CN103357016B

CN103357016B - 治疗耐药性结核病的药物组合物

Info

Publication number: CN103357016B
Application number: CN201310274445.4A
Authority: CN
Inventors: 曾娅莉; 王利民; 蒋涛; 王继相; 邓建军; 任雪松
Original assignee: Sichuan Mianyang 404 Hospital
Current assignee: Sichuan Mianyang 404 Hospital
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103357016A

Abstract

本发明涉及一种青蒿素药物组合物，特别涉及一种治疗耐药性结核用的纳米壳聚糖青蒿素与抗结核药物的组合物，包括以下有效成分：抗结核药物，纳米壳聚糖青蒿素及三种纳米壳聚糖青蒿素衍生物或青蒿素及其衍生物；所述纳米壳聚糖青蒿素包括重量百分比的以下成分制成：青蒿素或青蒿素衍生物40%-80%，聚乙烯基吡咯烷酮1%-5%，纳米壳聚糖15%-50%。本发明将青蒿素类药物、纳米壳聚糖青蒿及衍生物与抗结核药物作为药物组合物，能抑制和杀灭耐药性结核病菌，对于治疗耐药性结核病具有极其突出的疗效。

Description

治疗耐药性结核病的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种治疗耐药性结核病的药物组合物，特别涉及一种青蒿素类药物和纳米青蒿素与抗结核药物的组合物。

背景技术

近年来结核病的发病率逐渐上升，已经成为全球性重大的公共卫生问题，耐药结核的感染率逐年增加是引起结核病急剧上升的一个重要因素，也对结核病的控制造成严重影响。具世界卫生组织（WHO)报道，全球大约有20亿人感染结核分枝杆菌，虽然在2010-2011年之间肺结核新增病例有所下降，但是结核病仍然导致传染性疾病死亡的一个主要原因。尽管大规模运用卡介苗接种和抗结核药物，但结核病的感染率仍高，耐药结核（特别是耐多药结核及超耐药结核）的增加是其主要原因之一。WHO2012年报道显示:全球结核病总耐药率为20.0%，耐多药率为5.3%。我国是耐多药结核的高发国家之一，2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示：活动性肺结核患者高达499万，较2000年相比有所增加。肺结核的耐药情况：对检测的11种抗结核药物的任一耐药率为42.1％，总耐多药率为6.8％，广泛耐药率2.1％。我国现有耐多药肺结核约为33.9万，广泛耐药患者约为10.5万，由此可见，我国结核病患者的耐药情况较严重，已经对结核病的控制造成严重威胁。与此同时，临床应用的一线及二线抗结核药物种类有限，并且已有数十年没有对结核具有良好治疗作用的新药诞生，面对泛耐药结核的治疗更是陷于束手无策的境地。因此寻找新的治疗结核病的药物，尤其是治疗耐药性结核病的药物是一个不容迟缓的事情。

青蒿素是从中药青蒿中分离得到抗疟有效单体，具有过氧基团的半萜内酯化合物。临床证实青蒿素对疟疾具有“高效、速效、低毒”的突出疗效。青蒿素的衍生物主要有双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿素琥酯、蒿乙醚或蒿醚林酸，对于抗疟疾均有很好的活性。蒿甲醚被世界卫生组织列为治疗凶险型疟疾的首选药品，是我国第一个被国际公认的首创新药。近年来，又发现青蒿素类化合物对治疗和预防血吸虫病具有治疗作用；最新研究表明蒿甲醚在体内外具有广谱抗菌作用，它在治疗脓血症、乙肝、弓形虫、肺卡波尔氏囊虫等疾病时取得良好的效果，而且它还能治疗机体免疫系统相关性疾病：如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、肿瘤等。

目前少见关于青蒿素对于治疗结核杆菌的抑菌报道，白洁等人研究四种中药体外抗结核分枝杆菌H37R的作用。其研究结论表明夏枯草醇提物抗结核菌效果优于水提物；积雪草醇提物有微弱抑制结核杆菌活性，但其有效成分可能不是积雪草苷；青蒿素及二氢青蒿素无抑制结核分枝杆菌的活性。（文献1：白洁，孙海峰，陈翔飞，4种中药体外抗结核分枝杆菌H37RV的研究，时珍国医国药，18(1):77-78.）尚未见纳米青蒿素与非纳米青蒿素及其衍生物具有抗结核活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有抗结核病药物种类和数量有限，对耐药性结核尤其是泛耐药结核治疗效果差，甚至无效的困境，提供一种治疗耐药性结核病的药物组合物。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种治疗结核病的药物组合物，包括重量份的以下成分：抗结核药物1份，青蒿素或青蒿素衍生物0.1-100份。

所述青蒿素衍生物为双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿素琥酯、蒿乙醚或蒿醚林酸。

进一步，所述治疗结核病的药物组合物，包括重量份的以下成分：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物0.1-100份。

抗结核药作为治疗药物，在针对一般结核病时能够表现出良好的治疗效果，但对于耐药性结核病时，治疗效果差强人意。常常需要使用大剂量连续给药才能达到治疗效果，大剂量的给药无法避免的增加了病人的肝肾的负担，严重的情况下甚至会出现严重的肝肾衰竭。本发明中将抗结核药与青蒿素结合，青蒿素能够逆转耐药性结核病菌，极大的提高了病菌对药物的敏感性，降低抗结核药物用量，减少毒副作用。

对于不同的耐药性结核病菌，逆转其耐药性的纳米壳聚糖青蒿素复合物用量不同，不同的纳米壳聚糖青蒿素复合物对于耐药性结核病菌的逆转作用的浓度比例也不同，但总结起来用量都不能低于抗结核药十分之一。当青蒿素（衍生物）或纳米壳聚糖青蒿素（衍生物）与抗结核药物比例过低时，青蒿素类药物本身难以达到有效逆转，抗结核药物使用浓度依然比较大，毒副作用较大，不能有效达到消除，病人的身体还会受到一定的损害。而且低比例量的青蒿素在未能达到有效逆转的情况下病菌能够很快的适应出耐药菌种，使青蒿素的逆转作用进一步降低，甚至失效，所以青蒿素类药物剂量比例不能过低。逐渐加大青蒿素类药物的比例，能够更好的发挥出其逆转病菌耐药性的功效，把毒副作用降低到最低值，保证病人的身体因为药物的毒害作用达到最低化。

所述纳米壳聚糖青蒿素复合物包括重量百分比的以下成分制成：青蒿素或青蒿素衍生物40%-80%，聚乙烯基吡咯烷酮1%-5%，纳米壳聚糖15%-50%。

所述纳米壳聚糖为广汉恒宇新材料有限公司赠送，其制备方法在中国专利CN1485346A中公开。所述青蒿素衍生物为双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿素琥酯、蒿乙醚或蒿醚林酸。

青蒿素或其衍生物水溶性较差，青蒿素或其衍生物可以与纳米壳聚糖相结合形成纳米壳聚糖青蒿素复合物，复合物可充分发挥出壳聚糖生物相容性好的优点，利用纳米尺寸壳聚糖改善青蒿素或其衍生物的水溶性，促进了青蒿素的吸收，同时壳聚糖能够改善机体的免疫调节能力，增强抵抗力，强化了青蒿素的治疗效果，二者合用产生了协同增效作用，在治疗中所需用到的青蒿素剂量更小，疗效更好，降低了青蒿素的毒副作用，避免了耐药性的产生。

复合物中各组分对药物的性能都有着决定性的影响。

首先，纳米壳聚糖（下文简称壳聚糖）的用量对复合物的形成有重要影响，壳聚糖用量少于15%时（如10%），则最终产品难以形成稳定壳聚糖青蒿素复合物结构，有未溶解的青蒿素结晶析出；增加纳米壳聚糖的用量，纳米壳聚糖对青蒿素的包裹比例提高，最终达到完全包裹的效果，并逐步完善纳米微球的包裹效果，当达到一定比例以后，纳米壳聚糖包裹青蒿素的微球不再变化，多余的纳米壳聚糖形成无包裹物的实心微球，并开始逐渐对包裹有药物的微球之间形成团聚。当壳聚糖用量大于50%时（如60%），团聚现象严重，微球之间粘连比例将会影响到纳米壳聚糖青蒿素复合物在水中释放出的青蒿素速度，及平衡浓度，进而药物所能够达到的治疗效果下降。

然后，聚乙烯基吡咯烷酮是一种分散剂，水溶性纳米壳聚糖本身已经是一种稳定的微球结构，加入聚乙烯基吡咯烷酮，在纳米壳聚糖重新排布形成新的微球的过程中，将会促进青蒿素及其衍生物被作为微球核被包裹住。聚乙烯基吡咯烷酮本身还有有助于使青蒿素或其衍生物的均匀分布，并促进使壳聚糖与青蒿素形成在水中稳定的胶体复合物；并且聚乙烯基吡咯烷酮的羰基与青蒿素或其衍生物上的氢原子能形成氢键，这种键合能够抑制青蒿素形成大的结晶，使青蒿素更趋向于无定形态，显著改善青蒿素的溶解度和溶出速度。

当聚乙烯基吡咯烷酮的用量为1%-5%时，对青蒿素的均匀分布及溶解度的改善效果最佳；若聚乙烯基吡咯烷酮的用量少于1%（如0.5%），则不能够达到有效的分散效果或者分散效果不佳的情况下形成微球粒径差异大，制得药物的缓释比例不稳定，进而难以作为有效的治疗药物使用。更有甚者，由于青蒿素与壳聚糖结合的分散比例不佳，微球形成过程中，青蒿素未能均匀分布于壳聚糖中，出现单质青蒿素结晶析出。在一定用量范围内，增加聚乙烯基吡咯烷酮用量的增加，能使青蒿素更加均匀地分布于壳聚糖中，形成稳定水溶性溶胶复合物；但是当聚乙烯基吡咯烷酮的用量过大，大于5%时（如8%），壳聚糖青蒿素复合物的结构稳定性降低，真空干燥后再次溶于水时易于出现壳聚糖不成溶胶的问题，一遇水就自然完全分散，甚至部分还出现了青蒿素单体析出，壳聚糖单独分散的问题。

壳聚糖为脱乙酰化的甲壳素，生物相容性更好，对机体的刺激性更低，且壳聚糖能够增强机体免疫能力。纳米壳聚糖为应用现代纳米技术加工壳聚糖实现纳米化，制备得到的壳聚糖粒径在20-80nm范围，并呈现多种纳米形态粒子、独立类球形粒子、类球粒子串联的网络、非粒子三维胶体网络的纳米壳聚糖。所述纳米壳聚糖为广汉恒宇新材料有限公司赠送，其制备方法在中国专利CN1485346A中公开。

进一步，所述纳米壳聚糖青蒿素复合物为纳米壳聚糖双氢青蒿素复合物，所述纳米壳聚糖双氢青蒿素复合物由重量百分比的以下成分制成：双氢青蒿素40%-80%，聚乙烯基吡咯烷酮1%-5%，纳米壳聚糖15%-50%。

进一步，优选的所述治疗结核病的药物组合物，包括重量份的以下成分：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物5-80份。在该比例范围内青蒿素的用量适宜，不易产生毒副作用，能够更好的治疗耐药性结核病。

更优选重量份的：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物15-60份。在该比例范围内，青蒿素相对于抗结核药物的用量比例更进一步的调整，青蒿素类药物用量更适宜，能够最大化的发挥出青蒿素辅助抗结核药物对于治疗耐药性结核病的效果。

最优选重量份的：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物25-30份。在此比例范围内，纳米壳聚糖青蒿素复合物对病菌的逆转作用与抗结核药物的协同效果达到最大化，既充分发挥青蒿素类药物的逆转作用，又能够在同时达到极好的抗结核病菌治疗效果。青蒿素类药物与抗结核类药物达到最佳协同增效的情况，将两种药物分别使用的毒副作用降低到最小，治疗效果提升到最大。

进一步，所述抗结核药为异烟肼，利福平，乙胺丁醇，吡嗪酰胺，链霉素，卡那霉素，丁胺卡那霉素，卷曲霉素，紫霉素，环丙沙星，氧氟沙星，左氧氟沙星，莫西沙星，加替沙星，乙硫异烟胺，丙硫异烟胺，环丝氨酸，特立齐酮，对氨基水杨酸，氨硫脲，氯法齐明，阿莫西林/克拉维酸，克拉霉素，利奈唑胺，及抗结核药物的固定复方制剂。

采用已知方法将以上治疗结核病的药物组合物和药学可以接受的药用辅料制成任意制剂。

上述药物组合物在治疗耐药性结核病中的应用。所述耐药结核病包括：单耐药、多耐药、耐多药和广泛耐药结核病。所述单耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对一种一线药物抗结核药物耐药。所述多耐药：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对不同时包括异烟肼、利福平在内的一种以上的一线抗结核药物耐药。所述耐多药（MDR－TB）：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实至少对异烟肼、利福平耐药。所述广泛耐多药（XDR－TB）：结核病患者感染的结核杆菌体外被证实除了至少对两种主要一线抗结核药物异烟肼、利福平耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗生素（如：氧氟沙星）产生耐药，以及二线抗结核注射药物（如：卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等）中的至少一种耐药。

进一步，上述药物组合物在治疗耐异烟肼性结核病中的应用。

进一步，上述药物组合物在治疗耐利福平性结核病中的应用。

发明人研究发现，虽然如文献1报道所述青蒿素及其衍生物对于结核病菌没有抑制作用，但是青蒿素及其衍生物具有转变耐药性结核病菌耐药性的作用。青蒿素及其衍生物水溶性较差，发明人发现，青蒿素或其衍生物可以与纳米壳聚糖相结合形成纳米壳聚糖青蒿素复合物，制备得到的复合物对于耐药性结核杆菌具有逆转耐药性表达，降低耐药菌株的耐药性，在与抗结核药联用后，具有意想不到抑菌和杀灭结核杆菌作用。突出表现为此类化合物与异烟肼、利福平等抗结核药物联合用药时，极低的抗结核病药物浓度即可达到很好的抑制效果。

将纳米壳聚糖作为载体材料与我国传统药物青蒿素类药物结合，改善了青蒿素的溶解度和半衰期短的缺点，提高了青蒿素的生物利用度，降低了用药剂量，消除了耐药性的产生，充分发挥青蒿素的药理作用。纳米壳聚糖青蒿素复合物中青蒿素对于耐药性菌株的耐药性转化作用，消除耐药菌株的耐药性的效果。纳米壳聚糖青蒿素复合物与抗结核药物作为组合物使用，改变了青蒿素的理化性，增加了青蒿素的生物利用度，尤其是对耐药菌株有极好的疗效，能完全抑制或杀灭结核杆菌，尤其对耐多药结核杆菌的作用表现突出。

与现有技术相比，本发明的有益效果：纳米壳聚糖青蒿素复合物与抗结核药物联合应用，对耐药性结核具有很好的治疗效果，解决了长久以来结核病治疗中耐药性结核难以治疗，无法治疗和治疗副作用大的缺陷。

附图说明：

图1纳米壳聚糖青蒿素复合物及青蒿素类药物与异烟肼联用对耐多药株的抑制率

图2纳米壳聚糖青蒿素复合物及青蒿素类药物与利福平联用对耐多药株的抑制率

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下实施方式中简称说明：

青蒿素及其衍生物简称为青蒿素类药物。

跟据纳米壳聚糖青蒿素复合物制备原料中青蒿素及其衍生物不同，分别简称为纳米青蒿素、纳米蒿甲醚、纳米双氢青蒿素、纳米青蒿素琥酯。上述纳米壳聚糖青蒿素复合物，总的简称为纳米青蒿素类药物。

实施例1 青蒿素与异烟肼的药物组合物

药物组合物：异烟肼1份、青蒿素50份。

实施例2 双氢青蒿素、利福平的药物组合物

药物组合物：利福平1份、双氢青蒿素25份。

实施例3 纳米壳聚糖双氢青蒿素、利福平、乙胺丁醇的药物组合物

药物组合物：利福平1份、乙胺丁醇2份、纳米双氢青蒿素20份。

实施例4 纳米壳聚糖蒿甲醚、吡嗪酰胺的药物组合物

药物组合物：吡嗪酰胺1份、纳米蒿甲醚100份。

实施例5 纳米壳聚糖青蒿素琥酯、吡嗪酰胺的药物组合物

药物组合物：吡嗪酰胺1份、纳米青蒿素琥酯50份。

实施例6 纳米壳聚糖双氢青蒿素、利福平的药物组合物

药物组合物：利福平1份、纳米壳聚糖双氢青蒿素25份。

实施例7 双氢青蒿素、异烟肼的药物组合物

药物组合物：异烟肼1份、双氢青蒿素24份。

实施例8 蒿甲醚、利福平的药物组合物

药物组合物：利福平1份、蒿甲醚50份。

实施例9 纳米双氢青蒿素、异烟肼和利福平的药物组合物

药物组合物：利福平1份、异烟肼1份、纳米壳聚糖双氢青蒿素40份。

上述实施例中纳米壳聚糖青蒿素复合物按照以下方法制备并进行检测

纳米青蒿素类药物制备将青蒿素及三种衍生物（蒿甲醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯、纳米青蒿素琥酯）加入纳米壳聚糖胶体溶胶（广汉恒宇新材料有限公司赠送，制备方法在中国专利CN1485346A中公开）中，用四联恒温磁力搅拌器，70℃中速（150-400r/min）搅拌1h，制备出纳米壳聚糖青蒿素复合物（分别为纳米青蒿素、纳米蒿甲醚、纳米双氢青蒿素、纳米青蒿素琥酯）。

粒径测试使用激光粒度扫描仪（见表4）检测制备得到的纳米青蒿素类药物的平均粒径、分散度，测试结果见表1。

表1纳米壳聚糖青蒿素类药物的粒径及分散度

纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物对耐药结核的抑菌或杀菌作用观察

1实验药品、试剂及仪器

表2实验药品

表3试剂

表4仪器

2实验方法

2.1鉴定菌型及增菌

结核分枝杆菌临床株，按《结核病诊断细菌学检验规程》鉴定菌型，并用酸罗氏培养基进行绝对浓度法药物敏感试验，筛选出耐异烟肼株、耐利福平株、耐多药株（具有多种抗结核药物耐药性的结核菌株，缩写为耐MDR株），采用基因芯片法再次鉴定菌型及耐药性。将H37RV株及以上筛选出的三株耐药结核菌株接种于酸罗氏培养基，37℃、5％CO₂的恒温培养箱中孵育2-3周，增菌。

2.2MTT检测药物对结核菌株的抑制和杀菌作用

2.2.1实验分组与药物浓度选择

实验分组：

实验组1：纳米青蒿素类药物单用；实验组2：青蒿素类药物单用；实验组3：纳米青蒿素类药物和青蒿素类药物与异烟肼（INH）联用；实验组4：纳米青蒿素类药物和青蒿素类药物与利福平（RFP）联用；设阳性对照组（INH及RFP单用），阴性对照组（菌液组）和空白对照组（米氏7H9培养液）。

药物浓度选择：

纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物均选5个浓度：（50ug/mL，100ug/mL，200ug/mL，400ug/mL，800ug/mL）；

异烟肼浓度：（0.125ug/mL，0.25ug/mL，0.5ug/mL，1ug/mL，2ug/mL）；

利福平浓度：（0.25ug/mL，0.5ug/mL，1ug/mL，2ug/mL，4ug/mL）。

2.2.2单用纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物、INH和RFP分别对四种结核菌株的作用观察

◆加药：每种药物的贮存液用米氏7H9液稀释至试验最大终浓度的2倍，每种药物在无菌96孔板上加入100uL／孔米氏7H9液直接进行2倍系列稀释，同一浓度设3个复孔。

◆配制菌液：在生物安全柜中，在酸罗氏培养基中选取2-4个结核杆菌菌落，加3-5滴0.5％Tween80生理盐水进行磨菌，磨菌后的菌液用米氏7H9液调至1个麦氏单位浓度（相当于3×10⁸CFU／m1），用米氏7H9液1：20稀释，接种到96孔板中，100uL／孔。阴性对照组只加100uL／孔的菌液及100uL／孔的米氏7H9液，设3个复孔；空白组不加菌液及药物，只加等量（200uL／孔）的米氏7H9液，设3个复孔，周边的孔内加入蒸馏水以防在孵育时水份蒸发

◆呈色：将培养板密封置37℃含5％CO₂的恒温培养箱中孵育8天后，每孔加入MTT液（5mg/mL）10uL，再孵育24h，终止培养，每孔加入DMSO100uL，置摇床充分振荡6min，使结晶物充分溶解，再密封培养板置于37℃含5％CO₂的恒温培养箱中孵育3h。

◆比色：选用490nm波长，在酶标仪检仪上测定各孔的吸光值，记录结果。

2.2.3纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物分别联合INH对四种结核菌株的作用观察

◆加药：分别将纳米青蒿素类药物和青蒿素类药物的贮存液用米氏7H9液稀释至试验最大终浓度的2倍，每种药物在无菌96孔板上加入50uL／孔米氏7H9液直接进行2倍系列稀释，同一浓度设3个复孔，置37℃含5％CO₂的恒温培养箱中孵育24h后，每孔再分别加入INH（1ug/mL）50uL／孔。

◆配制菌液：同2.2.2。

◆呈色：同2.2.2。

◆比色：同2.2.2。

2.2.4纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物联合RFP对四种结核菌株的作用

◆加药：分别将纳米青蒿素类药物和青蒿素类药物的贮存液用米氏7H9液稀释至试验最大终浓度的2倍，每种药物在无菌96孔板上加入50uL／孔米氏7H9液直接进行2倍系列稀释，同一浓度设3个复孔，置37℃含5％CO₂的恒温培养箱中孵育24h后，每孔再分别加入RFP（2ug/mL）50uL／孔。

◆配制菌液：同2.2.2。

◆呈色：同2.2.2。

◆比色：同2.2.2。

2.2.5纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物抑制率、IC50和耐药指数的计算

药物对结核杆菌抑制率：取每3个复孔的OD值的平均数，计算结核杆菌的抑制率：

IC50：采用SPSS11.5统计软件分析处理，计算药物的IC₅₀值。

耐药指数：耐药指数=联合用药耐药菌株IC₅₀/联合用药H37RV敏感株的IC₅₀。

2.3基因芯片技术检测三种耐药结核菌株耐药位点荧光值变化

纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物与INH和RFP联用后，经过比较，纳米双氢青蒿素对耐药结核的抑制作用较明显，故选取纳米双氢青蒿素与耐药结核作用后，再检测基因位点。

◆配制菌液：选取耐INH株、耐RFP株和MDR株，配制方法同2.2.2。

◆加药：将纳米双氢青蒿素用米氏7H9液稀释浓度为200ug/mL，加入接种了菌液的96孔板中，100uL／孔，设3个复孔。周边的孔内加入蒸馏水以防在孵育时水份蒸发。

◆耐药位点检测将培养板密封置37℃含5％CO₂的恒温培养箱中孵育8天后，终止培养，利用基因芯片技术对耐药结核分支杆菌的耐药位点进行检测。

3.统计分析

实验数据采用SPSS11.5统计软件分析处理，各组间的均数比较采用方差分析

试验结果

1．单用青蒿素类药物对结核分枝杆菌均无抑制作用

各孔在加入DMSO后，颜色从黄色变为紫色沉淀，经37℃含5％CO₂的恒温培养箱中再孵育孵育3h后，颜色仍为紫色，预示有结核分枝杆菌生长。说明单用青蒿素类药物对结核分枝杆菌均无抑制作用。

2．单用纳米青蒿素类药物对结核分枝杆菌均无抑制作用

各孔在加入DMSO后，颜色从黄色变为紫色沉淀，经37℃含5％CO₂的恒温培养箱中再孵育孵育3h后，颜色仍为紫色，预示有结核分枝杆菌生长。说明单用纳米青蒿素类药物对结核分枝杆菌均无抑制作用。

3．单用INH及RFP对H37RV株有抑制作用，对耐药菌株均无抑制作用

加入DMSO后，H37RV株各孔颜色为淡黄色，无肉眼可见的紫色沉淀，耐药菌株各孔颜色从黄色变为紫色沉淀，说明单用INH及RFP对H37RV株有抑制作用，对耐药菌株均无抑制作用。利用SPSS11.5统计算出药物的IC₅₀值，将耐药结核菌株与H37RV株的IC₅₀值比较，p·0.05，具有统计学意义，算出耐药指数，如表5-6。

表5不同结核菌株与INH及RFP作用后IC₅₀值

注：耐药结核菌株与H37RV株相比，p·0.05。

表6耐药结核菌株与INH和RFP作用后的耐药指数

4．纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物分别与INH联用对耐药结核杆菌作用观察

4.1杀菌作用

各孔在加入DMSO后，颜色为淡黄色或黄色，无肉眼可见的紫色沉淀，说明对结核杆菌均有抑制作用，将96孔板部分显色为黄色的孔震荡器混匀，接种环挑取孔内培养液，涂片抗酸染色后显微镜观察，均无结核杆菌生长，说明一定浓度的纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物与INH联用后能杀灭结核杆菌株。

4.2纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物分别与INH联用对MDR抑制率

由图1可看出，纳米青蒿素及青蒿素类药物分别与INH联用对MDR株均有抑制作用。纳米青蒿素类药物与INH联用对耐MDR株的抑制作用强于青蒿素类药物与INH联用。抑制作用随着药物剂量的增加呈现递增趋势。

4.3纳米青蒿素类药物与INH联用后的IC₅₀值显著低于青蒿素类药物与INH联用

IC₅₀值与药物的抑菌作用呈反比，实验组1和INH联用后耐药菌株的IC₅₀值明显低于实验组2和INH联用后对耐药菌株的IC₅₀值，实验组1与实验组2的IC₅₀值相比，p·0.05，具有统计学意义。对于不同的结核菌株，联合用药后表现的IC₅₀值也不相同，耐药菌株的IC₅₀值明显低于H37RV株；耐INH株的IC₅₀值低于耐RFP株；对MDR株IC₅₀值低于耐INH株与耐RFP株，说明纳米青蒿素类药物及青蒿素类药物对多耐药株的抑菌效果具有显著优势,如表7。

表7纳米青蒿素类药物、青蒿素类药物分别与IHN（1ug/L）联用对结核杆菌的

注：实验组1和实验组2比较，^☆p·0.05，^◎p·0.05，^▽p·0.05，^◇p·0.05，n=3

4.4纳米青蒿素类药物与INH联用后的耐药指数显著下降

实验组1和INH联用后的耐药指数比实验组2耐药指数下降更明显，与阳性对照组比较，耐药菌株的耐药指数均有明显下降，p·0.05，n=3，具有统计学意义。对于耐药菌株的不同，实验组1与实验组2和INH联用后耐药指数下降的程度也不相同，实验组1和实验组2与INH联用后，耐INH株的耐药指数比耐RFP株下降更显著；MDR株耐药指数比耐INH株与耐RFP株株下降更多，如表8。

表8实验组和异烟肼（1ug/mL）联用后与对照组的耐药指数比较

注：非纳米组和纳米壳聚糖组与对照组的耐药指数相比，p·0.05

5．纳米青蒿素类药物及青蒿素类药物与RFP联用对多耐药结核菌株均有抑制和杀菌作用。

5.1杀菌作用

各孔在加入DMSO后，颜色为淡黄色或黄色，无肉眼可见的紫色沉淀，说明对结核杆菌均有抑制作用，将96孔板部分显色为黄色的孔震荡器混匀，接种环挑取孔内培养液，涂片抗酸染色后显微镜观察，均无结核杆菌生长，说明一定浓度的纳米青蒿素类药物及青蒿素类药物与RFP联用后能杀灭结核杆菌株。

5.2纳米青蒿素及青蒿素类药物分别与RFP联用对MDR抑制率

由图2可看出，实验组4对MDR株均有抑制作用。纳米青蒿素类药物与RFP联用对耐MDR株的抑制作用强于青蒿素类药物与RFP联用。对MDR株的抑制作用随着药物剂量的增加呈现递增趋势。

5.3纳米青蒿素类药物与RFP联用后IC₅₀值显著低于青蒿素类药物与RFP联用

实验组1与RFP联用后耐药菌株的IC₅₀值明显低于实验组2和RFP联用后对耐药菌株的IC₅₀值，对于不同的结核菌株，联合用药后表现的IC₅₀值也不相同，对耐药菌株的IC₅₀值明显低于H37RV株。与RFP联用后，耐RFP株的IC₅₀值低于耐INH株；MDR株IC₅₀值低于耐INH株与耐RFP株，说明纳米青蒿素类药物及青蒿素类药物对多耐药株的抑菌效果具有明显优势，如表9。

表9纳米青蒿素及青蒿素类药物分别RFP（2ug/L）联用对结核杆菌的

注：实验组1和实验组2比较，^☆p·0.05，^◎p·0.05，^▽p·0.05，^◇p·0.05

5.4纳米青蒿素及青蒿素类药物和RFP联用后，耐药菌株的耐药指数下降

实验组1和2与INH联用后的耐药指数下降，实验组1比实验组2耐药指数下降更显著，各组与阳性对照组比较，耐药菌株的耐药指数均有明显下降，p·0.05，n=3，具有统计学意义。对于不同的耐药菌株，与INH联用后耐药指数下降的程度也不相同，实验组1与实验组2和INH联用后耐药指数下降的程度也不相同，实验组1和实验组2与RFP联用后，耐RFP株的耐药指数比耐INH株下降更显著；

MDR株耐药指数比耐INH株与耐RFP株下降更多，说明纳米青蒿素类药物及青蒿素类药物对多耐药株的抑菌效果具有明显优势，如表10。

表10实验组与利福平（2ug/mL）联用后与对照组的耐药指数比较

注：实验组1和实验组2和对照组的耐药指数相比，p·0.05

6.经基因芯片检测，纳米双氢青蒿素与耐药结核杆菌作用后，耐药位点的基因检测表达值有下降，荧光信号显著减低

经基因芯片检测，纳米双氢青蒿素与耐药结核杆菌作用后，与用药前相比，耐药结核杆菌的耐药位点无改变，但其耐药位点的基因检测表达值比用药前有下降，耐INH株突变的katG基因检测表达值用药后下降了47.5%，耐RFP株突变的rpoB基因检测表达值下降了97.3%，耐多药株突变的katG基因检测表达值下降了14.7%，突变的rpoB基因检测表达值下降了60.1%，耐药位点的荧光强度用药后明显减弱，如表11-13。

表11耐INH株用纳米壳聚糖二氢青蒿素作用前后的基因检测值

由表11可见，与用纳米双氢青蒿素前相比，耐异烟肼株突变的katG基因位点的基因检测表达值用药有明显下降，比用药前下降了47.5%。

表12耐利福平株用纳米双氢青蒿素前后的基因检测值

由表12可见，与用纳米双氢青蒿素处理前相比，耐利福平株突变的rpoB基因位点的基因检测表达值用药后有明显下降，比用药前下降了47.5%。

表13耐多药株用纳米双氢青蒿素前后的基因检测值

由表13可见，与用纳米双氢青蒿素处理前相比，MDR株突变的rpoB基因位点的基因检测表达值用药后有明显下降，比用药前下降了60.1%，katG基因检测表达值下降了14.7%。

结论：

纳米青蒿素类药物和青蒿素类药物分别与异烟肼、利福平联用对耐药性结核杆菌有抑制作用，并与药物剂量正相关；纳米青蒿素类药物联用异烟肼、利福平对耐药结核杆菌的抑菌作用更强，且与青蒿素类药物联用异烟肼、利福平的效果相比，纳米青蒿素类药物的效果更好，两者之间存在统计学上的显著差异（p·0.05）。

青蒿素类药物与抗结核类药物作为组合物药物使用后耐单一药物菌株的耐药性下降至0.34-0.62，纳米青蒿素类药物与抗结核药物作为组合药物耐单一药物菌株的耐药性下降至0.002-0.17，与对比相比较下降3-180倍（表8、10）。

青蒿素类药物与抗结核类药物作为组合物药物使用后耐多药菌株的耐药性下降至0.14-0.17，纳米青蒿素类药物与抗结核药物作为组合药物耐多药物菌株的耐药性下降至0.02-0.13，与对比相比较下降0.3-30倍（表8、10）。

纳米青蒿素类药物与青蒿素类药相比，分别与抗结核药物作为组合药物使用对于治疗耐药性结核病菌均显著、突出优势。

Claims

1.一种治疗结核病的药物组合物，其特征在于，包括重量份的以下成分：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物0.1-100份；

所述纳米壳聚糖青蒿素复合物包括重量百分比的以下成分制成：青蒿素或青蒿素衍生物40%-80%，聚乙烯基吡咯烷酮1%-5%，纳米壳聚糖15%-40%；

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，包括重量份的以下成分：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物5-80份。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，包括重量份的以下成分：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物15-60份。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，包括重量份的以下成分：抗结核药1份，纳米壳聚糖青蒿素复合物25-30份。

5.如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其特征在于，所述抗结核药为异烟肼，利福平，乙胺丁醇，吡嗪酰胺，链霉素，卡那霉素，丁胺卡那霉素，卷曲霉素，紫霉素，环丙沙星，氧氟沙星，左氧氟沙星，莫西沙星，加替沙星，乙硫异烟胺，丙硫异烟胺，环丝氨酸，特立齐酮，对氨基水杨酸，氨硫脲，氯法齐明，阿莫西林/克拉维酸，克拉霉素和利奈唑胺中的一种或几种。