CN103330723A

CN103330723A - 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途

Info

Publication number: CN103330723A
Application number: CN201310011855XA
Authority: CN
Inventors: 张卫东; 蒋礼先; 蔡立刚
Original assignee: Ai Kexing (wuhan) Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Ai Kexing (wuhan) Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2013-10-02

Abstract

一种基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1RSV)在治疗癌症药物中的用途，能够应用于治疗肺癌、乳腺癌的药物中，还能够应用于治疗肝癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、喉癌和其他癌症的药物中。其优点是:用于治疗癌症药物中，只杀伤癌症细胞，而不损害人体的正常细胞。

Description

基因工程呼吸道合胞病毒(△NS1 RSV)在治疗癌症药物中的用途

技术领域

本发明涉及呼吸道合胞病毒（RSV）,具体地说是一种基因NS1 缺陷型呼吸道合胞病毒（△NS1 RSV）在治疗癌症药物中的用途。

背景技术

世界卫生组织(WHO)公布数据显示，2020年全球癌症发病率将比现在增加50%，全球新增癌症患者人数将达到1500万人/每年。抗癌药物的需求将进一步增，研制疗效好、安全性高的抗癌新药将成为新药研究的热点领域和主要方向。

目前，癌症的患病率逐年上升，而且目前缺乏有效的治疗手段。恶性肿瘤的主要治疗方法依然是传统的化疗、放疗和手术切除。但化疗存在着无法回避的耐药性和明显的药物毒副作用问题，临床治疗效果很不理想。而放疗同样存在严重的毒副作用，而且某些人体器官对放疗特别敏感，不适应选择放疗法治疗。肿瘤患者中只有不到30%的适用于手术治疗，且术后多有复发及转移，导致患者死亡率居高不下。因此亟需开发一种新的药物或新的疗法。溶瘤病毒药以其独特的杀瘤功效日益受到行业人士关注。

溶瘤病毒(oncolytic virus)，是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，世界上最早出现溶瘤病毒的报道是缘于当时发现一名子宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后肿瘤随之消退。

1991年，Martuza等人发现转基因HSV在恶性胶质瘤治疗中有一定疗效，从而采用病毒进行溶瘤治疗就日益受到关注。溶瘤病毒治疗肿瘤的原理是通过对自然界存在的某些病毒进行基因改造制成特殊的病毒，该病毒能选择性地感染癌细胞并最终摧毁肿瘤细胞。

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）、单纯疱疹病毒-1（herpes simplex virus-1，HSV-1）、呼肠孤病毒（reovirus）、腺病毒（adenovirus）等因具有天然的嗜肿瘤特性而被用来改造成溶瘤病毒，它们能感染癌细胞而最终摧毁之。由于这些溶瘤病毒不伤及机体正常细胞，理论上很少出现由毒副作用。但是这些溶瘤病毒的野生型毒株具有较强的致病原性，虽然这些病毒经过基因改造降低了其致病性，但进入人体后这些基因改造后的溶瘤病毒在某种条件下不排除恢复成野生型毒株的可能性，因而这些病毒的临床应用不可避免存在安全隐患。再者，这些病毒的抗原型较强，病毒进入机体后能刺激机体产生较强的中和抗体，该抗体可以中和后续进入体内的同种病毒从而降低溶瘤效果。另外，这些溶瘤病毒的野生型具有较强的致病性，相关易感人群大都接种过相关疫苗。人群中因此产生的中和性抗体可能终生携带，从而势必影响该人群患者中采用这些溶瘤病毒治疗癌症的实际效果。因此寻找新的致病性低、抗原性弱的溶瘤病毒迫在眉睫。

呼吸道合胞病毒(RSV)是一种RNA病毒，属副粘液病毒科。野生型RSV核苷酸序列为单负链RNA，其基因序列依次为3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’。其N、L和P基因编码核心蛋白, M基因编码基质蛋白,G基因编码糖蛋白, 基因F编码融合蛋白, SH 基因编码SH蛋白，M2基因拥有两个重叠基因M2-1和M2-2，分别编码相应蛋白，这些蛋白统称为结构蛋白。此外, RSV还含有NS1、NS2两基因分别编码病毒非结构蛋白NS1 和NS2。人、牛和其他动物的RSV基因具有相似的核苷酸序列。人野生型RSV病毒主要感染新生儿和6 个月以内的婴儿，成人和年长儿童也可感染该病毒，但感染率不高。患者主要表现为上呼吸道感染，但多半只需对症处理或无需特殊治疗即可恢复。同时机体对RSV感染的免疫力不完善，病人可以在短期内重复感染，预示机体难于产生有效中和抗体，这使得RSV有可能成为理想的溶瘤病毒候选者。

目前美国各大医药公司都十分看好溶瘤病毒药未来市场。虽然美国Biovex公司的溶瘤病毒产品尚处在临床抗癌试验的初级阶段，美国Amgen公司于2011年则以10亿美元收购了Biovex公司（其中4.25亿为现金）。凸现该抗癌新药在未来抗癌领域的重要地位。研制具有我国自主知识产权的新一代溶瘤病毒抗癌生物药非常必要。

发明內容

本发明的目的是应用生物科技手段将呼吸道合胞病毒基因改造后使其丧失致病能力的同时具有抗癌功效：只选择性杀死癌细胞, 不杀伤人体正常细胞。

本发明的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV)在治疗癌症中的用途，该病毒不但可以应用于治疗肺癌、乳腺癌，还能用于治疗肝癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、喉癌和其他癌症。

所述的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV)是指NS1基因功能缺失RSV。

所述的该呼吸道合胞病毒(ΔNS1 RSV)病毒可以来源于人RSV A、B亚型及其它病毒株以及牛及其他动物的RSV。

所述的NS1基因功能缺失的RSV, 为去除NS1部分或全部基因、或在NS1基因中引入其他核苷酸序列使之功能丧失、或NS1基因前后端引入其他核苷酸序列以抑制NS1基因的转录或翻译、或在基因水平上使用反义技术使得病毒NS1基因失活。

所述的基因工程改造, 能用反向遗传技术删除呼吸道合胞病毒中的NS1基因而得到NS1缺陷型RSV；或通过基因插入、基因突变、基因封闭或酶切等技术,使 NS1基因丧失功能。

本发明基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV)在治疗癌症中的用途优点包括: 1）抗癌谱广: 能有效杀伤肺癌、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、喉癌和其他癌症细胞；2）毒副作用低：病毒不损害人体正常细胞；3）鲜为产生中和抗体，使得病毒可以重复使用；4）能杀伤耐药癌细胞(包括多重耐药)；5）具有独特的抗癌机制：a)病毒直接杀伤作用；b)通过胞内线粒体机制导致癌细胞凋亡；c)线粒体膜上PT-PORE机构发生改变，通道持续开发，导致线粒体内钙离子外流，进而造成线粒体肿胀破裂；d)线粒体跨膜电位降低；e)Caspase 9-依赖性/非依赖性双重机制；f)该溶瘤病毒能够杀伤P53抗癌基因阴性和阳性癌细胞。

附图说明

图1示用反义寡核苷酸封闭NS1基因后的人RSV致Hep-2癌细胞产生凋亡。

图2示人△NS1 RSV对前列腺癌细胞LN CAP 的CPE。

图3示实验示人△NS1 RSV抗前列腺癌LN CAP的动物实验。

图4示人△NS1 RSV致肝癌 HepG2产生CPE。

图5示人△NS1 RSV拮抗肝癌的动物实验。

图6为 △NS1 RSV对肿瘤细胞的杀伤作用表。

具体实施方式:

本发明中所用缩写的特定含义为：

RSV: 呼吸道合胞病毒

ATCC: American Type Culture Collection

ΔNS1 RSV: NS1基因缺陷型呼吸道合胞病毒

Hep-2:喉癌细胞株

LN CAP: 前列腺癌细胞株

HepG2：肝癌细胞株

CPE: 细胞病变效应

本发明有如下显著特征：

本发明利用反向遗传技术删除人RSV NS1基因序列包括为病毒RNA上122到630碱基序列：被去除NS1基因的呼吸道合胞病毒称为NS1基因缺陷型呼吸道合胞病毒（△NS1 RSV），△NS1 RSV通过用分别携带有去除NS1基因的全病毒cDNA、病毒N基因、M2-1基因、P基因和L基因等的多个质粒共转染Hep-2细胞获得。

△NS1 RSV也可以通过其他办法制备：例如在野生型病毒株RSV A2株的NS1基因序列中插入一段无意义核苷酸序列使其不能编码出NS1蛋白；或用限制性核酸内切酶切割失活NS1基因，使NS1功能丧失；或使用反义核酸封闭NS1基因，从而生成NS1功能缺陷型的病毒。

△NS1 RSV经过Hep-2细胞扩增后，经高速离心或经分离层析柱进行纯化制成病毒浓缩液，保存在-80℃低温或液氮中。也可以通过冷冻干燥技术制备成病毒冻干粉制剂。

△NS1 RSV具有一显著特征：选择性杀伤癌细胞，而对正常细胞没有影响。体外实验条件下，△NS1 RSV用DMEM细胞培养液稀释成MOI=10分别感染人肝癌细胞、黑色素瘤细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、直肠癌细胞、胰腺癌细胞、喉癌细胞以及其相应正常细胞，37℃培养细胞两天后显微镜下观察细胞病变，结果显示△NS1 RSV对以上所述的癌细胞具有明显的杀伤作用，镜下显示细胞变圆、脱落、坏死等病变，而正常细胞形态未见明显改变。

为验证△NS1 RSV在体内的杀瘤效果，任意选取肝癌细胞、皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、直肠癌细胞、胰腺癌或喉癌，并接种到裸鼠后肢左右两侧。待癌细胞瘤长大到直径4cm,分别瘤内注射或静脉注射△NS1 RSV和野生型RSV。即一侧裸鼠后肢注射△NS1 RSV，另一侧注射野生型RSV作为对照。该△NS1 RSV可以为浓缩的病毒液体或冷冻干燥制成的干粉。其注射滴度为1X10¹-1X10¹⁰⁰。肿瘤局部注射后，连续观察并测量肿瘤的大小发现，一周后，实验侧肿瘤体积为对照侧的30%，表现出△NS1 RSV有明显的抑肿瘤效果，将实验鼠安乐死并剥离肿瘤，称量瘤体重量。

本发明具有另外一显著特征：RSV不局限于特定的RSV病毒株。任何病毒，只要其含有类似NS1的基因，该蛋白能拮抗宿主I-型IFN 的生成，就有可能通过删除或缺失该基因使之该成为溶瘤病毒。

其候选病毒包括但不局限于特定的RSV病毒株，可以是人RSV A、B亚型的所有病毒株以及其它基因型的多个病毒株，及牛和其他动物的RSV。

细胞株和病毒: LN CAP、HepG2、Hep-2 细胞和呼吸道合胞病毒(RSV)A2株来源于ATCC(American Type Culture Collection)。

反义寡核苷酸质粒构建:

siRNA的序列为:

siNS1: 5’-GGCAGCAATTCATTGAGTATGCTTCTGGAAATAAGCATACTCAATGAATTGCTGCCTTTTTG-3’;

siNS1a: 5’-GTGTGCCCTGATAACAATATTCAAGAGATATTGTTATCAGGGCACACTTTTTTG-3’;

siE7: 5’-GAAAACGATGAAATAGATGTTCAAGAGACATCTATTTCATCGTTTTCTTTTTT-3’;

siPB2: 5’-GGCTATATTCAATATGGAAAGAACTCGAGTTTTGTTCTTTCCATATTGAATATAGCCTTTTTG-3’;

siUR: 5’-GGTCACGATCAGAATACTTCGCTCGAGCGAAGTATTCTGATCGTGACCCTTTTTTG-3’。

SiRNA寡核甘酸序列插入到质粒psMWZ-1相应的位点, 生成呼吸道合胞病毒株 (RSV) NS1基因的siRNA；病毒HPV18基因E7的siRNA, 以及A型流感病毒基因PB2和pUR的siRNA作为对照。其反义寡核苷酸载体克隆方法见文献1。

NS1缺陷型呼吸道合胞病毒 (RSV) 的构建:

病毒核酸的提取及其cDNA链制备：将6孔细胞培养板中感染了HRSV A2的Hep-2细胞刮下并离心收集上清液，采用QIAamp Viral RNA Mini kit （QIAGEN）提取HRSV病毒 RNA。取病毒 RNA 1μg并加入随机引物(random hexamers， Invitrogen)125μg，补水至20μl。将反应系统置于PCR仪上，设置70℃10分钟，然后转置25℃，最后维持在4℃。按产品说明书分次在上述反应系统中加入5 x First Strand Buffer，DDT，dNTP (10 mM each) (Invitrogen)，SuperRase inhibitor(Ambion)，SuperScript II(Invitrogen)以及无RNA水至总体积40μl，最后在PCR仪循环。PCR程序设置25℃ 10分钟 ,37℃45分钟, 42℃45分钟, 70℃15分钟, 30-45个循环后，产物4℃存放待用。

病毒基因表达载体的构建：真核表达载体 pVAX1 (Invitrogen)分别用于表达病毒N基因，M2基因，P基因以及L基因。RT-PCR用于病毒相关基因的制备，模板见上述病毒cDNA。其相应病毒基因的扩增引物见下分别是：病毒N基因引物为：forward: 5’- TAGGATCCATGGGGCAAATA-3’, reverse: 5’- AATGTCCGAATTCTTATTAACTCAA -3’;具有校正功能的Pfu酶 (QIAGEN)外加Taq酶用于PCR扩增, 反应缓冲液采用Roche Expand buffer系统。扩增后片段经BamHI 和 EcoRI 双酶切，纯化回收该片段插入pVAX1载体供克隆用的相应酶切位点，连接子行转化并挑取重组子进行基因序列分析鉴定。M2基因引物为：forward: 5’-GGGCAAGCTTATGAAAACTGG-3’ (含酶Hind III序列），reverse: 5’-CGCGCTCGAGTTAAATAACTATC-3’ (含酶Xho I序列）。P基因引物为：forward: 5’-GGAAGCTTATGGGGCAAATA-3’(含Hind III 酶切位点），reverse: 5’-CGTTTGGGCCCCTATATTATA-3’ (含Apa I 酶切位点）。L基因引物为：forward: 5’-AACTGCAGAGTTGTGGGACA-3’ (含Pst I 酶切位点），reverse: 5’-GCGATGGGCCCTTAATAACTA-3’ (含Apa I 酶切位点）。应用上述引物扩增所得的相关病毒基因产物分别插入pVAX1载体供克隆用的相应酶切部位，同样经过重组子测序鉴定；

病毒基因缺陷型载体的构建：为了构建拥有病毒前导序列以及NS1，NS2 和 N 基因的克隆子，我们采用 RT-PCR方法（见上述方法）。引物序列为：forward: 5’-AGCTGCAGACGCGAAAAA-3’，reverse:5’-CCCCGGATCCTTATTAACTCAA-3’ 。其产物经用限制性核酸内切酶Pst I 和 Bam HI 双酶切后回收再插入PUC18 克隆载体中相对应的位点产生克隆子pUCR4，再经基因测序核实。为了去除病毒NS1基因，我们同样采用 PCR 方法将病毒NS2基因直接连接到NS1 基因起始密码子上游第45个碱基处。以克隆子pUCR4为模板，引物采用：forward: 5’- pAAAATGGGGCAAATAAATCA-3’，reverse: 5’- pAGTGGTACTTATCAAATTCTTATTTGC-3’ 。扩增产物自身连接环化后转化基因工程菌DH5α，挑取克隆子做基因序列分析验证得到缺失了NS1基因及其上游部分序列的缺陷型质粒pUCRΔ3。同样为了得到拥有病毒基因P，M，SH，G 以及F的克隆子，引物选用：forward: 5’-AAGGATCCATGGGGCAAAT-3’，reverse: 5’-CGCCGGGGTACCTTATATAACTATAA-3’ 。其PCR产物经用限制性核酸内切酶Bam HI 和 Kpn I 双酶切后回收再插入PUC18 克隆载体中相对应的酶切位点产生克隆子pUCR5，再经基因测序核实。为克隆病毒M2 和 L 两基因的引物为：forward: 5’-AGGAAGGTACCATGAAAACTGG-3’，reverse: 5’-GGAGGGGTCGACTTAATAACTATAATTG-3’ 。其 PCR 产物经用限制性核酸内切酶 Kpn I和 Sal I 双酶切后回收再插入PUC19 克隆载体中相对应的酶切位点产生克隆子pUCR2，同样用基因测序方法核实。最后分次用酶切下相应片段：如用 Pst I 和 Bam HI 双酶从克隆子pUCRΔ3 切下前导序列以及病毒NS2，N 基因片段后回收再插入载体pTR12中相应酶切位点成为新重组子pTR12A；用 Bam HI 和 KpnI 双酶切除克隆子pUCR5中含有的病毒基因P，M，SH，G和F的大片段，回收再插入已经插入有病毒基因NS2 和N 的载体pTR12A 相应位点使之成为新载体pTR12AB。同样采用 Kpn I和 Sal I 双酶从pUCR2上切下病毒M2 和 L 两基因片段，回收再插入拥有T7启动子和丁型肝病毒Ribozyme序列的表达载体pTR12AB中。这个拥有除了NS1基因外全部病毒基因及其起始密码子上游44个基因序列的表达载体我们称之为pTR-L2NS1；

缺陷病毒的产生：为了产生基因缺陷HRSV病毒，我们用NS1基因以及其上游44个碱基序列缺如的表达载体pTR-L2NS1 1μg 协同1μg各相应病毒蛋白N, M2, P以及 L的表达质粒共转染Hep-2细胞，细胞培养6到8天后收集上清液感染新Hep-2细胞。持续观察感染细胞并收集上清感染新的Hep-2细胞，直至细胞产生细胞病变效应（CPE）。再采用传统的空斑形成试验来纯化得到的缺陷病毒体，最后用RT-PCR检测各个病毒基因，NS1蛋白用蛋白印迹试验进行甄别。

收获的△NS1 RSV经过分离纯化，制成病毒浓缩液，保存在-80℃或液氮中，也可以通过冷冻干燥技术制备成病毒冻干粉。用该病毒浓缩液或病毒冻干粉进行肝癌，皮肤癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，直肠癌，喉癌，胰腺癌等癌症和其他癌症的药效学实验。

实施例1：喉癌细胞中用反义寡核苷酸封闭细胞中感染的RSV NS1基因造成人喉癌细胞凋亡

取 1×10⁶个Hep-2喉癌细胞接种于6孔细胞培养板上37°C培养至70%-80%融合, 分别用4μg的反义寡核苷酸siNS1（封闭人RSV NS1 基因）、siE7（封闭人HPV E7 基因）、siPB2（封闭人流感病毒PB2基因）和siUR（随机序列对照）转染Hep-2细胞（Lipofectamine, Life technologies），24小时后试验组各自再感染人野生型RSV (MOI=2)。如图1所示NS1 基因封闭后的RSV可以选择性地致Hep-2细胞产生凋亡, 而其他对照反义寡核苷酸siE7、siPB2和siUR组Hep-2细胞除了产生自发性凋亡外无明显凋亡产生。证实不管通过什么方法去除NS1功能，失去NS1功能的RSV皆可以杀伤癌细胞。

实施例2：ΔNS1 RSV 对前列腺癌的杀伤作用

ΔNS1 RSV 体外杀伤前列腺癌细胞:本实验前列腺癌细胞株LN CAP细胞以及正常前列腺上皮细胞来源于ATCC。取 1×10⁶个LN CAP细胞在6孔板上37°C培养至70%-80%融合, 等量接种ΔNS1 RSV, 野生型RSV和病毒稀释剂 (MOI=5)。如图2所示ΔNS1 RSV选择性地杀伤LN CAP细胞, 而野生型RSV和病毒稀释液则对该细胞没有杀伤作用。在另外一株前列腺癌细胞PC3中重复该实验, ΔNS1 RSV具有杀瘤作用, 而野生型RSV和病毒稀释液位则没有杀瘤作用。

ΔNS1 RSV诱导LN CAP细胞凋亡的实验: LN CAP细胞分别感染野生型RSV和ΔNS1 RSV (MOI=5) 。受染细胞用Annexin V 结合实验来检测。结果显示：ΔNS1 RSV诱导LN CAP细胞凋亡。

ΔNS1 RSV对人前列腺癌细胞株LN CAP荷瘤鼠的肿瘤抑制作用:

建立人前列腺癌细胞株LN CAP的BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型，筛选成瘤性好的动物随机分为3组(野生型RSV,ΔNS1 RSV,对照组)，用生理盐水作为对照, ΔNS1 RSV病毒液作为供试品，每组5只。具体分组及给药剂量如下：

给药途径:尾静脉注射

给药频率及期限:供试品每天一次，均连续给药4周。

结果评价:

一般临床观察

试验过程中每天上、下午各进行1次一般临床观察。

体重和瘤体积的测定

在试验过程中，应从分组、给药开始（包括末次给药及安乐死当天）每周2次，称重并用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，并比较各组间肿瘤生长曲线的差异。

按照以下公式计算肿瘤体积：

V=1/2×长径×短径2

其实验结果见图3。

实施例3：ΔNS1 RSV病毒对肝癌HepG2的杀伤作用

肝癌细胞HepG2以及正常肝细胞均来自ATCC。取1×10⁶个上述细胞培养在6孔板上在37°C培养至70%-80%细胞融合，分别感染野生型RSV、ΔNS1 RSV (MOI=5) 以及病毒稀释剂。显微镜下观察细胞病变。结果显示：ΔNS1 RSV病毒对肝癌细胞有明显的杀伤作用, 而对正常肝细胞没有毒副作用。野生型RSV以及病毒稀释剂, 对肝癌细胞和正常肝细胞均没有毒副作用（图4）。

ΔNS1 RSV对人肝癌细胞HepG2荷瘤鼠的肿瘤抑制作用:

建立人肝癌细胞HepG2的BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型，筛选成瘤性好的动物随机分为3组(对照组、ΔNS1 RSV、野生型RSV)，每组5只。用生理盐水作为阴性对照, ΔNS1 RSV病毒液经冷冻干燥后获得冻干粉,用该冻干粉作为供试品。具体分组及给药剂量如下：

给药途径: 尾静脉注射

给药频率及期限:供试品每天一次.

结果评价:

一般临床观察

试验过程中每天上、下午各进行1次一般临床观察。

体重和瘤体积的测定

在试验过程中，应从分组、给药开始（包括末次给药及安乐死当天）每周2次，称重并用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积，按照以下公式计算肿瘤体积：V=1/2×长径×短径²

根据肿瘤体积进行疗效评价

试验过程中，当肿瘤负荷超过体重的10%，平均肿瘤直径超过20mm，或肿瘤发生溃疡、坏死或感染，对动物实施安乐死。

如图5所示: ΔNS1 RSV冻干粉对人肝癌细胞HepG2荷瘤鼠的肿瘤生长抑制作用的起效剂量为1×10⁸PFU/只, ΔNS1 RSV冻干粉具有明显的肿瘤生长抑制作用，而野生型RSV无抑瘤作用。

实施例4：ΔNS1RSV病毒对直肠癌细胞的杀伤作用

直肠癌HCT116 细胞、直肠癌SW-620 细胞以及正常直肠细胞均来自ATCC。按ATCC培养条件, 取1×10⁶个上述细胞培养在6孔板上在37°C培养至70%-80%细胞融合，分别感染野生型RSV、ΔNS1 RSV(MOI=5)以及病毒稀释剂。显微镜下观察细胞病变。实验结果显示, ΔNS1 RSV对直肠癌细胞有明显的杀伤作用, 而对正常直肠细胞没有毒副作用。野生型RSV以及病毒稀释剂, 对直肠癌细胞和正常直肠细胞均没有毒副作用。

实施例5：ΔNS1 RSV 特异性的杀伤皮肤癌细胞

取1×10⁶个皮肤癌细胞株888、皮肤癌WM-115细胞分别培养在6孔板上在37°C培养至70%-80%细胞融合。细胞分别感染野生型RSV、ΔNS1RSV (MOI=5) 以及病毒稀释剂。ΔNS1 RSV 特异性地诱导皮肤癌细胞888和皮肤癌WM-115细胞的坏死，野生型病毒和对照病毒稀释剂对888皮肤癌细胞和皮肤癌WM-115细胞没有影响。该实验在其他皮肤癌细胞, 例如:SK-MEL-3 和624 中重复, 得到了一样的实验结果。

细胞凋亡经用Annexin V结合法检测，实验结果显示, ΔNS1RSV诱导了皮肤癌细胞888的细胞凋亡, 而野生型RSV病毒和病毒稀释剂对细胞没有影响。该实验结果为免疫杂交实验证实。

实例6： ΔNS1 RSV 对卵巢癌、宫颈癌、喉癌、胰腺癌的杀伤作用

人卵巢癌C-13细胞、宫颈癌Hela 细胞、喉癌1059、胰腺癌AR42J来源于ATCC, 分别取1×10⁶个上述细胞培养在6孔板上, 在37°C培养至细胞70-80%融合时, 分别感染ΔNS1 RSV和野生型RSV(MOI=5)并检测细胞病变。结果显示：ΔNS1 RSV能有效地杀伤上述癌细胞, 而野生型RSV则没有杀瘤作用。

本发明实施例包括但不局限于上述实例。

ΔNS1 RSV溶瘤作用机理的研究

研究表明不同的抗癌药物一般拥有不同的抗癌机制，但多涉及阻断不同的细胞信号通路。研究报道p53 蛋白可参与RSV诱导的细胞凋亡。本发明人为研究p53 基因是否为?NS1 RSV诱导细胞凋亡所必需，将?NS1 RSV感染p53缺陷型的H1299肺癌细胞，结果显示?NS1 RSV同样可诱导H1299细胞发生凋亡，表明?NS1 RSV诱导癌细胞凋亡不需p53参与。

细胞发生凋亡也可以通过线粒体途径诱导。为检测?NS1 RSV感染对细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm ）值的影响，本实验检测了?NS1RSV感染A549癌细胞（MOI=5）后的线粒体跨膜电位（ΔΨm ）值。结果显示NS1蛋白可以阻止线粒体跨膜电位（ΔΨm ）值的下降。电子显微镜下进一步证实了该结果：相对于对照组，ΔNS1 RSV 感染的A549 细胞线粒体电子密度下降，线粒体出现肿胀。本发明表明ΔNS1 RSV 可以通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。

以往的研究表明，NS1对宿主细胞的IFN-beta的生成有拮抗作用。而IFN-beta 具有抑制病毒生长的作用。这也是野生型RSV能够感染正常呼吸道细胞，诱发疾病的原因。当NS1基因功能缺失后，RSV不再抑制宿主细胞IFN-beta的生成，宿主细胞可以生成较高浓度的IFN-beta,从而抑制RSV病毒的增殖，因此NS1功能缺失的RSV不能在人正常细胞增殖，不能使人正常细胞发生病理改变。

研究显示，IFN-beta不但是一个病毒抑制因子，也是一个较强的肿瘤抑制因子。细胞癌变的机制之一是因这些细胞的IFN-beta 生成出现了障碍，从而不能有效地抑制这些细胞向癌细胞的转变，因此IFN-beta是目前临床上肿瘤治疗的候选药物之一。

当NS1功能缺失的RSV感染癌细胞，由于癌细胞本身干扰素系统不完善且病毒感染后不能产生足够的IFN-beta，因而NS1功能缺失的RSV能够在癌细胞中增殖，从而造成癌细胞死亡。

我们的工作进一步证实一个假设：只要将病毒基因中的类似NS1基因功能的基因失活，就能构建出新的溶瘤病毒。

所述的基因工程改造, 能用反向遗传技术删除呼吸道合胞病毒中的基因NS1, 而得到NS1缺陷型RSV；或通过基因插入、基因突变、基因封闭或酶切等技术,使 NS1基因丧失功能。

所述的通过基因插入、基因突变、基因封闭或酶切等技术,使 NS1基因丧失功能,，上述技术为基因工程中现有技术，应用这些技术使呼吸道合胞病毒中NS1基因丧失功能,不再一一累述。

参考文献：

1.Inhibition of respiratory syncytial virus infectionwith intranasal siRNA nanoparticles targeting the viral NS1 gene.Zhang W, Yang H, Kong X, Mohapatra S, San Juan-Vergara H, Hellermann G, Behera S, Singam R,Lockey RF, Mohapatra SS.

Nat Med. 2005 Jan;11(1):56-62. Epub 2004 Dec 26. Erratum in: Nat Med. 2005 Feb;11(2):233.

Claims

1.一种基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV) 在治疗癌症药物中的用途，能够应用于治疗肺癌、乳腺癌，其特征在于：还能够应用于治疗肝癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、直肠癌、胰腺癌、喉癌和其他癌症。

2.根据权利要求1所述的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV) 在治疗癌症药物中的用途，其特征在于：所述的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV) 是指NS1基因功能缺失RSV。

3.根据权利要求1所述的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV) 在治疗癌症药物中的用途，其特征在于：该呼吸道合胞病毒 (ΔNS1 RSV) 出自于人RSV A、B亚型及其它多个基因型，以及牛及其他动物的RSV株。

4.根据权利要求2所述的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV) 在治疗癌症药物中的用途，其特征在于：所述的NS1基因功能缺失RSV, 为去除NS1部分或全部基因, 或在NS1基因中引入核苷酸序列, 使之功能丧失, 或NS1基因前后端引入核苷酸序列, 抑制NS1基因的转录或翻译，或使用反义基因使NS1失活。

5.根据权利要求2所述的基因工程呼吸道合胞病毒（ΔNS1 RSV) 在治疗癌症药物中的用途，其特征在于：所述的基因工程改造, 能用反向基因策略删除呼吸道合胞病毒中的基因NS1, 而得到NS1缺陷型RSV；或通过基因插入、基因突变、基因封闭或酶切等技术使 NS1基因丧失功能。