol.2011年3月1日；29（7）:789-96）；和BMS-911543（Purandare等，Leukemia.2011年10月21日doi:10.1038/leu.2011.292.[电子出版先于印刷出版]），各参考文献都通过引用全文纳入本文。
临床开发中的JAK1/2包括a)INCB018424，局部或口服；5nM活性（因赛特）；b)CEP-701（瑟法隆（Cephalon））；和c)TG101348。
Figure BDA00003444511500441
Stat抑制剂的非限制性示例包括：WP-1034（Faderl等，Anticancer Res.2005年5月－6月；25(3B):1841-50）、氟达拉滨（加利福尼亚州伯莱克斯的福达华）、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）和贯叶金丝桃素。针对Jak/Stat信号转导的其它化合物描述于Ivanenkov等，Mini Rev Med Chem.2011年1月；11(1):55-78，其全部内容通过引用纳入本文。
了解感兴趣分子（例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽）的主要序列和该序列与具有已知功能的蛋白相似性可提供关于除了激动剂外所述感兴趣蛋白抑制剂或拮抗剂的信息。通过测定所述蛋白的结构特征来进一步促进激动剂和拮抗剂的鉴定和筛选，例如通过X射线晶体学、中子衍射、核磁共振波谱法和其它结构测定技术。这些技术提供了激动剂和拮抗剂的合理设计或鉴定。
测试化合物例如Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可从大型合成或天然化合物文库中筛选（参见Wang等，(2007)Curr Med Chem,14(2):133-55；Mannhold(2006)Curr Top Med Chem，6(10):1031-47；和Hensen(2006)Curr Med Chem13(4):361-76）。目前有多种方法用于随机和直接合成基于糖、肽和核酸的化合物。合成化合物文库可从Maybridge化学品公司（Maybridge Chemical Co.,英国康沃尔Trevillet）、AMRI公司（纽约州奥尔巴尼）、贸桥公司（ChemBridge,加利福尼亚州圣地亚哥）和MS公司（MicroSource，康涅狄格州盖洛德斯维尔）市售获得。稀有化合物文库可获自奥德里奇公司(Aldrich，威斯康星州密尔沃基)。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库可获自例如PL公司(PanLaboratories，华盛顿州波萨尔)，或者可容易地产生。此外，天然和合成产生的文库和化合物容易通过常规化学、物理和生化方法修饰（londelle等，(1996)Tib Tech14:60）。
制备分子文库的方法为本领域熟知且许多文库市售可得。本发明感兴趣的文库包括肽文库、随机寡核苷酸文库、合成有机组合文库等。简并肽文库可容易制备成溶液、固定形式，作为细菌鞭毛肽展示文库或作为噬菌体展示文库。肽配体可选自含有至少一个氨基酸的肽组合文库。文库可由拟肽和非肽合成部分合成。这类文库可进一步合成，其含有非肽合成部分，其相较其天然产生的对应物较少受到酶降解。例如，文库还可包括但不限于质粒上肽（peptide-on-plasmid）文库、合成小分子文库、适体文库、基于体外翻译文库、多核糖体文库、合成肽文库、神经递质文库和化学文库。
化学合成文库的示例描述于Fodor等，(1991)Science251:767-773；Houghten等，(1991)Nature354:84-86；Lam等(1991)Nature354:82-84；Medynski，(1994)BioTechnology12:709-710；Gallop等，(1994)J.Medicinal Chemistry37(9):1233-1251；Ohlmeyer等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10922-10926；Erb等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-11426；Houghten等，(1992)Biotechniques13:412；Jayawickreme等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:1614-1618；Salmon等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11708-11712；1993年10月14日的PCT公开号WO93/20242的；和Brenner等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5381-5383。
噬菌体展示文库的示例描述于Scott等，(1990)Science249:386-390；Devlin等，(1990)Science,249:404-406；Christian等，(1992)J.Mol.Biol.227:711-718；Lenstra，(1992)J.Immunol.Meth.152:149-157；Kay等，(1993)Gene128:59-65；和PCT公开号WO94/18318的。
基于体外翻译的文库包括但不限于PCT公开号WO91/05058；和Mattheakis等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-9026中描述的那些。
本文所用的术语“配体来源”可以是本文所述任何化合物文库，或从生物体系统中各种器官制备的组织提取物，其可用于筛选用作Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白激动剂或拮抗剂的化合物。筛选本文所列化合物文库[也可参见美国专利申请公开号2005/0009163，其通过引用全文纳入本文]可与体外动物研究、功能和信号转导试验联用来鉴定调节毛发生长或治疗毛发脱落疾病的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物。
可通过多种通常已知的方法实现对文库的筛选。参见例如，以下公开肽文库筛选的参考文献：Parmley和Smith，(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218;Scott和Smith,(1990)Science249:386-390;Fowlkes等,(1992)BioTechniques13:422-427;Oldenburg等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5393-5397;Yu等,(1994)Cell76:933-945;Staudt等,(1988)Science241:577-580;Bock等,(1992)Nature355:564-566;Tuerk等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6988-6992;Ellington等,(1992)Nature355:850-852;Ladner等的美国专利号5,096,815;5,223,409;和5,198,346;Rebar等,(1993)Science263:671-673;和PCT公开WO94/18318。
也可生成并筛选小分子组合文库。小有机化合物的组合文库是在一点或多点多样性上彼此不同的紧密相关类似物的集合，并通过采用多步骤过程的有机技术合成。组合文库包括大量有机小化合物。一类组合文库通过产生化合物阵列的平行合成方法制备。化合物阵列可以是可通过其笛卡尔坐标中的空间地址（spatialaddress）鉴别的化合物集合，并可使各化合物具有常见分子核心和一个或多个可变的结构多样性元件。该化合物阵列中的化合物在单独反应容器中平行产生，各化合物通过其空间地址鉴定和追踪。平行合成混合物和平行合成方法的示例在在以下专利中提供：1994年1月5日提交的美国系列号08/177,497和1995年7月13日公开的相应PCT公开专利申请W095/18972以及1998年1月27日授权的美国专利号5,712,171及其相应PCT公开专利申请W096/22529，其通过引用纳入本文。.
在一个非限制性示例中，可筛选非肽文库，例如苯二氮文库（参见例如Bunin等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4708-4712）。也可采用拟肽文库，例如Simon等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9367-9371描述的文库。可采用的另一文库示例如Ostresh等(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11138-11142所述，其中肽的酰胺官能团全甲基化以产生化学转化组合文库。
计算机建模和检索技术能鉴定化合物，或改善已鉴定的化合物，其可调节Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的表达或活性。鉴定该化合物或组合物后，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的活性位点或区域可继而通过检测所述化合物结合位点来鉴定。这些位点可以是配体结合位点并可使用本领域已知方法鉴定，所述方法包括例如来自从肽的氨基酸序列，核酸的核苷酸序列，或相关化合物或组合物与其天然配体的复合物研究。后一种情况中，可采用化学或X射线晶体方法通过寻找因子上发现复合物配体的位置来找到活性位点。
位点例如由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的三维几何结构可通过本领域已知方法测定，例如X射线晶体学，其可测定完整的分子结构。可采用固相或液相NMR来测定某些分子内距离。可采用其它任何结构测定试验方法来获得部分或完整几何结构。几何结构可用天然或人工的复合配体测定，所述复合配体可提高所测活性位点结构的准确性。
制备或鉴定结合靶标的肽的其他方法为本领域已知。例如可采用分子印迹从头构建大分子结构，例如结合于分子的肽。参见，例如Kenneth J.Shea，Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites（《合成网络聚合物的分子印迹：从头开始合成大分子结 合和催化位点》）TRIP卷2，第5号，1994年5月，Mosbach，(1994)Trends in Biochem.Sci.，19(9)；和Wulff,G.,Polymeric Reagents and Catalysts（《聚合物试剂和催化剂》）(Ford,W.T.编)ACS研讨会系列号308，第186-230页，美国化学协会（AmericanChemical Society）(1986)。一种Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物模拟物的制备方法包括以下步骤：(i)围绕展现所需活性的已知底物（模板）使功能单体聚合；(ii)去除模板分子；然后(iii)在所述模板留下的空间中使第二类单体聚合以提供展现与所述模板相似的一种或多种所需特性的新分子。除了用该方法制备肽，也可制备其它结合分子例如聚糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、碳水化合物、糖蛋白、类固醇、脂质和其它生物活性物质。该方法用于设计多种比其天然对应物更稳定的生物模拟物，因为其通过功能单体自由基聚合制备，产生有非生物降解性主干的化合物。设计这类分子的其它方法包括例如基于构效关系的药物设计，其要求合成和评估许多化合物和分子建模。
筛选试验
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可以是体内和/或体外影响Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性和/或表达的化合物。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可以是Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的激动剂和拮抗剂，且可以是通过表达、通过翻译后修饰或通过其它方法对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白发挥其作用的化合物。
与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白结合，和/或对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的活性或表达具有刺激或抑制作用的测试化合物或试剂可通过两类试验鉴定：(a)基于细胞的试验，其利用在细胞表面表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或其变体的细胞；或(b)无细胞试验，其可利用分离的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白。这些试验可采用Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的生物活性片段，全长蛋白、或包括全部或部分Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码多肽的融合蛋白。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白可获自任何适合的哺乳动物种类（例如，人、大鼠、鸡、蟾蜍、马、牛或鼠）。所述试验可以是包括直接或间接测定测试化合物结合的结合试验。所述试验也可是包括直接或间接测定Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性的活性试验。所述试验也可是包括直接或间接测定Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列或由Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白表达的表达试验。多种筛选试验可与体内试验联用，所述体内试验包括测定测试化合物在对象中对毛发脱落紊乱或疾病（例如激素性秃发、斑秃、全秃或全身脱毛）、在对象中对毛发色素丧失或甚至稀毛症的症状的作用。
体内试验也可包括评估测试化合物在已知哺乳动物模型或哺乳动物中对调节毛发生长的作用，所述模型表现缺陷型或异常的毛发生长表型，所述哺乳动物在核酸序列开放阅读框（ORF）中具有突变，所述核酸序列包含影响毛发生长调节或毛发密度或毛发色素的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因。在一个实施方式中，控制毛发生长可包括诱导对象中的毛发生长或密度。此处化合物调节毛发生长的作用可通过检测生物体身体毛发生长或脱落目视观察，或通过用本领域已知方法评估蛋白或mRNA表达来观察。
还可完成试验以筛选结合Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或调节其活性的测试化合物。测试化合物可通过任何合适方法获得，例如来自常规化合物文库。测试化合物对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的膜结合形式的结合能力测定可通过以下方法完成：将所述测试化合物偶联放射性同位素或酶标记从而可通过检测复合物中的标记化合物来测定测试化合物与表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的细胞的结合。例如，测试化合物可用3H、14C、35S或125I直接或间接标记，且放射性同位素可继而通过放射性发射直接计数或通过闪烁计数。或者，测试化合物可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶标记，且酶标记通过测定合适底物向产物的转化来检测。基于细胞的试验可包括使表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2的细胞接触检测试剂并测定检测试剂对膜结合分子活性或表达的调节（例如提高或降低）能力。测定检测试剂对膜结合Jak1、Jak2、Stat1或Stat2分子活性的调节能力可通过适于测定该分子活性的任何方法实现，例如监控下游信号转导事件（例如，You等，Ann N Y Acad Sci.2008年12月；1150:300-10；Posadas等，ExpertRev Clin Immunol.2009年1月；5(1):9-17；Korhonen等，Basic Clin Pharmacol Toxicol.2009年4月；104(4):276-84；Vital等，Ther Clin Risk Manag.2006年12月；2(4):365-75；Malek和Castro，Immunity.2010年8月27日；33(2):153-65；Cheng等，Immunol Rev.2011年5月；241(1):63-76；Lanier,Nat Immunol.2008年5月；9(5):495-502;Lowell,Cold Spring Harb Perspect Biol.2011年3月1日;3(3).pii:a002352;Mócsai等，Nat Rev Immunol.2010年6月；10(6):387-402;Bradshaw,CellSignal.2010年8月；22(8):1175-84;Ivanenkov等，Mini Rev Med Chem.2011年1月;11(1):55-78;Himpe等，Biofactors.2009年1月－2月；35(1):76-81，各文献通过引用全文纳入本文）。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的靶标可固定化以促进分离一种或两种蛋白的复合形式与非复合形式。可在适于容纳反应物的任何容器中实现测试化合物对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或其变体的结合，或在有和没有测试化合物情况下实现Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白与靶分子的相互作用。该容器的示例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方式中，可提供融合蛋白，所述融合蛋白加入了允许一种或两种蛋白与基质结合的结构域（例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶可吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠上（密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司（Sigma Chemical））或谷胱甘肽衍生的微量滴定板）。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或其变体也可通过结合固体支持物来固定。合适固体支持物的非限制性示例包括玻璃或塑料载片、组织培养板、微量测试孔、管、硅芯片或颗粒例如珠子（包括但不限于乳胶、聚苯乙烯或玻璃珠）。可采用本领域已知的任何方法将与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2对应的多肽（或多核苷酸）或其变体、或测试化合物与固体支持物结合，包括使用共价和非共价连接或被动吸收。
也可监控Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的表达。例如，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的表达调节剂可通过使细胞接触测试化合物并测定细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列所编码蛋白的表达来鉴定。细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列编码的蛋白在测试化合物存在情况下的表达水平与蛋白或mRNA在测试化合物缺失情况下的表达水平作比较。然后测试化合物可基于该比较鉴定为Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白表达调节剂。例如，当细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列所编码蛋白的表达在测试化合物存在时统计学高于上或显著高于测试化合物缺失时的表达，所述测试化合物鉴定为细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列所编码蛋白的表达刺激物/增强剂。所述测试化合物可称为Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物（例如激动剂）。
或者，当细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列所编码蛋白的表达在测试化合物存在时统计学上低于或显著低于测试化合物缺失时的表达，所述试化合物鉴定为细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列所编码蛋白表达的抑制剂。所述测试化合物也可称为Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物（例如拮抗剂）。细胞中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2mRNA核酸序列所编码蛋白的表达可通过上述方法测定。
对于结合试验，测试化合物可以是结合并占据Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽或其变体的结合位点的小分子。这可能使配体结合位点对基底不可及从而阻止了正常生物活性。这类小分子的示例包括但不限于小肽或类肽分子。结合试验中，测试化合物或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽可包含可检测标记，例如荧光、放射性同位素、化学发光或酶标记（例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素酶）。然后，检测与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽结合的测试化合物可通过放射性发射直接计数、通过闪烁计数或通过检测合适基底向可检测产物的转化来测定。
检测测试化合物与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的结合能力也可通过实时生物分子相互作用分析（Biamolecular Interaction Analysis）（BIA）[McConnel等，1992，Science257，1906-1912；Sjolander，Urbaniczky，1991，Anal.Chem.63，2338-2345]来实现。BIA是不需要标记任何相互作用物的实时研究生物特异性相互作用的技术（例如BIA-coreTM）。光学现象表面等离子体共振的变化可用于指示生物分子间的实时反应。
为鉴定与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白结合或相互作用的其它蛋白并调节其活性，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽可根据本领域实践的方法用作双杂交试验或三杂交试验中的引诱蛋白（Szabo等，1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5,699-705；美国专利号5,283,317）。双杂交系统基于多数转录因子的模块特性，其由可分离的DNA结合和活化结构域组成。
功能实验。可检测测试化合物提高或降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或其变体活性的能力。活性可在用测试化合物接触纯化的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白、细胞膜制品或完整细胞后检测。使Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的测试化合物鉴定为降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性的潜在试剂，例如拮抗剂。使Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的测试化合物鉴定为提高Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性的潜在试剂，例如激动剂。
治疗和预防
本发明还提供治疗或预防对象中毛发脱落疾病的方法。在一个实施方式中，所述方法包括检测所述对象样品中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因变化的存在，存在所述变化指示毛发脱落疾病，或有毛发脱落疾病倾向，以及对所需对象给予针对毛发脱落疾病的治疗性处理。所述治疗性处理可以是药物给予（例如，包含针对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2核酸的siRNA的药物组合物）。在一个实施方式中，待给予的治疗分子包括Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽，所述多肽包含至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％SEQ ID NO:1、3、5或7的氨基酸序列，并展现出降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白表达的功能。这可恢复在衍生自毛囊或皮肤的细胞中起始毛发生长的能力。在另一个实施方式中，待给予的治疗分子包括含编码多肽的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的核酸序列，所述核酸序列包含至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％SEQ ID NO:2、4、6或8的核酸序列，并编码具有降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白表达功能的多肽，因此恢复了在衍生自毛囊或皮肤的细胞中起始毛发生长的能力。
所述变化可在DNA、RNA或多肽的水平上测定。任选地，检测可通过实施寡核苷酸连接试验、基于确认的试验、杂交试验、测序试验、等位基因特异性扩增试验、微测序试验、熔解曲线分析、变性高效液相色谱（DHPLC）试验（例如参见Jones等，(2000)Hum Genet.,106(6):663-8）、或其组合测定。在另一个实施方式中，通过测序所有或部分Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或选择性杂交或扩增所有或部分Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因来进行检测。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因特异性扩增可在变化鉴定步骤前实施。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因占据的染色体区域中的变化可以是基因座编码和/或非编码区中任何形式的单独或各种组合性的突变、缺失、重排和/或插入。突变可包括点突变。插入可包括在基因座的编码或非编码部分添加一个或多个残基。插入可包括在基因座添加1－50个碱基对。缺失可包括基因座的编码或非编码部分中1、2或更多个残基的任何区域，例如从2个残基高至完整基因或基因座。缺失可影响较小区域，例如少于50个连续碱基对的结构域（内含子）或重复序列或片段，虽然较大缺失也可能出现。重排包括序列颠倒。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因占据的染色体区域中的变化可引起氨基酸取代、RNA剪接或加工、产物不稳定性、终止密码子的产生、移码突变和/或生成截断的多肽。所述变化可引起生成Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽，其具有改变的功能、稳定性、靶向或结构。所述变化还可引起蛋白表达的降低或甚至提高。在一个实施方式中，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因占据的染色体区域中的变化可包括Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或相应表达产物中的点突变、缺失或插入。在另一个实施方式中，所述变化可以是Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的缺失或部分缺失。所述变化可在DNA、RNA或多肽的水平上测定。
在另一个实施方式中，所述方法可包括检测是否存在改变的RNA表达。改变的RNA表达包括存在改变的RNA序列、存在改变的RNA剪接或加工、或存在改变的RNA量。这些可通过本领域已知的各种方法检测，包括测序所有或部分RNA或通过选择性杂交或选择性扩增所有或部分RNA。在另一个实施方式中，所述方法包括检测Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽是否存在改变的表达。改变的多肽表达包括存在改变的多肽序列、存在改变的多肽量、或存在改变的组织分布。这些可通过本领域已知的各种方法检测，包括通过测序和/或结合特异性配体（例如抗体）。
本领域已知的多种方法可用于检测或定量分析改变的基因或RNA表达或核酸序列，所述方法包括但不限于：杂交、测序、扩增、和/或结合特异性配体（例如抗体）。其它合适方法包括等位基因特异性寡核苷酸（ASO）、寡核苷酸连接、等位基因特异性扩增、Southern印迹（用于DNA）、Nouthern印迹（用于RNA）、单链构象分析（SSCA）、PFGE、荧光原位杂交（FISH）、凝胶迁移、钳位变性凝胶电泳、变性HLPC、熔解曲线分析、异源双链体分析、RNA酶保护、化学或酶错配剪切、ELISA、放射免疫试验（RIA）和免疫酶试验（IEMA）。这些方法中的一些（例如SSCA和CGGE）是基于核酸电泳迁移的变化，其作为存在经改变序列的结果。根据这些技术，改变的序列可通过凝胶上的迁移变化而可视化。然后可测序所述片断以确定改变。一些其它方法基于来自所述对象的核酸和对野生型或经改变基因或RNA特异的探针之间的特异性杂交。所述探针可悬浮或固定在基底上。可标记所述探针以促进杂交体检测。这些方法中的一些适于评估多肽序列或表达水平，例如Northern印迹、ELISA和RIA。这些方法中的后者需要使用对多肽特异的配体，例如使用特异性抗体。
测序可使用本领域熟知方法采用自动测序仪实施测序。测序可在完整的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或其特异性结构域中进行，例如已知或猜测带有缺失突变或其它改变的那些。
扩增扩增基于用于起始核酸复制的互补核酸序列间特异性杂交体的形成。扩增可根据本领域已知的各种方法实施，例如聚合酶链反应（PCR）、连接链反应（LCR）、链置换扩增（SDA）和核酸序列依赖性扩增（NASBA）。这些技术可使用市售可得的试剂和实验方案实施。本领域有用的技术包括实时PCR、等位基因特异性PCR或PCR-SSCP。扩增通常要求使用特异性核酸引物来起始反应。用于扩增来自Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或基因座的序列的核酸引物能与侧接所述基因座靶区域的部分Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因座特异性杂交，其中所述靶区域在患有毛发脱落疾病的特定对象中发生改变。在一个实施方式中，扩增可包括使用含有SEQID No.2、4、6或8的核苷酸序列的正向和反向PCR引物。
本发明提供核酸引物，其中所述引物可与患有毛发脱落疾病的某些对象中发生改变的部分Jak1、Jak2、Stat1或Stat2编码序列（例如基因或RNA）互补和特异性杂交。本发明的引物可对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或RNA中改变的序列有特异性。通过使用这类引物，检测扩增产物指示Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因中存在变化或缺失该基因。引物也可用于鉴定位于Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因座中或周围的单核苷酸多态性（SNP）；SNP可包括单核苷酸变化、或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因座中或周围的SNP簇。本发明的引物示例可以是约5-60核苷酸长度或约8-25核苷酸长度的单链核酸分子。所述序列可直接获自Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因序列。完美互补有助于确保高特异性；然而，可容忍某些错配。例如，上述核酸引物或核酸引物对可用于检测对象中存在毛发脱落疾病或其倾向的方法。
扩增方法包括，例如聚合酶链反应、PCR(PCR PROTOCOLS,A GUIDE TOMETHODS AND APPLICATIONS（《PCR实验方案，方法和应用指南》）,Innis编,纽约的学术出版社,1990和PCR STRATEGIES（《PCR策略》）,1995,Innis编,纽约的学术出版社公司（Academic Press,Inc.）、连接酶链反应(LCR)(参见例如，Wu,Genomics4:560,1989;Landegren,Science241:1077,1988;Barringer,Gene89:117,1990)；转录扩增(参见例如，Kwoh,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173,1989)；和自主序列复制(参见例如，Guatelli,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874,1990)；Q Βeta复制酶扩增(参见例如，Smith,J.Clin.Microbiol.35:1477-1491,1997),自动Q Βeta复制酶扩增试验(参见例如，Burg,Mol.Cell.Probes10:257-271,1996)和其它RNA聚链酶介导技术(例如，NASBA，安大略省米西索加市的坎吉公司（Cangene）)；也可参见Berger,Methods Enzymol.152:307-316,1987；Sambrook；Ausubel；美国专利号4,683,195和4,683,202；Sooknanan,Biotechnology13:563-564,1995。本说明书中上述所有参考文献通过引用全文纳入本文。
选择性杂交杂交检测方法基于用于检测核酸序列改变的互补核酸序列间特异性杂交体的形成。检测技术涉及使用对野生型或经改变基因或RNA特异的核酸探针，随后检测杂交体的存在。所述探针可悬浮或固定在基底或支持物上（例如，核酸阵列或芯片技术）。可标记所述探针以促进杂交体检测。例如来自对象的样品可接触对野生型Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或经改变Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因特异的核酸探针，并继而评估杂交体的形成。在一个实施方式中，所述方法包括使样品同时接触一组分别对野生型Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因和其多种改变形式特异的探针。因此，可能直接检测样品中Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因的多种改变形式的存在。同样地，来自多个对象的各种样品可平行处理。
根据本发明，探针可以是与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或RNA（的靶向部分）互补并能特异性杂交的多核苷酸序列，并且其适于检测与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因（或多种基因）的等位基因相关的多核苷酸多态性，所述基因倾向于毛发脱落疾病或与之相关。有用的探针是与Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因、RNA或其靶部分互补的探针。探针可包含长度为8-1000个核苷酸的单链核酸，例如，10-800、15-700、或20-500。也可以使用更长的探针。本发明的有用探针是长为8-500个核苷酸的单链核酸分子，其可与携带改变的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或RNA区域特异性杂交。例如，所述探针可针对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因占据的染色体区域。
所述探针序列可来自本文提供的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因或RNA序列。可进行核苷酸取代以及所述探针的化学修饰。可实现这类化学修饰以提高杂交体稳定性（如嵌入基团）或标记探针。一些标记示例包括但不限于放射性、荧光、发光和酶标记。
核酸杂交的指南可在参见例如：Sambrook编，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》）（第三版），卷1-3，冷泉港实验室（ColdSpring Harbor Laboratory），2001；Current Protocols in Molecular Biology（新编分 子生物实验方案），Ausubel编，纽约的约翰·威利父子出版公司,1997；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:Hybridization with Nucleic Acid Probes（《生物化学和分子生物实验室技术：与核酸探针的杂交》），第一部分，Theory and Nucleic Acid Preparation（《理论和核酸制备》），Tijssen编，纽约的爱思唯尔（Elsevier）,1993。
特异性配体结合
如本文所讨论，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因占据的染色体区域改变或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因表达的改变也可通过筛选Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的序列或表达水平改变来检测。可采用不同类型的配体，例如特异性抗体。在一个实施方式中，所述样品与对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽特异的抗体接触，且然测定免疫复合物形成。可使用检测免疫复合物的多种方法，例如ELISA、放射免疫试验(RIA)和免疫酶试验(IEMA)。
例如，抗体可以是多克隆抗体，单克隆抗体，以及具有基本相同抗原特异性的其片段或衍生物。片段包括Fab、Fab'2或CDR区域。衍生物包括单链抗体、人源化抗体或多功能抗体。对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽特异的抗体可以是选择性结合该多肽的抗体，即，针对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽或其含表位的片段而产生的抗体。虽然会发生对其它抗原的非特异性结合，和靶多肽的结合具有高亲和性并能与非特异性结合可靠区分。在一个实施方式中，所述方法可包括使来自所述对象的样品接触对野生型或改变形式的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽特异的抗体，并测定免疫复合物的存在。可选地，所述样品可接触某一支持物，所述支持物包被有对野生型或改变形式的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽特异的抗体。在一个实施方式中，所述方法可同时或平行或相继接触对Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的不同形式（例如野生型和其各种改变形式）特异的多种抗体。
基因治疗和蛋白取代方法
可使用载体例如病毒载体（例如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒）离体、原位或体内影响核酸向活细胞中的递送或使用物理DNA转移方法（例如脂质体或化学处理）离体影响。适于核酸向哺乳动物细胞中体外转移的非限制性技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀方法（参见例如，Anderson,Nature，卷392附录，6679号，第25-20页(1998)）。引入编码本发明多肽的核酸或基因也可用染色体外基质（瞬时表达）或人工染色体（稳定表达）实现。细胞也可在本发明治疗组合物存在下离体培养以增殖这类细胞或对之产生所需作用或活性。然后能出于治疗目的引入经处理的细胞。
核酸可插入载体并用作基因治疗载体。许多病毒已用作基因转移载体，包括乳头状多瘤空泡病毒，例如SV40(Madzak等，1992)，腺病毒(Berkner，992;Berkner等，1988；Gorziglia和Kapikian，1992；Quantin等，1992；Rosenfeld等，1992；Wilkinson等，1992；Stratford-Perricaudet等，1990)，痘苗病毒(Moss,1992)，腺相关病毒(Muzyczka，1992；Ohi等，1990),包括HSV和EBV的疱疹病毒(Margolskee，1992；Johnson等，1992；Fink等，1992；Breakfield和Geller，1987；Freese等，1990)，和禽类逆转录病毒(Biandyopadhyay和Temin，1984;Petropoulos等，1992)，鼠类逆转录病毒(Miller，1992；Miller等，1985；Sorge等，1984；Mann和Baltimore，1985；Miller等，1988)和人来源逆转录病毒(Shimada等，1991;Helseth等，1990；Page等，1990；Buchschacher和Panganiban，1992)。体内基因转移技术的非限制示例包括用病毒（如逆转录病毒）载体（参见美国专利号5,252,479，其通过引用全文纳入本文）转染和病毒外壳蛋白脂质体介导的转染（Dzau等，Trendsin Biotechnology11:205-210(1993)，其通过引用全文纳入本文）。例如，裸DNA疫苗通常在本领域已知；参见Brower,Nature Biotechnology,16:1304-1305(1998)，其通过引用全文纳入本文。可通过例如静脉内注射、局部给予（参见例如美国专利号5,328,470）或通过立体定位注射（参见例如Chen等,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057）向对象递送基因治疗载体。基因治疗载体的药物制品能包括溶于可接受稀释剂的基因治疗载体，或可包括缓释基质，其中包埋基因递送载剂。或者，可从重组细胞完整地产生全部基因递送载体时，例如逆转录病毒载体，所述药物制品可包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。
关于基因治疗实验方案和方法的综述可参见Anderson等，Science256:808-813(1992);美国专利号5,252,479,5,747,469,6,017,524,6,143,290,6,410,0106,511,847；美国申请公开号2002/007731和2002/00069，其都通过引用全文纳入本文。关于基因治疗技术的其它综述参见Friedmann,Science,244:1275-1281(1989);Verma,Scientific American:68-84(1990);Miller,Nature,357:455-460(1992);Kikuchi等，JDermatol Sci.2008年5月;50(2):87-98;Isaka等,Expert Opin Drug Deliv.2007年9月;4(5):561-71;Jager等,Curr Gene Ther.2007年8月;7(4):272-83;Waehler等,NatRev Genet.2007年8月;8(8):573-87;Jensen等,Ann Med.2007;39(2):108-15;Herweijer等,Gene Ther.2007年1月;14(2):99-107;Eliyahu等,Molecules,2005年1月31日;10(1):34-64;以及Altaras等,Adv Biochem Eng Biotechnol.2005;99:193-260，其都通过引用全文纳入本文。
蛋白取代治疗可通过输注方法外源性引入野生型或生物功能蛋白来提高蛋白量。取代多肽可根据已知化学技术合成或可通过已知分子生物技术产生或纯化。蛋白取代治疗已就多种疾病中开发。例如，野生型蛋白可从重组细胞表达系统（如哺乳动物细胞或昆虫细胞，参见Desnick等的美国专利号5,580,757；Selden等的美国专利号6,395,884和6,458,574；Calhoun等的美国专利号6,461,609；Miyamura等的美国专利号6,210,666；Selden等的美国专利号6,083,725；Rasmussen等的美国专利号6,451,600；Rasmussen等的美国专利号5,236,838和Ginns的美国专利号5,879,680）、人胎盘、或动物乳汁（参见Reuser等的美国专利号6,188,045）或其它本领域已知来源中纯化。输注后，外源蛋白可通过非特异性或受体介导的机理由组织摄取。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因编码的多肽也可在控释系统中递送。例如，所述多肽可使用静脉输注、植入式渗透泵、透皮贴片、脂质体或其它给予模式给予。在一个实施方式中，可使用泵(参见Langer,同上;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987);Buchwald等,Surgery88:507(1980);Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574(1989)。在另一实施方式中，可使用多聚物质（参见Medical Applications ofControlled Release（《控释的药物应用》）,Langer和Wise(编),佛罗里达州波卡拉顿的CRC出版社（CRC Pres.）,(1974);Controlled Drug Bioavailability,DrugProduct Design and Performance（《受控药物的生物利用度，药物产品设计和性能》）,Smolen和Ball(编),纽约的威利出版公司（Wiley）,(1984);Ranger和Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);也参见Levy等,Science228:190(1985);During等,Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等,J.Neurosurg.71:105(1989)）。在另一实施方式中，可将控释系统放置于治疗靶点附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release(《控释的医学应用》)，第2卷，第115-138页(1984))。其它控释系统在Langer的综述（Science249:1527-1533(1990)）中有论述。
用于治疗的药物组合物和给予
本发明的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白和Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可向对象给予一次（如，作为单次给予或沉积）。或者，Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白和Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可向需要的对象一天给予一次或两次，所述给予段为约2-约28天，或约7-约10天。Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白和Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物也可向对象一天给予一次或两次，所述给予段为每年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次或其组合。另外，本发明的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白和Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可与其它治疗共同给予。当给药方案包括多次给予时，给予所述对象的有效量Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可包括整个给药方案中所给予的基因产物总量。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可通过适于向所述对象细胞（例如真皮、表皮、真皮乳头细胞或毛囊细胞）递送Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物的任何方法给予所述对象。例如，本发明的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白和Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物可通过适于转染细胞的方法给予。真核细胞的转染方法为本领域熟知，且包括直接将核酸注入细胞的核或者原核，电穿孔，脂质体转移或亲脂性材料介导的转移，受体介导的核酸递送，生物射弹或颗粒加速，磷酸钙沉淀或病毒载体介导的转染。
可配制并给予本发明组合物通过使活性组分与对象（例如人或动物（例如狗、猫或马））身体中试剂作用位点接触的任何方法来减少与毛发脱落疾病相关的症状。其能通过任何可与药物（作为单独治疗活性成分或与治疗活性成分组合）联用的常规方法给予。其可单独给予，但通常与基于选定给予途径和标准药学实践选择的药物载体共同给予。
Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物的治疗有效剂量可取决于本领域普通技术人员已知的许多因素。可改变Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物剂量，例如，取决于所处理对象或样品的特性、尺寸和条件，进一步取决于所述组合物待给予的途径（如果适用），以及实践人员需要Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物对本发明核酸或多肽具有的作用。技术人员可容易地确定这些量。本文所述的任何治疗应用可用于任何需要该治疗的对象中，包括例如哺乳动物，如狗、猫、牛、马、兔、猴、猪、绵羊、山羊或人。
可以使用一种或多种生理上可接受的运载体或赋形剂，以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。本发明的治疗组合物可配制用于多种给予途径，包括全身或局部或局限性给予。技术和配方通常可参见Remmington's Pharmaceutical Sciences（《雷明顿药物科学》）,宾夕法尼亚州伊斯顿的米德出版公司（MeadePublishing Co.）,(第20版,2000)，其全部公开内容通过引用纳入本文。对于全身给予，注射很有用，包括肌内、静脉内、腹膜内、皮下注射。就注射而言，本发明的治疗组合物可配制在液体溶液中，例如生理相容性缓冲液，如汉克斯（Hank’s）溶液或林格（Ringer’s）溶液。另外，治疗组合物可以固体形式配制并在临用前再次溶解或悬浮。也包括冻干形式。本发明药物组合物的特征是至少无菌且无热源。这些药物制剂包括人用和兽用的制剂。
根据本发明，药学上可接受的运载体可包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。就药学活性物质使用这种介质和试剂为本领域熟知。可使用任何与所述活性化合物相容的常规介质或试剂。补充的活性化合物也可纳入所述组合物。
本发明还提供包含药学上可接受运载体和用本发明筛选试验鉴定的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物的试剂盒，其中还装有使用说明书。对于作为Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性拮抗剂的调节剂，或降低Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白表达的调节剂，说明书应详细说明所述药物组合物用途以促进哺乳动物体表（例如，手臂、腿、比基尼区域、脸）的毛发脱落。
对于作为Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白活性激动剂的调节剂，或提高Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码一种或多种蛋白表达的调节剂，说明书应详细说明所述药物组合物用途以调节毛发生长。在一个实施方式中，说明书应详细说明所述药物组合物用途以治疗毛发脱落疾病。在另一个实施方式中，说明书应详细说明所述药物组合物用途以恢复毛发色素。例如，给予激动剂可减少对象中的毛发变灰。
含有Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物的药物组合物可就本文所述的任何治疗效果与药学上可接受运载体联合给予。这类药物组合物可包含例如，针对基因所编码多肽及其变体的抗体，所述基因含有Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因，或Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码多肽的激动剂和拮抗剂。可单独给予该组合物或与至少一种其它药剂如稳定化合物联合给予，其能利用任何无菌的生物相容性药物运载体给予，所述药物运载体包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。该组合物可单独给予患者或与其它试剂、药物或激素联合给予。
可将所需量的Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物（如多肽或抗体）和一种本文所述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂然后过滤灭菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性化合物掺入含有碱性分散介质和本文所述其它所需成分的无菌载剂中来制备分散液。在用于制备无菌注射液制备的无菌粉末情况中，有用的制备方法示例是真空干燥和冷冻干燥，由其之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
在一些实施方式中，可通过透皮递送系统应用Jak1、Jak2、Stat1或Stat2调节化合物，所述系统缓慢释放用于经皮吸收的活性化合物。可使用渗透增强剂促进条件培养基中活性因子的透皮渗透。透皮贴片描述于例如美国专利号5,407,713;美国专利号5,352,456;美国专利号5,332,213;美国专利号5,336,168;美国专利号5,290,561;U美国专利号5,254,346;美国专利号5,164,189;美国专利号5,163,899;美国专利号5,088,977;美国专利号5,087,240;美国专利号5,008,110;和美国专利号4,921,475。
可采用各种给药途径和各种细胞植入位点，例如皮下或肌内，以将细胞集群引入优选位点。一旦植入对象（如小鼠、大鼠或人），聚集的细胞可随后刺激导入位点的毛囊形成并继而刺激毛发结构生长。在另一实施方式中，转染的细胞（如，表达Jak1、Jak2、Stat1或Stat2基因所编码蛋白的细胞）植入对象以促进对象中的毛囊形成。在其他实施方式中，转染的细胞是源自毛囊终球的细胞（如真皮乳头细胞或真皮鞘细胞）。维持1次或更多传代的聚集细胞（如悬滴培养物中生长的细胞）或转染细胞（如根据本文所述产生的细胞）可引入（或植入）对象（例大鼠、小鼠、狗、猫、人等）中。
“皮下”给予可指刚好在皮肤下方（即真皮下方）给予。通常，皮下组织是一层脂肪和容纳大血管及神经的结缔组织。这层组织的大小在全身中变化且因人而异。皮下和肌肉层间的界面可由皮下给予而涵盖。
当皮下层足够薄以至所述组合物中存在的因子可从给予位点迁移或扩散并接触负责毛发形成的毛囊细胞时，该给予模式是可行的。因此，采用皮内给予时，在紧邻皮下层的位置推注所给予的组合物。
给予细胞聚集体（如DP或DS聚集体）不局限于单种途径，而可包含多种途径的给予。例如，多种途径的示例性给予包括皮内和肌内给予，或皮内和皮下给予的组合。多种给予可以是依序或同时给予。通过多途径的其它应用模式对于技术人员是显而易见的。
在其它实施方式中，该植入方法就一些对象而言是一次处理。在本发明其它实施方式中，需要多次细胞治疗植入。在一些实施方式中，用于植入的细胞通常是对象特异性遗传工程改造细胞。在另一实施方式中，可使用从不同种类或相同种类的另一个体获得的细胞。因此，使用这类细胞可能需要给予免疫抑制剂以防止植入细胞的排斥。这类方法也描述于美国专利申请公开2004/0057937和PCT申请公开号WO2001/32840，且通过引用纳入本文。
抑制剂
生成细胞因子来活化相邻细胞以向其它细胞传递危险信号并扩散和扩大炎症反应。多年来，已知如何既用封闭抗体中和这些细胞因子又通过小分子蛋白酪氨酸激酶抑制剂来抑制其响应细胞中的信号转导。存在用于这两种方法的FDA批准药物，例如IL-2和TNF封闭抗体和阻断细胞因子信号转导的口服使用小分子GleevecTM。只要有可能，所述中心会致力于局部小分子制剂，所述制剂应改进功效而同时限制全身毒性（改进的治疗指数），其促进生物制药流水线中AA的其它小分子抑制剂的临床评估。
为阻断细胞因子受体的信号转导，可使用局部/口服JAK1/2抑制剂（因赛特），其已证实在银屑病和RA患者中具有安全性和有效性。
所述抑制剂可包含多肽（如抗体或其片段）、小分子、核酸（如siRNA或反义RNA）、或可与感兴趣基因编码的多肽分子结合的其它试剂和/或对感兴趣蛋白的生物活性或其表达具有抑制作用的分子。
如本文所用，“Jak1抑制剂”指与Jak1基因或Jak1蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或表达的化合物。所述化合物可降低Jak1编码的蛋白的活性或表达。
在一个实施方式中，Jak1抑制剂可以是与含有SEQ ID NO:1的蛋白结合的多肽片段。例如，所述片段可包含SEQ ID NO:1中至少约8个连续氨基酸的任何部分。所述片段可包括SEQ ID NO:1中至少约10个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸或至少约75个连续氨基酸。片段包括约8-约100个氨基酸的所有可能氨基酸长度，例如约10-约100个氨基酸、约15-约100个氨基酸、约20-约100个氨基酸、约35-约100个氨基酸、约40-约100个氨基酸、约50-约100个氨基酸、约70-约100个氨基酸、约75-约100个氨基酸或约80-约100个氨基酸的长度。这些肽片段可以市售获得或通过液相或固相合成方法合成获得（Atherton等，(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach（《固相肽合成：实践方法》）.英国牛津的IRL出版社）。
如本文所用，“Jak2抑制剂”指与Jak2基因或Jak2蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或表达的化合物。所述化合物可降低Jak2编码的蛋白的活性或表达。
在一个实施方式中，Jak2抑制剂可以是与含有SEQ ID NO:3的蛋白结合的多肽片段。例如，所述片段可包含SEQ ID NO:3中至少8个连续氨基酸的任何部分。所述片段可包括SEQ ID NO:3中至少约10个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸或至少约75个连续氨基酸。片段包括约8-约100个氨基酸的所有可能氨基酸长度，例如约10-约100个氨基酸、约15-约100个氨基酸、约20-约100个氨基酸、约35-约100个氨基酸、约40-约100个氨基酸、约50-约100个氨基酸、约70-约100个氨基酸、约75-约100个氨基酸或约80-约100个氨基酸的长度。这些肽片段可以市售获得或通过液相或固相合成方法合成获得（Atherton等，(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach（《固相肽合成：实践方法》）.英国牛津的IRL出版社）。
如本文所用，“Stat1抑制剂”指与Stat1基因或Stat1蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或表达的化合物。所述化合物可降低Stat1编码的蛋白的活性或表达。
在一个实施方式中，Stat1抑制剂可以是与含有SEQ ID NO:5的蛋白结合的多肽片段。例如，所述片段可包含SEQ ID NO:5中至少8个连续氨基酸的任何部分。所述片段可包括SEQ ID NO:5中至少约10个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸或至少约75个连续氨基酸。片段包括约8-约100个氨基酸的所有可能氨基酸长度，例如约10-约100个氨基酸、约15-约100个氨基酸、约20=约100个氨基酸、约35-约100个氨基酸、约40-约100个氨基酸、约50-约100个氨基酸、约70-约100个氨基酸、约75-约100个氨基酸或约80-约100个氨基酸的长度。这些肽片段可以市售获得或通过液相或固相合成方法合成获得（Atherton等，(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach（《固相肽合成：实践方法》）.英国牛津的IRL出版社）。
如本文所用，“Stat2抑制剂”指与Stat2基因或Stat2蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或表达的化合物。所述化合物可降低Stat2编码的蛋白的活性或表达。
在一个实施方式中，Stat2抑制剂可以是与含有SEQ ID NO:7的蛋白结合的多肽片段。例如，所述片段可包含SEQ ID NO:7中至少8个连续氨基酸的任何部分。所述片段可包括SEQ ID NO:7中至少约10个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸或至少约75个连续氨基酸。片段包括约8-约100个氨基酸的所有可能氨基酸长度，例如约10-约100个氨基酸、约15-约100个氨基酸、约20-约100个氨基酸、约35-约100个氨基酸、约40-约100个氨基酸、约50-约100个氨基酸、约70-约100个氨基酸、约75-约100个氨基酸或约80-约100个氨基酸的长度。这些肽片段可以市售获得或通过液相或固相合成方法合成获得（Atherton等，(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach（《固相肽合成：实践方法》）.英国牛津的IRL出版社）。
如本文所用，“Jak/Stat抑制剂”指与Jak1/Jak2/Stat1/Stat2基因或Jak1/Jak2/Stat1/Stat2蛋白或多肽相互作用并抑制其活性和/或表达的化合物。所述化合物可降低Jak1/Jak2/Stat1/Stat2编码的蛋白的活性或表达。
本发明抑制剂可以是蛋白，例如针对SEQ ID NO:1、3、5或7所编码多肽的抗体（单克隆、多克隆、人源化、嵌合或全人抗体）、或其结合片段。抗体片段还可以是全长形式以外的抗体形式，并且除了经工程改造的抗体片段还包括全长抗体中存在的部分或组分。抗体片段可包括但不限于，单链Fv（scFv）、双抗体、Fv和(Fab′)2、三抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、四抗体、双功能杂交抗体、构架区、恒定区等（参见Maynard等，(2000)Ann.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402）。抗体可市售获得、定制生成或根据本领域已建立的方法针对感兴趣抗原合成（Janeway等，(2001)Immunobiology（《免疫学》）第5版，加兰出版公司（Garland Publishing））。
本发明抑制剂也可以是结合于蛋白并破环其功能的小分子。小分子是通常具有低分子量的一组多样的合成和天然物质。它们可从天然来源（例如植物、真菌、微生物等）中分离，市售获得和/或作为库或集合可得，或合成。调节蛋白的候选小分子可通过计算机模拟筛选或高通量（HTP）筛选组合文库来鉴定。大多数传统药物（例如阿司匹林、青霉素和许多化疗）是小分子，可市售获得，可化学合成或可从随机或组合文库中获得（Werner等，(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic5(1):32-6）。在一些实施方式中，所述试剂是与靶蛋白或RNA结合、相互作用或相关联的小分子。该小分子可以是有机分子，当靶标是胞内靶标时，该有机分子能穿透细胞脂双层与靶标相互作用。小分子包括但不限于毒素、螯合剂、金属和准金属化合物。小分子可连接或偶联于靶向试剂从而特异性引导所述小分子至特定细胞。
用于治疗的药物组合物和给予
本发明抑制剂或激动剂可掺入适于给予的药物组合物，例如抑制剂和药学上可接受的运载体。
根据本发明，药学上可接受的运载体能包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。就药学活性物质使用这种介质和试剂为本领域熟知。可使用与所述活性化合物相容的任何常规介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。
本文所述的任何治疗应用可用于任何需要该治疗的对象中，包括例如哺乳动物，如狗、猫、牛、马、兔、猴、猪、绵羊、山羊或人。
可就本文所述的任何治疗效果将本发明药物组合物与药学上可接受运载体联合给予。这类药物组合物可包括，例如针对多肽的抗体。可单独给予该组合物或与至少一种其它药剂如稳定化合物联合给予，其可利用任何无菌的生物相容性药物运载体给予，所述药物运载体包括但不限于：盐水、缓冲盐水、右旋糖和水。该组合物可单独给予患者或与其它试剂、药物或激素联合给予。
本发明的药物组合物配制为与其预期的给予途径相容。给予途径的示例包括胃肠道外给予，例如，静脉内、皮内、皮下、口服（如吸入）、透皮（局部）、经粘膜和直肠给予。用于胃肠道外、皮内或皮下应用的溶液或悬液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给予，合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛EMTM（(BASF，新泽西州帕西潘尼）或磷酸缓冲盐水（PBS）。所有情况下，所述组合物必须无菌，并应该是达到存在易注射性(easy syringability)程度的流体。它在制造和贮存的条件下必须是稳定的并且必须保存抵御微生物如细菌和真菌的污染作用。所述运载体可以是包含例如水、乙醇、药学上可接受多元醇（例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇）及其合适混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂覆材料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现防止微生物的作用。在许多情况下，组合物中可有用地包含等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶能延长可注射组合物的吸收。
可将所需量的本发明抑制剂（如多肽或抗体或小分子）或激动剂和一种本文所述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂然后过滤除菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性化合物掺入含有碱性分散介质和本文所述其它所需成分的无菌载剂中来制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉末情况中，有用的制备方法示例是真空干燥和冷冻干燥，由其之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用运载体。它们可包封在凝胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗给药目的，所述活性化合物可用赋形剂掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用液体运载体制备以用作漱口水，其中液体运载体中的所述化合物口服使用以及冲刷并吐出或吞咽。
药学上可相容的结合剂和/或佐剂物质可作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶和明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，崩解剂例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或sterote；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂。
也可通过经粘膜或透皮方法全身给予。就经粘膜或透皮给予而言，在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。该渗透剂通常为本领域已知，并包括例如用于经粘膜给予的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给予可通过使用鼻喷雾或栓剂实现。对于透皮给予，所述活性化合物配制在药膏、软膏、凝胶或霜剂中，如本领域通常已知。
***
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了示例性方法和材料。
本领域技术人员应了解或能仅采用常规实验来确定本文所述具体材料和方法的许多等同形式。应认为该等同形式在本发明的范围内且由下述权利要求涵盖。
本文提到的所有发表物和其它参考文献通过引用全文纳入本文，就好像各单独发表物或参考文献特定和单独表明通过引用纳入。并非承认本文引用的发表物和参考文献为在先技术。
实施例
提供以下实施例以便于更完整理解本发明。以下实施例表明了制备和实施本发明的示例性模式。然而，本发明范围不限于这些实施例所公开的具体实施方式，其仅用于说明目的，因为可用替代性方法获得相似结果。
实施例1
已显示干扰素γ是鼠AA中的靶标（参见Nakamura等，2008,Am J Pathol,172(3):650-658;也可参见Freyschmidt-Paul等，Br J Dermatol.,155(3):515-521;也参见Gilhar等，Journal Invest.Dermatol.,124(1):288-289）。在人AA中，AA PBMC显示Th1倾向，AA皮肤显示IFN特征和GWAS基因（SOCS/IFN-g/）。IL-2/6/13/21/26也是。
干扰素γ通路（图7）在靶HF细胞中诱导NKG2DL，通过DC增强抗原呈递，促进Th1细胞自身免疫以及增强NK和CTL介导的细胞裂解。
临床开发中的JAK1/2抑制剂包括a)INCB018424，局部或口服；5nM活性（因赛特）；b)CEP-701（瑟法隆）；和c)TG101348。
表1.INCB18424-203:以降序排列治疗引发不良事件（所有伤亡）（口服递送视为可接受的概况）
AA临床项目包括以下内容：
轻中度AA：2/3期银屑病和口腔3期骨髓纤维变性，使用局部JAK抑制剂。
群组评估国家斑秃登记处（National Alopecia Areata Registry）确定的病例对比纽约市癌症项目（New York City Cancer project）确定的对照。使用AIMS将其与北欧血统的人配对。
病例：n=1080(全身脱毛=482;全秃=120;短暂性斑秃=176;局部（Patchy）斑秃=302)
对照：n=1053
图9显示AA全基因组关联研究（GWAS）。
表2：涉及AA的基因列表。
Figure BDA00003444511500702
表3：皮肤自身免疫疾病的共同病因模型。也参见http://www.genome.gov/gwastudies(银屑病)和Jin等，2010,NEJM,362:1686-1697。
Figure BDA00003444511500711
表4：其他自身免疫疾病的共同病因模型。也参见http://www.genome.gov/gwastudies(银屑病)和Jin等，2010,NEJM,362:1686-1697。
Figure BDA00003444511500721
表5：涉及AA的基因列表。黑色圈表示影响NKG2D的基因；灰色圈表示影响T细胞调节的基因；带有星号的黑色圈表示影响末梢器官的基因
包括靶器官中NK配体在内的其它自身免疫疾病常规通路包括以下内容：
RA中，滑膜细胞异常表达MIC配体，导致自体反应性T细胞刺激。
乳糜泻中，MIC配体在活性疾病期间的肠上皮中过度表达。
1型糖尿病中，前驱糖尿病NOD小鼠中的岛细胞表达RAE-1配体。
遗传倾向个体中NK活化配体的异常表达可诱导或恶化疾病。
AA中表现治疗新机遇的候选通路包括以下内容：
共刺激受体家族成员，对T细胞活化有互补作用，且其平衡调控免疫和自身免疫应答的总体结果。
增强NK细胞毒性应答的基因；触发T细胞产生促炎细胞因子；和诱导CD4(+)T细胞分化成Th17细胞。
通过控制调节性T（Treg）细胞存活或增殖在调节适应性免疫系统中起关键作用的基因，其为维持免疫耐受所需。
自然杀伤（NK）细胞、NK1.1(+)T细胞和T细胞上表达的活化配体。NKG2D配体包括MHC I类链相关的(MIC)A,MICB。
治疗AA的候选化合物包括针对Jak/Stat信号转导的化合物，如Ivanenkov等，Mini Rev Med Chem.2011年1月;11(1):55-78所述，其通过引用全文纳入本实施例 2。
实施以下遗传研究：
用另1000名AA患者的重复研究
对候选区域深度测序
收集10,000名患者
T1D、CeO和AA常见遗传研究
使用NK活化配体的免疫研究通过用ULBP3、ULBP6-诱导型转基因、新小鼠模型实施。
Figure BDA00003444511500731
表6：GWAS研究中具有标称显著性的基因
Figure BDA00003444511500741
表7：标称基因的通路分析（参见http://david.abcc.ncifcrf.gov/）
实施例3-研究样品、基因分型、质量控制以及人群分层
在美国，斑秃（AA）是主要的医学问题并且是最普遍的自身免疫疾病（表8），影响大约460万人口，包括所种族的男性和女性，终生风险为1.7%（Kyriakis KP,Paltatzidou K,Kosma E,Sofouri E,Tadros A,Rachioti E.Alopecia areata prevalenceby gender and age（通过性别和年龄的斑秃流行性）J Eur Acad Dermatol Venereol.23:572-3,2009）。另外，AA代表人毛发脱落的第二最常见形式，仅次于雄激素性秃发，并引起明显的外形缺陷和所影响个体的心理困扰（图1）。AA影响的个体多于大部分其它自身免疫疾病的总和，包括红斑狼疮（LE）、1型糖尿病（T1D）、银屑病、多发性硬化（MS）和类风湿性关节炎（RA）（表8）。
表8.自身免疫疾病流行性
Figure BDA00003444511500742
与这些其它病症形成鲜明对比的是，AA的发病机制和创新疗法的开发远远滞后。这可能部分归因于认为AA仅仅是美容病症。事实上，AA带来所有皮肤疾病中最大的负担之一，特别是在自我形象与外貌紧密相关的儿童和青少年中（BickersDR,Lim HW,Margolis D,Weinstock MA,Goodman C,Faulkner E,Gould C,GemmenE,Dall T;美国皮肤病学协会（American Academy of Dermatology Association）；皮肤病学研究学会（Society for Investigative Dermatology）。The burden of skin diseases:2004a joint project of the American Academy of Dermatology Association and theSociety for Investigative Dermatology（《皮肤疾病的负担：美国皮肤病学协会和皮肤病学研究学会2004合作项目》），J Am Acad Dermatol.55:490-5,2006）。
尽管AA有高流行性，仍没有基于证据的AA治疗方法。涉及总共540名参与者的17个随机临床试验（RCT）的综合性询证医学分析评估没有发现证实的AA治疗方法（Delamere FM,Sladden MM,Dobbins HM,Leonardi-Bee J.Interventions foralopecia areata（斑秃的干预），Cochrane Database Syst Rev.2:CD004413,2008）。每个试验包括6-85名参与者并评价一定范围的干预，所述干预包括局部和口服皮质类固醇、局部环孢菌素、光动力疗法和局部米诺地尔。总之，相比安慰剂没有所述干预显示涉及毛发生长的显著治疗益处。结论是，很少（如果有）AA治疗方法证明是有效的。使用二苯莎莫酮、二硝基氯苯、病损内皮质类固醇或蒽三酚没有发现RCT，虽然这些药已普遍用于治疗AA。相似地，虽然局部皮质类固醇和米诺地尔被广泛处方且似乎很安全，仍然没有说服性的证据表明它们是长期有益的。大多数试验是未充分报告且/或很小以至于任何重要临床益处都是非结论性的。这些观察强调了限定AA遗传基础和确定发病机制的重要性，从而可开发合理的治疗方法并可开始转化研究。
斑秃中Jak/Stat靶向的临床前评价
NKG2D受体（NKG2D）具有消除细胞发出危险信号的功能且此识别过程的调节异常经常导致自身免疫的发展。将追踪JAK和NF-kb抑制影响，其中，不受理论的约束，NKG2DL表达在转录水平受到抑制。INCB18424是一种JAK1/JAK2抑制剂（口服/局部），处于骨髓增殖性/骨髓纤维化疾病和银屑病的II期临床试验中。
表9：Jak1/Jak2的小分子抑制剂
Figure BDA00003444511500751
Figure BDA00003444511500761
GWAS研究揭示了许多与其它自身免疫形式共有的风险基因座，例如类风湿性关节炎（RA）、I型糖尿病（T1D）、乳糜泻（CeD）、全身性红斑狼疮（SLE）、多发性硬化（MS）和银屑病（PS），尤其是CTLA-4、IL2/IL2RA、IL21和对维持Treg关键的基因。
AA遗传基础提供了基于AA潜在机理的疗法的探究途径。该疗法不仅聚焦于T细胞亚组和其它自身免疫形式共有的机制，且而聚焦于涉及Jak1/Jak2信号转导通路和下游效应子的独特机理。
AA自身免疫的源头可能存在于毛囊本身。本文的研究聚焦于定义毛囊中推定的危险信号，所述信号作用于AA的发病机理。也鉴定可能引起免疫调节异的位于MHC中的致病性等位基因。这可能部分归因于抗原递呈细胞（APC）在递呈作为对免疫系统新抗原的危险信号中的重要性。
将研究Jak1/Jak2信号转导机理，以及评价Jak1/Jak2/Stat1/Stat2相互作用作为诱导疾病的驱动因素的重要性。寻求干扰Jak1/Jak2/Stat1/Stat2信号转导的药理学方法。
保护C3H IFN-γ缺陷型小鼠免于AA发展。已显示，IFN能在经培养的人真皮角质形成细胞和成纤维细胞细胞中上调NKG2DL。进一步NKG2D交联通过固有的NK、NKT和γδT细胞诱导IFN-γ生成，因此产生可能的积极反馈环，驱动适应性自身反应免疫。因此过继转移和抗体消耗/阻断实验会确定涉及的带有NKG2D的细胞。
旨在干扰CD8NKG2D轴的药理学干预将接受检测。用上调NKG2DL或活化带有NKG2D的细胞进行干扰都是要寻求的合理方法。已显示IFN→JAK/STAT通路可诱导NKG2DL表达。
将评估IFN→JAK/STAT通路是否对正常和患病皮肤中诱导NKG2DL有关键作用。IFN JAK/STAT信号转导通路可通过局部JAK1/JAK2抑制剂来有效抑制，包括在银屑病中取得早期临床成功的试剂。如果I型干扰素响应是NKG2D配体上调的基础，JAK1/JAK2抑制剂可阻断该诱导，以及阻断适应性免疫应答的IFN-γ依赖性组分。
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实施例4
斑秃（AA）潜在的特异性自身免疫机理仍然不清楚，因此AA的临床研究历来滞后于其它自身免疫疾病。尽管大量新型生物疗法可用于临床评价自身免疫，仅病损内或全身性类固醇仍为护理标准且过去的十年间仅公开过两个随机小临床试验。由发现GWAS基因获取的见解为缩小差距提供路线图，这是通过就机理和治疗相关性来研究GWAS鉴定的免疫学通路。
在斑秃小鼠模型中鉴定有效、临床相关的疗法。正常状态中，毛囊（HF）代表一种免疫赦免（IP）保护区，其表达很少或不表达经典HLA I类分子。活性AA中，IP状态丧失，因为HLA I类分子表达和NKG2D配体表达显著上调。考虑到NKG2D配体基因座和人AA的强烈遗传相关性，不受理论限制，NKG2DL异常上调和NKG2D对免疫受体细胞的持续活化驱使AA发作并发展。不受理论限制，就乳糜泻而言的AA中，IL-I5驱动CD8T细胞效应物分化，使之具有混杂的“NK型”CD8细胞毒性。事实上，局部HF IL-15/NKG2DL炎症信号伴随着表达NK标记物的CD8+T细胞的密集浸润，如同负责产生IFNγ和HF细胞毒性的关键AA免疫效应物。在人和小鼠中完成的这些整体观察中允许疗效评价。
通过用相关细胞因子IFN-γ和相关免疫受体信号转导通路（NKG2D）干扰来阻断NK样重编程和细胞毒性的治疗可能。使用脱毛移植模型，其中所有经移植的C3H小鼠在12周内及时发展AA。这显著促进药物筛选，因为考虑到发作迟缓（＞6月龄）和较低的累积发病率，在C3H/HeJ中评价自发疾病的预防/反转是不切实际的。评价具有潜在局部递送优点的小分子方法和具有优良生物特异性的生物治疗蛋白（抗体）。总目标是使用生物疗法建立可能由更多临床可维持、小分子局部方法靶向的关键免疫通路。
鉴定C3H小鼠中疾病相关性AA生物标记物和其用有效疗法的逆转例如，使用GWAS和转录概况分析的方法以及对T细胞子集使用免疫染色和FAC的方法已用于例如鉴定AA小鼠皮肤和血液中数种致病性AA生物标记物。这些小鼠研究会继续了解发展人AA中翻译生物标记物平台。皮肤中，脱毛C3H/Hej小鼠中的研究证实IFN诱导基因被显著上调，包括趋化因子CXCL9-11，其似乎负责征集产生IFNγ的带有CXCR3+NKG2D的HF相关CD8T效应物的密集浸润。谱型数据提供有力证据显示这些循环NKG2D+CD8T效应物是真正的自身抗原驱动效应T细胞，这些细胞随着疾病发展增加。短暂评价处理期间小鼠中的这些血清学、皮肤和细胞生物标记物能鉴定动态、机理上重要、预知的炎症生物标记物以预测治疗结果以及了解临床生物标记物的发现/利用。
使用AA人组织离体临床前检验靶向方法为促进证实AA小鼠模型中“概念验证”的临床治疗发展，使用人AA组织来进行靶标检测和相关性研究。“爬出（crawl-outs）”系统提供一种简便的离体人生物试验来验证逆转小鼠AA的试剂可转换到人中，有效抑制人AA T细胞存活/增殖/功能。
正如来自数千名脱发对象的人DNA提供GWAS基因和对人疾病的独特观点，来自AA对象的人组织、血液和皮肤将用于持续研究这些遗传相关的免疫通路，最终用于治疗用途。概念上，人们寻求的斑秃小鼠模型提供了用于斑秃治疗方法的临床前测试基础。
在美国自身免疫疫疾病影响了估计2300万个体（1），并且虽然没有建立AA流行性，但它是最普遍的自身免疫疾病（2，3）。1999-2000中，估计有240万例关于AA的就诊，其中半数为二十几岁和三十几岁的患者。AA对受影响个体引起明显外观缺陷和心理困扰，并且带来所有皮肤疾病中最大的负担之一，特别是在自我形象与其外貌紧密相关的儿童和青少年中（4）。目前，AA预后是不可预测的且没有确定的治疗。现有疗法包括类固醇和局部免疫疗法，且仅在三分之一的患者中诱导持续缓解（5，6）。尽管其存在高流行性，综合性询证医学分析的结论是没有基于证据的AA治疗方法。
与其它自身免疫情况形成鲜明对比，对AA的发病机制和创新疗法的发展远远滞后。在靶向免疫治疗时代，仅报道过两个评价AA中蛋白生物疗法的临床研究（8，9）（都靶向T细胞运输）。这部分归因于对特异性AA免疫通路的有限了解，所述了解会促进对合理治疗方法的快速评价。基于对AA遗传和致病性基础的全新了解，将得到促进该疾病合理治疗方法的临床评价的临床前概念验证数据。
GWAS（10）研究揭示了许多与其它自身免疫形式共有的风险基因座，例如RA、（T1D）、乳糜泻（CeD）、SLE、MS和PS，尤其是CTLA-4、IL2/IL2RA、IL21、NKG2D配体和对Treg功能关键的基因（Eos）。RA、T1D和CeD的遗传共性尤其值得注意，这是鉴于末梢器官（滑膜、岛、肠道和皮肤）中NK配体表达的致病显著性，以及各三种疾病的发病机理中涉及NKG2DL/NKG2D通路（11，14）。皮肤免疫治疗研究的一个优势是相对容易接近靶器官。因此，本文检测皮肤的研究可提供关于NKG2D和IL-15引发的CD8毒性、IFN引发的损伤等重要认识，其对理解这些其它相关人类疾病（其总靶器官不可及）产生影响。实际上，对这些具有共同病因的自身免疫疾病中任一种疾病的积极研究都可作为常规治疗的基础。
AA潜在的特殊自身免疫机理仍不清楚，其超出了普遍观点，即由T细胞介导对毛囊攻击所引起。正常状态下，毛囊代表一种免疫赦免（IP）保护区（15-17），其表达很少或不表达经典HLA I类分子，且相反表达抑制性HLA配体HLA-E和HLA-G，因此同时避免被I类限制性CD8细胞免疫识别而负调控NK细胞，其可能另外对“失去自我（missing self）”做出反应（16,18-21）。活性AA中，正常毛囊的IP状态失效，因为HLA I类表达显著上调。之前的研究已注意到CD4和CD8T细胞都围绕小鼠和人斑秃皮肤区中的毛囊浸润（22，23）。实际上是总体T细胞而非B细胞或血清的转移可将疾病从脱毛小鼠或人转移至正常WT（24）或SCID小鼠（25），这表明效应T细胞为致病性细胞。然而之前没有鉴定位点特异性炎症的分子介导物。通过GWAS发现和之前免疫生物研究的引导，提供关于常见自身免疫疾病的新认识，这引起创新、合理的靶向治疗发展以符合AA患者未满足需求。
GWAS试验鉴定的AA免疫通路表10中显示发现与斑秃相关的最高度显著基因座：（灰色区域表示“标称显著”基因）。已在不同人群的确认研究中验证这些开创性研究。带下划线的基因是HF表达基因而粗体基因是免疫细胞中表达的基因。总之，其它组织特异性自身免疫状态共有许多易感基因座，其中I型糖尿病表现最突出重叠（右列）。与RA、T1D和CeD的共性尤其值得注意，因为NKG2D已显示在各三种疾病的疾病生成中起显著作用（11-14）。因此对这三种疾病/模型系统中的任一种的了解似乎都揭示多种自身免疫状态共有的共同致病性通路。鉴定的最高度显著基因座（除了HLA）是四种NKG2D配体（粗体斜体表示UBLP-3/UBLP-6/MICA/MICB）和一种抑制配体（HLA-G）。NKG2D受体（NKG2D）具有消除细胞发出危险信号的功能且此识别过程的调节异常经常导致自身免疫的发展（26）。引起风险的其它HF表达基因包括HLA、抗原加工基因（TAP）和PRDX/STX17。
Figure BDA00003444511500821
表10：与AA相关的遗传基因座。
通过带有NKG2D的活化效应物产生IFNγ可逆转免疫赦免并永久维持炎症环。
IFNγ相关通路可通过现有疗法在临床研究下破坏，促进所述通路转化。在过去的十年中，已在临床上成功开发蛋白酪氨酸激酶（PTKi）的几个小分子抑制剂用于口服和局部递送。将追踪PTKi方法阻断AA中CD8介导的炎症反应，即JAK/STAT信号转导的抑制，负责CD8效应物细胞因子IFN-γ下游的细胞因子应答。
在脱毛小鼠中鉴定靶向效应T细胞应答的临床相关疗法
使用免疫染色和流式细胞术分析来自AA皮肤的总细胞群，发现CD8+NKG2D+T细胞浸润毛囊(图17)且在AA但不在正常皮肤中增殖（图18和图4A）。此外，AA小鼠显示皮肤淋巴结病，至少部分归因于CD8+NKG2D+群在AA皮肤淋巴结和血液中的显著全身性扩增，代表总LN细胞的全6+/-1%是总PBMC的2.4+/-1.3%，各自比正常C3H小鼠中所见高10倍。这些CD8+NKG2D+T细胞针对HF真皮鞘细胞有强细胞毒性（图21）。对CD8+NKG2D+T细胞的进一步免疫表型分析揭示该群体表达T记忆标记物CD44+和多种“NK标记物”，包括DX5、NKG2A/C/E和NKp46（图19）。
为提供证据显示循环CD8+NKG2D+群代表真正的“AA特异性”效应群，不受理论约束，淋巴结中发现的CD8+NKG2D+T细胞可表达与发现浸润AA皮肤的总T细胞相似的TCR库。图20显示CD8+NKG2D淋巴结群展现正常CDR长度分布，一种反映未限制多克隆T细胞群的模式。相比之下，皮肤T细胞TCR库高度受限，几乎所有Vβ家族成员由少量CDR长度主导，指示抗原驱动T细胞的寡克隆群。来自皮肤淋巴结细胞的CD8+NKG2D+T细胞也高度受限并显示与总皮肤T细胞惊人相似的模式。
这些数据确定CD8+NKG2D+T细胞含有皮肤中发现的大多数寡克隆T细胞群。另外，皮肤和淋巴结中普通寡克隆T细胞扩增的证据对立于这些LN群（或甚至标记物）作为对炎症事件的反应过程而扩增/活化的可能性。例如，AA淋巴结中Treg细胞（CD4+CD25+FoxP3+）数目也增加，然而这可能是反应过程，因为其谱型多样且不同于皮肤中存在的那些。注意到一些TCR/克隆于皮肤而不是引流皮肤淋巴结中发现，例如Vβ10。这些可能包括发现于AA皮肤但不存在于分选的CD8+LN部分的CD4+T细胞群。这些数据确立CD8+NKG2D+T细胞是小鼠AA中致病性NKG2D+效应物，建立人AA的平行小鼠模型。
体内确立治疗方法概念验证的临床前AA模型
C3H/HeJ皮肤移植模型：已研究斑秃的C3H/HeJ小鼠模型，因为该模型在1994年第一次报道（29，30，31）。尽管发现其它斑秃小鼠模型（32），该模型仍然是现今本领域中研究和使用最多的模型。在数年中已经用该模型完成多种药物试验（33），优化各种试验方案（34）。
从脱毛C3H/HeJ小鼠移植全厚度皮肤至2-3月龄未受影响的C3H/HeJ雌性小鼠上，10周内所有接受者的移植中产生局部脱毛，20周时发展成全身性脱毛。采用各种建立在组织病理学家传统训练上的全面有效的组织学评分系统，其中描述用的形容词（正常，0；轻度，1；中度，2；重度，3；和极度，4）转化为数值用于输入关系数据库（小鼠疾病信息系统[或MoDIS]）：http://research.jax.org/faculty/sundberg/registration.php)(35,36)。这些数据库可通过Excel输出用于输入统计分析或其它软件程序。根据严重性、炎性细胞位置、炎性细胞类型和相对数目（粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞）、囊营养失调等对斑秃分级。分子RNA和蛋白生物标记物会纳入此组，完成此多变量数据库的生成和分析。
实验方案#1：在预防设定中，移植后第一周开始处理受体小鼠。
实验方案#2：就治疗而言，具有早期建立AA的移植小鼠接受处理以逆转AA发展。
首先在预防模型中检测试剂。然后将成功预防AA的试剂转移到已建立疾病设置的二级评估中，而弃去那些首次测试失败的试剂，允许其它创新性方法进入。以下是初始治疗方法，选择特异性生物制剂和小分子用于临床前评价。
将测试小分子JAK蛋白酪氨酸激酶抑制剂（PTKi），所述抑制剂靶向参与T效应应答的活化通路。这些PTKi已经处于III期临床试验中，便于转化和潜在临床开发“NK型”T细胞靶向的局部（topical）。
通过小分子PTKi干扰进行治疗干预
局部递送在限制全身接触和毒性上有明显优势。临床前和临床研究已证实小分子PTKi以霜剂递送可以克服皮肤屏障并在真皮中到达有效局部浓度以及有限的全身接触（78）。靶向对AA中效应T应答关键的PTK，即细胞因子IFNγ。
用Jak1/2抑制剂靶向IFN：干扰素是具有吸引力的AA治疗靶标，因为其可能参与炎症反应的数个步骤；包括消除HF免疫赦免和诱导细胞炎症反应。干扰素上调数种毛囊末梢器官中相关促炎分子，包括NKG2DL、粘附分子（如ICAM-1）、抗原加工/递呈（TAP1/2、LMP、蛋白体、I类和II类MHC）并另外驱动免疫效应物应答（增加的Th1型应答、DC活化和IFNγ介导的细胞毒性）。AA的C3H-HeJ小鼠模型中，发病机制需要IFNγ（89，90）且给予IFNγ加速疾病（91）。重要的是，C3H-HeJ小鼠中给予IFNγ中和抗体逆转AA发病（92，93）。同样地在人类中，已注意斑秃到在几个系列中作为I型干扰素治疗的副作用（94-104），人AA皮肤的转录概况分析已注意到损伤活检中的I型IFN应答（105）以及外周血液中Th1倾向和提高的IFN应答细胞因子/趋化因子（图22，23）（106-110），并在（111）中综述。从AA皮肤活检移植物获得的T细胞是均一的CD8+NKG2D+细胞，且当刺激时产生IFN-γ（图21A）而非IL-4或IL-17。与之形成鲜明的对比，获自正常皮肤移植物的主要T细胞是CD4+(112,113)。该情况相似于AA小鼠，产生IFN-γ的CD8T细胞在皮肤淋巴结中扩增（图19，21）。皮肤中，从损伤相比非损伤C3H皮肤分离的全皮肤转录概况分析研究已鉴定干扰素应答为主要特征，排名前20的上调基因中有17个是干扰素应答基因（图22）。实际上IFN上调毛囊靶标中的NKG2DL表达，闭合IFN介导的致病循环，其中CD8效应物产生的IFN-Γ驱动引起CD8+NKG2D+活化的HF NKG2D配体。
临床JAK1/2抑制剂：靶向自身免疫中IFN应答的阻断抗体（114，115）和小分子PTKi都处于临床开发中。IFN诱导的STAT1/2活化由Jak1/Jak2/Tyk激酶介导，并已在几个自身免疫病症（包括RA和银屑病）中使用口服Jak1/Jak2PTKi产生临床数据。局部疗法的额外优势是限制全身免疫抑制可能性的改善治疗指数。INCB018424抑制Jak1和Jak2(IC50=1nM)，并且其目前在临床研究中只是局部JAK抑制剂（78），其安全性概况至今已可接受。采用口服递送的概念验证已在Jak依赖性疾病（骨质纤维化）（116）和通过产生局部细胞因子驱动的皮肤病（银屑病）（78）中证实。银屑病对象中，局部INCB018424诱导快速临床响应和皮肤Th1/Th17细胞因子响应的标准化（来自clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00820950的未公开数据）。总之，局部INCB018424是预测在斑秃中具有功效的安全干预，斑秃是由IFN特性主导的炎症状态。
方法：方案#1：全身递送INCB018424：考虑到啮齿动物中t1/2半衰期为3－6小时，一天两次（90mg/kg）口胃强饲提供良好的全身接触。该方法中，我们能评估JAK1/2抑制是否阻碍AA发展。
方案#2：局部递送INCB018424（1.5%）：通过局部JAK1/JAK2抑制剂逆转斑状AA。开始每天对移植小鼠中新的受影响斑状区域进行局部处理（78），所述区域在移植后6-10周出现。局部处理可通过合适的绷带包扎限于小鼠皮肤特定区域以防止理毛、舔舐等引发的全身接触。重要的是，通过处理受影响区域，我们能评估局部接触是否可逆转AA发展这一临床相关问题。
鉴定告知临床研究的AA疾病活性的鼠生物标记物
鉴定伴随这些临床前研究处理结果的免疫事件对以下两方面很重要，一是验证所提出的作用机制，二是提供有用的生物标记物，其告知AA患者中这些相同疗法的可能临床评价。因为临床评价中生物样本限于血液和皮肤样品，焦点是在小鼠中的小鼠生物标记物上，其易从这些位点采样。例如，使用GWAS和转录概况分析的方法以及对T细胞子集使用免疫染色和FAC的方法已用于例如鉴定AA小鼠皮肤和血液中数种致病性AA生物标记物。在脱毛C3H/HeJ小鼠中的研究已鉴定数个在AA中上调的皮肤生物标记物，例如IFN诱导的基因（图22）。谱型数据（图2）提供有力证据显示这些循环NKG2D+CD8T效应物是真正的自身抗原驱动效应T细胞。短暂评价经过或不经处理的小鼠中这些血清学、皮肤和细胞生物标记物能鉴定动态、机理上重要、预知的炎症生物标记物以预测治疗结果以及了解生物标记物的发现/利用。
AA中循环免疫效应物的细胞生物标记物：“NK型”CD8T细胞在AA小鼠的皮肤、血液和淋巴结中扩增，是研究发病机制的有价值工具。另外，所述细胞子集似乎直接与人疾病相关。
基于谱型的免疫监控：通过流式细胞仪循环50μl全血鉴定NK型CD8T细胞（图18）。移植后每三周评估该CD8+NKG2D+分选T细胞子集的总数和谱型以监控单个小鼠中克隆优势/表位扩展的进展。谱型分析将用于确定CD8+NKG2D+T细胞的免疫表型丧失是由于与处理相关的循环脱落T细胞克隆消除。非侵入性免疫监控方法将用于跟踪所有处理的小鼠。例如，用JAK1/2抑制剂INCB018424的3周处理不是。不受理论约束，预期JAK1/2抑制剂消除靶组织中T细胞衍生效应细胞因子（IFN-γ，IL-17）下游炎症结果。
血清中免疫“蛋白质组学”特性：血清中的细胞因子和趋化因子反映靶器官中的炎症环境。人的数据证实几种细胞因子和趋化因子的提高，其中一些与疾病活性有关（如IL-8），这扩展了之前研究的观察结果（106、107、109）。与我们之前涉及IL-15和IFN-γ的发现一致，AA发病机制中，观察到人AA血清中IFN-γ和熟知的IFN-γ诱导型趋化因子IP-10(CXCL10)上调。功能相关的炎性细胞因子/趋化因子生物标记物将使用多分析物方法（鲁米耐克斯（Luminex）平台）鉴定。小鼠中发展生物标记物除了具有遗传同质性的优点外，还能相对便于纵向研究以鉴定生物标记物，所述生物标记物出现在疾病发展的早期或晚期并与处理响应相反。RNA水平上，C3H小鼠皮肤IFN微阵列证实I型IFN（IFNα1-3，ε）和II型IFN（IFNγ）上调，几种与IFN相关的趋化因子（CXCL9-11,CCL5）也如此。使用自定义多分析物鲁米耐克斯试验（R&D）在血清中检测细胞因子/趋向因子生成，综合性针对9种趋化因子（CCL2-5、CCL11、CXCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11）和14种细胞因子（IFNα、IFNγ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、TNF、GM-CSF）的血清水平。我们纳入抗体对来检测NKG2DL(117)和IL-15Rα的血清水平。
皮肤的转录概况分析：人AA中，公开的小系列患者研究已注意到损伤活检中的I型IFN应答（105）以及外周血中的Th1倾向和提高的IFN应答细胞因子/趋化因子（106-110），综述在（111）中。这些数据在C3H小鼠的分析中反映。分离自脱毛小鼠皮肤的RNA转录概况分析揭示主要的IFN应答。AA皮肤中，排名前21个上调基因中有18个是IFN应答基因，其通过实时PCR确定（图22）。IFN应答基因CXCL9-11的上调值得注意，因为CD8+NKG2D+细胞也均匀表达它们共有的趋化因子受体CXCR3，CXCR3是一种在短期免疫效应物中上调的受体（118-120）。这些趋化因子也在人AA对象血清中上调，且因此可为皮肤（mRNA）和血液（蛋白）中功能相关的AA皮肤生物标记物。该领域的工作将继续，可建立在进行处理前或处理期间采集的皮肤RNA特性数据库，其可用于调整处理计划并作为处理反应的早期指示剂。为了这些目的，可用病损内类固醇和CTLA4-Ig在小鼠内实施平行研究，以及使用治疗干预，从而提供可用于交叉参考人处理研究（研究间的比较基因组分析以及用于更新型方法的潜在临床发展）的转录概况分析数据库。
人对象：
来自头皮的皮肤活检将从最少100名斑秃患者和大约100名对照中采集。该对象人群将由AA患者和接受毛发移植的未受影响对照对象组成。批准采集这些样品经过快速核检查/豁免，因为其为弃去的组织。从AA患者采集头皮活检的实验方案在准备中。招募最少100名AA对象，但集合100名以上有益处并能提高该方法的优势。
为在产生表达相互作用组的样品中实现最大均一性，仅从中年高加索人男性AA对象中采集毛囊，因为匹配对照供体最常来自该组。因此，尽管存在AA没有显示种族或性别倾向这一事实，出于该研究目的，选择AA患者根据年龄和性别与对照配对（中年男性高加索人）。也选择患有活性疾病的患者（即具有一些剩余的毛囊）从而其可有效纤维解剖。
脊椎动物
从杰克逊实验室（Jackson Lab）获得幼龄C3H/HeJ小鼠（2-3月龄）和显示可见毛发脱落的退役种畜。所述动物在标准条件下饲养在动物设施中。
通过全身注射或局部注射向小鼠给予药物或抗体。对于局部应用，用电推剪在小鼠皮肤背面剃毛。剃毛一周后，小鼠将接受化学物的局部施用，化学物溶于作为载剂的丙酮或10%v/v聚乙二醇。腹膜内或皮下给予注射。剂量以及给予频率根据建立的实验方案操作。处理全程中每天监控小鼠的痛苦迹象。
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实施例5
使用谱型分析流式分选细胞在脱毛小鼠的淋巴结和血液中鉴定脱毛效应T细胞。开发基于血液的试验以在处理期间监控这些脱毛T细胞。已发展细胞毒性试验用于评价人和小鼠中毛囊（HF）功能组分与CTL的相互作用。
使用获自AA对象的生物样本，证实循环T细胞表达高水平NKG2D且来自皮肤的原代T细胞主要是CD8+NKG2D+IFN-γ生成细胞，建立了小鼠和人疾病之间的平行性。
免疫表型和皮肤免疫生物学
为研究生物样本的通路，要求分析皮肤和血液中的异质细胞群。人自身免疫的临床研究中，斑秃提供独特的机会，因为末梢器官可及性使人们能够研究/分离其相关微环境中的致病性免疫效应物。提供所需分析工具和人员用于优化研究这些宝贵的末梢器官皮肤生物样本，和其从相同个体获得的血液中的细胞/血清对应物。
制备和分析生物样本：
提供以下方案以协助血液分析：
i)来自血清样品的多分析物细胞因子/趋化因子分析。
ii)流式细胞术免疫表型，包括对来自AA对象的人PBMC进行细胞因子分析。
iii)就下游应用使用T细胞子集的流式分选（RNA概况，谱型）。
提供以下方案以协助皮肤分析：
i)制备/分析原代毛囊和T细胞组分的活细胞部分用于功能（细胞毒性）和分析研究（T细胞克隆，谱型）。
ii)全皮肤的免疫染色和转录概况分析。
iii)来自人和小鼠AA皮肤的真皮淋巴细胞的流式细胞术免疫表型。
科学实验
a.将鉴定AA对象外周血中的致病性HF特异性细胞子集。为此，将谱型分析用作工具来鉴定循环人脱发T细胞群，正如就小鼠模型所完成，通过配对全部皮肤T细胞中所见谱型与获自相同患者外周血中特异性分选的外周血T细胞子集的谱型。
b.将建立人AA中的Th1主导型并发展Th1靶向疗法的原理和生物标记物平台。疾病特异性Th通路的治疗靶向已在其它人皮肤炎症疾病中取得成功，尤其是银屑病中的典型Th17疾病。AA动物模型中有大量数据可用于作为主导Th1疾病的AA。浸润真皮AA T细胞和血液中相关循环T细胞子集的Th概况将通过多叉（multi-prong）方法解决，包括多分析物、RNA概况分析、免疫染色以及皮肤和血液的胞内流式细胞术分析。
转化研究的整合性方法起始于鉴定AA中可靶向通路的基础研究，然后在临床前模型中治疗性测试这些通路，在临床试验中纵向生物标记物评估以及以遗传研究为基础开展基于人群的研究。干预的临床前治疗作用将在移植AA小鼠模型中评价，在皮肤和血液中评估对炎症反应的治疗效果，以及提供人生物样本用于在离体研究中检验人相关性。
监控人皮肤中免疫细胞和靶细胞间的致病性相互作用需要复杂的加工以及分析原代人组织和血液。
流失细胞术已成为根据特定参数鉴定细胞群的主要工具，且因此被日益增多的生物医药科学家采用。
皮肤免疫生物学呈现特殊特性和挑战；组织的特殊结构包括其屏障功能，其相关的的独特免疫细胞群和其与微生物群紧密相邻/相互作用，以及分离浸润淋巴细胞的操作困难，这些都是皮肤免疫疾病方法中需理解的复杂性一部分。提供协助组织加工和染色、以及细胞分离的服务为保证得到高质量一致性结果所必需。
流式细胞术是临床研究的工具，且所有转化免疫学家都需要掌握其使用工作知识。可用四种流式细胞仪，包括两种使用较多的仪器（ACs Canto和FACsCaliber）、6激光LSR II(6-laser LSR II)和4激光BD Influx(4-laser BD Influx)。LSRII和BD Influx已设计成具有相当的激光/检测仪以促进从分析转化为比较分选。LSR II配有6个激光设备，能同时检测总共19种色彩，提供检测荧光蛋白（mBanana、GFP、BFP、RFP/dsRed、mCherry mRasberry）和荧光染料/化学荧光物的多用性。LSR II可使用广泛的有机和无机荧光物阵列分析来自组织的异质细胞群中不同的细胞类型。这些额外的荧光参数允许检测混合群体内特异细胞类型中的协调功能事件（例如，来自皮肤组织和引流淋巴结的T细胞群中胞内IFNγ、IL-10生成和磷蛋白检测）。基础LSR II仪器配有三种激光设备；蓝色（488nm）、红色（633nm）、紫色（405nm）。定制设计的LSR II另外具有三种额外的激光设备，允许最高达20色检测和96孔读板器。“留一法（Leave one out）”10色组设计用于T细胞子集（例如Treg），B细胞和单核细胞已设计成利用100W黄绿594激光，其对“红”Alexa594具有敏锐的敏感性。因此，研究者可采用“留一法”设计以通过用Alexa594偶联抗体染色来灵敏性检测感兴趣的特异标记物表达。
质量：将进行人外周血液和其它实验中就免疫表型淋巴细胞群而言的组发展。因为LSR II6激光系统的能力，建立常规的“便于使用”颜色设置，其使用时不需要补偿。由于荧光物在光谱中彼此相隔较远并由各自的激光线单独激发，不需要荧光补偿的5/6色实验能力提高了数据分辨率。这能够使群体清楚分开，这是使用补偿时罕见的。目前选择的荧光物组合是DAPI（门控在DAPI阴性细胞）太平洋蓝（Pacific Blue）、FITC、PE、Alexa Fluor594和APC，然而其它荧光组合物也在测试和使用中。该5荧光物设置作为实验组的基础平台，可向其中增加其它荧光物。“概念验证”实验中，使用5荧光物显示同时不需要补偿。用CD8太平洋蓝、CD3FITC、CD45R(B220)PE、CD11b Bio+链霉亲和素Alexa Fluor594和CD4APC染色C57BL/6脾细胞。
对皮肤免疫生物学的维持和质量控制：已从Clark和Kupper（2）开发的方法中改良用于从皮肤活检中分离淋巴细胞的步骤，其中所述活检是在3维钽包被的细胞泡沫基质上的培养物以促进T细胞从活检中迁移。进一步研究或低温保藏前，各分离细胞群中的小部分用于CD45/CD3染色以通过流式细胞术评估白细胞/T淋巴细胞的数目。为重新利用，将所述基质在10％漂白剂中浸泡30分钟，然后用水冲洗并转移到Enzyte酶清洗剂（德科实验室（Decon Labs））溶液中。基质留在热板上的该溶液中，搅拌24小时，用蒸馏水洗涤并在高压灭菌前干燥。
将提供全皮肤分析技术（例如免疫染色）。提供以下方案：1)用于制备/分析原代毛囊和皮肤T细胞的活细胞部分的皮肤免疫生物学的关键专业知识；2)用于临床生物样本的生物标记物发展能力，包括多分析物分析（鲁米耐克斯）和珍贵临床生物样本的转录概况分析（来自临床试验所招募对象的皮肤和血液）。将提供临床前研究生物过程和监控炎症AA机理的工具和来自血液及AA靶标末梢器官皮肤的临床样品。
微阵列数据分析和储存、序列和通路分析的能力可用于本文的研究，且延伸了调节网络逆向工程改造的最新算法的所有方法。建立并维护了许多广泛应用的数据库。另外，所有重要序列和结构数据库集中维护。这允许大规模检索，如果需要定制算法和集群计算。许多已开发的检索方法可纳入软件应用和计算服务中，供科学界自由使用（http://www.c2b2.columbia.edu/page.php?pageid=10）。
可用以下服务：
1.免疫监控：
a.来自血清样品的多分析物细胞因子和趋化因子分析
可用两种方法：a)基于多重珠的免疫试验系统（例如CBA/FlowCytomix）提供多种分析物，其允许10种或更多种细胞因子/趋化因子在单次读取小量（50μl）样品下评估。LSR II孔高通量容量提供了有效联用的便利。软件（“对齐（snap-to）”门选）可用于数据分析。还将开发基于多重珠的试验系统以定量分析血清中可溶性人和鼠NKG2DL，用其中特异抗体组市售可得。b)使用鲁米耐克斯平台的多重分析可用于CTSA来分析市售可得的小鼠和人细胞因子和趋化因子这列（图24）。基于服务收费模式提供鲁米耐克斯试验，试剂由使用者购买。一旦AA血清生物标记物平台大量购买所选分析物能够节省成本。
流式细胞术免疫表型
已使用多参数流确定，CD8+NKG2D+细胞在从自发性脱毛小鼠皮肤收获的真皮白细胞群中占优（图25）。为解决人类情况，已发展流动组以定义任何30PBMC子集中的定量改变，聚焦在NK和CD4和CD8T细胞群上,使用3个FACS管（T细胞子集管、用于CD4、CD8和NK细胞的NK标记管和第三个非T细胞管）；谱系标记：CD3、CD4、CD8α、CD8β、CD14、CD19、CD20、CD56、CD64；T细胞子集标记：CD45Ra、CD45Ro、CD56、CD62L、CCR7、CD127、FoxP3、Helio；皮肤趋化因子受体分析：CCR4、CCR8、CCR10、CLA、E和P选择素；NK免疫受体家族成员：抑制：KIR/CD158、CD94/NKG2A、LILR/ILT、LAIR1NKR-P1，活化：NKp46、NKp30、NKp44、NKG2C、NKG2D。对来自四个AA对象的PBMC的初始评价中，观察到CD56+CD8+T细胞和NK细胞中的NKG2D表达提高，但CD4+T细胞中没有该情况（图26）。
细胞因子分析：用PMA/伊屋诺霉素活化新鲜分离的血沉棕黄层外周T细胞将驱使循环记忆T细胞产生细胞因子。用布雷菲德菌素孵育4小时后，细胞用细胞表面标记物染色、固定和透化，之后胞内染色IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-17和FOXP3/氦核。这些细胞因子/转录因子与表面标记物CD3、CD4、CD8、CD25、CD56、CD62L、NKG2D、CD45Ra、CD45Ro、CLA/CCR4一起，将描绘总体Th1/Th2/Th17/Treg部分和皮肤CD4/CD8原初及记忆T细胞隔室以及其NKG2D表达。不受理论约束，使用能在单个管中进行多参数测试的LSRII，2-400万PBMC对于该分析绰绰有余。这将使30ml血液抽取物中留下足够的PBMC（>2000个细胞）以用于其它目的。
就下游应用使用T细胞子集的流式分选。
该目的是提供可能的脱毛T细胞用于下游功能分析。例如，将提供流式分选的T细胞子集用于RNA概况分析，如NK型细胞T细胞的转录概况分析。对于生物标记研究，改善合适的细胞子集能改进分析的分辨率，其能另外通过混合异质PBMC群中存在RNA来稀释。
AA小鼠中的研究表明脱毛T细胞(图24)是再循环的且可易于发现和从血液和皮肤淋巴结中分离。多于500万CD8+NKG2D+T细胞可通过流式分选从单个小鼠的皮肤淋巴结中分离。用于下游研究的新鲜原代“致病性”T细胞的数目惊人，且对细胞产率有实质性改进，人们可期望通过“爬出”从脱毛皮肤中回收。鉴定AA对象人AA对象中致病性T细胞子集是科学目标。将提供流式分离的T细胞子集用于下游应用，包括生物标记物研究，功能研究和谱型以提供特异性T细胞子集的免疫致病性相关性证据。
i)TCR库的谱型分析
来自组织或表型分离的淋巴细胞子集的RNA谱型或TCRβ链长度分布分析提供了浸润T细胞的TCR克隆型利用/库的定量描述。近年来，其他人（5-7）已使用该技术作为高灵敏和准确方法来描绘样品中克隆扩增的T细胞比例。寡克隆性即具有受限TCR的T细胞子集扩增的证据说明炎症过程中的抗原性驱动且可用作第一步骤来鉴定致病性T细胞克隆。因为各TCR重排在多种三核苷酸的CDR3长度上不同，T细胞群中CDR3长度的异质性可用作TCR多样性的量度。该技术的原理是使用上游特异性Vβ家族成员引物和下游恒定区引物对获自T细胞群的cDNA进行PCR扩增，所述引物共同跨越由组合和接合VDJ连接形成的CDR3区域。然后使用荧光标记的恒定区引物在引物延伸（“流走（run-off）”）反应中对PCR产物进行荧光物标记。然后所述产物在ABI PRISM3700DNA分析仪上运行。使用基因作图软件可显示并分析对应于离散CDR3长度的峰值大小（图20和27）。输出所述数据并与参照多克隆库作比较，并计算寡克隆性（例如汉明（Hamming）距离）量度。各柱状图的峰面积反映各家族中各CDR3长度的表达频率。皮肤中的克隆扩增优势说明真皮抗原在驱动疾病中的主要作用，且将聚焦在致病性T细胞研究上。相反,未扩增克隆的多克隆库指示由非克隆特异性趋化因子受体募集。相同个体的非损伤皮肤和血液中TCR库的比较指示克隆扩增的皮肤驻留T细胞群是否也可在循环中发现。相似的分选T细胞子集可用于库分析中的RNA源材料。
例如，图20和27证实小鼠中，寡克隆群发现于损伤皮肤，其是也在NKG2D阳性而非阴性CD8淋巴结群中过量表达的库。这些数据确定CD8+NKG2D+T细胞含有发现于皮肤的大多数（但非全部）寡克隆T细胞群。注意到一些TCR/克隆发现于皮肤但不是在引流皮肤淋巴结，例如Vβ10。这些可能包括发现于AA皮肤但不存在于分选的CD8+LN部分的CD4+T细胞群。该方法提供了“抗原驱动”的有力证据，且联合如本发明所述的流式分选，鉴定细胞群中的致病性T细胞子集。
克隆共有或寡克隆性的证据将在小鼠和人样品中于克隆型分辨水平上研究和验证，这是通过制备PCR产物的细菌文库，使用基于拓扑异构酶的克隆，并用高通量的方法使用所述基于96孔的技术测序所得克隆的TCRβ链（5-7）。通常选择48或96克隆并对每个PCR产物测序。输出序列并在Geneious中比对，使用Vquest测定VDJ元件良好结构的使用和连接。这能对不同区域的共有克隆和淋巴细胞运输进行确定性鉴定，以及样品克隆型组合物的精确计算。另外，克隆型TCR可用于基因转导研究以产生T细胞和表达脱毛TCR的逆基因小鼠。该努力也可使用HLA02转基因小鼠中转基因表达的人脱毛TCR从而发展“人源化”转基因TCR脱毛模型。
ii)循环免疫细胞的转录生物标记
标记侵袭性、药物难治性狼疮的转录特性可在CD8T细胞隔室中鉴定，但使用总PBMC的RNA时不能鉴定（8）。因此采用转录概况分析的组合流式分选大大增加了分析能力。斑秃中，致病性细胞子集似乎是包封毛囊的CD8+NKG2Dhi T细胞且可能在自身免疫（9）中具有广泛的致病相关性，所述自身免疫包括乳糜泻（4，10），I型糖尿病（11）和类风湿性关节炎（12－14）。乳糜泻（4，10）中这些细胞的转录分析概况先前描述了这些细胞的NK样转录程序，其在分选纯化的循环和皮肤衍生CD8T细胞中相似评价。重要的是特异性针对这些细胞群的转录概况以鉴定对这些细胞关键的生物通路中心。
使用基于伊鲁米那（Illumina）的基因组方法鉴定表观遗传调节自身免疫基因，且DNA是获自分选的自身免疫人T细胞，所述细胞来自I型糖尿病、斑秃和乳糜泻患者。鉴定启动子区域的超甲基化，其下调重要免疫调节基因的表达，包括CD3、PD-1和FasL。
iii)细胞免疫学
活化PBMC的流式细胞分析可用作胞内细胞因子分析或磷酸化蛋白的信号转导活化。典型的抗原特异性、促有丝分裂或混合的淋巴细胞应答可理解为有CFSE染色的T细胞或掺入胸苷激酶。可用的设备包括细胞收集器和Microbeta/Trilux读板器（用于基于胸苷激酶的增殖和铬释放细胞毒性试验），ELISA读板器/洗涤器，ELISPOT读取器。
皮肤免疫生物学
制备原代毛囊和T细胞组分用于功能（细胞毒性）、预备性（T细胞克隆）和分析研究（谱型，RNA概况分析）。来自研究中AA患者的活检样品很宝贵，免疫染色和转录概况分析研究取得最高优先权，考虑到这两种方法可行性和报告性能力。常规人头皮皮肤获自对照个体（毛发移植供体）以建立皮肤和毛囊中个体细胞群的原代培养物。
a)T细胞和毛囊组分培养物、毛囊器官培养物和皮肤器官培养物。
i)HF靶标:获自对照或受AA影响的个体的人头皮皮肤用于建立皮肤和毛囊中个体细胞群的原代培养物（图28）以研究NKG2DL对原代HF群的调节以及在CTL试验中评估作为靶标的HF群。滤泡间皮肤用分散酶处理以分离表皮和真皮组分以及酶处理建立角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养物。显微解剖毛囊以分离间质组分并进一步用于培养真皮鞘细胞（DSC）和真皮乳头细胞（DPC）。根据Kondo和Philpott等(15)操作方案实验室建模的已建立无血清毛囊器官培养物（图30）用于常规培养来自对照个体的个体毛囊，以及来自AA患者的损伤（可能时）和对照皮肤。在无血清生长条件下培养毛囊并显示7-10天的正常毛发生长期，之后进入毛发生长中期并在基质中崩解（16）。对于细胞毒性试验，所述毛囊转移至维持细胞毒性T细胞或NK细胞（MyeloCult,干细胞技术公司（Stemcell Technologies））4-8小时的介质中。所述皮肤移植物维持正常的皮肤结构，以及免疫微环境，并用于功能研究（17）。
ii)T细胞效应物:从酶消化/分散的人皮肤中分离足够数目的T细胞可能很困难；然而可使用Clark的（2）开发的真皮爬出方法扩增经培养的T细胞。皮肤移植物已用于扩增皮肤的驻留T细胞群，所述扩增通过在含20%FCS、IL-2和IL-15IMDM，于细胞泡沫基质上对所述移植物培养3周。该技术产生每4mm活检0.3-3.0x106个T细胞，能实施免疫表型、T细胞克隆、和其它下游应用（如，转录概况分析、细胞毒性和其它功能试验）。对于干预试验中的AA患者，如果扩增3周后获得充足的T细胞（>1x106），将其分开，一半用于RNA分离/概况分析且另一半用于流式免疫表型/Th概况分析。如果产率少于1x106个总细胞，研究将限于RNA概况分析。对于未研究的AA患者，可以更大范围使用爬出T细胞和自体HF靶标来用于替代性功能研究，包括例如用抗体阻断/小分子的细胞溶解试验和研究。作为稀有临床T细胞群的分析能力的示例，图29显示了T细胞“爬出”试验，其中获自钻取皮肤活检的经培养人真皮用作流式细胞术分析的源材料。.
注意到获自AA皮肤活检的T细胞是产生IFN-γ的寡克隆CD8+NKG2D+T细胞，鲜明对比于正常皮肤的爬出试验中所见的预期多克隆CD4群（2，18）。
b.)斑秃模型中皮肤和免疫组分的相互作用
建立的实验方案可用于评估本发明研究的皮肤-免疫相互作用。原代培养细胞以及器官培养毛囊可用于靶标，使用来自对照或患者外周血淋巴细胞或衍生自所述皮肤的细胞毒性T细胞（图29）。免疫效应细胞可与CFSE标记的靶细胞/毛囊共同培养，且细胞裂解将通过LDH释放比色法测定，或者，死细胞用7-AAD染色并通过流式细胞术计数细胞数目。这些试验可用于测定免疫效应物和HF靶标相互作用的分子要求，包括细胞毒性。例如本文所示，细胞毒性需要NKG2D参与和之前有细胞因子/TLR配体的靶标敏化，其已知上调NKG2DL转录和表面表达。
发病机制的皮肤生物标记物的评价：免疫染色和转录概况分析
AA显示与数种自身免疫疾病高度相关，使毛囊成为研究自身免疫基本机制的高度可及器官。对鉴定发病机制的早期替代性生物标记物有巨大兴趣。同样，AA代表一种生物标记物发展的模型系统，其可具有与广泛范围疾病的相关性。以下生物标记物目前用于监控AA发展以及对人和小鼠治疗的反应。
a)淋巴细胞浸润的免疫组化染色。AA与囊泡内和囊泡旁免疫浸润的存在有关。对于免疫组化，组织在溶于PBS的10％福尔马林中室温固定8小时，并就石蜡切片而言储存在70％乙醇中用于或就-80°C下储存的冷冻切片而言在干冰上直接包埋于Cryomatrix（珊顿公司（Shandon），马萨诸塞州沃森姆）。
将石蜡包埋的组织块切成8μm切片，实施苏木精和伊红（H&E）染色用于组织学研究。冷冻组织也切成8μm厚度的切片并固定在4%多聚甲醛中用于免疫荧光染色。切片用荧光标记的二抗染色并用Zeiss Axioskop显微镜进行免疫荧光成像。基本的免疫组织学/荧光染色包括用针对CD3、CD4、CD8的一抗染色。作为免疫染色的示例，提供证据显示MHC I和II以及ICAM-1在脱毛HF中大幅上调，其与密集CD8主导的浸润有关（图31）。
b)分离总皮肤RNA和定量PCR用于炎症标记物。就已定义的炎症基因转录本提高来测试人和小鼠皮肤，包括IFN应答基因，以及待确定的基因特性，包括“NK型”CD8T细胞转录本。使用RNeasy纯化试剂盒（凯杰公司（Qiagen））从皮肤提取总RNA.使用SuperScript II逆转录酶（加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司）逆转录经DNA酶处理的总RNA。
使用SYBR Green主要混合物（SYBR Green Master Mix）和ABI Prism7000序列检测系统（ABI Prism7000Sequence Detection System）（加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司（Applied Biosystems））实施RT-PCR。GAPDH和β肌动蛋白用作内部归一化对照基因。
本文研究的一个目的是建立循环AA效应群表型，其中通过将分选的外周血AA T细胞子集的谱型与来自相同患者的总皮肤T细胞所见谱型配对。流式细胞术分选技术与谱型分析联用以鉴定AA患者循环中的致病性T细胞。该相同方法用于小鼠模型以表明CD8+NKG2D+淋巴结细胞含有脱毛皮肤中发现的大部分T细胞克隆。AA对象中，相同个体的损伤和非损伤皮肤以及血液的TCR库进行比较以鉴定克隆扩增的皮肤驻留T细胞群是否也在循环中发现。通过逐步优化从循环T细胞子集中分离RNA源材料的分选标准，人们能（至少部分）配对来自相同患者的总皮肤所见TCR库，且通过该方法鉴定致病性CD4和CD8T细胞的免疫表型标记物。鉴定致病性T细胞子集对监控临床研究、优化生物标记物发展极其有益，并提供独特的细胞材料以用于从临床到实验室的发病机制研究。
本发明研究的另一目的是建立浸润真皮及在外周血中循环的AA T细胞的Th概况。致病性AA T细胞效应物分化/细胞因子概况分析：特异性Th通路的治疗靶向已在其它人皮肤炎症疾病中取得成功，尤其是银屑病中的典型Th17疾病。AA动物模型中存在大量数据可用于作为主导Th1疾病的AA(19-23)。为建立人中的Th1主导并发展Th1靶向疗法的原理和生物标记物平台，浸润真皮AA T细胞和血液中相关循环T细胞子集的Th概况将通过多叉（multi-prong）方法来解决，包括多分析物、RNA概况分析、免疫染色以及皮肤和血液的胞内流式细胞术分析。优化AA CD4和CD8T细胞的免疫表型标记物当然允许检测多克隆循环群中潜在脱毛特异性T细胞的Th概况。
虽然来自小系列对象的AA损伤转录概况表明Th1型倾向（24），不受理论约束，AA不是“一种疾病”。AA对象中常见共病免疫病症反映潜在的Th2或Th1/17偏向，其倾向于具有共同致病性通路的疾病，包括过敏性（25）（皮炎）和其它自身免疫病症（26-33）（参见本文所述的研究），这说明可能存在Th2型AA以及Th1或Th17型AA。因此重要的是在外周PBMC中以及大量患者AA损伤组织移植物中鉴定功能T细胞应答，其中可能用不同Th概况鉴定AA子集，以及使这些免疫功能生物标记物参数与相关SNP存在或缺失相关联。
评估外周T细胞和损伤T细胞的T细胞免疫表型。根据GWAS和所附的临床史研究50名AA患者和50名正常对照。总循环T细胞的Th概况的评估简单直接，但将多参数流应用于T细胞子集以用于更颗粒性的研究，最终通过定义AA致病性群免疫表型标记物来辅助。从酶消化/分散的人皮肤分离充足数目的T细胞可能很困难，可以通过培养条件改变。通过转录概况分析采用全皮肤方法和显微解剖的皮肤样品实施相关性以在毛囊鞘浸润以及从滤泡间上皮中的浸润来描述细胞因子概况。
人对象：
来自头皮的皮肤活检采集自正常对象，其由AA患者和接受毛发移植的未受影响对照对象组成。另外的活检获自临床试验对象。
研究材料来源是来自AA患者和对照的头皮皮肤活检。常规性获得来自小组织样品的RNA，包括显微解剖的毛囊隔室。提供来自AA患者和对照的组织活检。
脊椎动物
从杰克逊实验室（Jackson Lab）获得幼龄C3H/HeJ小鼠（2-3月龄）和显示可见毛发脱落的退役种畜。各参与的主要研究者建立的小鼠系在其各自动物饲养套间中饲养。小鼠自由接触水和颗粒饲料（5010啮齿动物饲料，LabDiet，PMI营养国际有限责任公司（PMI Nutrition International））。
建立用于个体皮肤的原代细胞培养和毛囊组分以及毛发/皮肤器官培养物用于野生型和转基因或敲除小鼠。这些研究也涉及毛囊和皮肤组织鉴定。通过CO2窒息然后颈脱位法对小鼠施以安乐死，这是一种兽医批准和广为推荐的方法。其是不与动物疼痛或压力相关的最快和最人性方法。用电推剪在小鼠背面剃毛，然后切出皮肤组织。皮肤单个细胞组分和毛囊以及从皮肤移植物分离T细胞的分离方案描述于图25、28和29。皮肤样品也包埋在OCT和石蜡中。除了皮肤，脾脏和胸腺也可从动物切出并进一步用于流式细胞术。也可通过尾出血收集动物血清并用于细胞因子谱分析。
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实施例6
阻断Jak1/Jak2的体内临床前研究使用INCB018424Jak1/Jak2抑制剂在移植动物疾病模型-C3H-HeJ小鼠中进行。用INCB018424处理后0/5小鼠发生脱毛，其中2/5安慰剂处理的小鼠发生AA。

Claims (14)

1.一种在需要的哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Jak1和/或Jak2抑制剂。
2.一种在需要的哺乳动物对象中治疗毛发脱落疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予Stat1和/或Stat2抑制剂。
3.一种在对象中诱导毛发生长的方法，所述方法包含：
(a)向所述对象给予有效量的Jak/Stat抑制剂，
从而控制所述对象中的毛发生长。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述抑制剂包括抗体，所述抗体特异性结合于含有SEQ ID NO:1、3、5或7的蛋白。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述对象患有毛发脱落疾病。
6.如权利要求1、2或5所述的方法，其特征在于，所述毛发脱落疾病包括雄激素性秃发、静止期脱发、斑秃、静止期脱发、头癣、全秃、稀毛症、遗传性单纯稀毛症或全身脱毛。
7.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(b)通过与所述对象在所述抑制剂处理之前的毛发生长相比来确定给予的所述抑制剂是否诱导患有毛发脱落疾病的对象的毛发生长。
8.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是特异性抑制编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2蛋白的基因表达的反义RNA；特异性靶向编码Jak1、Jak2、Stat1或Stat2的基因的siRNA；或小分子。
9.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是INCB018424。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述小分子是AG490、CYT387、SB1518、LY3009104、TG101348、BMS-911543或CEP-701。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述小分子是氟达拉滨、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）或贯叶金丝桃素。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述siRNA针对含有SEQ ID NO:2、4、6或8的人核酸序列。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述针对Jak1基因的siRNA是表11所列的任一序列。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述针对Stat1基因的siRNA是表12所列的任一序列。
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