CN103352052A - 一种多顺反子双标表达慢病毒载体构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种慢病毒载体，其是将FUGW中原有的hUbc启动子替换为U6启动子或强启动子EF1α，并将原有的EGFP基因替换为强荧光蛋白copGFP或Tomato基因，并在该基因的同一顺反子上连接真核抗性标记基因以及多克隆位点和标签蛋白Flag，并采用剪切蛋白T2A和P2A连接该同一顺反子上的多个基因。本发明的慢病毒载体较现有常规慢病毒载体具有更多的优势。如同一顺反子同时高效表达表达多个蛋白；荧光强度高；可对已干扰的基因进行诱导性功能回复；适用于大片段基因的承载等。本项发明的慢病毒载体适用更广泛，效率更高，更加有利于慢病毒载体在临床及科学研究中的应用，具有良好的实用价值和应用前景。

Description

一种多顺反子双标表达慢病毒载体构建及应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种多顺反子双标表达慢病毒载体的构建及应用。

背景技术

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。慢病毒颗粒的感染谱系广，不仅可以高效感染分裂期细胞，而且可以感染非分裂期细胞，还可以高效感染质粒难转染的原代细胞和胚胎干细胞，因此越来越多的研究人员开始用慢病毒载体技术转导目的片段进入细胞或者组织。鉴于其具有携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应等优点，现已成为理想的基因转移载体,广泛应用于基因治疗、疫苗生产、转基因动物、基因敲除、药物研究、生产目的蛋白细胞系等科学研究领域。

肿瘤发生往往是多基因改变的结果，基因治疗时导入多基因才能实现其价值。并且慢病毒载体应用时，为了实现不同科研目的，如同时进行定位跟踪及筛选等不同目的，需要在慢病毒载体上接入报告基因和真核抗性筛选基因等。这些均要通过构建多顺反子慢病毒载体，即在同一个载体上同时表达多个基因来实现。目前构建慢病毒多顺反子载体常用的策略有：（1）内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）连接,约1000bp，但是这种方式存在自身结构大、上下游表达不平衡等缺陷，严重限制了其应用；（2）基因融合，该方式已导致蛋白异常折叠或运输而影响其表达；（3）使用多个启动子，每个启动子启动独立的编码框。其缺点是串联的启动子易相互干扰。慢病毒载体一个最大的特点是载体容量有限，可插入不超过2Kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低。只要高滴度才能实现高效无毒性的基因导入，因此需要通过改造载体对同一顺反子上的多个蛋白进行表达，同时还不受载体容量的限制。具有小分子结构，18-22个氨基酸的自剪切蛋白2A多肽可以使这一目的成为现实。

一些正链病毒编码的2A多肽，可以使同一顺反子上多个基因分别表达。其“剪切”机制是在翻译过程中2A的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间排阻，使得2A和2B之间的肽键无法形成，从而引起上游基因的释放同时启动下游蛋白翻译（M.J.Osborn,2005;P.de Felipe,2006)。现已发现的2A短肽有P2A（porcine teschovirus）、T2A(Thosea asigna virus)。鉴于2A结构短小、剪切效率高、上下游基因表达平衡的优点，成为构建多顺反子理想的工具。

发明内容

本发明提供一种慢病毒载体，其是以慢病毒载体FUGW为出发载体进行改进，插入了U6多克隆位点，标签蛋白Flag，剪切蛋白P2A，标签蛋白HA和剪切蛋白T2A。

优选的，所述的慢病毒载体将FUGW中原有的hUbc启动子替换为U6启动子或强启动子EF1α。

优选的，所述的慢病毒载体将FUGW中原有的EGFP基因替换为强荧光蛋白copGFP或Tomato基因。

优选的，所述的慢病毒载体插入了真核抗性标记基因。

更优选的，所述的慢病毒载体是将FUGW中原有的hUbc启动子替换为U6启动子或强启动子EF1α，并将FUGW中原有的EGFP基因替换为强荧光蛋白copGFP或Tomato基因，并在该强荧光蛋白copGFP或Tomato基因的同一顺反子上连接真核抗性标记基因以及多克隆位点和标签蛋白Flag，并采用剪切蛋白T2A和P2A连接该同一顺反子上的多个基因。

进一步优选的，所述的真核抗性标记基因为Puromycin或Hygromycin抗性基因。

优选的，所述的慢病毒载体为将慢病毒载体FUGW的Pac I和EcoR I酶切位点之间(包含hUbC启动子和EGFP)的片段置换为U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段而得的慢病毒载体，又称为pUETP。所述的U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段为U6启动子，强启动子EF1α，多克隆位点MCS，标签蛋白Flag、剪切蛋白P2A，荧光蛋白Tomato，剪切蛋白T2A、真核抗性标记Puromycin。

优选的，所述的慢病毒载体为将慢病毒载体FUGW的Pac I和EcoR I酶切位点之间(包含hUbC Promoter和EGFP)的片段置换为U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin片段而得的慢病毒载体，又称为pUEGH。所述的U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin片段为U6启动子，强启动子EF1α，多克隆位点MCS，标签蛋白Flag、剪切蛋白P2A，荧光蛋白copGFP，剪切蛋白T2A、真核抗性标记Hygromycin。

更优选的，所述的U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述的U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin片段的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.3所示。

本发明还提供一种重组慢病毒载体，其是以本发明的慢病毒载体为载体，插入了外源核酸。

优选的，所述的外源核酸为目的基因的shRNA，所述的外源核酸插入所述慢病毒载体的U6启动子中。

更优选的，所述的外源核酸插入U6启动子的EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间。

优选的，所述的外源核酸为目的基因的cDNA，所述的外源核酸插入所述慢病毒载体的多克隆位点MCS。

本发明还提供一种慢病毒颗粒，其由包括以下步骤的方法制备而得：将所述的慢病毒载体或者所述的重组慢病毒载体与三种包装辅助质粒Gagpol，VSVG，REV一起转染293T细胞，由细胞培养液中获得慢病毒颗粒。

本发明还提供所述的慢病毒载体在基因克隆或表达中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明以已知载体FUGW为出发载体，改良后是基于2A剪切蛋白的多顺反子双标表达慢病毒载体。利用基因工程方法切除FUGW中原有的hUbc-promoter和EGFP元件，并重新引入U6-EF1α-MCS-T2A-copGFP/Tomato-P2A-hygromycin/puromycin元件。该元件包括U6启动子，强启动子EF1α，多克隆位点MCS，标签蛋白Flag、剪切蛋白P2A，荧光蛋白copGFP或Tomato，标签蛋白HA，剪切蛋白T2A、真核抗性标记Puromycin或Hygromycin。

本发明所述的U6启动子，是一种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，启动子自身元素均位于转录区的上游，可使发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达，非常精确的在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U终止，并使转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA。转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而十分有利于双链RNA诱发RNAi。

本发明所述的启动子EF1α，是一种强表达的启动子，可使外源基因在哺乳动物细胞中广泛表达，甚至可在原代细胞和干细胞内表达。

本发明所述的荧光蛋白Tomato，该具有最强的蛋白荧光亮度。它是一种原始的水果蛋白的橙色衍生物，包含Tomato的两个拷贝，由12个氨基酸残基的接头链接。

本发明所述的荧光蛋白copGFP，是绿色荧光蛋白，稳定性高，荧光亮度强，其荧光亮度可为EGFP的3倍。

本发明的慢病毒载体较现有常规慢病毒载体具有更多的优势。

1）将目的基因的shRNA序列插入U6启动子，可以沉默目的基因；或将目的基因的cDNA插入多克隆位点MCS区域，可过表达目的基因；因此，可以对已干扰的基因进行诱导性功能回复，用于更具有说服力的功能验证实验。

2）本发明使用的荧光蛋白为最新一代的copGFP和Tomato，荧光强度高，形式较稳定，并且均为单体。

3）本发明采用结构短小的2A多肽，使得同一顺反子同时高效表达表达多个蛋白，避免了上下游表达不平衡，P2A高效启动了荧光蛋白（copGFP或Tomato）的表达，T2A高效启动了抗性蛋白（puromycin或hygromyin）。

4)本发明采用结构短小的2A多肽，有效的提高了病毒滴度，适用于大片段载体的慢病毒构建。

5）本发明的慢病毒载体适用更广泛，效率更高，更加有利于慢病毒载体在临床及科学研究中的应用，具有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1显示载体图谱。其中，图1A是载体FUGW，图1B是载体pUETP，图1C是载体pUEGH。

图2显示用于载体构建的连接产物的电泳图。其中，图2A是U6-EF1α-MCS-FLAG片段（1015bp）电泳图；图2B是扩增P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段（1454bp）电泳图；图2C是扩增copGFP-Hygromycin片段(1926bp)电泳图。其中，1,2,3表示重复试验中的核酸片段样品，M表示分子量标记。

图3显示pUETP-shCDH1载体转染荧光图。其中，A为pUETP明场图；B为pUETP暗场图；C为pUETP-shCDH1明场图；D为pUETP-shCDH1暗场图。

图4显示CDH1knockdown验证。其中，1，pUETP；2，pUETP-shCDH1。

图5显示pUEGH-CDH1载体转染荧光图。其中，A为pUEGH明场图；B为pUEGH暗场图；C为pUEGH-CDH1明场图；D为pUEGH-CDH1暗场图。

图6显示CDH1过表达验证电泳图。1，pUEGH；2，pUEGH-CDH1。a，CDH1(130kD)；b，β-Actin。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puro（简称pUETP）慢病毒载体构建

（一）分别扩增U6、EF1α-MCS-FLAG、Tomato和Puromycin

1.扩增U6启动子

1）全基因合成U6序列

人工全基因合成U6片段，序列如SEQ ID NO.1所示。

2）以全基因合成U6片段为模板，通过重叠延伸PCR去除U6片段中的AscⅠ和Nhe Ⅰ酶切位点,同时在序列中引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点。其中，在第一轮PCR中，用U6-F1和U6-R1引物PCR扩增出U6-1片段，用U6-F2和U6-R2引物扩增出U6-2片段。在第二轮PCR中，以U6-1和U6-2片段为模板，以U6-F1和U6-R2为引物进行PCR扩增，得到带EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的U6片段。所用的引物序列如下所示：

U6-F1：5’-TTAATTAATTTCCCATGATTCC-3’

U6-R1：5’-GAATTCCTCGACGGATCCTCGTCCTTTCCACAAG-3’

U6-F2：5’-GGATCCGTCGAGGAATTCAGTTATTAATAGTAATC-3’

U6-R2：5’-CGCAGATCCTTAATTAAAACGCGGAAC-3’。

采用KOD-Plus PCR试剂（购自Toyobo公司）进行PCR反应。PCR扩增体系如下（下同）：

PCR程序如下（下同）：

2.扩增EF1α-MCS-FLAG

以pMIRNA1载体（购自System Biosciences,SBI）为模板，以hEF1-F和hEF1-MCS-R为引物，进行qPCR扩增，并在hEF1-MCS-R引物序列中引入MCS片段，获得EF1α-MCS片段,。以Flag–F和Flag–R引物同时作为PCR模板和引物，反应和体系如下进行PCR扩增得FLAG片段。以EF1α-MCS和FLAG为模板，以hEF1-F和FLAG-R引物进行PCR扩增，得EF1α-MCS-FLAG片段。

EF1α-MCS扩增引物：

hEF1-F：5’-TTAATTAAGGATCTGCGATCGCTC-3’；

hEF1-MCS-R：

5’-GCTAGCtccTCTAGACGTCGACGGCGCGCCCATGGTGGCgGCGATCGCGTAGGCGCCGGTCACAG-3’。

FLAG扩增引物：

FLAG-F：

5’-CGTCTAGAggaGCTAGCggaTTCGAAGACTACAAAGACCATGACGGTGATTACAAGGATGACGATGAC-3’；

FLAG-R：

5’-GCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGTTAACCTTGTCATCGTCATCCTTGT-3’。

FLAG片段PCR反应体系

PCR程序如下：

3.扩增P2A-Tomato和T2A-puromycin

以pLVX-IRES-td Tomato载体（购自Clontech）为模板，用Tomato-F和Tomato-R引物PCR扩增出Tomato，同时在Tomato上游引入P2A。以pMIRNA1载体（购自System Biosciences,SBI）为模板，用Puro-F和Puro-R引物扩增出Puromycin，同时在Puromycin上游引入T2A。其中，引物序列如下：

Tomato-F：

5’-CAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；

Tomato-R：

5’-CTCTCCGCTTCCATTTAAATaGTTAACGGCGTAGTCAGGCACGTCGTAAGGATACTTGTACAGCTCGTCC-3’；

Puro-F：

5’-GAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGACCGAGTA-3’；

Puro-R：5’-TCAGCTATTTAAATGGCACCGGGCTTGCGGGTC-3’。

（二）重叠延伸PCR扩增U6-EF1α-MCS-FLAG和P2A-Tomato-T2A-Puromycin

1.扩增U6-EF1α-MCS-FLAG

以上述制备的U6和EF1α-MCS-FLAG为模板，用U6-F1和P2A-SpeI-R引物扩增出U6-EF1α-MCS-FLAG，同时引入SpeI酶切位点，同时PCR扩增了3管，产物如图2所示。其中，引物序列如下：

U6-F1：5’-TTAATTAATTTCCCATGATTCC-3’；

P2A-SpeI-R：5’-cgat act agt GTT AAC CTT GTC ATC GTC ATC C-3’。

2.扩增P2A-Tomato-T2A-Puromycin扩增

以上述制备的Tomato和Puromycin为模板，用P2A-SpeI-F和Puro-R引物扩增出Tomato-Puromycin,并引入SpeI酶切位点，同时PCR扩增了3管，产物如图2所示。其中，引物序列如下：

P2A-SpeI-F：

5’-cgat act agt GGA AGC GGA GCT ACT AAC TTC AGC CTG CTG AAGC-3’；

Puro-R：5’-TCAGCTATTTAAATGGCACCGGGCTTGCGGGTC-3’。

（三）重叠延伸PCR扩增U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin

1.分别将U6-EF1α-MCS-FLAG和P2A-Tomato-T2A-Puromycin酶切后，连接克隆到pJET1.2/blunt载体（Fermentas）中。其中酶切体系和连接体系如下：

酶切体系：

连接体系：

2.扩增U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin

以上一步构建的pJET1.2-U6-EF1α-MCS-FLAG载体和pJET1.2-P2A-Tomato-T2A-Puromycin载体一起为模板，以U6-F1和Puro-R为引物进行PCR扩增，得U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段。其中，引物如下：

U6-F1：5’-TTAATTAATTTCCCATGATTCC-3’；

Puro-R：5’-TCAGCTATTTAAATGGCACCGGGCTTGCGGGTC-3’。

3.将U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin克隆到慢病毒载体FUGW中，生产pUETP

酶切体系：

FUGW酶切产物补平：

FUGW酶切产物补平后去磷酸化：

U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin产物磷酸化：

连接体系：

获得U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puro慢病毒载体（简称pUETP），其图谱见图1。

实施例2U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin（简称pUEGH）慢病毒载体构建

（一）分别扩增U6、EF1α-MCS-FLAG、P2A-copGFP和T2A-Hygromycin

1.扩增U6、EF1α-MCS-FLAG

方法同pUETP。

2.扩增T2A-Hygromycin

以linear hygro线性化的片段（购自Clontech)为模板，通过重叠延伸PCR点突变去除Hygromycin中的EcoRⅠ酶切位点。其中，在第一轮PCR中，以linear hygro为模板，用Hygro-F和Hygro-R为引物扩增出Hygro-1，用Hygro-MF和Hygro-MR为引物扩增出Hygro-2。在第二轮PCR中，以Hygro-1和Hygro-2为模板，以Hygro-F和Hygro-MR为引物PCR扩增，得到无EcoRⅠ酶切位点的Hygromycin，并在Hygromycin上游引入T2A。其中引物序列如下：

Hygro-F：

5’-GAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTtATTTAAATATGAAAAAGCC-3’；

Hygro-R：

5’-TCAGCTATTTAAATTTCCTTTGCCCTCGGACG-3’；

Hygro-MF：5’-ATTGGGGAGTTCAGCGAG-3’；

Hygro-MR：5’-CTCGCTGAACTCCCCAAT-3’。

3.扩增copGFP

以pMIRNA1载体为模板，用copGFP-F和copGFP-R引物扩增出copGFP，PCR体系和程序同上。其中，引物序列如下：

copGFP-F：5’-CAGCCTGCTGAAGCAGGCTG-3’；

copGFP-R：

5’-TCCTCTGCCCTCTCCGCTTCCGTTAACGGCGTAGTCAGGCACGTCGTAAGGATAGCGAGATCCGGTGGAG-3’。

（二）重叠延伸PCR扩增U6-EF1α-MCS-FLAG和copGFP-T2A-Hygromycin

1.扩增U6-EF1α-MCS-FLAG

方法同pUETP。

2.扩增copGFP-Hygromycin

以上述制备的copGFP和Hygromycin为模板，用P2A-SpeI-F和Hygro-MR引物扩增出copGFP-Hygromycin，并引入SpeI酶切位点，PCR产物如图2所示。其中，引物序列如下：

P2A-SpeI-F：

5’-cgat act agt GGA AGC GGA GCT ACT AAC TTC AGC CTG CTGAAG C-3’；

Hygro-MR：5’-CTCGCTGAACTCCCCAAT-3’。

（三）重叠延伸PCR扩增U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin

重叠延伸PCR扩增U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin，方法同pUETP，除所用的引物序列之外。引物序列如下：

U6-F1：5’-TTAATTAATTTCCCATGATTCC-3’；

Hygro-MR：5’-CTCGCTGAACTCCCCAAT-3’。

将U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin克隆到PacI和EcoRI酶切的慢病毒载体FUGW中，生产pUEGH，方法同pUETP。

获得U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin慢病毒载体（简称pUEGH），其图谱见图1。

实施例3pUETP和pUEGH慢病毒载体的应用实例

（一）pUETP应用于CDH1基因RNAi稳定株的构建

1.CDH1基因shRNA引物设计

根据shRNA引物设计原则，针对CDH1基因（NCBI号：NM_004360.3）设计1对shRNA引物。

shCDH1-F：

5’-GATCCGGCGATTCAAAGTGGGCACAGATGGTACCATCTGTGCCCACTTTGAATCGTTTTTG-3’；

shCDH1-R：

5’-AATTCAAAAACGATTCAAAGTGGGCACAGATGGTACCATCTGTGCCCACTTTGAATCGCCG-3’。

2.构建pUETP-shCDH1慢病毒载体

以引物F（10μM）10μl、引物R（10μM）10μl、10×退火缓冲液5μl，ddH₂O25μl的反应体系放置于100℃恒温水浴锅中水浴5分钟后，自然冷却至室温进行退火。得到CDH1shRNA双链后，连接至本发明改造慢病毒载体U6的EcoRⅠ和BamHⅠ位点上。反应体系为：shRNA引物4μl、慢病毒载体2μl、ddH₂O2μl、10×T4缓冲液1μl、Roche T4连接酶1μl，室温放置2个小时。转化入GeneHogs感受态大肠杆菌细胞内，涂布于含氨苄青霉素的固体LB培养板上，37℃培养14小时后，选取饱满的阳性克隆进行扩增，Promega质粒纯化试剂盒提取质粒，KpnI单酶切验证。EB胶电泳，可见两条条带清晰的2.8Kb和7.2Kb的DNA片段，与理论相符。获得pUETP-shCDH1慢病毒载体。

3.pUETP-shCDH1慢病毒包装

将pUETP-shCDH1慢病毒载体与三种包装辅助质粒（Gag pol，VSVG，REV，购自Invitrogen）一起转染293T细胞，24h后观察荧光情况。如图3所示，可以看出红色荧光表达强度高，说明P2A可以高效启动Tomato的表达。并于分别转染后48h及72h收集上清病毒粗液。收集的病毒液上清经离心去除残余细胞及细胞碎片后，Millex-HV0.45μm滤膜过滤以进一步去除残余的细胞碎片。荧光鉴定法测得病毒粗液的滴度为3E7TU/ml。

4.A549细胞pUETP-shCDH1稳定株筛选

指数期生长状态良好的目的细胞密度达70%～80%时，传代处理，并以合适的数目接种到24孔板内，使得第二天细胞密度达30%～40%左右。使用空载体慢病毒液pUETP和pUETP-shCDH1慢病毒液分别感染A549细胞96小时后，加入0.4μg/ml puromycin处理细胞1周，荧光感染比例达100%。而后将puromycin浓度降至0.1μg/ml持续扩大培养，获得稳定细胞株，并收集细胞RNA样品和蛋白样品。RNA样品CDH1的qPCR结果如图4所示，pUETP-shCDH1慢病毒感染组与空载体pUETP相比CDH1在mRNA水平上抑制效果达97%以上。A549细胞CDH1基因RNAi稳定株的成功筛选，说明pUETP载体中可以有效地应用于目的基因的knockdown，同时T2A可以高效启动puromycin的表达。

5.总结

pUETP-shCDH1稳定株的顺利构建、CDH1基因沉默效果的成功验证及高强度的红色荧光表达，说明了pUETP载体上的元件U6，Tomato，Puromycin均能高效表达，载体上P2A和T2A的应用成功避免了同一顺反子上下游的表达不平衡。

（二）pUEGH用于大片段CDH1过表达稳定株的构建

1.构建pUEGH-CDH1慢病毒载体

克隆CDH1基因（2649bp）的cDNA片段，以cDNA片段4μl，经AscI和Nhe I酶切过的pUEGH载体2μl，Roche T4ligase1μl，10×T4buffer1μl，2μl ddH₂O的反应体系放置于24℃水浴锅2小时进行连接，连接产物经转化、摇菌后质粒抽提得pUEGH-CDH1慢病毒载体。

2.pUEGH-CDH1慢病毒包装

将pUEGH-CDH1慢病毒载体与三种包装辅助质粒（Gag pol，VSVG，REV）一起转染293T细胞，24h后观察荧光情况。如图5所示，可以看出绿色荧光表达强度高，其荧光强度为原FUGW载体上EGFP的2倍，同时也说明P2A可以高效启动copGFP的表达。并于分别转染后48h及72h收集上清病毒粗液。收集的病毒液上清经离心去除残余细胞及细胞碎片后，Millex-HV0.45μm滤膜过滤以进一步去除残余的细胞碎片。利用GFP荧光观测法测定pUEGH-CDH1病毒粗液滴度为3X10⁶TU/ml，而以FUGW为载体得pFUGW-CDH1慢病毒载体未包装出慢病毒颗粒。

3.A549细胞CDH1过表达稳定株筛选

指数期生长状态良好的目的细胞密度达70%～80%时，传代处理，并以合适的数目接种到24孔板内，使得第二天细胞密度达30%～40%左右。使用空载体慢病毒液pUEGH和pUEGH-CDH1慢病毒液分别感染A549细胞96小时后，加入100μg/ml Hygromycin处理细胞1周，荧光感染比例达100%。而后将Hygromycin浓度降至25μg/ml持续扩大培养，获得稳定细胞株，并收集细胞蛋白样品。蛋白样本的western blot结果如图6所示，pUEGH-CDH1组的CDH1有明显的过表达效果。A549细胞CDH1基因过表达稳定株的成功筛选，说明pUEGH载体中可以有效地应用于大片段基因的过表达,同时也说明了T2A可以高效启动hygromycin的表达。

4.总结

pUEGH-CDH1过表达稳定株的成功筛选及验证，说明了pUEGH载体上的EF1α、coGFP和Hygromycin均能高效表达，载体上P2A和T2A的应用成功避免了同一顺反子上下游的表达不平衡。同时，CDH1基因（大小为2649bp）慢病毒液的成功包装，说明pUEGH载体可以用于2Kb以上大片段基因的慢病毒包装。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种慢病毒载体，其是以慢病毒载体FUGW为出发载体进行改进，其特征在于，所述的慢病毒载体是将FUGW中原有的hUbc启动子替换为U6启动子或强启动子EF1α，并将FUGW中原有的EGFP基因替换为强荧光蛋白copGFP或Tomato基因，并在该强荧光蛋白copGFP或Tomato基因的同一顺反子上连接真核抗性标记基因以及多克隆位点和标签蛋白Flag，并采用剪切蛋白T2A和P2A连接该同一顺反子上的多个基因。

2.如权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的真核抗性标记基因为Puromycin或Hygromycin抗性基因。

3.如权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的慢病毒载体为将慢病毒载体FUGW的Pac I和EcoR I酶切位点之间包含hUbC启动子和EGFP的片段置换为U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段而得的慢病毒载体；或者，所述的慢病毒载体为将慢病毒载体FUGW的Pac I和EcoR I酶切位点之间包含hUbC Promoter和EGFP的片段置换为U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin片段而得的慢病毒载体。

4.如权利要求3所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-Tomato-T2A-Puromycin片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述的U6-EF1α-MCS-FLAG-P2A-copGFP-T2A-Hygromycin片段的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.3所示。

5.一种重组慢病毒载体，其特征在于，其以权利要求1所述的慢病毒载体为载体，插入了外源核酸。

6.如权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述的外源核酸为目的基因的shRNA，所述的外源核酸插入所述慢病毒载体的U6启动子中。

7.如权利要求6所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述的外源核酸插入U6启动子的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间。

8.如权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述的外源核酸为目的基因的cDNA，所述的外源核酸插入所述慢病毒载体的多克隆位点。

9.一种慢病毒颗粒，其特征在于，其由包括以下步骤的方法制备而得：将权利要求1所述的慢病毒载体或者权利要求5所述的重组慢病毒载体与三种包装辅助质粒Gag pol，VSVG，REV一起转染293T细胞，由细胞培养液中获得慢病毒颗粒。

10.如权利要求1所述的慢病毒载体在基因克隆或表达中的应用。

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