CN103361318B - 利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒和方法，属于外来有害生物入侵综合防控的技术领域。本发明通过分离和筛选获得一株薇甘菊萎蔫病毒，并且公开了该薇甘菊萎蔫病毒的扩繁方法；包含该薇甘菊萎蔫病毒的控制薇甘菊的试剂盒，通过喷施接种薇甘菊萎蔫病毒可有效地控制薇甘菊的扩散，克服了利用物理、化学防治薇甘菊的不足，避免了环境污染，具有方便快捷，特异性强、省时省力、防治效果好的优点，可获得良好的社会效益、经济效益和生态效益。

Description

利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于外来入侵有害生物综合防控的技术领域，具体涉及一种利用薇甘菊萎蔫病毒（Mikania micrantha wilt virus，MMWV）生物控制薇甘菊的试剂盒和方法。

背景技术

薇甘菊（Mikania micrantha H.B.K.）是菊科（Compositae）假泽兰属（MikaniaWilld）多年生藤本植物。薇甘菊生物入侵对华南地区的生态环境造成严重危害，薇甘菊的控制问题已经成为世界性的难题。控制技术有人工及机械清除、除草剂化学防治、利用天敌和致病病原菌控制的生物防治等，生物防治是控制有害生物入侵的有效方法。其中人工清除劳动强度大，效率低、成本高，难以根除；化学防治易造成环境污染，生物防治是控制外来入侵种最有前景的方法。目前发现的薇甘菊萎蔫病毒（Mikania micrantha wilt virus）可引起薇甘菊叶片萎蔫、节间矮化，顶枯等症状，严重抑制薇甘菊的生长。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株以薇甘菊病株为筛选对象，分离得到具有强的可使薇甘菊致病的薇甘菊萎蔫病毒（Mikania micrantha wilt virus），为薇甘菊生物入侵的防治奠定基础。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒。该试剂盒适用于控制薇甘菊入侵的灌丛、人工林、天然次生林等地，能有效的控制薇甘菊的入侵。

本发明的另一目的在于提供所述利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法。

本发明的再一目的在于提供一种繁殖和提纯薇甘菊萎蔫病毒的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种薇甘菊萎蔫病毒，其命名为蚕豆病毒属（Fabavirus）薇甘菊萎蔫病毒MMWV-5（Mikania micrantha wilt virus，MMWV-5），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201321，保藏时间为2013年7月10日。

所述的薇甘菊萎蔫病毒的繁殖，包括以下步骤：

（1）将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸缓冲液（0.01mol/L，pH7.0）稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质；薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

（2）按病叶加入2倍体积（w/v）预冷的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液（KPB，pH7.5，内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5%蔗糖），匀浆2min，4℃静置1h，8000g离心20min；

（3）取上清液，加入PEG-6000、NaCl和Triton X-100，使其浓度分别达到质量分数为6%、0.1mol/L、质量分数为2.5%，4℃下搅拌6h，8500g离心5min；

（4）取沉淀，用0.01mol/L KPB（pH7.5，内含质量份数为0.01％TritonX-100)，充分悬浮，7000g离心10min；

（5）吸取上清液置于离心管，沉淀再悬浮离心，重复2次，合并上清液；

（6）上清液78000g超速离心2h；

（7）沉淀用0.01mol/L KPB（pH7.5）悬浮，悬浮液低速离心后取上清液，得到提纯病毒液。

一种利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒，包含上述的薇甘菊萎蔫病毒毒原。

所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊试剂盒，优选为由以下组分组成：

1）薇甘菊萎蔫病毒毒原（-20℃保存）；

2）0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液(KPB，pH7.5，内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5%蔗糖)；

3）聚乙二醇（PEG-6000）；

4）氯化钠（NaCl）；

5）Triton X-100；

6）0.01mol/L KPB（pH7.5，内含质量分数为0.01％Triton X-100)；

7）金刚砂（400～600目）；

8）0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）。

利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法，包括喷施接种薇甘菊萎蔫病毒控制薇甘菊和薇甘菊萎蔫病毒的增殖两部分。喷施接种薇甘菊萎蔫病毒达到抑制薇甘菊生长和扩散的目的；当试剂盒中病毒量不足时，通过薇甘菊萎蔫病毒的增殖来增加薇甘菊萎蔫病毒的量的目的。

利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法中的喷施接种薇甘菊萎蔫病毒控制薇甘菊包括以下步骤：

（1）将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸缓冲液（0.01mol/L，pH7.0）稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质。薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

（2）按每1g鲜病叶加入30～50mL0.01mol/L磷酸缓冲液的比例，充分研磨，3000r/min离心15min，取上清液备用；

（3）每100mL的上清液中加入0.5g400～600目的金刚砂，充分混匀，利用喷枪进行喷施接种，喷嘴距幼苗叶片2cm，空气压缩机的工作压力为2～2.5kg/cm²；

（4）为确保接种成功，可喷施接种两次，相隔一天。接种时及接种后的温度以25-27℃为宜，有利于薇甘菊萎蔫病毒的侵染。

利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法中的薇甘菊萎蔫病毒的增殖包括以下步骤：

（1）将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸缓冲液（0.01mol/L，pH7.0）稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质；薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

（2）按病叶加入2倍体积（w/v）预冷的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液(KPB，pH7.5，内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5%蔗糖)，匀浆2min，4℃静置1h，8000g离心20min；

（3）取上清液，加入PEG、NaCl和Triton X-100，使其浓度分别达到质量分数为6%、0.1mol/L、质量份数为2.5%，4℃下搅拌6h，8500g离心5min；

（4）取沉淀，用0.01mol/L KPB（pH7.5，内含质量分数为0.01％TritonX-100)，充分悬浮，7000g离心10min；

（5）吸取上清液置于离心管，沉淀再悬浮离心，重复2次，合并上清液；

（6）上清液78000g超速离心2h；

（7）沉淀用0.01mol/L KPB（pH7.5）悬浮，悬浮液低速离心后取上清液，得到提纯病毒液。

所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒在控制薇甘菊生物入侵中应用。

本发明提供了薇甘菊萎蔫病毒的保存试剂盒及利用该病毒生物控制薇甘菊入侵的方法，可有效地控制薇甘菊的扩散，克服了利用物理、化学防治薇甘菊的不足，避免了环境污染，具有方便快捷，特异性强、省时省力、防治效果好的优点，可获得良好的社会效益、经济效益和生态效益。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

现有对薇甘菊入侵的防治控制方法都存在较大的缺陷：用化学方法防除薇甘菊易造成环境污染；用物理方法控制薇甘菊，效率低、成本高，难以根除；利用生物防治的方法控制薇甘菊入侵具有特异性强，防治作用持久、对人和其他生物安全，产品无残留，不污染环境，易于与其他防控方法协调配合使用等优点，在薇甘菊生物综合防治中发挥着非常重要的作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

薇甘菊萎蔫病毒的分离和筛选：

1）取经分子生物学方法鉴定含有薇甘菊萎蔫病毒的发病薇甘菊植物叶片，25-27℃，按病叶加入2倍体积（w/v）预冷的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液(KPB，pH7.5，内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5%蔗糖)，匀浆2min，4℃静置1h，8000g离心20min，取上清液，加入PEG、NaCl和Triton X-100，使其浓度分别达到质量分数为6%、0.1mol/L、质量分数为2.5%，4℃下搅拌6h，8500g离心5min，取沉淀，用0.01mol/L KPB（pH7.5，内含质量分数为0.01％Triton X-100)，充分悬浮，7000g离心10min，吸取上清液置于离心管，沉淀再悬浮离心，重复2次，合并上清液，上清液78000g超速离心2h，沉淀用0.01mol/L KPB（pH7.5）悬浮，悬浮液低速离心后取上清液，得到提纯薇甘菊萎蔫病毒液。提纯病毒液适当稀释后，可用分光光度计测定200nm-300nm的紫外吸收曲线，并计算病毒提取率。

2）本发明发病薇甘菊植物叶片取自广州市华南农业大学试验农场、广州火炉山、广州市白云山、珠海市淇澳岛、增城市宁西冯村等地的27株薇甘菊病株中，经分子生物学方法鉴定采集的27株发病薇甘菊植物叶片确定包含薇甘菊萎蔫病毒，利用上述1）提取获得的薇甘菊萎蔫病毒液，将获得的薇甘菊萎蔫病毒液按相同量利用汁液摩擦法接种到薇甘菊幼叶上，其中采自火炉山的5号分离薇甘菊萎蔫病毒对薇甘菊有最强的侵染力，命名为蚕豆病毒属（Fabavirus）薇甘菊萎蔫病毒MMWV-5（Mikania micrantha wilt virus，MMWV-5），送与中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201321，保藏时间为2013年7月10日。

所用的分子生物学方法鉴定方法为专利ZL201210027972.0中所述的方法进行检测。

实施例2

薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒，包括以下组分：

1）薇甘菊萎蔫病毒毒原（-20℃保存）；

2）0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液（KPB，pH7.5，内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5%蔗糖）；

3）聚乙二醇（PEG-6000）；

4）氯化钠（NaCl）；

5）Triton X-100；

6）0.01mol/L KPB（pH7.5，内含质量份数为0.01％Triton X-100)；

7）金刚砂（400～600目）；

8）0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）。

实施例3

一种应用实施例2的试剂盒生物控制薇甘菊的方法，包括以下步骤：

（1）将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸缓冲液稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质。薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

（2）按每1g鲜病叶加入30～50mL0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）的比例，充分研磨，3000r/min离心15min，取上清液备用；

（3）每100mL的上清液中加入0.5g400～600目的金刚砂，充分混匀，利用喷枪进行喷施接种，喷嘴距幼苗叶片约2cm，空气压缩机的工作压力为2～2.5kg/cm²；

（4）为确保接种成功，可喷施接种两次，相隔一天。接种时及接种后的温度以25-27℃为宜，有利于薇甘菊萎蔫病毒的侵染。

在薇甘菊入侵的灌丛、人工林、天然次生林利用喷施的方法接种薇甘菊萎蔫病毒。薇甘菊感染薇甘菊萎蔫病毒后，7-10d后薇甘菊幼叶出现皱缩、萎蔫、变形、扭曲的症状，20-30d后薇甘菊顶端生长受到抑制，节间缩短，植株明显矮化。薇甘菊萎蔫病毒可以抑制薇甘菊的生长从而控制其进一步的扩散。在喷施时，也选取10种薇甘菊的常见伴生植物进行喷施，喷施20-30d后，这10种薇甘菊常见伴生植物的叶片未出现皱缩、萎蔫，说明上述薇甘菊萎蔫病毒喷施不影响这10种薇甘菊常见伴生植物的生长。上述选取的10种薇甘菊常见伴生植物为大叶榕(Ficus virens)、马尾松(Pinus massoniana)、龙眼(Dimocarpus longgana)、淘金娘(Rhodomyrtus tomentosa)、毛竹(Phyllostachys pubescens)、荔枝(Litchi chinensis)、台湾相思(Acacia confusa)、鱼尾葵(Caryota ochlandra)、大叶桉(Eucalyptus robusta)和番石榴(Psidium guajava)。

实验中发现喷施薇甘菊萎蔫病毒可侵染豇豆(Vigna sinensis)、菠菜(Spinaciaoleracea)和大豆(Glycine max)，使其叶片发生不同程度的皱缩和萎蔫，在实践中要避免在有此类作物的生境中使用本试剂盒和方法。

实施例4

一种薇甘菊萎蔫病毒的扩繁方法包括以下步骤：

（1）将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸缓冲液稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质。薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

（2）按病叶加入2倍体积（w/v）预冷的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液(KPB，pH7.5，内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5%蔗糖)，匀浆2min，4℃静置1h，8000g离心20min；

（3）取上清液，加入PEG、NaCl和Triton X-100，使其浓度分别达到质量分数为6%、0.1mol/L、质量分数为2.5%，4℃下搅拌6h，8500g离心5min；

（4）取沉淀，用0.01mol/L KPB（pH7.5，内含质量分数为0.01％TritonX-100)，充分悬浮，7000g离心10min；

（5）吸取上清液置于离心管，沉淀再悬浮离心，重复2次，合并上清液，

（6）上清液78000g超速离心2h；

（7）沉淀用0.01mol/L KPB（pH7.5）悬浮，悬浮液低速离心后取上清液，得到提纯病毒液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种薇甘菊萎蔫病毒，其特征在于命名为蚕豆病毒属(Fabavirus)薇甘菊萎蔫病毒MMWV-5(Mikania micrantha wilt virus，MMWV-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：V201321，保藏时间为2013年7月10日。

2.权利要求1所述的薇甘菊萎蔫病毒的繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质；薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d周采取病叶；

(2)按病叶重量加入2倍体积预冷的内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5％蔗糖的pH7.5的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液，匀浆2min，4℃静置1h，8000g离心20min；

(3)取上清液，加入PEG-6000、NaCl和Triton X-100，使其浓度分别达到质量分数为6％、0.1mol/L、质量分数为2.5％，4℃下搅拌6h，8500g离心5min；

(4)取沉淀，用内含质量分数为0.01％Triton X-100的pH7.5的0.01mol/LKPB，充分悬浮，7000g离心10min；

(5)吸取上清液置于离心管，沉淀再悬浮离心，重复2次，合并上清液；

(6)上清液78000g超速离心2h；

(7)沉淀用pH7.5的0.01mol/L KPB悬浮，悬浮液低速离心后取上清液，得到提纯病毒液。

3.一种利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的薇甘菊萎蔫病毒。

4.根据权利要求3所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒，其特征在于：由以下组分组成：

1)权利要求1所述的薇甘菊萎蔫病毒；

2)内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5％蔗糖的pH7.5的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液；

3)PEG-6000；

4)氯化钠NaCl；

5)Triton X-100；

6)内含质量分数为0.01％Triton X-100的pH7.5的0.01mol/L KPB；

7)400～600目的金刚砂；

8)pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液。

5.权利要求3或4所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法，其特征在于包括喷施接种薇甘菊萎蔫病毒控制薇甘菊和薇甘菊萎蔫病毒的扩繁两部分。

6.根据权利要求5所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的喷施接种薇甘菊萎蔫病毒包括以下步骤：

(1)将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸缓冲液稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质；薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

(2)按每1g鲜病叶加入30～50mL0.01mol/L磷酸缓冲液的比例，充分研磨，3000r/min离心15min，取上清液备用；

(3)每100mL的上清液中加入0.5g400～600目的金刚砂，充分混匀，利用喷枪进行喷施接种，喷嘴距幼苗叶片2cm，空气压缩机的工作压力为2～2.5kg/cm²；

(4)为确保接种成功，可喷施接种两次，相隔一天；接种时及接种后的温度以25-27℃为宜，有利于薇甘菊萎蔫病毒的侵染。

7.根据权利要求5所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的薇甘菊萎蔫病毒的增殖包括以下步骤：

(1)将薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液稀释后，在25-27℃，常规汁液摩擦接种，当蚕豆幼苗具有3～4片真叶时，在顶部的第1片和第2片真叶上均匀地洒一层石英砂，用齐头毛笔蘸取接种液在接种叶上轻轻摩擦，随后用蒸馏水冲洗掉叶片上残留的物质；薇甘菊萎蔫病毒在蚕豆上繁殖，7-10d后采取病叶；

(2)按病叶重量加入2倍体积预冷的内含体积分数为0.1％巯基乙醇，质量分数为0.01％Triton X-100，质量分数为2.5％蔗糖的pH7.5的0.5mol/L的磷酸钾盐缓冲液，匀浆2min，4℃静置1h，8000g离心20min；

(3)取上清液，加入PEG-6000、NaCl和Triton X-100，使其浓度分别达到质量分数为6％、0.1mol/L、质量分数为2.5％，4℃下搅拌6h，8500g离心5min；

(4)取沉淀，用内含质量分数为0.01％Triton X-100的pH7.5的0.01mol/LKPB，充分悬浮，7000g离心10min；

(5)吸取上清液置于离心管，沉淀再悬浮离心，重复2次，合并上清液；

(6)上清液78000g超速离心2h；

(7)沉淀用pH7.5的0.01mol/L KPB悬浮，悬浮液低速离心后取上清液，得到提纯病毒液。

8.权利要求3或4所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的试剂盒在控制薇甘菊生物入侵中应用。