CN103352065A - 一种怀山药抗氧化多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种怀山药抗氧化多肽及其制备方法，属于生物技术领域。以怀山药为原料，采用中性蛋白酶对怀山药进行酶解得到怀山药粗多肽液，再通过无水乙醇脱糖、透析、葡聚糖凝胶层析等分离纯化手段得到怀山药抗氧化多肽，其分子量范围为600-5000da。本发明制备得到的怀山药抗氧化多肽具有较高的纯度及抗氧化性，若开发成一种天然抗氧化剂，不仅消除了人们对于人工合成氧化剂的安全性忧虑，还促进了怀山药的开发及综合利用，为抗氧化肽在食品、医学上的应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种怀山药抗氧化多肽及其制备方法。
背景技术
生物分子的氧化是一个自由基介导的过程，它会对食品和生物系统造成许多不利的影响。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制抗氧化物的的作用一直是生化营养学的研究热点。多肽是涉及生物体内多种细胞功能的活性物质。随着现代蛋白质工程、生物酶工程技术的发展，大量具有特性功能的生物活性肽被发现、开发出来，应用于食品配方、化妆品等领域。多肽的抗氧化作用机制的研究及抗氧化多肽的制备方法研究也日渐成熟。化学合成的抗氧化剂虽然价格便宜、效果好，但目前很多研究者发现化学合成抗氧化剂对人体肝、肺等器官会造成蓄积性致癌作用，从而引起人们对化学合成抗氧化剂的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的应用。于是人们把目光转向了天然抗氧化剂，因此，天然抗氧化多肽的制备研究显得尤为重要。
素有“怀参”之称的怀山药产自河南焦作境内，具有极高的药用及保健价值，是很多保健药品和功能性食品的主要原料之一。怀山药中含有丰富的蛋白，将其蛋白提取出来通过蛋白酶酶解成多肽液，再对多肽液进行纯化，可得到具有较强抗氧化活性的怀山药多肽。生物活性肽是人体中极其重要的活性物质，它参与了人体生长发育、新陈代谢、疾病及衰老、死亡的整个过程，并起着至关重要的作用。研究发现，肽与蛋白质相比，具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，低分子肽不会产生过敏反应等优点。除此之外，还具有众多的生理活性，如抗氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳、促进乙醇代谢等活性。
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。它是目前多肽最广泛使用的分离方法之一，也是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种怀山药抗氧化多肽的制备方法，该方法分离效果好，获得的多肽纯度达90%以上。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的怀山药抗氧化多肽。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种怀山药抗氧化多肽的制备方法，包括如下步骤：采用中性蛋白酶对怀山药进行酶解得到怀山药粗多肽液，经分离纯化、冷冻干燥得到怀山药抗氧化多肽；所述的分离纯化的手段包括脱糖、透析和凝胶层析。
所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）怀山药粗多肽液的制备：称取怀山药，加入水打浆；先热处理，再冷却至酶解反应温度，用NaOH溶液调至酶反应所需 pH值，加入中性蛋白酶，反应过程中不断滴加NaOH溶液，使pH值稳定在酶反应所需 pH值，反应结束后，灭酶，冷却，离心取上清液，即得到黄褐色的怀山药粗多肽液YP。
（2）脱糖：用无水乙醇对粗多肽液YP进行脱糖得到脱糖后的多肽液YP 
。
（3）透析：将多肽液YP用三氯乙酸处理，可除去多肽液中剩余的大部分蛋白，脱除蛋白后，通过1000da透析袋透析，多肽液中小于1000da的小分子氨基酸及离子等均被透析掉，得到较纯的混合肽组分YPP。
（4）凝胶层析：用Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析分离混合肽组分YPP，收集最佳抗氧化活性组分的层析洗脱液，再经1000da透析袋透析脱盐。
（5）冷冻：收集脱盐后的多肽液，置于-50℃以下超低温冰箱冷冻24h以上形成冰块。
（6）干燥：将冷冻冰块置于真空干燥机中干燥，得到怀山药抗氧化多肽。
步骤（1）中所述的怀山药粗多肽液的制备优选为：按20%质量浓度的底物浓度称取怀山药，加入蒸馏水打浆；然后在 90℃下热处理30min，冷却到45℃后，用0.1mol/L的NaOH溶液调至pH为6，依据所用酶的活力单位加入酶底物比[E]/[S]为1.2-6万U/g的中性蛋白酶，反应过程中不断滴加 0.1mol/L的NaOH溶液，使pH值稳定6；反应6h后，沸水浴灭酶 10min，冷却后10000r/min离心15 min取上清液，即得到黄褐色的怀山药粗多肽液YP。
步骤（2）中所述的脱糖优选为：按照无水乙醇与粗多肽液YP体积比1:1的比例混合，于摇床170rpm/min摇动1h，8000rpm/min离心15min，取上清液即为脱糖后的多肽液YP
。
步骤（3）中所述的三氯乙酸优选为体积浓度15%的三氯乙酸，多肽液YP
与15%的三氯乙酸的体积比优选为1:1。
步骤（4）中所述的凝胶层析的条件优选为：采用的层析柱柱径为2cm，装柱高度为45-70cm，进样量为0.5-1mL，洗脱液为pH 8.0终浓度50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷/HCI和终浓度0.lmol/L氯化钠的混合液，流速3-6mL/10min，在280nm下进行测量；收集不同吸收峰的洗脱液，通过羟自由基试剂盒测定各洗脱组分的抗氧化活性，进而收集最佳抗氧化活性组分的层析洗脱液。
所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法还包括进一步粉碎过筛和灌装，具体如下：粉碎过筛：将冷冻、干燥得到的怀山药多肽经粉碎机粉碎，过100目振动筛；灌装：过筛后的怀山药抗氧化多肽粉进行无菌灌装，得到怀山药抗氧化多肽粉。
一种怀山药抗氧化多肽通过上述方法制备得到，其分子量为600-5000da。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，是一种天然抗氧化剂，可以取代传统的合成食品抗氧化剂。这种抗氧化肽也会被作为主要活性成分开发成各种保健品，如保健食品、化妆品等，这不仅对提高人们的健康水平有着十分重要的意义，并且会促进山药的规模化生产及深加工，为抗氧化肽在食品、医学上的应用奠定了基础。
附图说明
图1 为Sephadex G-50葡聚糖凝胶对怀山药混合肽的分离效果图；
时间：1小时46分29秒，A=0.014；
时间：2小时13分47秒，A=0.018；
时间：4小时55分33秒，A=0.035；
时间：14小时31分06秒，A=0.032。
图2为洗脱液标准曲线图；牛血清蛋白（M=68000）出峰时间：0小时51分07秒，A=0.109；牛胰岛素（M=5700）出峰时间：2小时03分19秒，A=0.031。
图3为分子量对数与洗脱体积关系图，分子量分布曲线方程为：y=-0.0498x+5.5951。
图4为不同洗脱组分还原能力比较图，YPP III组分有较强的还原能力。
图5为不同洗脱组分羟自由基清除活性图，YPP III组分有较强的羟自由基清除活性，与维生素C相当。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
（1）怀山药粗多肽液的制备：按20%的底物浓度准确称取100g新鲜山药，加入400mL蒸馏水打浆；然后在90℃下热处理30min，冷却到酶解反应温度45℃后，用0.1 mol/L的NaOH溶液调至酶反应所需 pH值pH 6；加入3g中性蛋白酶（郑州聚亿鑫化工原料有限公司，食品级，酶活为120万U/g），反应过程中不断滴加0.1mol/L的NaOH溶液，使pH值稳定在6；反应6h后，沸水浴灭酶10min，冷却后10000r/min离心15 min取上清液，即得到黄褐色的怀山药粗多肽液YP。经双缩脲法测定得粗多肽液YP多肽含量为0.98g/L，多肽的得率为0.26g/100g山药。
（2）脱糖：用无水乙醇对粗多肽液YP进行脱糖，按照无水乙醇与粗酶解液体积比1:1的比例混合，于摇床170rpm/min摇动1h，8000rpm/min离心15min，取上清液即为脱糖后的多肽液YP。经苯酚硫酸法和双缩脲法测定得多糖去除率达58.07%，多肽保留率达75.17%。
（3）透析：多肽液YP
经体积浓度15%的三氯乙酸按体积比1:1比例处理，可除去多肽液中剩余的大部分蛋白，脱除蛋白后，通过1000da透析袋透析，多肽液中小于1000da的小分子氨基酸及离子等均被透析掉，得到较纯的混合肽组分YPP。
（4）凝胶层析：用Sephadex G-50（pharmacia公司）葡聚糖凝胶层析分离混合肽组分YPP，采用的层析柱柱径为2cm，装柱高度为70cm，进样量为1mL，洗脱液为pH 8.0终浓度50mmol/L三羟甲基氨基甲烷/HCI和终浓度0.lmol/L氯化钠的混合液，流速3mL/10min，在280nm下进行测量，收集不同吸收峰的洗脱液，通过羟自由基试剂盒测定各洗脱组分的抗氧化活性。
采用的仪器、检测手段如下：
利用自动收集器（BSZ-100，上海精科实业有限公司）和电脑紫外检测仪（HD-9707，上海精科实业有限公司）检测收集不同洗脱组分。
怀山药抗氧化多肽的分子量及抗氧化活性测定如下：
1）抗氧化多肽的分子量测定
测定最佳抗氧化活性组分分子量，定量进样牛血清蛋白和牛胰岛素标准品混合液，绘制标准蛋白质吸收曲线（见图2），确定标准蛋白质峰值所对应的洗脱液时间，再以此洗脱液时间为横坐标，蛋白质标准品相应分子量对数值为纵坐标作图绘制logM-V标准曲线（见图3），采用一元线性回归法求得分子量对数值与洗脱液时间的关系式，从而得到标准品分子量分布曲线。根据此分布曲线由最佳抗氧化多肽组分的洗脱时间可求出最佳抗氧化多肽组分的分子量范围。
2）抗氧化活性的测试
抗氧化活性通过还原能力和羟自由基清除活性综合进行比较。
3）还原能力的测试
取一定浓度的样品（0.1mg/mL-500mg/mL）2.5mL，加入2.5mL pH6.6的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）和2.5mL 质量浓度l%的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20min后加入2.5mL体积浓度10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min离心10min。取上清夜2.5mL，加2.5mL蒸馏水和0.50mL 质量浓度0.1%的FeC13，室温下显色5min，然后在700nm波长处测定吸光度。空白管即把样品换成2.5mL蒸馏水，其余操作步骤与样品管相同。测得的吸光度越大，则样品的还原能力越强。
4）羟自由基清除活性的测试
利用羟自由基试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定洗羟自由基清除活性，按照表1所述方法将表中各溶液混匀，37℃反应1分钟（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到一分钟结束，立即加入显色剂终止反应，每支比色管加入显色剂的量均为2mL，一次只能做一只比色管。加入显色剂后，混匀，室温放置20分钟后，1cm光径，550nm，蒸馏水调零，测各管吸光度值。
表1 羟自由基清除活性测定方法表
| 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 | |
| 蒸馏水（mL） | 0.4 | 0.2 | 0.2 | |
| 0.03％H2O2标准应用液（mL） | 0.2 | |||
| 底物应用液（mL） | 0.2 | 0.2 | ||
| 样本*（mL） | 0.2 | |||
| 试剂三应用液（mL） | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
5）清除羟自由基活性计算公式
清除羟自由基能力（U/mL）=（对照OD值-测定OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（8.824mmol/L）×（1mL/取样量）×样本测试前稀释倍数。
结果如下：Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析分离混合肽组分YPP的效果图如图1所示，收集吸收峰
、、
、
的洗脱液，分别命名为YPP I、YPP II、YPP III、YPP IV。YPP I、YPP II、YPP III、YPP IV四种组分的的还原能力和羟自由基清除活性结果如图4和图5（山药蛋白为怀山药经盐溶酸沉法制备得到的怀山药粗蛋白，维生素C为市售维生素C药品）所示，YPP III组分为佳抗氧化活性组分，其分子量为600-5000da。
（5）脱盐：收集最佳抗氧化活性组分YPP III的层析洗脱液，经1000da透析袋透析脱盐。
（6）冷冻：收集脱盐后多肽液置-50℃以下超低温冰箱冷冻24h以上形成冰块。
（7）干燥：将冷冻冰块酶解物至真空干燥机干燥。
（8）粉碎过筛：冷冻干燥得到的怀山药多肽经粉碎机粉碎，过100目振动筛。
（9）灌装：过筛后的抗氧化多肽粉进行无菌灌装，得到怀山药多肽抗氧化剂。得到的怀山药抗氧化多肽经双缩脲法测定可得抗氧化多肽的质量含量为90.8%。
本发明应用乙醇脱糖、透析袋透析和Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析等多种分离纯化手段，实现具有显著活性的抗氧化多肽的高效分离纯化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：采用中性蛋白酶对怀山药进行酶解得到怀山药粗多肽液，经分离纯化、冷冻干燥得到怀山药抗氧化多肽。
2.根据权利要求1所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述的分离纯化的手段包括脱糖、透析和凝胶层析。
3.根据权利要求1所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）怀山药粗多肽液的制备：称取怀山药，加入水打浆；先热处理，再冷却至酶解反应温度，用NaOH溶液调至酶反应所需 pH值，加入中性蛋白酶，反应过程中不断滴加NaOH溶液，使pH值稳定酶反应所需 pH值，反应结束后，灭酶，冷却，离心取上清液，即得到怀山药粗多肽液YP；
（2）脱糖：用无水乙醇对粗多肽液YP进行脱糖得到脱糖后的多肽液YP 
；
（3）透析：将多肽液YP
用三氯乙酸处理，脱除蛋白后，通过1000da透析袋透析，得到混合肽组分YPP；
（4）凝胶层析：用Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析分离混合肽组分YPP，收集最佳抗氧化活性组分的层析洗脱液，再经1000da透析袋透析脱盐；
（5）冷冻：收集脱盐后的多肽液，置于-50℃以下超低温冰箱冷冻24h以上形成冰块；
（6）干燥：将冷冻冰块置于真空干燥机中干燥，得到怀山药抗氧化多肽。
4.根据权利要求3所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的怀山药粗多肽液的制备为：按20%质量浓度的底物浓度称取怀山药，加入蒸馏水打浆；然后在 90℃下热处理30min，冷却到45℃后，用0.1 mol/L的NaOH溶液调至pH为6，依据所用酶的活力单位加入酶底物比为1.2-6万U/g的中性蛋白酶，反应过程中不断滴加 0.1 mol/L的NaOH溶液，使pH值稳定6；反应6h后，沸水浴灭酶 10min，冷却后10000r/min离心15 min取上清液，即得到怀山药粗多肽液YP。
5.根据权利要求3所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的脱糖为：按照无水乙醇与粗多肽液YP体积比1:1的比例混合，于摇床170rpm/min摇动1h，8000rpm/min离心15min，取上清液即为脱糖后多肽液YP
。
6.根据权利要求3所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的三氯乙酸为体积浓度15%的三氯乙酸，多肽液YP
与体积浓度15%的三氯乙酸的体积比为1:1。
7.根据权利要求3所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的凝胶层析的条件为：采用的层析柱柱径为2cm，装柱高度为45-70cm，进样量为0.5-1mL，洗脱液为pH 8.0终浓度50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷/HCI和终浓度0.lmol/L氯化钠的混合液，流速3-6mL/10min，在280nm下进行测量。
8.根据权利要求1所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：冷冻、干燥得到怀山药抗氧化多肽后还包括粉碎过筛和灌装。
9.根据权利要求8所述的怀山药抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述的粉碎过筛为将冷冻、干燥得到的怀山药多肽经粉碎机粉碎，过100目振动筛；所述的灌装为将过筛后的怀山药抗氧化多肽粉进行无菌灌装，得到怀山药多肽抗氧化剂。
10.一种怀山药抗氧化多肽，其特征在于：通过权利要求1-9任一项所述的方法制备得到。
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