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CN103347578B - 用于实施染色质免疫沉淀测定的方法 - Google Patents

用于实施染色质免疫沉淀测定的方法 Download PDF

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CN103347578B CN201180067254.XA CN201180067254A CN103347578B CN 103347578 B CN103347578 B CN 103347578B CN 201180067254 A CN201180067254 A CN 201180067254A CN 103347578 B CN103347578 B CN 103347578B
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Abstract

在一个方面，提供了一种从样品分离染色质的方法，包括使包含染色质的液体样品通过刚性多孔基质，所述基质上固定有配体，其中所述配体结合与染色体缔合的蛋白质。

Description

用于实施染色质免疫沉淀测定的方法
领域
本发明涉及染色质免疫沉淀测定方法，以及用于在此类方法中使用的分离柱。
背景
染色质免疫沉淀(ChIP)是一种在DNA/蛋白质相互作用的研究中使用的重要技术。ChIP的一个优势在于它能够用于分析特定蛋白质，或它们的修饰同种型，与确定的基因组区域的缔合。O'Neilletal.(2003)“Immunoprecipitationofnativechromatin,NChIP”,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology31:76-82中提供了对现有的ChIP技术的综述。ChIP可以用来确定蛋白质如转录因子和修饰的组蛋白等是否结合活细胞或组织的内源染色质上的特定区域。
在ChIP测定中，以一定的方式制备DNA-蛋白质复合物(即染色质)的片段，以保留特异性的DNA-蛋白质相互作用。然后可以使用针对该复合物中存在的蛋白质的抗体对这些染色质片段进行免疫沉淀。然后可以对分离出的染色质级分进行处理以将DNA和蛋白质组分分开。然后可以通过聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、微阵列上的杂交、直接测序或者用于鉴定给定序列的DNA片段的其他技术，来确定与特定蛋白质(及免疫沉淀所使用的抗体所针对的蛋白质)一起被分离的DNA片段的身份。
因此，染色质免疫沉淀测定典型地涉及下列5个关键步骤：(i)从细胞制备要分析的染色质；(ii)使用抗体免疫沉淀染色质；(iii)分离被沉淀的染色质片段；(iv)从被沉淀的产物回收DNA；和(v)DNA分析。
ChIP有两种主要的变型，它们主要不同之处在于起始(输入)染色质是如何制备的。第一种变型(称为NChIP)使用按照标准程序用微球菌核酸酶消化细胞核而制备的天然的染色质。第二种变型(称为XChIP)通过对生长中的细胞添加甲醛交联染色质，然后断裂(通常是利用超声处理)染色质。一些工作者使用了温和的甲醛交联后续核酸酶消化，且UV照射已经被成功地应用为替代的交联技术。
典型地，针对染色质片段的免疫沉淀是使用对DNA上结合的感兴趣蛋白质特异性的抗体来实施的。结合有抗体的染色质片段可以使用固相来从样品中分离出来。例如，可以将抗体自身直接连接于固相，诸如琼脂糖或磁珠，然后使固相与染色质接触。或者，可以将游离于溶液中的抗体施加到含有染色质的样品中，然后使用如蛋白A、蛋白G、或缀合于固相的抗免疫球蛋白抗体等作用剂来分离结合着抗体的染色质片段。
该步骤中使用的固相典型地是凝胶型结构(通常基于一种糖类：琼脂糖)或磁珠(通常基于聚甲基丙烯酸酯型聚合物)。在任一种情况下，固相均分散于液体样品中，而且在染色质结合于固相后，必须通过某些手段从样品中将固相分离出来。凝胶(例如琼脂糖)可以在离心机中旋转沉降形成离心沉淀，然后可以通过抽吸将后者与液体样品分开。磁性珠子典型地通过使用磁铁来将珠子拉向容器的侧边，同时从容器中抽吸出液体样品，来加以分离。
在琼脂糖凝胶的场合，形成离心沉淀和抽吸的步骤需要重复数次来去除样品的所有残留，这是不便且缓慢的。虽然使用磁珠通常比使用琼脂糖更快、更方便，但利用磁铁和抽吸来分离的步骤仍然需要相当的技巧，而且可能十分耗时。此外，这两种方法在各个阶段中都有产物损失，而且这些损失在整个过程中可能累积。使用凝胶和珠子所必需的操作步骤导致人们难以获得高的DNA回收率、理想的纯度，以及各次测定之间良好的可重复性。琼脂糖凝胶和磁珠容易发生DNA和蛋白质的非特异性结合，而且，难以提供足够的洗涤步骤来降低由此产生的背景信号。因此，常规的ChIP测定典型地需要大量的样品，而就分离的DNA产品而言其提供的特异性不足。这样的方法也难以自动化，并且不适合高通量筛选应用。
因此，对可解决上述一个或多个问题的改进的染色质免疫沉淀的测定方法存在需求。尤其是，对从样品中分离染色质的灵敏、特异性、便于使用的方法和产品存在需求。
概述
由此，在一个实施方案中，本发明提供一种从样品分离染色质的方法，包括将包含染色质的液体样品通过刚性多孔基质(rigidporousmatrix)的步骤，所述基质上固定有配体，其中所述配体结合与染色质缔合的蛋白质。
优选地，所述刚性多孔基质包含经烧结的热塑性聚合物颗粒。在一个实施方案中，所述刚性多孔基质是滤碟(filterdisc)或筛板(frit)。
在一个实施方案中，所述刚性多孔基质包含通过化学氧化产生的改性表面。优选地，所述改性表面是通过用一种或多种氧化性酸处理而产生的。
所述刚性多孔基质可以，例如，包含在分离柱，优选离心柱(spincolumn)中。在一个实施方案中，所述柱还包含疏水性基质。
优选地，所述液体样品在离心机中，由重力，或由真空牵引通过所述刚性多孔基质。
在一个实施方案中，所述液体样品包含结合有免疫球蛋白的染色质。所述配体可包括，例如，抗体、蛋白A或蛋白G。
所述方法优选包括选自下列的一个或多个步骤：(i)使洗涤溶液通过所述刚性多孔基质，(ii)将结合于基质的染色质中存在的核酸与缔合的蛋白质分开，和(iii)检测结合于基质的染色质中存在的核酸。
在一个实施方案中，提供包含多个刚性多孔基质的阵列，并使多个液体样品中的每一个通过该阵列中的刚性多孔基质。优选地，该阵列包括多孔板，该板中的每个孔包含如上文定义的分离柱。
在另一个方面，本发明提供一种分离柱，包含用于容纳包含染色质的液体样品的室，和上面固定有配体的刚性多孔基质，其中所述配体能够结合与所述染色质缔合的蛋白质，且其中所述刚性多孔基质在所述室中如此定位，使得该液体样品能够被动地通过(bepassedthrough)该刚性多孔基质。
在一个实施方案中，所述刚性多孔基质包含经烧结的热塑性聚合物颗粒。优选地，所述刚性多孔基质是滤碟或筛板的形式。
在一个实施方案中，所述刚性多孔基质包括通过化学氧化产生的改性表面。优选地，所述改性表面是通过用一种或多种氧化性酸处理而产生的。
在一个实施方案中，所述刚性多孔基质定位于所述柱的流出端口的上方。优选地，容纳于所述室中的所述液体样品能够被动地通过所述刚性多孔基质并流出所述柱，从而通过染色质与该刚性多孔基质的结合从液体样品中将染色质分离出来。
在一个实施方案中，所述柱进一步包含用于接收已经通过所述刚性多孔基质并从柱中流出的液体的收集容器。所述柱可还包含疏水性基质。优选地，所述疏水性基质位于所述柱的刚性多孔基质和流出端口之间。
在一个实施方案中，所述分离柱为离心柱。优选地，所述配体包括免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G。
在一个进一步的方面中，本发明提供包含多个如上文定义的分离柱的阵列。优选地，所述阵列为多孔板或过滤微孔板的形式。
在一个进一步的方面中，本发明提供一种试剂盒，其包含如上文定义的分离柱，和一种或多种适合用于进行染色质免疫沉淀测定的缓冲剂、溶液或试剂。
在一个进一步的方面中，本发明提供如上定义的分离柱用于从液体样品分离染色质的用途。典型地，所述分离柱在染色质免疫沉淀测定中使用。
本发明的实施方案有利地容许以高特异性和灵敏度从样品中分离染色质片段。此外，通过使样品通过刚性多孔基质，使用该方法比利用琼脂糖或磁性珠子的常规方法方便得多。
附图简要说明
图1对来自使用BioVyonTM蛋白A(在重力流动柱中)的ChIP测定中的预封闭步骤的优化实验的PCR产物的实时PCR分析。使用获自NIH3T3小鼠成纤维细胞的经交联的细胞裂解物，用针对RNA聚合酶II的小鼠单克隆抗体进行ChIP测定。将ChIP程序后回收的DNA用与GAPDH-TATA框重叠的引物进行PCR扩增(详情见表1)。进行了三次分别的实验，并显示了一个典型实验的三次重复的定量。BioVyonTM蛋白A柱的预封闭使用预封闭溶液如蛋白A的规程来进行，所述预封闭溶液含有LSC(“低盐”)缓冲液(0.1%SDS,1%TritonX-100,2mMEDTA,20mMTris-HCl,pH8,150mMNaCl)+1mg/mlBSA+400μg鲑鱼精子DNA)。用预封闭溶液充满BioVyonTM蛋白A柱，在+40℃温育30min，然后排干。Ab=有抗体存在，无Ab=无抗体存在。富集值表示有抗体的ChIP测定的RT-PCR值对相应的对照(无抗体的ChIP测定)的比值，它们在插入的表格中表示。
图2.显示BioVyonTM蛋白A(在重力流动测定中)蛋白A和蛋白A在ChIP测定中的比较的实时PCR分析。ChIPDNA的实时PCR分析如实施例1所述。在涉及蛋白A的的实验中使用了Upstate规程。对于蛋白A我们遵循制造商的规程，对于BioVyonTM蛋白A使用了经优化的ChIP规程。进行了三次分别的实验，且显示了一个典型实验的三次重复的定量。误差棒表示标准偏差。在所有实验中，使用特异性抗体的ChIPDNA的富集在BioVyonTM蛋白A与对照之间的差异都是统计学显著的，除了对无抗体的富集之外(以星号表示)。缩写：“Ab”—对图2A为抗RNA聚合酶II抗体，对图2B为抗CTCF家兔多克隆抗体；“无ab”—无抗体；IgG—非特异性IgG；“肌动蛋白”—抗肌动蛋白小鼠单克隆(无关)抗体。“Histag”—抗His标签家兔多克隆（无关）抗体。A.使用小鼠单克隆抗RNA聚合酶II抗体和TATA框进行的ChIP测定的实时PCR分析。使用来自NIH3T3小鼠成纤维细胞的交联的细胞裂解物，进行使用小鼠单克隆抗RNA聚合酶II抗体的ChIP。平行地运行对照样品，对照样品不含抗体，含非特异性小鼠IgG，或含抗肌动蛋白小鼠多克隆(无关)抗体。对ChIP步骤后回收的DNA，用与GAPDHTATA框重叠的引物在PCR反应中加以扩增（详情见表1）。B.使用抗CTCF家兔多克隆抗体和不同的CTCF靶位点(CTS)的ChIP测定的实时PCR分析。使用来自MCF7乳腺癌细胞的经交联的细胞裂解物，用抗CTCF家兔多克隆抗体进行ChIP。平行地运行对照样品，对照样品不含抗体，含非特异性小鼠IgG，或含抗肌动蛋白小鼠多克隆(无关)抗体。对ChIP步骤后回收的DNA，用与6个CTSsN-位点Myc[10;19],PIM[15],DM1[20],β-珠蛋白[21],PLK[15]和H19[22;23]重叠的引物在PCR反应中加以扩增(详情见表1)。
图3：Sepharose和BioVyonTM的化学结构。Sepharose二聚体由半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成，如(A)中所示，而BioVyon单体为C2H4，如(B)中所示。
图4：化学腐蚀前后表面积的氮吸附分析。使用氮吸收分析(BET法)来测定BioVyonTM的表面积。这是如下进行的：使用GeminiIII2375表面积分析仪(Micromeritics,Norcross,GA,USA)测定特定温度和压力下吸附到表面上的氮分子的质量。显示了利用氮吸附分析的未经处理的和经化学腐蚀的BioVyonTM的表面积的比较(n=3)。
图5：BioVyonTM介质的扫描电子显微镜(SEM)照片
将两份经烧结的BioVyonTM样品用HitachiS-520扫描电子显微镜(HitachiHighTechnologiesCorporation,Tokyo,Japan)进行扫描电子显微术。A组：未处理的BioVyonTM的SEM，放大倍率2300X，展现了烧结颗粒的平滑的表面结构，颗粒之间形成的孔清晰显示。B组：经腐蚀的BioVyonTM的SEM，放大倍率2300X，展现了经烧结颗粒的坑洼（pitted）的表面结构，该结构提供了额外的表面积。
图6：BioVyonTM模式A.具有不同直径的刚性BioVyonTM滤碟。B.BioVyonTM-蛋白A重力流动柱。这些柱具有与标准1ml固相萃取(SPE)管相同的尺寸，并含有直径约6mm、长2mm的刚性多孔高密度聚乙烯(HDPE)筛板。显示了具有单个滤碟(顶部)和数个叠层的滤碟(底部)的柱的例子。C包含位于流出端口上方的刚性多孔基质(以BioVyonTM蛋白A滤碟的形式)的离心柱。
图7：使用BioVyonTM蛋白A(在重力流动柱中)的ChIP测定的洗涤步骤及去污剂浓度的优化实验的PCR产物的实时PCR分析。使用获自NIH3T3小鼠成纤维细胞的经交联的细胞裂解物，进行了使用针对RNA聚合酶II的小鼠单克隆抗体的ChIP测定。对于在ChIP步骤后回收的DNA，用与GAPDHTATA重叠的引物(见表1)进行PCR扩增。进行了三个分别的实验，并显示了一个典型实验的三次重复的定量。Ab=有抗体存在，无Ab=无抗体存在。富集值表示有抗体的ChIP测定的RT-PCR值对相应的对照(无抗体的ChIP测定)的比值。A.对使用下述规程获得的ChIPDNA的PCR产物的分析，该规程在用高盐(HS)缓冲液：0.1%SDS(或0.2%SDS)，20mMTris/HclpH8.0,2mMEDTA,500mMNaCl,1%TritonX100的洗涤步骤中包括不同浓度的SDS(0.1%或0.2%)。预封闭步骤包括在该规程中。富集值显示在插入的表格中。B.对使用下述规程获得的ChIPDNA的PCR产物的分析，该规程包括不同次数的洗涤(3次和6次)，并且包括或不包括一个含有LiCl缓冲液的洗涤步骤。缩写：LS缓冲液(低盐缓冲液)：10mMTris/HepespH8.0,1mMEDTA,150mMNaCl;MS缓冲液(中盐缓冲液):0.1%SDS,20mMTris/HClpH8.0,2mMEDTA,150mMNaCl,1%TritonX100;HS缓冲液(高盐缓冲液):0.1%SDS,20mMTris/HClpH8.0,2mMEDTA,500mMNaCl,1%TritonX100;LiCl缓冲液:250mMLiCl,10mMTris/HClpH8.0,1mMEDTA,1%脱氧胆酸钠。
图8：使用BioVyon-蛋白A(在重力流动柱中)获得的ChIP信号与蛋白G磁珠的直接比较。当直接比较时，使用相同的输入样品和浓度染色质，BioVyon-蛋白A方法导致DNA拉下（pulldown）增加大约25倍。
图9.BioVyon-蛋白A离心柱性能与重力流动柱性能的对照。使用带有疏水性筛板的离心柱使得从重力流动柱测定到离心柱测定的成功转换成为可能。当固定化在疏水性筛板旁边并作为离心柱使用时，BioVyon-蛋白A法导致%DNA拉下相比于其使用完全相同的DNA模板样品和抗体浓度的重力流动对应方案增加2.3倍。
图10.疏水性筛板对BioVyon离心柱的性能的影响。比较了使用疏水性筛板的离心柱和没有疏水性筛板的离心柱的情况下的特异性(Ab)和背景(IgG)信号(以%DNA拉下计)。
图11：高通量处理模式。显示了过滤微孔板(1)，其包含多个孔(2)，每个孔包含一个依照本发明的分离柱。每个分离柱包含呈滤碟或筛板形式的刚性多孔基质(3)，位于柱的流出端口(4)的上方。所述刚性多孔基质上固定有配体，该配体结合与染色质缔合的蛋白质。使用多通道移液器(7)和/或自动化(例如机器人)液体操作系统将液体样品(5)通过上部开口(6)导入每个孔中。可以通过真空、重力或离心力将液体样品抽过过滤微孔板的每个孔。样品通过过滤微孔板的每个孔中的刚性多孔基质，经由流出端口(4)从每个孔出来，被位于平板的每个孔下方的收集容器(8)所接收。
详细说明
在一个方面，本发明涉及一种从样品分离染色质的方法。“分离染色质”典型地意味着染色质变成与基质结合，例如，使得其能够方便地与液体样品分离。
染色质
染色质由DNA和蛋白质(主要是组蛋白)的复合物组成，并组成真核细胞中出现的染色体。染色质以具有不同的染色性质的常染色质和异染色质两种状态出现，在细胞分裂过程中，其卷曲并折叠而形成中期染色体。染色质在本文中用来指任何这样的核酸(典型为DNA)与相关蛋白质的复合物，包括由染色体或其他染色质制备物断裂而产生的染色质片段。
染色质免疫沉淀
典型地，该方法作为染色质免疫沉淀(ChIP)测定的一部分进行。术语“染色质免疫沉淀测定”是本领域技术人员熟知的，优选地包括至少下列步骤：(i)从细胞制备包含要分析的染色质的液体样品；(ii)使用抗体将该液体样品中的染色质免疫沉淀到基质上；和(iii)从经沉淀的染色质回收DNA，和(iv)DNA分析。ChIP测定可以是如上所述的NchIP或XchIP。
样品
液体样品可以从任何包含染色质的生物来源(例如任何包含细胞的制备物)制备。细胞可以源自组织样品，或源自任何在培养中生长的细胞。优选地，所述细胞包括哺乳动物细胞，优选人或小鼠细胞。
典型地，所述方法可以对这样的样品进行：该样品包含103至109个细胞，例如优选少于107个细胞，少于106个细胞或少于105个细胞，优选约104个细胞至106个细胞的染色质。一个细胞典型地包含约6pg(6x10-12g)DNA每个细胞，并在染色质中包含等量的DNA和蛋白质。因此，所述方法可以例如对这样的样品进行：该样品包含约0.6μgDNA，或1.2μg染色质(这等于大约100,000个细胞中的DNA或染色质的质量)。
染色质制备物
在本发明的实施方案中，对包含细胞的制备物进行染色质免疫沉淀测定(ChIP)。典型地首先将染色质从制备物中提取出来，以制备包含染色质片段的液体样品。
在一个实施方案中，首先利用标准方法从制备物收获细胞，然后可以从细胞获得细胞核。例如，可以破碎细胞(例如使用细胞裂解缓冲液或超声)，导致细胞核从中释放。在释放细胞核之后，该方法优选包括消化细胞核以释放染色质的步骤，例如通过使用微球菌核酸酶或进一步的超声。
在另一个实施方案中，所述方法可包括交联染色质的步骤。这可以通过任何合适的手段实现，例如通过添加合适的交联剂，如甲醛，优选在断裂染色质之前。断裂可以通过超声进行。但是，可以在断裂之后添加甲醛，然后进行核酸酶消化。或者，可以使用UV照射来作为替代的交联技术。
在一个实施方案中，首先用甲醛固定细胞或组织片段来交联蛋白质-DNA复合物。可以在室温或37℃在轻柔震荡下将细胞与甲醛温育5-20min，优选10min。组织片段可能需要更长的与甲醛温育的时间，例如10-30min，例如15min。甲醛的浓度可以为0.5-10%，例如1%(v/v)。
一旦交联反应完成，可以利用与交联剂等摩尔浓度的交联剂抑制剂，如甘氨酸，来终止交联反应。合适的终止交联反应的时间可为室温下2-10min，优选约5min。然后可以收集细胞并用含有钠盐、EDTA、及去污剂如SDS的裂解缓冲液裂解细胞。组织片段可以在裂解之前匀浆。
然后可将细胞或经匀浆的组织混合物机械或酶促剪切，产生合适长度的DNA片段。通常，ChIP测定需要200-1000bp的经剪切的染色质或DNA。DNA的机械剪切可以通过雾化或超声，优选通过超声来进行。DNA的酶促剪切可以通过在Mn盐的存在下使用DNA酶I，或者通过在Mg盐的存在下使用微球菌核酸酶来产生随机DNA片段来进行。交联DNA剪切可以基于细胞、超声设备或消化酶浓度来加以优化。
在一个实施方案中，一旦DNA剪切完成，可以通过离心去除细胞碎片，并收集含有DNA-蛋白质复合物的上清液。结果是，包含染色质片段的液体样品，其中蛋白质被固定化在DNA上(例如其中DNA与蛋白质交联)，可以在本方法中使用。在替代的实施方案中，可以省略离心步骤，例如，在DNA剪切后直接进行下述步骤。
免疫沉淀
一旦蛋白质已经固定化在染色质上，即可以免疫沉淀蛋白质-DNA复合物。因此，一旦制备好包含染色质的样品，方法优选地包括免疫沉淀染色质的步骤。优选地，免疫沉淀通过添加针对染色质中可能存在的感兴趣的蛋白质的合适抗体来实施。
在一个实施方案中，抗体可以固定化在刚性多孔基质上，即，抗体是与和染色质缔合的蛋白质结合的配体。在这个实施方案中，与染色质缔合的蛋白质是感兴趣的蛋白质，例如结合于染色质中的DNA的蛋白质。
在一个备选的实施方案中，首先将游离于溶液中的抗体施加到含有染色质的样品。然后可以利用可结合所述抗体的作用剂，该作用剂缀合于所述刚性多孔基质，分离结合有抗体的染色质片段。在这个实施方案中，结合于所述刚性多孔基质的配体可以是任何可结合所述抗体的作用剂，如蛋白A，蛋白G或抗免疫球蛋白(例如抗IgG)抗体。与染色质缔合的蛋白质是对感兴趣的蛋白质特异性的抗体。
所述抗体可结合任何与染色质缔合的蛋白质。在一个实施方案中，所述抗体对非组蛋白蛋白质，如转录因子或其他DNA结合蛋白具有免疫特异性。或者，所述抗体可以对组蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4以及它们的诸多翻译后修饰同种型和变体中的任意者具有免疫特异性。或者，所述抗体可以对染色质修饰中涉及的酶，诸如组蛋白乙酰化酶或脱乙酰酶，或DNA甲基转移酶，具有免疫特异性。此外，应当理解，组蛋白可以在体内被特定的酶翻译后修饰，例如通过特定氨基酸残基的乙酰化、甲基化、磷酸化、ADP-核糖化，SUMO化以及遍在蛋白化。因此，所述抗体可以是对任何这些翻译后修饰免疫特异性的。
刚性多孔基质
在本发明的实施方案中，使包含染色质(其任选被抗体结合)的液体样品通过刚性多孔基质。
合适的基质是现有技术已知的。在一个实施方案中，刚性多孔基质包括经烧结的热塑性聚合物颗粒，例如如WO2005/018803中所述的。基质可具有化学活性或官能化的改性表面，例如该表面提供适于附接配体(任选地通过接头)的悬垂官能团。本发明的基质是实质上刚性的。
在一个实施方案中，所述基质包括热塑性聚合物，诸如聚烯烃或乙烯聚合物。此类聚烯烃的例子包括聚乙烯和聚丙烯。乙烯聚合物的例子包括聚乙烯乙酸(PVA)和聚氯乙烯(PVC)。优选的聚合物包括聚乙烯或聚丙烯，最优选聚乙烯。在其他实施方案中，所述热塑性聚合物可以为聚偏氟乙烯(PVDF)，聚四氟乙烯(PTFE)或聚酰胺(尼龙)。
如本文中使用的，术语“聚合物”包括但不限于同聚物、共聚物，例如嵌段、接枝、无规和交替共聚物，三聚物，等等，及它们的共混物(blend)与修饰。此外，除非另外特别限定，术语“聚合物”还包括分子所有可能的几何构型。这些构型包括全同立构、间同立构、无规立构和随机对称等等。
在一个实施方案中，热塑性聚合物是聚乙烯；或者包含聚乙烯，优选包含至少80%聚乙烯，特别优选至少90%聚乙烯，最优选至少95%聚乙烯的共聚物或共混物。
可以使用的聚乙烯的例子包括高密度聚乙烯和超高分子量聚乙烯，如PorvairTechnology,UK制造的，商品名为“Vyon”或“BioVyon”。热塑性聚合物还可包括本领域中常用的流动改性剂、添加剂、等等。
要用来烧结形成所述基质的热塑性聚合物颗粒的尺寸通常将处于适合于基质的最终用途的范围。颗粒可以为球状、大致为球状，或者可以为任何其他合适的规则或不规则形状。本领域技术人员将理解，流体通过基质的速率将至少部分地由构成该基质的颗粒，以及那些颗粒的烧结条件所决定。在此方面其他要考虑的变量包括任何连接于该基质的材料的分子大小及其他性质。
如本文中使用的，术语“经烧结的热塑性聚合物”是指多个热塑性聚合物颗粒，这些颗粒通常已经在受热和震荡的影响，而不实际液化所述聚合物的条件下，聚结(coalesce)成单一单元。因此，基质包括多个熔合(fused)的热塑性聚合物颗粒，它们具有确定的、在施加流体时仍得以维持的结构。由于其组成颗粒被熔合的性质，“经烧结的热塑性聚合物”一般还会是实质上刚性的，即其实质上不可压缩，且其在水溶液中不会收缩或膨胀。然而，本发明的某些实施方案，诸如包含(comprise)本发明基质的片(sheet)或膜(membrane)，可以是柔性的。
烧结热塑性物质的方法是本领域中公知的。这些包括例如US2002/064413和GB2369796中公开的方法。
基质在烧结后的孔尺寸(poresize)可以在其制造过程中预先确定，使其适合于期望的用途。一般而言，基质中的孔的尺寸可为1-1000,μm,1-500μm,500-1000μm,200-700μm,5-100μm,20-40μm或40-80μm。
在烧结之后，将基质改性以提供化学活性表面，例如官能化表面，优选不规则表面。这种改性可增加基质的表面积。它还在表面上提供有助于附接配体的官能基团。换言之，化学活性表面是经改性的表面，并提供适于将配体附接于该表面(任选藉由接头)的悬垂的官能基团。
已知有多种用于热塑性聚合物的表面改性的技术。在此方面能够使用的三种优选技术是气相等离子氨化(gasplasmaamination)、γ-辐射和化学氧化，如WO2005/018803中所述。
优选地，所述基质具有通过化学氧化产生的改性表面。化学氧化技术通过打断热塑性物质中的碳键，导致产生中间性不规则反应性官能(intermediateirregularreactivefunctions)。
优选地，通过用一种或多种氧化性酸(例如选自下组的酸：三氟乙酸、三氟甲磺酸、三氧化铬和硫酸)进行处理，任选地在过氧化物盐如K2Cr2O7的存在下进行处理，来改性基质的表面。
已经有多种常用的热塑性物质的化学氧化策略。如果期望仅改性热塑性表面，可以通过使用过氧化物盐和酸，诸如K2Cr2O7和H2SO4，进行相对温和的氧化来实现，而不会导致表面的物理结构的显著损伤。热塑性物质的物理腐蚀(塑性材料中的隧道和洞，用于增加其结合本领，在塑性材料的表面的改性之前)可以通过用更强的酸，如三氟乙酸，以更高浓度和更高温度施加，处理塑性物质来实现。
基质表面上存在的官能基团的类型取决于用来产生它们的反应的类型。在大多数情况下，产生羧基或羟基基团。醛基和酮基也可能作为反应的副产物产生。羧基或羟基官能可以用更稳定且潜在反应性的官能来替换，如胺。可以将氨基基团直接化学导入热塑性表面之上或借助间隔分子(接头)附接。
当基质的表面被官能化之后，可以将表面与一种或多种接头或间隔物反应。此类实体的功能是(i)便于期望的配体附接于基质的表面和/或(ii)如果期望的话，容许将配体置于与基质的表面相距一定距离的地方。
有利的是，经改性的表面保持化学惰性，从而显著地降低非特异性背景结合。接头技术有助于在很大程度上保持任何固定化的蛋白质，以及在此类基质上纯化的任何蛋白质的天然构象。在基质上使用不可切割的接头容许蛋白质永久性地共价交联到基质，从而极大地减少任何固定化的分子从基质淋失。
优选地，将接头连接于基质的表面。最优选地，在表面被改性后立即将接头连接于基质的表面。
合适的接头的选择将依赖于基质的表面官能化以及要结合于基质的配体。有许多种这样的接头是本领域已知的。尤其是，可以用来将多肽或DNA/RNA分子偶联于特定接头或直接偶联于固体支持物的反应是本领域公知的。为了方便，可以在配体的化学合成的过程中将官能团掺入配体中。潜在的官能团包括醚、酯、硫醇、二烷基酰胺、酰肼、二胺和许多其他的。合适的接头将会是那些含有能够与一种或多种前述的官能基团反应的基团的接头。例如，对于利用配体与接头之间的硫醚键的形成的接头，可以在一端(配体)具有硫醇基团，在另一端(接头)具有溴乙酰基团。
典型地，固定化在基质上的配体是生物分子，通常是蛋白质(例如抗体、蛋白A或蛋白G)。一旦生物分子被结合于基质，保持其活性是重要的。这限制了接头策略的选择，因为必须使用非致变性的(例如生理的或温和的)条件来将蛋白质与接头连接。不是所有的接头都可以在此类条件下使用。蛋白质的生物活性可能依赖于特定官能基团的可及性(对底物)；因而不能使用这样的基团来将蛋白质连接于基质。此外，许多潜在的官能基团可能在翻译后被修饰(例如通过磷酸化、乙酰化等等)，因此连接反应将无法触及它们。
用于缀合生物活性分子与接头的优选反应包括：
1)氨基-连接，或通过接头末端的酯官能与蛋白质的伯胺和/或仲胺之间的反应在接头与配体(例如蛋白质)之间形成酰胺键。这样的反应通常是可靠的，且固定化的蛋白质的活性极少受到影响。此外，该反应可以在中性pH(对于伯胺)上至大约pH8.3(对于仲胺)进行。此外，反应在反应混合物中不需要游离胺。
2)硫-连接，或在基质上的硫醇以及来源于蛋白质的另一硫醇之间形成共价键。在该反应中，缀合反应是可逆的，即用2-巯基乙醇或DTT还原之后可以将配体去除回到流体相中。这对于例如蛋白质之间的相互作用的研究可能是非常方便的。该反应要求某些特殊的缀合条件，即溶液中不存在II价金属；并且在缀合之前必须将蛋白质的SH基团还原。
3)羧基连接，或在基质上的官能基团与蛋白质的羧基末端之间形成共价键。这种反应的效率和可靠性较低，因为许多蛋白质的C末端被天然修饰(即封闭)。
在一个实施方案中，将与和染色质缔合的蛋白质结合的配体固定化在基质的表面上。在此实施方案中，在烧结之后，给基质提供非胺化或基本上非胺化的表面。在此方法中，在氧化后(且优选在刚刚氧化后)，在基质上的羧基官能与6-氨基己酸之间的反应中产生间隔物(spacer)。该反应产生具有锚定性羧基官能(anchoringcarboxylicfunction)的接头。重要的是，这种途径不涉及表面上未结合胺的产生，显著地降低对经改性表面的非特异性背景结合。
接头优选足够长以避免支持物与结合所述配体的蛋白质之间的任何立体位阻。还可以导入接头以在配体和附接位点之间生成足够大的间距，由此提供配体对试剂的不受限制的访问，而且还防止配体在聚合物的表面上聚集。
在生物活性分子的缀合中，接头的长度将决定配体与固体支持物之间的距离。已经有人显示，该长度可能显著影响通过接头附接的生物分子的功能活性。优选地，接头将包含3-11个碳原子，最优选3、4、5、6、7或8个碳原子。接头可以是可切割的接头或不可切割的接头。术语“可切割的接头”意在表示这样的接头，其能在不影响通过接头与基质连接的配体的活性的条件下被切割。
附接于基质(任选地通过接头)的配体可以是任何与和染色质缔合的蛋白质结合的作用剂。典型地，所述配体是蛋白质、多肽、肽、肽模拟物、抗体或其片段(例如单克隆、多克隆、Fab、scFv)。优选地，所述配体包括结合抗体的作用剂，例如，抗免疫球蛋白(例如抗IgG)抗体、蛋白A或蛋白G。或者，所述配体可包括结合感兴趣的蛋白质的抗体，例如，所述配体可以是抗组蛋白抗体。
所述基质通常将会是多孔的，即基质内将存在可供液体通过的孔或间隙。本发明的基质可采取任何方便的物理形式，例如片、过滤器(filters)、膜、筒(cylinders)、纤维或管。在一个优选的实施方案中，基质包括过滤器、滤碟或筛板。基质典型地发挥吸附剂的功能(例如通过借助其表面上的配体结合与染色质缔合的蛋白质)。因此，虽然在某些实施方案中，基质的物理形式可能是过滤器(例如滤碟或筛板)，但基质并不必须作为典型的过滤器发挥作用。在一个实施方案中，基质包括吸附性滤碟或筛板。
基质可以作为分离的实体提供，或者可以构成其他实体的组成部分。例如，基质可以整合到分离装置如柱、离心管、筒或注射器，而且，取决于要操作的样品和下游过程，此类装置中的一者或多者可以以串联或并联的方式。这样的装置可以手动、半自动，或者完全自动方式操作。
分离柱
刚性多孔基质可以包含在任何类型的容器中，只要该设置容许液体样品被动地通过基质。优选地，基质包含在分离柱中。
在一个实施方案中，分离柱包括用于盛放包含染色质的液体样品的室，以及流出端口。典型地，流出端口位于柱的下端。柱典型地包括位于柱上端的开口，可以通过该开口添加液体样品。在一个实施方案中，刚性多孔基质位于流出端口的上方，即所述室中的液体样品与流出端口之间。在该实施方案中，分离柱被称为重力流动柱。
在一些实施方案中，柱还包括疏水性基质。疏水性基质典型地不包括结合的配体，但在其他方面可以是如上所述的刚性多孔基质。例如，疏水性基质可以从与刚性多孔基质类似的材料，例如，烧结的热塑性聚合物颗粒形成。然而，疏水性基质典型地具有未改性或未衍生化的表面，例如，疏水性基质缺少如羟基、羰基或氨基等官能团。在某些实施方案中，疏水性基质可由热塑性聚合物如聚乙烯形成，典型地具有未改性的表面。不存在亲水性官能团通常使得基质具有足以实施其功能(例如将液体样品保留在柱内一段期望的时间)的疏水性。然而，在供选择的实施方案中，疏水性基质可以用疏水性官能团如全氟烷基来改性。
疏水性基质可以是例如过滤器、滤碟或筛板的形式。疏水性基质可以位于刚性多孔基质与柱的流出端口之间。疏水性基质可以起到这样的作用：将液体样品保留在柱内，即防止从柱子的室中渗漏，直到想要将该样品冲洗通过该基质并冲洗到柱外。在纳入疏水性筛板或其他防止重力所致的液体流动的手段的实施方案中，柱称为离心柱。
分离柱可以是任何合适的形状，取决于测定的性质，尤其是用来将液体牵引通过基质的方法。因此，分析可以是，例如，重力流动柱，真空柱或离心柱。在一个实施方案中，分离柱是微型离心柱(micro-spincolumn)，例如，该柱适配有适用于桌上微型离心机的1.5或2.0ml的微型离心管。典型地，柱还包含收集容器，用于接收已经通过刚性多孔基质并流出柱的液体。
在一个实施方案中，提供包含多个依照本发明的分离柱的阵列。例如，所述分离柱可形成适用于高通量筛选的多孔板的一部分。在一个实施方案中，可以在多孔平板，例如过滤微孔板中提供多个分离柱，每个分离柱对应于板中的单个孔。有多种适用于多通道移液器和自动化(例如机器人)液体操作系统的多孔板模式可供使用。例如，在特定的实施方案中，可以使用96、384或1536孔模式，即多孔平板包含96个、384个或1536个分离柱。在一个实施方案中，可以使用如图11所示的过滤微孔板。
使液体样品通过基质
可以使用任何合适的方法使液体样品通过所述基质。在一个实施方案中，首先将液体样品添加到分离柱中的室中，例如通过柱的上部开口。然后液体样品可通过刚性多孔基质(其典型地位于柱下端的流出端口之上)，从而流出该柱。以此方式，液体样品中存在的染色质片段在通过该基质的同时可以与配体结合。这样可以从液体样品中分离出染色质片段，然后可以弃去液体样品。
在本发明的实施方案中，可以在离心机中、通过重力、或者通过真空将液体样品牵引通过所述基质。
在一些实施方案中，将液体样品与基质温育合适的时间，例如在将样品添加到柱之后，且在从柱抽取(withdraw)样品之前。例如，可将液体样品与基质温育30秒至48小时的时间，例如1分钟至12小时，1分钟至2小时，5至60分钟，或大约30分钟。该温育的长度可以变化，以便提供充分的时间供配体结合染色质，依据这种反应的动力学而定。
液体样品的体积可依据柱的室的体积，以及基质(例如筛板)的尺寸而定。基质是多孔的，且典型地具有大约0.5的孔隙率，即基质总体积的大约50%是内部空隙。在一个实施方案中，添加的液体样品的体积使得其完全被基质所吸附，即基质的内部空隙大于或等于液体样品的体积。例如，适合在离心柱中使用的多孔基质可以是直径大约7.2mm、厚度大约2mm的滤碟的形式。这样的基质具有大约80μl的体积，假设孔隙率为0.5，内部空隙将约为40μl。当使用疏水性基质来将液体样品保留在柱中时，优选基质具有足够的疏水性，以实质上防止任何液体透到疏水性基质中。
洗涤
使液体样品通过基质后，在一个实施方案中，洗涤柱以减少对基质的非特异性结合。可以采用一个或多个洗涤步骤，典型地通过对柱添加洗涤溶液，并使得该洗涤溶液通过基质。
例如，可以用高严紧度缓冲液洗涤基质以消除非共价相互作用。高严紧度缓冲液可含有例如20-50mMTris-HCl(pH8.0),1-5mMEDTA,0.1-0.5%SDS,0.5-1MNaCl,和0.5-1%TritonX-100。或者，洗涤缓冲液可包含：含有0.5%Tween-20的PBS，或含有200mMNaCl以及去污剂如Tween-20或TritonX-100等的100mM磷酸钠。典型地，洗涤步骤可包括一系列严紧度不同的缓冲液，例如包含相对低盐浓度的低严紧度缓冲液，和具有较高盐浓度的高严紧度缓冲液。
优选地，洗涤缓冲液包含至少0.1%SDS，更优选约0.2%SDS。在一个实施方案中，所述方法包括1个、2个或3个洗涤步骤，优选3个洗涤步骤。优选地，所述洗涤缓冲液包含NaCl，而LiCl是较不优选的。
交联的逆转
在样品包含经交联的DNA-蛋白质复合物的实施方案中，在洗涤后可以逆转交联。可以对用于交联逆转的缓冲液进行优化，以使交联物的逆转最大化，并使由于化学、生化及热力学作用导致的DNA降解最小化。
例如，在一个实施方案中，用于逆转交联的缓冲液包含EDTA、SDS和蛋白酶K，它应该高效地降解与DNA复合的蛋白质，并防止DNA被核酸酶如DNA酶I降解。还可以使用额外的缓冲液，其包含高浓度的钠盐和钾盐，例如1M的氯化钠或0.5M的氯化钾。已经证明这样的缓冲液可高效地降低由于化学和热力学作用导致的DNA降解(Marguet,E.Forturre,P,Extremophiles,2:115-122,1998)，并增加甲醛交联物的逆转速率。典型地，交联的逆转在高温下发生，例如50-85℃5分钟至4小时，优选65-75℃0.5-1.5小时。
在本发明的某些实施方案中，交联的逆转步骤可以在分离柱内部进行。或者，可以将刚性多孔基质(例如以滤材或筛板的形式)从分离柱移出(例如在洗涤之前或之后)，从而使得交联的逆转在不同的容器中进行。在其他实施方案中，在逆转交联之前，可以首先从柱上洗脱结合于基质的染色质。
DNA捕获和分析
一旦完成了交联DNA-蛋白质复合物的逆转，就可以捕获并净化DNA。这可以通过苯酚-氯仿抽提的标准技术来实现，或者通过在另一固相(例如二氧化硅或硝酸纤维素，在高浓度非离液盐的存在下)上捕获DNA来实现。
在纯化步骤之后，接下来可以对分离的DNA片段进行分析，并确定它们的身份。这优选地通过PCR来实现。例如，分析步骤可包括使用合适的引物，这些引物在PCR的过程中将导致一定长度的核酸被扩增。本领域技术人员会认识到可以应用该方法来检测可对其制备特异性PCR引物的基因或任何基因组区域。PCR结果可以在例如电泳凝胶上检视。
应用
本发明可具有多种应用，包括任何目前使用ChIP测定的应用，而且可以应用到多种多样的生物样品类型。例如，本方法可以在多种研究应用中使用，用来表征DNA/蛋白质相互作用。组蛋白蛋白质修饰，非组蛋白蛋白质修饰，和/或DNA甲基化等变量是基因表达的关键调节物，而它们的改变与细胞功能变化或功能障碍相关，从而与疾病相关。由于ChIP测定可以用来研究此类表遗传标志物的变化，因此本方法可以在诊断和预后应用中应用，并且可以用来指引合适的治疗方案。
由此，在一个方面，本发明可以用于疾病状况的诊断或预后。本方法可以例如在癌症例如前列腺、宫颈癌，或何杰金氏淋巴瘤，以及自身免疫病如类风湿性关节炎的诊断或预后中使用。优选地，诊断方法在体外实施。
在一个实施方案中，该方法可包括采取第一和第二样品，然后根据本方法对每个样品实施ChIP测定。例如，第一样品可包含正常(对照)细胞，而第二样品可包含怀疑患病的细胞。通过比较此类分析的结构，可以利用该方法来将样品归类为患病的或未患病的。
试剂盒
在本方法中使用的组件可以作为试剂盒的形式提供，试剂盒任选地与关于实施该方法的说明书包装在一起。这样的试剂盒可包含，例如，如上文所述的分离柱，以及任选地一种或多种用于实施染色质免疫沉淀测定的其他试剂。典型的供包含在试剂盒中的试剂包括用来制备液体样品、交联染色质、洗涤基质、逆转交联物、和/或纯化DNA的一种或多种缓冲液或溶液。
下面将援引下述非限制性的实施例描述本发明。
实施例
实施例1
染色质免疫沉淀(ChIP)是DNA/蛋白质相互作用的研究中的一项重要技术。但是ChIP程序有不足之处，其过程冗长，可能有不一致性，而且容易受到DNA和蛋白质对基于珠子的固相基质(此类基质经常用于免疫沉淀步骤)的非特异性结合的影响。在这个实施例中，我们考察了一种新的基质BioVyonTM-蛋白A对ChIP测定的用处，该基质是一种基于多孔聚乙烯的固相支持物。在使用两种抗体和7个DNA座位的ChIP实验中，BioVyonTM-蛋白A的表现显著更好，在测试的所有测定中，DNA拉下的百分比均高于基于珠子的基质：蛋白A和蛋白A。此外，柱内刚性多孔滤碟的模式使得BioVyon基质更易用，步骤更少，对设备的要求更少，从而显著减少了处理ChIP样品要花费的时间。总之，BioVyonTM-蛋白A提供了一种供ChIP及其他基于免疫沉淀的程序使用的、基于柱的测定方法；BioVyonTM的刚性多孔结构使得快速、稳健，无显著样品损失的规程成为可能。
介绍
染色质免疫沉淀(ChIP)测定是现代分子生物学中的重要研究工具[1;2;34;5]。它容许人们研究和鉴定这样的DNA序列：这些DNA序列特异性结合于作为转录机制的重要调节元件的特定蛋白质。ChIP测定是一个复杂的程序，包括数个步骤：DNA/蛋白质交联，超声处理，经交联的DNA/蛋白质复合物的免疫沉淀(IP)，这些复合物的捕捉，以及最后从经沉淀的产物回收DNA以及DNA的分析。在IP步骤中，利用对蛋白质组分特异性的抗体，并且通过免疫球蛋白对缀合于固体支持物的蛋白A和/或蛋白G的特异性结合来实现免疫球蛋白/DNA/蛋白质复合物的捕捉[6]。DNA分析可以通过PCR、实时PCR、微阵列上的杂交(ChIPChIP)[7;8]或直接测序(ChIP-Seq)[9]来进行。
然而ChIP测定有固有的问题，这些问题往往可能导致对ChIP数据的误导性的，或者甚至错误的解读[4]。这些问题是在ChIP测定中最关键的部分—IP的过程中产生的。IP的两个主要组分决定着ChIPDNA的质量和数量：抗体，以及用来结合抗原/抗体复合物的固体支持物。抗体有助于非特异性结合，而且可能由于对结合于DNA的蛋白质的亲和力低而造成回收的DNA的收率低。但是人们认为，对固体支持物的非特异性结合，尤其是对IP和ChIP测定中常用的基于琼脂糖的基质如蛋白A的非特异性结合中的大部分都是由于DNA/蛋白质复合物与Sepharose表面上各种各样的化学基团反应所致。Sepharose来源于天然物质(海藻)，具有化学上高度异质的基础结构，并具有极高的表面积(见图3A)。
蛋白A变体的高表面积已经被证明对涉及蛋白质的IP而言非常有用，但是倾向于允许对ChIP测定的染色质靶物中的DNA的高水平的非特异性结合，这可能是sepharose和DNA的带电荷情况不同的表面之间的离子相互作用的结果。为了最小化这个问题，通常在ChIP规程中推荐额外的DNA预封闭步骤。在该步骤中，在IP之前将基于sepharose的固体支持物与非同源的DNA/RNA预温育，以封闭任何潜在具有活性的结合位点。
在本实施例中，我们使用了一种替代的基质BioVyonTM-蛋白A，它基于多孔性高密度聚乙烯(HDPE)，可以从PorvairFiltrationGroupLtd,Fareham,UK获得。BioVyonTM可以使用如WO2005/018803中描述的方法来制备。BioVyonTM的聚合物化学与sepharose大相径庭：它是由碳氢化合物乙烯的重复单元构成的合成聚合物，在化学上是均一的(见图3B)，这种结构的可变性较小，而惰性高得多。BioVyonTM的表面已经通过氧化而被化学腐蚀，其提供更温和的表面积增加，并容许接头与蛋白A分子共价附接(见图4和5)。该腐蚀/氧化过程导入的氧化种类的表面浓度相对较低(相对于多糖)，生成具有对ChIP测定而言足够浓度的蛋白A的惰性表面。BioVyonTM-蛋白A的化学结构，如上文所述，可望表现出减少的对DNA/蛋白质复合物的非特异性结合的量。而且，这种基材(base)化学结构中的差异还可能有助于BioVyonTM-蛋白A在ChIP测定中可能发生的酸水解和氧化过程中的化学稳定性改善(相对于蛋白A)。
BioVyonTM被制造成固体但多孔的滤碟的形式，这种滤碟是刚性且不可压缩的，并被插入到柱中(见图6)。这使得BioVyonTM基质比基于珠子的基质更容易操作，而且能够制备出在基材上固定有精确量的蛋白A的柱。不需要凝胶重悬，而且在试剂和缓冲液的添加过程中BioVyonTM床不会被破坏，而且，吸取珠子到容器的过程中涉及的误差也得以消除。
在本实施例中，我们用两种不同的抗体和数个DNA座位，使用重力流动柱中的BioVyonTM-蛋白A进行了ChIP测定。将这些结果与在相似条件下采用其他基质(蛋白A和蛋白A)而获得的ChIP测定的结果比较。是超顺磁性颗粒，包覆有聚丙烯酸酯聚合物层。从这些实验我们得出结论：BioVyonTM-蛋白A基质在ChIP，以及可能在其他基于IP的测定中可以作为现有基质的令人感兴趣的替代。
材料和方法
细胞NIH3T3小鼠成纤维细胞维持补充有10%供体血清和50μg/ml庆大霉素(都来自Invitrogen,SanDiego,USA)的DMEM(Lonza,Basel,Switzerland)中。MCF7，人类乳腺癌细胞，在含有Ultraglutamine1的RPMI-1640(两者都来自Lonza,Basel,Switzerland))中培养，该培养基补充有10%FBS(Biosera,EastSussex,UK)和50μg/ml庆大霉素。
用于ChIP测定的NIH3T3细胞的裂解物如下制备。使大约5x106个细胞在75cm2的瓶中的20mlDMEM培养基中生长。向培养基中加入10%终浓度的甲醛37℃处理细胞10分钟，以交联DNA/蛋白质复合物。然后向培养基中加入NH4OH至终浓度0.5%，室温(RT)保持5min以中和甲醛。然后加入冷的PBSM(标准PBS缓冲液+2mMMaCl2)，收获细胞，通过离心收集，用冷的PBSM洗涤两次。
然后将细胞细胞在置于冰上的PBSM，0.5%TritonX-100中裂解15min，通过6000g离心10min收集细胞核。离心沉淀用冷PBSM洗涤，离心，并在NLB(10mMTris/HepespH8.0,1mMEDTA,2.5MNaCl,0.5mMPMSF)中重悬，并在NLB中于冰上温育20min(1:5v/vpellet/NLB)。按如下比例将该悬液在NLB+1M蔗糖的垫层上铺层：悬液/NLB+1M蔗糖1/10v/v，然后10000g离心10min。将离心沉淀在低盐缓冲液LS(10mMTris/HepespH8.0,1mMEDTA,150mMNaCl)中重悬，然后在冰上使用BioruptorTM(WolfLaboratoriesLimited,Pocklington,York,UK)以爆裂5x1min，间歇1min，功率3进行超声，直到达到期望的DNA片段长度(400-500bp)。然后以下述浓度向裂解物添加蛋白酶抑制剂：抑肽酶800nM、苯丁抑制素(Bestatin)50μM、亮肽素(Leupeptin)20μM、胃酶抑素(Pepstatin)10μM、AEBSF1mM、E6415μM(批号：78425ThermoScientific)。如果裂解物在-80℃保存，则将蛋白酶抑制剂添加到融化的裂解物中。
MCF7细胞的裂解物如下制备。使大约5x106个细胞在75cm2的瓶中的20mlRPMI培养基中生长。排干培养基，向细胞加入1ml温热的PBS。为了交联DNA/蛋白质复合物，用1%甲醛(终浓度)在室温下在旋转平台上震荡下处理细胞10min。用0.67M甘氨酸(终体积)室温震荡下处理5min来终止反应。
然后收获细胞并在3500rpm离心5分钟。将细胞离心沉淀在2ml低渗缓冲液(10mMTris/HCl,pH7.2,2mMMgCl2,0.5%TritonX-100)中重悬，并在冰上保持10min。在4℃5000rpm离心5min后收集细胞核。将离心沉淀重悬于600μl裂解缓冲液(50mMTris/HClpH8.0,10mMEDTA,1%SDS)中，在冰上保持10min，然后用BioruptorTM(WolfLaboratoriesLimited,Pocklington,York,UK)以爆裂15x1min，间歇1min，功率3在冰上超声处理，直到达到期望的DNA片段长度(400-500bp)。将样品在4℃13,000rpm离心10min。将经超声处理的细胞悬液在Upstate的“ChIP离心缓冲液”(ChIPdilutionbuffer)(0.01%SDS,1.1%TritonX-100,1.2mMEDTA,16.7mMTris/HCl,pH8.0,167mMNaCl)中稀释10倍。然后向裂解物加入下述浓度的蛋白酶抑制剂：抑肽酶800nM,苯丁抑制素50μM,亮肽素20μM,胃酶抑素10μM,AEBSF1mM,E6415μM(批号：78425ThermoScientific).如果裂解物在-80℃保存，则将蛋白酶抑制剂添加到融化的裂解物中。
此研究所用的抗体如下：抗RNA聚合酶II(抗-PolII)(8WG16)小鼠单克隆(CovanceResearchProducts,Princeton,NewJersey,USA)，先前曾用于ChIP测定[10]；抗CTCF家兔多克隆(Upstate-Millipore,Massachusetts,USA)，用于基因组范围ChIP测定[例如[11;12]]；抗His标签家兔多克隆(Abcamplc,Cambridge,UK);抗β-肌动蛋白小鼠单克隆(Sigma-Aldrich,StLouis,USA)；小鼠和家兔IgG(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)。
BioVyonTM-蛋白A重力流动柱获自PorvairFiltrationGroupLtd,Fareham,UK。所述柱与标准的1ml固相萃取(SolidPhaseExtraction,SPE)管具有相同的尺寸，且包含直径约6mm、长2mm的刚性多孔HDPEBioVyonTM-蛋白A筛板(见图6B)。所述筛板已经通过化学处理以增加表面积，该处理使用一种选择性氧化方法，该方法优先腐蚀该表面并提供羧酸锚定基团，用于进一步的共价附接。图5中可清晰地见到该腐蚀过程造成的坑洼，该图比较了腐蚀前后表面的微结构。这种坑洼形成是图4中所示的表面积增加的原因。该表面已通过该过程而得到调整，以便为ChIP测定的免疫沉淀步骤提供充足的官能团。然后通过接头将HDPE表面上形成的锚定基团与蛋白A共价偶联，形成BioVyonTM-蛋白A固相。
染色质免疫沉淀(ChIP)测定根据蛋白A(Sigma-Aldrich,StLouis,USA)的ChIP试剂盒的制造商手册(Upstate-Millipore,Massachusetts,USA)来进行，并作了一些修改。在涉及BioVyonTM-蛋白A的ChIP实验中，应用了经过某些修改的上述规程；将其中的蛋白A浆液换成了BioVyonTM-蛋白A重力流动柱。在使用蛋白A(Invitrogen,SanDiego,USA)的ChIP测定中，我们遵照制造商的规程。使用所述三种不同基质进行的ChIP实验的详细规程如下所述。
使用蛋白A的染色质免疫沉淀(ChIP)
使用蛋白A的染色质免疫沉淀(ChIP)测定使用ChIP试剂盒(Upstate)按照制造商的说明进行，并作了一些修改(引自UpstateChIP试剂盒手册)。对于使用小鼠NIH3T3细胞的裂解物的ChIP测定，使用了下列抗体(每500μl裂解物4μg)：抗-PolII，非特异性小鼠IgG，和抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体。对于使用人MCF7细胞的裂解物的ChIP测定，使用了下列抗体(每500μl裂解物100μg)：抗-CTCF；非特异性家兔IgG，以及抗His标签家兔多克隆。
1.对于每个反应，使用500μl稀释的经超声的细胞悬液。
2.保留1%的经稀释细胞悬液用于输入。
3.加入80μl鲑鱼精子DNA/蛋白ASepharose-50%浆液(SIGMA)，4℃回转震荡30min，以预澄清该悬液。
4.用1ml预封闭溶液来预封闭蛋白A(0.2ml)，预封闭溶液含“低盐”LS缓冲液(0.1%SDS,1%TritonX-100,2mMEDTA,20mMTris-HCl,pH8,150mMNaCl)+1mg/mlBSA+400μg鲑鱼精子DNA。将蛋白A与预封闭溶液混合并在4℃下回转震荡30min。500rpm离心并去除上清液。
5.短暂离心(1100rpm，5min，4’C)来沉降珠子，并收集上清液级分。
6.向裂解物加入免疫沉淀抗体并在4℃回转震荡下温育3小时。
7.加入60μl精子DNA/蛋白ASepharose-50%浆液，4℃回转震荡1h，以收集抗体/CTCF复合物。
8.通过离心沉降琼脂糖(4℃1000rpm,1min)。
9.在回转震荡平台上用1ml的下述缓冲液小心地洗涤复合物3-5min：LS,“低盐”(0.1%SDS,1%TritonX-100,2mMEDTA,20mMTris-HCl(pH8),150mMNaCl),HS,“高盐”(0.1%SDS,1%TritonX-100,2mMEDTA,20mMTris-HCl(pH8),500mMNaCl),用“最终洗涤”(0.1%SDS,1.1%TritonX-100,1.2mMEDTA,16.7mMTris-HCl,pH8.0,167mMNaCl)x2洗涤两次，最后用TE洗涤一次。
DNA的洗脱和抽提
1.加入200μl新鲜制备的“洗脱缓冲液”(1%SDS,0.1MNaHCO3)。
2.65℃温育10min。短暂涡旋震荡。以最大速度旋转沉降sepharose珠子5min，并小心地将上清液级分(洗脱物)转移到另一个管中。重复该步骤两次。
3.向合并的洗脱物(400μl)中添加18μl5MNaCl，并65℃加热eppendorf管4-5h以逆转交联。
4.向洗脱物添加10μl0.5MEDTA,20μl1MTris/HCl,pH6.5(6.8)和1.5μl14-22mg/ml蛋白酶K，45℃温育1h。
5.通过加入苯酚/氯仿回收DNA。
6.在40μlH2O中重悬离心沉淀。
使用蛋白A的染色质免疫沉淀(ChIP)测定
使用蛋白A的染色质免疫沉淀(ChIP)测定按照制造商(Invitrogen)的手册进行，并作了一些修改(引自蛋白AInvitrogen手册)。对于使用小鼠NIH3T3细胞的裂解物的ChIP测定，使用了下述抗体(每500μl裂解物各4μg)：抗PolII，非特异性小鼠IgG，以及抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体。对于使用人MCF7细胞的ChIP测定，使用了下述抗体(每500μl裂解物各100μg)：抗CTCF、非特异性家兔IgG，和抗His-标签家兔多克隆。
步骤如下：
1.1Dynabeads的制备
1.通过吹打或者通过在回转器上回转震荡(5分钟)彻底地重悬Dynabeads。
2.将50μl(1.5mg)Dynabeads转移到试管中。
3.在磁铁上分离，直到上清液澄清，并移出上清液。
4.从磁铁上取下试管。
5.直接进行抗体(Ab)结合(第1.2节)
1.2抗体(Ab)的结合
6.将在200μl的“Ab*Binding&*WashingBuffer”(抗体结合与洗涤缓冲液)中的你的抗体加入来源于上述步骤4的试管。
7.室温回转震荡下温育10分钟。
8.将试管置于磁铁上，去除上清液。
9.从磁铁上取下试管，通过轻柔吹打洗涤以将珠子重悬在200μl的“抗体结合与洗涤缓冲液”中。
10.直接接着进行免疫沉淀(第2.3节)
1.3靶抗原的免疫沉淀
11.将试管(来自第10步)置于磁铁上，并移去上清液。
12.加入你的含有抗原(Ag)(典型地为100-1000μl)的样品，并轻柔地吹打以重悬Dynabeads-Ab复合物。
13.室温回转震荡下温育10分钟，以让Ag结合Dynabeads-Ab复合物。注意：取决于抗体的亲和力，可能需要增加温育时间以获得最优的结合。
14.将试管置于磁铁上。如果期望，将上清液转移到干净的试管中以便进一步分析。
15.洗涤Dynabeads-Ab-Ag复合物三次，每次洗涤使用200μl洗涤缓冲液。每两次洗涤之间在磁铁上进行分离，去除上清液，并通过轻柔吹打重悬。
16.将Dynabeads-Ab-Ag复合物重悬在100μl洗涤缓冲液中并将珠子悬液转移到干净的试管中。推荐这样做，以避免结合在试管壁上的蛋白质共洗脱。
17.将试管置于磁铁上，移去上清液，接着如蛋白A规程(如上文所述)中描述的那样进行DNA洗脱和抽提。
*缓冲液组成：
结合缓冲液：PBS/Tween20(1xPBSpH7.4./0.02%Tween20)
洗涤缓冲液：PBS
使用BioVyonTM-蛋白A重力流动柱的染色质免疫沉淀(ChIP)测定的优化规程
向裂解物中加入免疫沉淀抗体并在回转震荡下4℃温育3小时。对于使用小鼠NIH3T3细胞裂解物的ChIP测定，使用下面的抗体(每500μl裂解物4μg)：抗-PolII，非特异性小鼠IgG和抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体。对于使用人MCF7细胞的裂解物的ChIP测定，使用下述抗体(每400μl裂解物100μg)：抗CTCF、非特异性家兔IgG、和抗His标签家兔多克隆。
BioVyonTM-蛋白A重力流动柱如下制备(对柱的所有操作都是在室温下通过重力流动实现的)：首先用蒸馏水洗涤柱，然后用1mlChIP洗涤缓冲液(0.01%SDS,1.1%TritonX100,1.2mMEDTA,16.7mMTris/HCl,pH8.0,167mMNaCl)洗涤三次。然后将细胞裂解物施加到柱上，并进行洗涤步骤：用1mlLS缓冲液(低盐缓冲液：10mMTris/HepespH8.0,1mMEDTA,150mMNaCl)洗涤3次，用1mlMS缓冲液(中盐缓冲液：0.1%SDS,20mMTris/HClpH8.0,2mMEDTA,150mMNaCl,1%TritonX100)洗涤3次，并用1mlHS缓冲液(高盐缓冲液，0.1%SDS,20mMTris/HClpH8.0,2mMEDTA,500mMNaCl,1%TritonX100)洗涤三次。用500μl洗脱缓冲液(7M脲，50mM2-ME)洗脱DNA，然后添加NaHCO3和NaCl至终浓度分别为0.1M和0.5M，并将eppendorf管65℃加热4-5小时以逆转交联。在这个步骤之后，向洗脱物加入25μl的0.5MEDTA、50μl1MTris/HCl，pH6.5和1.5μl的14-22mg/ml蛋白酶K，并将试管在45℃温育1小时。然后用苯酚/氯仿抽提DNA，回收水相，并用2-3倍体积乙醇沉淀；向溶液中加入20ng糖原(载体)。然后将其在10,000rpm离心10min，并将DNA离心沉淀在40μlH2O中重悬。
实时PCR(Q-PCR)和PCR反应PCR和Q-PCR的引物和条件如表1所示。在前人报道的基础上加以改进[13]来进行实时PCR反应。简而言之，将反应组分组合成25μl混合物，其含有3μl样品、200nM的每种引物，和12.5μl的SensiMixPlusSYBRGreenPCR试剂盒(Quantace,London,UK)。扩增、数据获取和分析使用Chromo4RealTimePCR(BioRadLaboratories,California,USA)来进行。在PCR后对每个样品进行解离曲线分析，以验证获得了具有预期的熔解-曲线特征的单个扩增子。根据下式计算相对于总输入染色质的沉淀DNA的量，并表示为总量的百分比：%输入=2ΔCt×100%,其中ΔCt=Ct(输入)-Ct(免疫沉淀)，且Ct为相应的PCR反应的平均阈值循环数。这些实验按一式三份进行，从%输入获得平均值。
统计学分析统计学分析使用非配对Student氏检验来进行。当概率低于5%置信水平(P<0.05)时检测到显著的值。
结果和讨论
在为BioVyonTM-蛋白A开发的ChIP规程中，为了与这种固体支持物一起使用，IP步骤需要优化。作为这项研究中的一个模式测试系统，我们选择了一种前人描述过的用于检测RNA聚合酶II对小鼠GAPDH基因启动子区域内的TATA框的结合的测定法[10;14]。
在常规ChIP中预封闭Sepharose珠子有助于防止DNA/蛋白质复合物在IP步骤中非特异性地结合Sepharose。这一点在我们的测试中得到了证实，在该测试中，省略预封闭步骤导致蛋白A-Sepharose珠子和蛋白A二者的背景都增高(图1)。对于BioVyonTM-蛋白A柱，预封闭步骤实际上稍微增加了非特异性结合(图1)，因此ChIP规程中未包括该步骤。
然后我们考察了对BioVyonTM-蛋白A柱的低非特异性结合是否可以通过改变洗涤缓冲液的配比和洗涤次数来进一步降低。已知引入亚致变性量的离子型去污剂如SDS可改善使用蛋白A的ChIP实验中的信号/背景(抗体/无抗体)比。为了比较增加的SDS浓度如何影响蛋白A蛋白A和BioVyonTM-蛋白A上的信号/背景比，测试了含有两种不同浓度的SDS(0.1%和0.2%)的洗涤缓冲液，所有的基质使用的规程均包含预封闭步骤。在较高的SDS浓度(0.2%)，蛋白A和BioVyonTM-蛋白A的信号/背景比增加，而蛋白A的信号/背景比显著降低(图7，小图A)。
我们还研究了洗涤强度对ChIP测定的质量的影响。在这些实验中，在DNA/蛋白质复合物的结合之后，用不同化学的缓冲液将柱洗涤3次或6次。如图7所示，三次洗涤是最优的，6次洗涤显著降低了特异性信号。
先前经验性地观察到，用LiCl替代缓冲液中的NaCl可以减少核酸对蛋白ASepharose珠子的非特异性结合，这就是许多ChIP规程包含LiCl的原因。然而，在使用BioVyonTM-蛋白A柱的ChIP测定中，该步骤没有减少非特异性背景结合；而且，其导致特异性信号的显著降低(图7，小图B)。
通过使用不同缓冲液组成进行的一系列测试获得了BioVyonTM-蛋白A的优化规程，其与Upstate的规程有如下不同(i)其不包括预封闭步骤，且(ii)最优的洗涤条件为用LS、MS、HS缓冲液洗涤3次(在用HS洗涤的步骤中使用0.1%SDS)，且过程中省去了LiCl缓冲液，代之以NaCl缓冲液。
我们提出这样的假设，即封闭、LiCl和SDS对BioVyonTM-蛋白A、蛋白A和蛋白A的不同影响可以用这些基质的化学性质的差异来解释，其中相比于BioVyonTM-蛋白A，蛋白A和蛋白A容易发生更多非特异性DNA结合。
然后在ChIP测定中平行地使用BioVyonTM-蛋白A、蛋白A和蛋白A，其中ChIP测定使用与上述(图1)相同的特异性抗体和DNA座位，也引入了针对非特异性DNA结合的对照。在这些实验中，用特异性抗体对ChIPDNA的富集在BioVyonTM-蛋白A、对照、以及另外两种基质之间是统计学显著的(P<0.05)(图2A)。这些测定中BioVyonTM-蛋白A的DNA拉下(%输入)显著高于另外两种基质。
我们将这些测试进行了扩展，纳入了另一种抗体和数个DNA座位。从这个角度看，一种转录因子，CTCF[15;16;17]，是理想的候选者，因为其在基因组中有多个结合位点[11;18]，它们中多个是得到表征的[15]，而且我们的实验室专门进行CTCF的研究。CTCF结合(靶)位点(CTSs)是测试ChIP测定法的良好实验模型，因为它们对CTCF的亲和力不同。我们选择了下述六种人CTSs：N-位点Myc[10;19],PIM[15],DM1[20],β-珠蛋白[21],PLK[15]和H19[22;23]。对于全部六个位点，BioVyonTM-蛋白A的DNA拉下(%输入)均高于其他基质。各CTS之间的BioVyonTM-蛋白A的ChIPDNA富集确有不同，这最有可能反映了不同CTS对CTCF的亲和力(图2B)。BioVyonTM-蛋白A与所有对照之间使用特异性抗体的ChIPDNA富集都是统计学显著的(P<0.05)。
需要指出的是，不同DNA座位的非特异性对照的值有相当大的差异。在某些情况下，无抗体时获得的非特异性产物比使用IgG和无关抗体时获得的多。不过这样的情形并不少见，先前在文献中已有报道(例如见参考文献[24;25])。可能的是，DNA结合位点的特定特征的组合(例如碱基组成、复制子的长度等等)，与基质的特定性质一起对这些差异起贡献。根据这些实验得出的现实的建议是，ChIP测定中对“无抗体”对照应当谨慎对待。
然后使用图2中呈现的绝对数据来评估三种基质的信号/背景比，方法是计算来自7个DNA座位的特异信号相对于无抗体对照和其他两种分别使用IgG或无关抗体的非特异性抗体对照的富集倍数；结果总结于表2中。
表2三种基质在ChIP实验(详见图2)中来自7个DNA座位的特异信号相对于无抗体对照和两种非特异性对照IgG与无关抗体的富集倍数
富集倍数值通过用特异信号的值除以三种对照之一来计算，该数据以表格形式呈现(低于4的值用粗斜体显示)。
表2：所有三种基质相对于每种对照的富集比
具体地说，如果我们认为富集倍数值为4是一个ChIP测定有效所必需的合理的值，则BioVyon在21个被评估的测定中的20个中是有效的，Dynabeads在21个被评估的测定中的16个中是有效的，而Sepharose仅在21个被评估的测定中的13个中是有效的(为了清楚，表2中低于4的富集值以粗斜体显示)。换言之，在全部21个测定的范围内进行比较时，几乎任一个DNA富集水平(大于1的值)都显示BioVyonTM-蛋白A比所述两种基于珠子的基质更有效。考虑到ChIP测定复杂的性质，对于特定的ChIP实验，需要多少富集倍数因子方能提供有用的信息是难以确定的。然而这些结果显示，在这项考察中，较之用于比较的其他两种基质，BioVyon一贯地提供了更高的富集。
这项比较性考察还显示，与两种基于松散的珠子的模式相比，使用刚性的BioVyon蛋白A柱的实验程序容易实施得多。BioVyon装置预装有固定量的蛋白A，其结合在柱内的刚性多孔筛板上。这立即消除了将基于珠子的基质加入到IP过程使用的容器中时带来分装误差的可能。此外，BioVyon柱相关的处理步骤在所有情况下都更简单，在任何温育时段内试剂和缓冲溶液都被保持在柱中，然后再让它们从柱中排出。结合于蛋白A的染色质同样与BioVyon柱中的刚性多孔筛板结合，在IP中常规使用的任何过程中都不会从柱中流失，而珠子则必须在所有的洗涤和试剂混合步骤(对Sepharose而言是离心，对Dynabeads而言是磁性分离)中仔细分离和保持。这使得基于珠子的IP过程非常耗时，而且在多步骤的过程中每个步骤都有可能损失珠子(从而也损失靶物)。
仅举一例，一个使用Sepharose珠子的IP过程，其包括多个离心、抽吸和重悬步骤，可耗时3个小时以上。一个使用Dynabeads的IP过程，其涉及数个磁性分离步骤(抽吸和重悬)，可耗时超过30分钟。相比之下，使用BioVyon的IP过程耗时10-15分钟，需要的洗涤步骤更少(每种缓冲液3次，而非对于珠子那样每种缓冲液6次)，而且不需要分离或重悬，因此它没有同样的在整个过程中损失靶物的风险。
此外，上述实验提示预封闭步骤对于而言BioVyon规程也是不必要的，这进一步简化了过程，又减少了对于基于珠子的基质而言必需的操作珠子的相关步骤，并降低了靶物损失的可能。还需要注意的是，经“ChIP”的DNA片段对核酸酶活性非常敏感，因此总加工时间的任何缩短都会减少核酸酶降解DNA的可能性。
总之，BioVyon基质提供更高的DNA拉下，更好的富集性能，以及操作上的便利性，减少了过程步骤，从而降低了可能导致靶物损失的操作误差的可能性。BioVyon的这些性质对于开发微型ChIP应用以及ChIP测定的自动化都是非常有价值的[26;27;28;29]。因此我们得出结论，对于ChIP和其他基于IP的测定的应用，可以认为BioVyonTM-蛋白A是基于珠子的基质的一个特别有吸引力的替代，其使用更容易，更迅速，误差可能更低。
实施例2
在此实施例中，使用单独一种针对RNA聚合酶II生成的抗体，以及单独一个座位，人GAPDH，作为Q-PCR分析的靶基因，来实施ChIP测定。最初进行的比较聚焦于对一个推荐的优化ChIP规程的调整，其中在免疫沉淀步骤将磁珠替换为BioVyon重力流动柱。结果显示BioVyon-蛋白A重力流动柱比它们现今使用的磁珠对应物显著地更适合作为IP的支持物。在进一步的实验中，将重力流动柱替换为离心柱来进一步改善该测定。
材料和方法
细胞培养和固定
获得次级人乳腺癌细胞系MCF-7，以7.5x106的密度播种到14cm圆形塑料培养皿(Invitrogen)上。在10%经吸附处理过的(stripped)血清DMEM(Gibco)中生长后，细胞在24小时后达到了80-100%汇合(15x106个细胞)，将细胞在室温下浸没在20ml的1%甲醛中10分钟。抽提出染色质，通过超声处理制备，用于免疫沉淀。
使用BioVyon-蛋白A重力流动柱与使用带蛋白G磁珠的离心柱的ChIP的比较
将经过断裂的染色质样品调整到10μg/μl，然后利用RNApolII特异性家兔多克隆抗体(0.8μg/μl)或作为阴性对照的普通未缀合的家兔IgG对其进行免疫沉淀。对回收的DNA通过Q-PCR一式三份地进行分析。使用蛋白G磁珠的方法按照推荐的规程来实施，并将其与使用优化的缓冲液组成(参见例如上文的实施例1)的使用BioVyon-蛋白A重力流动柱的方法进行比较。染色质免疫沉淀浆液在端到端回转器(endtoendrotor)上4℃温育3小时后，在BioVyon柱上温育1小时。
BioVyon离心柱
将BioVyon-蛋白A基质装填到小的塑料离心管(Sigma)中，见图6C，并套装在2ml收集管中，以便利用离心力，而非重力流动，来抽吸缓冲液和免疫沉淀溶液通过柱。将疏水性筛板(包含经烧结的聚乙烯颗粒)置于柱中BioVyon-蛋白A筛板的下方，以便去除在施加离心力前后发生的任何穿透(flowthrough)。
在重力流动法和离心柱法二者中均将经断裂的染色质样品调节到10μg/μl，然后利用RNApolII特异性家兔多克隆抗体(0.8μg/μl)或作为阴性对照的普通未缀合的家兔IgG对其进行免疫沉淀。对回收的DNA通过Q-PCR一式三份地进行分析。在离心柱上进行BioVyon-蛋白A优化规程中的免疫沉淀和洗涤步骤，使用的离心力为10000rpm，历时30秒；然后将免疫沉淀浆液再次在回转器上温育3小时，然后施加到经稀释的柱上，再经过1小时。
疏水性筛板的作用
在另外一个实验中，测试了两种离心柱变化形式，一种形式中将疏水性筛板置于蛋白A柱的下方以除去任何发生的穿透，另一种形式中没有筛板。离心柱所用的筛板的尺寸为7.2mm直径。
将经过断裂的染色质样品调节到10μg/μl，然后利用RNApolII特异性家兔多克隆抗体(0.8μg/μl)或作为阴性对照的普通未缀合的家兔IgG对其进行免疫沉淀。对回收的DNA通过Q-PCR一式三份地进行分析。将免疫沉淀浆液再次在回转器上温育3小时，然后施加到经过洗涤的柱上，再经过1小时。BioVyon-蛋白A离心柱的免疫沉淀和洗涤步骤使用的离心力为1000rpm，历时30秒。
结果
使用BioVyon-蛋白A重力流动柱和蛋白G磁珠的ChIP的比较
该优化的BioVyon-蛋白A法，与使用蛋白G磁珠的最优ChIP规程相比较，就实现的信号拉下(signalpull-down)而言更胜一筹。在最优的条件下，使用完全相同的MCF7乳腺癌细胞样品，靶向与GAPDH靶基因结合的RNA聚合酶II蛋白时，BioVyon-蛋白A规程导致%DNA拉下增加了大约25倍(见图8)。这体现出ChIP信号的显著增加，以及对一种市场上领先的ChIP研究规程的显著改进。
BioVyon离心柱法
将重力流动柱适用到离心柱，可能便于ChIP规程中更容易地操作柱，并能够增加信号拉下。更安全的离心洗涤(就能够捕获任何使用重力流动时柱子可能损失掉的穿透而言)被认为是提高该方法效率的一个主要因素。
图9显示，使用包含疏水性筛板的离心柱，成功实现了从重力流动测定到离心柱测定的转换。当固定化在疏水性筛板旁边并作为离心柱使用时，BioVyon蛋白A方法相比于使用完全相同的DNA模板样品和抗体浓度的重力流动对应方法相比，导致%DNA拉下增加2.3倍。
疏水性筛板的作用
在另一个实验中比较了两种离心柱的变化形式，其中一种形式中将疏水性筛板置于柱中BioVyon-筛板的下方以除去发生的任何穿透，另一种则没有疏水性筛板。
图10显示了疏水性筛板作用对BioVyon离心柱的性能的影响。当使用疏水性筛板时，在抗体存在下的%DNA拉下比IgG(对照)样品大得多，因此改善了富集比。
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兹通过提述并入上文说明书中提到的所有出版物。本领域技术人员能够在不背离本发明的范围和精神的同时想到上述的本发明的方法和系统的各种修改和变化形式。虽然已经结合具体的优选实施方案对本发明进行了说明，但应当理解，要求保护的发明不应被过分地限制到这些具体实施方案。事实上，下述权利要求的范围意图涵盖生物化学及生物技术或相关领域中的普通技术人员容易想到的对所描述的本发明实施模式的各种修改。

Claims (25)

1.一种用于实施染色质免疫沉淀测定的方法，包括：
a)从样品分离染色质，其通过使包含染色质的液体样品通过刚性多孔基质进行，所述刚性多孔基质上固定有配体，其中所述配体结合与所述染色质缔合的蛋白质，且其中所述刚性多孔基质包含经烧结的热塑性聚合物颗粒，且其中所述刚性多孔基质呈滤碟或筛板的形式，
b)从所述染色质回收DNA；并
c)分析所述DNA。
2.权利要求1的方法，其中所述刚性多孔基质包含在分离柱中。
3.权利要求2的方法，其中所述刚性多孔基质包含在离心柱中。
4.权利要求2或权利要求3的方法，其中所述柱还包含疏水性基质。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中在离心机中，通过重力，或者通过真空来牵引液体样品通过所述刚性多孔基质。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述液体样品包含结合有免疫球蛋白的染色质。
7.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述配体包括抗体、蛋白A或蛋白G。
8.权利要求1-3中任一项的方法，还包括选自下面的一个或多个步骤：(i)使洗涤溶液通过所述刚性多孔基质，(ii)将结合于基质的染色质中存在的核酸与缔合的蛋白质分开，和(iii)检测结合于基质的染色质中存在的核酸。
9.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述刚性多孔基质包含通过化学氧化产生的改性表面。
10.权利要求9的方法，其中所述改性表面是通过用一种或多种氧化性酸处理而产生的。
11.权利要求1至3中任一项的方法，其中提供包含多个刚性多孔基质的阵列，并且让多个液体样品中的每一个通过该阵列中的刚性多孔基质。
12.权利要求11的方法，其中所述阵列包括多孔板，该板中的每个孔包含如权利要求2定义的分离柱。
13.分离柱用于实施染色质免疫沉淀测定的用途，其中所述分离柱包含用于容纳包含染色质的液体样品的室，和上面固定有配体的刚性多孔基质，其中所述配体能够结合与所述染色质缔合的蛋白质，且其中所述刚性多孔基质位于所述室中，从而能够让该液体样品通过该刚性多孔基质，且其中所述刚性多孔基质包含经烧结的热塑性聚合物颗粒，且其中所述刚性多孔基质呈滤碟或筛板的形式。
14.权利要求13的分离柱的用途，其中所述刚性多孔基质位于所述柱的流出端口上方，从而能够让容纳于所述室中的所述液体样品通过所述刚性多孔基质并流出所述柱，由此借助染色质与该刚性多孔基质的结合从液体样品中将染色质分离出来。
15.权利要求13或14的分离柱的用途，其中所述分离柱还包含用于接收已经通过所述刚性多孔基质并从柱中流出的液体的收集容器。
16.权利要求13或14的分离柱的用途，其中所述分离柱还包含疏水性基质。
17.权利要求16的分离柱的用途，其中所述疏水性基质位于所述刚性多孔基质和所述柱的流出端口之间。
18.权利要求13或14的分离柱的用途，其中所述分离柱是离心柱。
19.权利要求13或14的分离柱的用途，其中所述配体包括免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G。
20.权利要求13或14的分离柱的用途，其中所述刚性多孔基质包含通过化学氧化产生的改性表面。
21.权利要求20的分离柱的用途，其中所述改性表面是通过用一种或多种氧化性酸处理而产生的。
22.试剂盒用于从液体样品分离染色质的用途，所述试剂盒包括如权利要求13-19中任一项所定义的分离柱，以及适合于实施染色质免疫沉淀测定的一种或多种缓冲液、溶液或试剂。
23.阵列用于从液体样品分离染色质的用途，其中所述阵列包含多个权利要求13至22中任一项定义的分离柱。
24.权利要求23的用途，其中所述阵列是多孔板的形式。
25.权利要求23或24的用途，其中所述阵列是过滤微孔板的形式。
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