CN103319580A

CN103319580A - 植物耐逆性相关蛋白TaHSF1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103319580A
Application number: CN2012100727182A
Authority: CN
Inventors: 徐兆师; 马有志; 张双喜; 李连城; 陈明
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaHSF1及其编码基因与应用。所述蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质：耐旱性和耐热性。实验证明，将序列表序列2所示DNA分子的重组表达载体pBI121-TaHSF1转化拟南芥得到的T₃代转基因植株，与相同条件下的野生型和转空载体植株相比，在耐旱性实验中存活率可从21.3％提高到75％；在耐热性实验中存活率可从20％提高到90％。本发明所提供的TaHSF1蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaHSF1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的一种逆性相关的蛋白及其编码基因和应用，特别是一种植物耐逆性相关蛋白TaHSF1及其编码基因与应用，该蛋白质TaHSF1来源于小麦，具有提高植物抗旱和抗高温胁迫的能力。

背景技术

高温等逆境胁迫是影响小麦生长发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，以提高植物对逆境的适应能力。

植物在胁迫下会产生各种防御响应，其中，热激因子(Heat-shock factor，HSF)引起的热激蛋白(Heat shock protein，HSP)合成的明显增加引起了人们的关注。热激反应(Heat shock response，HSR)是植物细胞或器官在遇到外界热刺激时所产生的一种保护性反应，是正常的蛋白质合成受阻时产生HSP的一种细胞生理活动，其表达通过HSF来调控。近年来发现HSF在植物耐热基因的表达调控中起着重要作用，它位于编码HSP基因的上游，具有一定保守的DNA序列和特定的转录因子结合位点(Heat-shock element，HSE)。当植物受到外界的热刺激时，HSF可以与HSE特异性结合，激活HSP基因的表达，引起作为分子伴侣的HSP在体内迅速积累，从而帮助其他相关蛋白重新折叠、稳定、组装和细胞内的分配降解，提高植物体对高温的耐受性。

HSF又称为热休克转录因子，是在热胁迫、氧化逆境和病毒感染下结合在HSP基因的热激元件上，吸引其他转录因子结合在HSP基因上而形成转录复合体，导致HSP基因的转录和HSP的累积。HSF本质上是一种蛋白质，具有广泛的同源性，在真菌、果蝇、鸡、人类等真核生物中都存在HSF。HSF的研究首先从动物的开始，已普遍应用于人类和动物疾病研究。在生物进化过程中，因植株的能动性差，为了适应环境，进化出与动物体有所不同且复杂多样的HSF类型。根据DNA结合域研究及聚合区域的比较，植物的中HSF家族存在A、B、C三类成员。在所有已研究的植物中，都存在多种类型的HSF，其在大豆和玉米中最多，分别为55和54种，在拟南芥中有25种，在烟草中有18种，在小麦中不少于14种。

HSF是一种高度保守并普遍存在于原核生物以及真核生物细胞中热激因子，为生物应对不良环境胁迫和各种侵害免受巨大损伤的核苷酸序列。作为一种热激因子，HSF非应激情况是细胞中有丰富的种类，植物热激转录因子Hsfs家族组成的功能的多样性及物种特异性以适应快速多变和极端的环境。

HSF主要包含以下几个重要的结构域：保守的N端DNA结合域(DNA-bindingdomain，DBD)、寡聚域(Oligomerization domain，OD)、核定位信号区(Nuclearlocalization signal，NLS)、C端的七肽重复域(C-terminal heptad repeats，HR-C)和激活域(Activator domain，CTAD)。寡聚域是由两个疏水的7肽重复区域A和B(HR-A/B)组成，这两个区域之间的插入序列是高度可变的，可以作为HSF亚家族分类的一个依据。由此，热休克转录因子可分成A、B、C三类。HsfB类HR-A和HR-B之间没有A类HSF主要负责热激基因表达的调控；B类HSF虽然具有DNA结合活性但却没有热激诱导的转录激活活性，可能与A类HSF共同发挥作用。不同种类的HSF成员可同时在细胞中存在，但其免疫原性不同，表明它们在功能上可能存在差异。

植物HSF的分子量通常在31.2至57.5kD之间目前，对植物HSF的功能研究主要集中在HsfA1a、A2和B1这三类上。不同生物体内分离出来的HSF分子种类和大小各有不同，如从酵母菌、果蝇、人类体内分离出来的HSF，其分子量分别为：150、110、80×103；但其结构却极为相似，共同具有一个极为保守的核心区域DNA结合区域(DNAbinding domain)和三聚区域(Trimerization domain)。无应激状态下，HSF以无活性的单体形式存在。当细胞处于应激状态时，细胞内环境发生变化，解除了对HSF的活性抑制，促进HSF由单体向三聚体转换。HSF之间通过三聚区域结合，具体位点是三聚区域的3个七氨基酸重复序列。无应激时，这3个序列在HSF内部形成稳定的卷曲螺旋结构，以维持其单体状态；应激时在不明机制作用下，卷曲螺旋结构打开，相邻HSF的七氨基酸重复序列之间相互作用，形成分子间的卷曲螺旋，在此结构帮助下，每3个HSF单体结合在一起形成一个三聚体。

HSF在原核生物和真核生物中高度保守并普遍存在，研究发现，HSF定位于细胞核和部分液胞内。

HSF在细胞的生长进程中起着至关重要的作用，包括细胞生长、凋亡、癌变、应激反应、植物免疫、发育甚至进化。最近，在拟南芥、烟草和水稻上的研究发现，HSF在植物抗逆、对高温环境的应答以及抗病性中起着重要作用。Mishra用HsfA iRNA沉默拟南芥HSF得到的植株，耐热性明显下降。陈晓军等(2006)采用生物信息学和比较基因组学方法结合技术从大豆基因组中克隆到GmHSFA1因子基因，可明显提高大豆的耐热性。上述研究表明，植物HSF在植物适应逆境环境过程中起着重要的作用。因此，深入研究植物HSF在逆境条件下的功能，对正确认识感应热胁迫信号的传导、抗逆相关基因的调控促进抗逆相关基因的表达、以及提高作物的抗逆性有重要的指导意义和实际应用价值以及提高作物的耐高温性有重要的指导意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaHSF1及其编码基因与应用。

本发明所提供的与植物耐逆性相关蛋白，来源于小麦，名称为TaHSF1，该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与如下至少一种植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质：耐旱性和耐热性。

序列表序列1所示的氨基酸序列由236个氨基酸残基组成。

为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质的基因可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列2由711个脱氧核苷酸组成，是小麦TaHSF1蛋白的编码序列。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))、组成型启动子或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

含有所述基因的所述重组载体具体可为pGBKT7-TaHSF1、16318hGFP-TaHSF1或pBI121-TaHSF1；

所述pGBKT7-TaHSF1为将所述基因插入载体pGBKT7得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2所示的DNA分子插入载体pGBKT7的EcoR I和BamH I酶切识别位点之间得到的重组表达载体；

所述16318hGFP-TaHSF1为将所述基因插入载体hGFP得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2所示的DNA分子插入载体hGFP的Sal I和BamH I酶切识别位点之间得到的重组表达载体；

所述pBI121-TaHSF1为将所述基因插入载体pBI121得到表达所述蛋白的重组表达载体；具体可为将序列表序列2所示的DNA分子插入载体pBI121的BamH I和Sac I酶切识别位点之间得到的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所述的培育转基因植物的方法是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

在上述方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在上述方法中，所述双子叶植物具体可为拟南芥。

在上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和耐热性。

在上述方法中，所述耐热性为耐42℃的高温。

本发明保护所述蛋白在作为转录因子中的应用。

实验证明，将序列表序列2所示DNA分子的重组表达载体pBI121-TaHSF1转化拟南芥得到的T₃代转基因植株，与相同条件下的野生型和转空载体植株相比，在耐旱性实验中(即正常生长萌发15天的幼苗不浇水，直至野生型植株枯萎时，再复水一周)存活率从21.3％提高到75％；在耐热性实验中(将正常生长4周的幼苗进行42℃高温处理3h，之后经过正常培养1周)存活率从20％提高到90％。本发明所提供的TaHSF1蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性方面具有重要意义，为人为控制抗逆相关基因的表达提供了基础，将在培育高抗逆性如强耐旱性和强耐热性植物品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为TaHSF1蛋白的结构模型。其中，DBD为N端DNA结合域，HR-A/B为两个疏水的7肽重复区域A和B组成的寡聚域，NLS为核定位序列，AHA为酸性C端的激活结构域。

图2为TaHSF1蛋白的空间结构模型。

图3为实时荧光定量PCR分析不同胁迫处理下TaHSF1基因的表达图谱。其中，A-F依次分别为干旱、盐渍、冷害、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)和高温的胁迫处理，横坐标为胁迫的时间，纵坐标为TaHSF1基因的相对表达量。

图4为重组载体16318hGFP-TaHSF1的结构示意图。

图5为TaHSF1亚细胞定位结果。其中，A为hGFP空载体对照，B为TaHSF1定位于细胞核中。

图6为重组载体pBI121-TaHSF1的结构示意图。

图7为转基因拟南芥植株的PCR鉴定电泳图。其中，A为转pBI121-TaHSF1拟南芥植株PCR鉴定电泳图，泳道M为DL2000DNA Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道1为质粒pBI121-TaHSF1阳性对照，泳道2-6为转pBI121-TaHSF1拟南芥株系1的植株；泳道7-11为转pBI121-TaHSF1拟南芥株系2的植株；泳道12-15为转pBI121-TaHSF1拟南芥株系3的植株；泳道16为拟南芥Col-0阴性对照；泳道17为H₂O空白对照；B为转空载体对照植株的PCR鉴定电泳图，泳道M为DL2000DNA Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道1为质粒pBI121阳性对照，泳道2-15为转空载体拟南芥植株；泳道16为拟南芥Col-0阴性对照；泳道17为H₂O空白对照。

图8为转pBI121-TaHSF1的拟南芥植株和野生型拟南芥Col-0在干旱条件下的表型。其中，1为野生型拟南芥，2-4为转pBI121-TaHSF1的拟南芥植株。

图9为转pBI121-TaHSF1的拟南芥植株和野生型拟南芥Col-0在高温条件下的表型。其中，1为野生型拟南芥，2-4为转pBI121-TaHSF1的拟南芥植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的小白麦和载体hGFP的信息如下：

小白麦(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai)和载体hGFP：中国农业科学院作物科学研究所保证向公众提供；参考文献Zhao-Shi Xu，Lan-Qin Xia，Ming Chen，etal.Isolation and molecular characterization of the Triticum aestivum L.ethylene-responsive factor1(TaERF1)that increases multiple stress tolerance.Plant Mol.Biol.2007，65：719-732.

实施例1、TaHSF1基因的克隆

一、总RNA提取及cDNA文库构建

将小白麦播种在苗床上，20～24℃生长10d左右，从土壤中取出，用蒸馏水冲洗干净，放在滤纸上干旱处理2h，取叶片立即放入液氮中，-80℃保存备用。

采用Trizol法(天根生化科技(北京)有限公司)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA用反转录酶XL(AMV)(TaKaRa)合成。采用SMART法合成ds cDNA。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

二、TaHSF1蛋白及其编码基因的获得

以水稻热激因子AK066316为已知序列，在小麦数据库比对小麦相似序列。经过DNAMAN软件分析和设计引物5’-ATGGGAAGCGAGTGCAAG-3’和5’-TCAGTAGAACACCTGTCCCAGA-3’，以小白麦的cDNA为模板进行PCR扩增，回收750bp左右的条带，纯化后插入到pEASY-Blunt上，转化大肠杆菌TOP10(天根生化科技(北京)有限公司)进行测序，结果显示该回收片段的长度为711bp，其核苷酸序列如序列表序列2所示。将序列表序列2所示的基因命名为TaHSF1，编码蛋白TaHSF1，该蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所示，结构模型如图1和图2所示。

实施例2、TaHSF1的激活特性

一、诱饵载体的构建

1、TaHSF1基因的获得

以步骤一获得的小白麦cDNA为模板，TaHSF1-EI和TaHSF1-BI为引物(引物末端分别引入EcoR I和BamH I的识别序列)，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化750bp左右的PCR产物。测序结果表明，该PCR产物含有序列表序列2所示的711bp核苷酸序列。

TaHSF1-EI：5’-GGAATTCATGGGAAGCGAGTGCAAG-3’；

TaHSF1-BI：5’-CGGATCCTCAGTAGAACACCTGTCCCAGA-3’。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切表达载体pGBKT7(Clontech)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(Clontech公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pGBKT7-TaHSF1，该质粒为在载体pGBKT7的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表序列2所示的DNA片段。

二、TaHSF1的激活特性

将诱饵载体pGBKT7-TaHSF1、空载体pGBKT7以及阴性对照分别与pGADT7(TaKaRa)共同转入酵母菌株AH109(天根生化科技(北京)有限公司)中，分别涂到培养基SD/-Trp/-Leu(STL)和培养基SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade(STL-HA)上培养3-5天。结果显示，阴性对照(空AH109)和含有pGBKT7的AH109在培养基STL和STL-HA上都没有生长，而含有pGBKT7-TaHSF1的AH109在培养基STL和STL-HA上生长，说明pGBKT7-TaHSF1具有自激活活性。

实施例3、实时荧光定量PCR分析TaHSF1基因的表达特性

一、胁迫处理

将水培的苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理：

1、干旱处理：将小白麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

2、盐渍处理：将小白麦幼苗置于2％的由NaCl和Na₂SO₄组成的钠盐溶液中(NaCl与Na₂SO₄的质量百分比为3∶2)中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

3、冷害处理：将小白麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

4、ABA处理：将小白麦幼苗置于100μM的ABA溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

5、GA处理：将小白麦幼苗置于50μM的GA溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

6、高温处理：将小白麦幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

对照的处理：直接取未经任何处理的小白麦幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

将步骤一获得的材料分别用QuikprepMicro mRNA PurificationKit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

三、反转录为cDNA

采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(天根生化科技(北京)有限公司)将步骤二纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后作为实时荧光定量PCR的模板。根据TaHSF1基因的序列，在其可变区设计特异引物HSF1F和HSF1R。以actin为内参基因，引物为actin-2F和actin-2R。

实时荧光定量PCR在ABI

7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T＝(C_T.Target-C_T.Actin)_Timex-(C_T.Target-C_T.Actin)_Time0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

HSF1F：5’-ACTTCCTCCTCCCCTCCTACT-3’(对应序列表序列2的第164-184位)；

HSF1R：5’-ATCAGCGGCAGCAGCTT-3’(对应序列表序列2的第298-314位)；

actin-2F：5’-CTCCCTCACAACAACCGC-3’；

actin-2R：5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。

TaHSF1对各个胁迫及激素表现出响应，结果如图3所示。

实施例4、TaHSF1亚细胞定位分析

一、重组表达载体的构建

1、TaHSF1基因的获得

根据TaHSF1基因的序列(即序列表序列2的序列)设计引物TaHSF1-SI和TaHSF1-BI，引物末端分别引入Sal I和BamH I的识别序列，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaHSF1基因，将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化750bp左右的PCR产物。

TaHSF1-SI：5’-GCGTCGACATGGGAAGCGAGTGCAAG-3’(划线部分对应序列表序列2中的第1位至第18位)；

TaHSF1-BI：5’-CGGATCCGTAGAACACCTGTCCCAGA-3’(划线部分对应序列表序列2中的第708位至第690位)。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶Sal I和BamH I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶Sal I和BamH I酶切表达载体hGFP，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化Top10，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒16318hGFP-TaHSF1，该质粒为在载体hGFP的Sal I和BamH I酶切位点之间插入了序列表序列2所示的DNA片段，其结构示意图如图4所示。

二、材料准备

3μg步骤一得到的重组质粒16318hGFP-TaHSF1加入直径为1.0μM的金粉悬液6μl(50mg/ml)，0.1M亚精胺(spermidine)4μl，2.5M CaCl₂ 6μl，将金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。12000rpm离心10s(转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μl无水乙醇，粗振荡后(打散金粉)12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20μl无水乙醇悬浮沉淀，点膜。

三、基因枪轰击受体材料

①选用一定压力的可裂膜(本实验用1100psi)，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡1～2h，取出晾干；

②金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；

③取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；

④将上述载体固定圈安装到发射装置上；

⑤将可裂膜安装到气体加速管下端；

⑥将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；

⑦抽真空指针到26In/Hg；

⑧放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开；

⑨气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；

⑩将轰击好的洋葱表皮细胞放入25℃培养箱中，暗培养16～24h后在激光共聚焦显微镜下观察。

四、洋葱表皮细胞镜检

将基因枪轰击、暗培养16-24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Rad MicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy，LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像(如图5所示)。结果表明TaHSF1定位于细胞核中。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。

实施例5、TaHSF1提高拟南芥的抗逆性

一、重组表达载体的构建

1、TaHSF1基因的克隆

根据TaHSF1基因的序列设计引物对(TaHSF-1F和TaHSF1-1R)，引物末端分别引入BamH I和Sac I酶切识别位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaHSF1。

TaHSF1-1-121F：5’-CCGGATCCATGGGAAGCGAGTGCAAG-3’(划线部分对应序列表序列2中的第1位至第18位)；

TaHSF1-1-121R：5’-CGAGCTCTCAGTAGAACACCTGTCCCAGA-3’(划线部分与序列表序列2中第711位至第690位的序列反向互补)

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA PurificationKitVer.2.0(TaKaRa，DV807A)回收纯化750bp左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶BamH I和Sac I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶BamH I和Sac I酶切pBI121(Clontech公司)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pBI121-TaHSF1(在pBI121的BamHI和Sac I酶切位点之间插入了序列表序列2自5’端第1位-711位核苷酸所示的DNA片段；如图6所示)。

二、转基因拟南芥的获得

1、用重组质粒pBI121-TaHSF1转化农杆菌C58(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T1代种子，卡那霉素筛选(浓度为50mg/L卡那霉素)抗性植株，大部分非转基因植株黄化死去，而转基因植株能够正常生长。

对T₁代抗性植株进行DNA水平的PCR鉴定，部分样本的鉴定结果如图7所示。从抗性植株中筛选得到阳性转基因植株(转TaHSF1基因的拟南芥植株)。

PCR鉴定的引物如下：

HSF1-PF：5’-CCAGCTCAACACCTACGGT-3’(对应序列表序列2的第216-234位)；

HSF1-PR：5’-CCTCCTTCTTGGCGACCA-3’(与序列表序列2的第553-536位互补)；

其预测片段的大小为338bp。

T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pBI121转化农杆菌，得到重组农杆菌，用该重组农杆菌转化拟南芥，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

转空载体对照植株的PCR鉴定引物为引物F：5’-TTCAGAAAGAATGCTAACCC-3’和引物R：5’-GAGGCATCTTCAACGATGGCCTT-3’，预测产物为600bp，鉴定结果如图7B所示。

四、转基因植物的耐旱性鉴定

分别将经PCR鉴定呈阳性的T₃代转基因拟南芥植株(Transgenic Line，TL)、经PCR鉴定呈阳性的T₃代转空载体对照植株(CK)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将正常生长15天的幼苗进行干旱处理，连续不浇水直至拟南芥Col-0枯萎(约20天)，然后复水7天，观察表型、拍照并统计存活率，结果如表2和图8所示。

表2.转基因拟南芥植株耐旱性鉴定的存活率统计结果

	重复1	重复2	重复3	平均
					TL	74％	78％	73％	75％
CK	23％	24％	22％	23％
					WT	20％	23％	21％	21.3％

结果表明：拟南芥Col-0大部分死亡，成活率仅为21.3％，但75％转基因植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

五、转基因植物的耐热性鉴定

分别将经PCR鉴定呈阳性的T₃代转基因拟南芥植株(Transgenic Line，TL)、经PCR鉴定呈阳性的T₃代转空载体对照植株(CK)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐高温性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将正常生长4周的幼苗进行42℃高温处理3h，之后经过正常培养1周，观察表型、拍照并统计存活率，结果如表3和图9所示。

表3.转基因拟南芥植株耐高温性鉴定的存活率统计结果

	重复1	重复2	重复3	平均
					TL	89％	93％	88％	90％
CK	24％	22％	20％	22％
					WT	23％	19％	18％	20％

结果表明：拟南芥Col-0大部分死亡，成活率仅为20％，转基因植株成活率高达90％，且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

Claims

1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pGBKT7-TaHSF1、16318hGFP-TaHSF1或pBI121-TaHSF1；

所述pGBKT7-TaHSF1为将权利要求2或3所述的基因插入载体pGBKT7得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2所示的DNA分子插入载体pGBKT7的EcoR I和BamH I酶切识别位点之间得到的重组表达载体；

所述16318hGFP-TaHSF1为将权利要求2或3所述的基因插入载体hGFP得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2所示的DNA分子插入载体163hGFP的Sal I和BamH I酶切识别位点之间得到的重组表达载体；

所述pBI121-TaHSF1为将权利要求2或3所述的基因插入载体pBI121得到表达权利要求1所述蛋白的重组表达载体；具体为将序列表序列2所示的DNA分子插入载体pBI121的BamH I和Sac I酶切识别位点之间得到的重组表达载体。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：耐逆性为耐旱性和耐热性。

10.权利要求1所述蛋白在作为转录因子中的应用。