CN103351394B - 具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途。本发明将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸以及没食子酸与4′-去甲表鬼臼毒素进行酰胺取代反应，得到具有抗肿瘤活性的式(Ⅴ)所示的酰胺取代鬼臼类衍生物。本发明酰胺取代鬼臼类衍生物通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，具有更好的抗肿瘤疗效。体外细胞活性抑制测试表明，本发明的酰胺取代鬼臼类衍生物具有优异的抗肿瘤活性、毒副作用低，能制备成抗肿瘤药物应用于临床抗肿瘤治疗。
Description
技术领域
本发明涉及鬼臼毒素类衍生物，尤其涉及4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位取代后所得到的具有抗肿瘤活性酰胺取代鬼臼类衍生物及其制备方法，本发明还涉及该酰胺取代鬼臼类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，属于鬼臼毒素类衍生物的制备及应用领域。
背景技术
鬼臼类植物属于小檗科，包括八角莲属、足叶草属和山荷叶属，这类植物具有显著的生物活性，又具有悠久的药用历史。4′-去甲基表鬼臼毒素(4′-Demethylepipodophyllotoxin)是从鬼臼类植物中提取得到的具有独特抗肿瘤活性的天然活性先导化合物。但是，4′-去甲基表鬼臼毒素均不同程度的存在着毒副作用大、生物利用度差等缺陷，严重限制了它们在临床上的使用，因此，针对4′-去甲基表鬼臼毒素的结构进行修饰以得到抗肿瘤活性提高或毒副作用降低的鬼臼类衍生物，对于肿瘤的临床治疗将具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物；
本发明的目的之二是提供一种制备和纯化上述酰胺取代鬼臼类衍生物的方法；
本发明的目的之三是将上述酰胺取代鬼臼类衍生物应用于制备成临床用抗肿瘤药物；
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物，其结构式为式(Ⅴ)所示：
式（Ⅴ）
其中，R1选自 或
此外，式（Ⅴ）化合物的酸成盐也当然包括在本发明的保护范围之内，优选的，所述的酸成盐包括盐酸盐或磷酸盐等酸成盐。
吡嗪，茶碱，没食子酸等杂环类化合物含有氧、氮类活性原子，这些活性原子有可能增强化合物与拓扑异构酶Ⅱ的结合能力，使其更好的作用于拓扑异构酶Ⅱ的活性位点从而使药物的抗肿瘤活性提高；本发明以它们作为4′-去甲基表鬼臼毒素C环4位的取代基团，得到抗肿瘤活性进一步提高、毒副作用有所降低的式（Ⅴ）所示的鬼臼类衍生物。
本发明目的之二是提供一种制备上述式(Ⅴ)化合物的方法，该方法包括以下步骤：通过酰胺取代反应，将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸以及没食子酸引入到4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，得到酰胺取代鬼臼类衍生物粗产品。
所述的酰胺取代反应优选在以下条件下进行：（1）将4′-去甲表鬼臼毒素的C环4位活化生成4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素；（2）将4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素C环4位活化生成4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素；（3）将4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素溶于有机溶剂中，加入2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸，搅拌进行酰胺取代反应。
其中，所述步骤（1）的活化为迭氮取代反应，用叠氮化钠和三氟乙酸对4′-去甲表鬼臼毒素C环4位进行活化；优选的，所述的活化包括以下步骤：将4’-去甲基表鬼臼毒素干燥，加入叠氮化钠和三氯甲烷，于室温下预先反应5min，再在氮气保护下，边搅拌边滴加三氟乙酸，于室温下反应10min，即得4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品。
其中，所述步骤（2）的活化为氨基取代反应，用锌粉、甲酸铵以及四氢呋喃对所述步骤（1）所得的4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素进行活化；优选的，所述的活化包括以下步骤：将4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，锌粉和甲酸铵置于四口瓶中，抽真空通氮气三次，再加入85%四氢呋喃，于室温下反应24h，即得4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品。
其中，步骤（3）中所述的有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺；所述的搅拌为在真空条件下进行搅拌，其搅拌转速为50～800转/分钟，优选为600转/分钟；酰胺取代反应时间为24～48小时。
为了达到更好的合成效果，在步骤（3）所述的酰胺取代反应中，先将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸活化，再与所述步骤（2）所得的4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素进行酰胺反应，反应摩尔比为1:1。
其中，2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸的活化方法是用1-羟基-苯并-三氮唑(无水)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对其进行活化；优选地，所述活化方法和所述酰胺反应包括以下步骤：将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸干燥，与1-羟基-苯并-三氮唑(无水)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐一起置于四口瓶中，并抽真空通氮气，冰浴下反应2～4h，在氮气保护下，冰浴下边搅拌边加入4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，并缓慢滴加三乙胺；加料完毕后，撤去冰浴，室温25℃反应24～48h。
为了达到更好的技术效果，可以将上述反应产物在以下条件下进行初步纯化得到酰胺取代鬼臼类衍生物产物：将反应产物旋转蒸发浓缩，用二氯甲烷提取过滤得滤渣，再用体积比为1:1的二氯甲烷:甲醇复溶，真空干燥，得到初步纯化的酰胺取代鬼臼类衍生物产物。
本发明还提供了一种将上述初步纯化的酰胺取代鬼臼类衍生物产物进一步纯化的方法，包括：
(1)待分离纯化样品的制备：将初步纯化的酰胺取代鬼臼类衍生物产物通过二氯甲烷溶剂溶解，并用水反复洗涤，收集有机层，真空干燥，备用；
(2)分离纯化：将步骤（1）所制备的样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得。
优选的，所述的硅胶柱层析的分离方法包括：①硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂优选是由体积比为40:1的氯仿和甲醇组成；②将样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶。
优选的，所述的凝胶柱层析分离方法包括：①凝胶以甲醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；②将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。
本发明将4′-去甲基表鬼臼毒素与2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸以及没食子酸进行酰胺取代反应，得到具有良好抗肿瘤活性的式(Ⅴ)化合物，该化合物可通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，从而达到更好的抗肿瘤疗效。体外HepG-2、Hela、A549、BGC-823细胞活性抑制的测试表明，本发明式(Ⅴ)所示化合物的抗肿瘤活性较依托泊苷或4′-去甲基表鬼臼毒素的抗肿瘤活性有显著提高。试验结果表明，本发明式(Ⅴ)化合物可制备成抗肿瘤药物，临床应用于抗肿瘤治疗。
本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤药物组合物，由式（Ⅴ）所示的化合物和药学上可接受的载体配合而成，即：将治疗上有效量的式（Ⅴ）化合物与药学上可接受的载体配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一类适宜的药物制剂；通常该药物组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其它的给药方法，例如经皮给药。所述药物制剂可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂、口服液或无菌胃肠外悬液等液体制剂形式。该药物制剂也可以是大或小容量注射剂、冻干粉针、无菌粉分装等制剂形式。
为了达到给药的一致性，本发明药物组合物优选为单剂形式。用于口服给药的单剂形式可以是片剂和胶囊，并可含有常规赋形剂诸如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁；崩解剂，例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶纤维素，或药学上可接受的湿润剂，诸如十二烷基硫酸钠。
附图说明
图1为4’-去甲基表鬼臼毒素的结构式。
图2为2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸、没食子酸的结构式。
图3为本发明酰胺取代鬼臼类衍生物的4种具体结构式。
图4为本发明酰胺取代鬼臼类衍生物的通式结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
4′-去甲基表鬼臼毒素：购自西安和霖生物工程有限公司，纯度为98%。
2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸、没食子酸：均购自阿拉丁试剂。预备实施例14’-去甲基表鬼臼毒素C环4位的第一步活化：迭氮取代反应
称1.6g4’-去甲基表鬼臼毒素，45℃真空干燥2h；在氮气保护下，将干燥的4’-去甲基表鬼臼毒素、1.32g叠氮化钠和8mL三氯甲烷加入250mL四口瓶中，于室温下预先反应5min，再在氮气保护下，室温搅拌下慢慢滴加4mL三氟乙酸，反应10min，即得4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品。
预备实施例24’-去甲基表鬼臼毒素C环4位的第二步活化：氨基取代反应
称1.35g4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品；在氮气保护下，将干燥的4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素、0.39g锌粉和85%四氢呋喃水溶液加入250ml四口瓶中，于室温下反应24～48h。反应结束后，用滤纸对反应液进行过滤，除去不溶物，加压旋蒸除去四氢呋喃。再用二氯甲烷对上步所得水相进行反萃，合并有机层，用无水硫酸钠干燥过夜，旋干即得4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品。
预备实施例3N,N-二甲基甲酰胺的干燥
称取1.5g氢化钙于1000mL圆底四口瓶中，将干净的漏斗放入侧口，倒入500mL N,N-二甲基甲酰胺，加入3～4颗玻璃珠防止暴沸，加热调整温度至N,N-二甲基甲酰胺呈微沸状态，加回流管回流2～3h后冷凝回收至装有无水氯化钙的试剂瓶中，收集完液体后，向瓶中通入少许氮气，盖上盖子即可，以后每次用完后补充氮气。
实施例14-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素（化合物1）的合成和纯化
(1)4-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取124mg2-吡嗪羧酸，400mg4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，45℃真空干燥2h；在氮气保护下，将干燥好的N,N-二甲基甲酰胺加入四口瓶中，加入124mg干燥好的2-吡嗪羧酸和162mg1-羟基-苯并-三氮唑以及230mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，于冰浴下搅拌反应2～4h，再在氮气保护下，加入干燥好的4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，搅拌下缓慢滴加三乙胺，加料完毕后，撤去冰浴，室温反应24～48h。反应结束后，用20mL水萃取反应液，取下层有机相，再用饱和食盐水反复萃取三次，取有机相于无水硫酸钠中干燥过夜，取上清旋转蒸干后，所得即为4-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素粗产品。
(2)分离和纯化4-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：
(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿:丙酮（20:1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。
(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素。
4-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：白色粉末；C26H23O8N3;505,δ(ppm):9.08(d,1H),8.87(d,1H),8.29(s,1H,-NH),6.85(s,2H,ArH),6.57(s,2H,ArH),6.28(s,2H),5.98(d,2H,-OCH2O),5.44(m,1H,OH),4.49(d,1H,4-H),4.33(m,1H,11-H),3.77(m,1H,11-H),3.73(s,6H,3’,5’-OCH3),3.65(s,1H,1-H),3.58(d,1H,3-H),3.35(s,1H,2-H)
13C-NMR(300MHz,CDCl3):δ175.31(C-12,C),164.01(C-1′′;C),148.20(C-7;C),148.00(C-6;C),147.89(C-3′,5′;2C),147.22(C-2′′;C),145.46(C-3′′;C),144.63(C-4′′;C),143.96(C-5′′;CH),135.40(C-9;CH),133.58(C-10;CH),130.96(C-1′;CH),130.37(C-4′;CH),110.18(C-5;CH),109.65(C-8;CH),109.20(C-2′,6′;2C),101.92(-OCH2O-),68.93(C-11;CH),56.71(3′,5′-OCH3),48.06(C-4;CH),43.71(C-1,CH),41.31(C-2,CH),37.27(C-3;CH)
实施例24-β-(5-甲-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素（化合物2）的合成和纯化
(1)4-β-(5-甲-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取138mg5-甲基2-吡嗪羧酸，400mg4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，45℃真空干燥2h；在氮气保护下，将干燥好的N,N-二甲基甲酰胺加入四口瓶中，加入138mg干燥好的5-甲基-2-吡嗪羧酸和162mg1-羟基-苯并-三氮唑以及230mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，于冰浴下搅拌反应2～4h，再在氮气保护下，加入干燥好的4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，搅拌下缓慢滴加三乙胺，加料完毕后，撤去冰浴，室温反应24～48h。反应结束后，用20mL水萃取反应液，取下层有机相，再用饱和食盐水反复萃取三次，取有机相于无水硫酸钠中干燥过夜，取上清旋转蒸干后，所得即为4-β-(5-甲-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素粗产品。
(2)分离和纯化4-β-(5-甲-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：
(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿:丙酮（20:1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。
(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-β-(5-甲基-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素。
4-β-(5-甲基-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素，白色粉末，C27H25O8N3519m/z,δ(ppm):1.13(d,1H,CH3),2.48(s,1H,2-H),2.55(s,1H,3-H),3.00(d,1H,1-H),3.71(m,6H,3′,5′-OCH3),4.30(m,2H,11-H),4.66(d,4-H),5.39(m,1H,OH),5.93(d,2H,-OCH2O),6.24(s,2H,ArH),6.53(s,1H,ArH),6.79(s,1H,ArH);8.33(s,1H,-NH),8.55(s,1H,=CH-),8.96(d,1H,=CH-)
13C-NMR(300MHz,CDCl3):δ175.43(C-12,C),164.22(C-1′;C),157.75(C-;C),147.96(C-7;C),147.80(C-6;C),147.17(3′,5′-OCH3;2C),143.46(C-2′′3′′;C),142.57(C-4′′5′′,C),135.21(C-9;CH),133.52(C-10;CH),130.96(C-1′;CH),130.29(C-4′;CH),110.17(C-5,C),109.57(C-8,C),108.99(C-2′,6′),101.90(-OCH2O),68.97(C-11;CH2),56.65(3′,5′-OCH3;CH3),47.95(C-4),43.63(C-1;CH),41.27(C-2,CH),37.29(C-2;CH)
实施例34-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素（化合物3）的合成和纯化
(1)4-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取238mg茶碱乙酸，400mg4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，45℃真空干燥2h；在氮气保护下，将干燥好的N,N-二甲基甲酰胺加入四口瓶中，加入238mg干燥好的5茶碱乙酸和162mg1-羟基-苯并-三氮唑以及230mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，于冰浴下搅拌反应2～4h，再在氮气保护下，加入干燥好的4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，搅拌下缓慢滴加三乙胺，加料完毕后，撤去冰浴，室温反应24～48h。反应结束后，用20mL水萃取反应液，取下层有机相，再用饱和食盐水反复萃取三次，取有机相于无水硫酸钠中干燥过夜，取上清旋转蒸干后，所得即为4-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素粗产品。
(2)分离和纯化4-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：
(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿:丙酮（20:1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。
(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素。
4-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：白色晶体；C30H29O10N5;619m/z,δ(ppm):8.72(d,1H),8.26(s,1H),6.81(s,1H),6.55(s,1H),6.29(d,2H),6.02(m,2H),5.18(m,1H),5.09(m,2H),4.54(d,1H),4.26(m,1H),3.97(m,1H);3.63(s,6H),3.44(s,3H),3.32(s,1H),3.21(s,3H),3.15(d,1H),2.97(d,1H).
13C-NMR(300MHz,CDCl3):δ175.18(C-12;C),166.84(C-1′′;C),151.72(C-4′′,5′′;2C),147.83(C-7;C),147.26(C-6;C),144.31(C-3′,5′;C),135.40(C-9,C-10;C),133.03(C-3′′,6′′,7′′;C),130.77(C-1′,4′;CH),110.12(C-5;CH),109.15(C-8;CH)107.23(C-2′,6′;C),101.96(-OCH2O,C-13),68.95(C-11;CH2),56.69(3′,5′-OCH3;CH3),48.96(C-4;C),47.87(C-2′′;C),43.58(C-1;CH),41.60(C-2,CH),37.28(C-2;CH),30.15(CH3;C),28.12(CH3;C)
实施例44-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素（化合物4）的合成和纯化
(1)4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素的合成：
(1)4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素的合成：称取170mg没食子酸，400mg4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，45℃真空干燥2h；在氮气保护下，将干燥好的N,N-二甲基甲酰胺加入四口瓶中，加入170mg干燥好的没食子酸和162mg1-羟基-苯并-三氮唑以及230mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，于冰浴下搅拌反应2～4h，再在氮气保护下，加入干燥好的4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，搅拌下缓慢滴加三乙胺，加料完毕后，撤去冰浴，室温反应24～48h。反应结束后，用20mL水萃取反应液，取下层有机相，再用饱和食盐水反复萃取三次，取有机相于无水硫酸钠中干燥过夜，取上清旋转蒸干后，所得即为4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素粗产品。
(2)分离和纯化4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离纯化：
(A)用正相硅胶柱(正相硅胶：中国青岛海洋化工有限公司，HG/T2354-92；分离系统：瑞士步琪等度快速色谱系统；色谱柱：瑞士步琪玻璃柱C-690，长460毫米，内径15毫米)或者相似极性柱分离；氯仿:丙酮（20:1）系统作为洗脱液，上样量2毫升，流速恒流1.0毫升/分钟；每2毫升洗脱液作为一个馏分进行收集。用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿:甲醇（40:1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；将合并后的样品真空干燥，避光条件下保存于4℃的冰箱中作为供纯化样品。
(B)用凝胶柱层析(凝胶：Sephadex LH-20；分离柱：玻璃柱，长480毫米，内径30毫米)分离；将处理好的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，以甲醇平衡。将待纯化样品溶于6毫升甲醇中，以0.6毫升/分钟的流速上样吸附，然后用600毫升甲醇以0.6毫升/分钟的流速洗脱，每10毫升洗脱液收集1瓶，用正相硅胶薄层(德国莫克高效硅胶薄层)或相似极性薄层检视各馏分；氯仿：甲醇（40：1）系统作为展开剂，将Rf值0.5的馏分进行合并；真空干燥后所得的白色粉末状样品为4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素。
4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素：白色粉末,C28H25O11N;619,δ(ppm):9.03(s,1H),8.86(s,1H),8.26(s,2H),6.84(d,2H),6.77(s,1H),6.53(s,1H),6.24(d,1H),5.95(m,1H),5.36(s,6H),3.428(d,1H),3.267(t,1H);2.060(s,1H),4.46(s,15H),4.32(s,2H,11H),3.61(d,OCH3),3.44(s,15H),3.32(s,1H,2-H)
13C-NMR(600MHz,CDCl3):δ175.44(C-12,C),167.35(C-1′;C),147.88(C-7;C),146.09(C-6;C),137.21(C-3′,5′;C-5′′,6′′;2C),135.41(C-9;C),133.11(C-10;C),131.39(C-1′,C),130.99(C-4′;CH),124.85(C-3′′,4′′;2C),110.03(C-5;CH),109.58(C-8;CH),109.19(C-2′,6′;C),107.84(C-1′′,2′′;C),101.85(-OCH2O-;C-13),69.14(-OCH2O-;C-11),56.71(3′,5′-OCH3;CH3),47.80(C-4;C),43.68(C-1;CH),41.44(C-2,CH),37.38(C-3;CH)
试验例本发明化合物抑制肿瘤细胞的活性试验
一、试验材料
1.供试化合物：实施例1～4所制备的化合物，分别编号为化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。
2.对照化合物：4′-去甲表鬼臼毒素药物依托泊苷(Etoposide)购自西安和霖生物工程有限公司，纯度98%。
3.细胞株：HepG-2细胞株、Hela细胞株、A549细胞株、BGC-823细胞株均购自武汉博士得生物科技有限公司。
二、试验方法
将生长至对数生长期的HepG-2细胞株、Hela细胞株、A549细胞株、BGC-823细胞株，1000rpm离心5min，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×104/孔。将细胞接种于96孔培养板中，分成阴性对照组和5个同浓度同序列的试验组，即：化合物1组、化合物2组、化合物3组、化合物4组、依托泊苷组；每孔0.10mL，用含有10%小牛血清的DMEM作为培养液，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24h接近长满时，弃去培养液，分别加入含化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、依托泊苷、10%小牛血清的DMEM培养液0.10mL；阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO；各组均设3个复孔，继续培养48h，每孔加入5mg/mL的MTT10μL,37℃放置4h。每孔加入100μl DMSO，37℃摇床振荡30min，492nm测吸光度（OD），计算MTT比值＝药物组OD值/阴性对照组OD值。
三、试验结果
试验结果见表1。由表1可知，本申请实施例所合成的四个酰胺取代鬼臼类衍生物化合物（化合物1～化合物4）对HepG-2、Hela、A549、BGC-823细胞株的抗肿瘤活性相比目前已作为抗肿瘤药物上市的鬼臼类衍生物药物依托泊苷（VP-16）抗肿瘤活性均有明显提高.
表1酰胺取代鬼臼类衍生物对体外肿瘤株的IC50值
Claims (12)
1.具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物或其盐，其特征在于，选自以下四种化合物中的任意一种：
4-β-(2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素；
4-β-(5-甲-2-吡嗪甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素；
4-β-(茶碱乙酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素；
4-β-(1,2,3-苯三酚-4-甲酰胺)-4-脱氧-4’-去甲基表鬼臼毒素。
2.一种制备权利要求1所述酰胺取代鬼臼类衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过酰胺取代反应，将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸以及没食子酸引入到4′-去甲基表鬼臼毒素的C环4位，得到酰胺取代鬼臼类衍生物粗产品。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的酰胺取代反应包括以下步骤：(1)将4′-去甲表鬼臼毒素的C环4位活化生成4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素；(2)将4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素C环4位活化生成4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素；(3)将4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素溶于有机溶剂中，加入2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸，搅拌进行反应，即得酰胺取代鬼臼类衍生物粗产品。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)的活化为迭氮取代反应，用叠氮化钠和三氟乙酸对4′-去甲表鬼臼毒素C环4位进行活化；
所述步骤(2)的活化为氨基取代反应，用锌粉、甲酸铵以及四氢呋喃对所述步骤(1)所得的4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素进行活化。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)的活化包括以下步骤：将4’-去甲基表鬼臼毒素干燥，加入叠氮化钠和三氯甲烷，于室温下预先反应5min，再在氮气保护下，边搅拌边滴加三氟乙酸，于室温下反应10min，即得4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品；
所述步骤(2)的活化包括以下步骤：将4-β-N3-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，锌粉和甲酸铵置于四口瓶中，抽真空通氮气三次，再加入85％四氢呋喃，于室温下反应24h，即得4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素粗产品。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述的搅拌为在真空条件下进行搅拌，其搅拌转速为50～800转/分钟；酰胺取代反应时间为24～48小时。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：其搅拌转速为600转/分钟。
8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括：
(1)将酰胺取代鬼臼类衍生物粗产品旋转蒸发浓缩，用二氯甲烷提取过滤得滤渣，再用体积比为1:1的二氯甲烷:甲醇复溶，真空干燥，得到初步纯化的酰胺取代鬼臼类衍生物产物，再将初步纯化的酰胺取代鬼臼类衍生物产物通过二氯甲烷溶剂溶解，并用水反复洗涤，收集有机层，真空干燥，得到待分离纯化样品；
(2)将待分离纯化样品依次使用硅胶柱层析和凝胶柱层析分离，即得纯品。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述的硅胶柱层析的分离方法包括：①硅胶柱层析为正相硅胶柱层析，正相硅胶以低极性有机溶剂拌匀后装柱，以洗脱剂平衡；所述的洗脱剂是由体积比为40:1的氯仿和甲醇组成；②将样品以洗脱液溶解，进行上样吸附，然后用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，将样品挥干并重结晶；
所述的凝胶柱层析分离方法包括：①凝胶以甲醇浸泡；将处理好的凝胶装柱，以甲醇平衡；②将经硅胶柱层析初步分离后的样品溶于甲醇中，进行上样吸附，然后用甲醇洗脱，收集洗脱液，将样品中溶剂挥干并重结晶。
10.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：
先将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸活化，再与4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素进行酰胺反应；
其中，2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸的活化方法是用无水的1-羟基-苯并-三氮唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对其进行活化；所述活化方法和所述酰胺反应包括以下步骤：将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸干燥，与无水1-羟基-苯并-三氮唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐一起置于四口瓶中，并抽真空通氮气，冰浴下反应2～4h，在氮气保护下，冰浴下边搅拌边加入4-β-NH2-4-脱氧-4′-去甲表鬼臼毒素，并缓慢滴加三乙胺；加料完毕后，撤去冰浴，室温25℃反应24～48h；
在酰胺取代反应中，4′-去甲基表鬼臼毒素与2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸或没食子酸的摩尔比为1:1。
11.权利要求1所述酰胺取代鬼臼类衍生物或其盐在制备抗肿瘤药物中的用途。
12.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括有效量的权利要求1所述的酰胺取代鬼臼类衍生物或其盐和药学上可接受的载体。
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Effective date of registration: 20160602 Address after: 430068 Key Laboratory of fermentation engineering, Ministry of education, Hubei University of Technology, 28, Hongshan, Wuhan, Hubei Patentee after: Hubei Industry University Address before: 430068 Wuchang City, Hubei Province, South Lake District, Lee House, special pier No. 1 Patentee before: Tang Yajie |
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