CN103305542B

CN103305542B - 一种重组噬菌体双表达载体及应用

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Publication number: CN103305542B
Application number: CN201310255769.3A
Authority: CN
Inventors: 徐海; 王义伟; 鲍熹; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Yanjiang Agricultural Science Research Institute
Current assignee: Guangxi Junke Bioengineering Co ltd
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-06-25
Also published as: CN103305542A

Abstract

本发明提供一种重组噬菌体双表达载体及应用，涉及生物技术领域。所述重组噬菌体双表达载体，是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体。本发明重组噬菌体双表达载体，稳定性高，能够在噬菌体表面展示目的基因1编码的蛋白，同时能够将真核表达盒运到免疫细胞内部，实现目的基因2的真核表达，可作为各种抗原表位多肽表达的通用平台。通过免疫效力检测发现，该疫苗免疫后，机体能够产生高水平的抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体，而且抗体持续期长。

Description

一种重组噬菌体双表达载体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体双表达载体及其应用。

背景技术

T7噬菌体是感染大肠杆菌的小型烈性噬菌体，基因组为线状双链DNA，长39 936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白(P10A)、次要头蛋白(P10B)、颈圈蛋白(P8)、尾蛋白(P11、P12)和尾丝蛋白(P17)，其中P10A和P10B是由p10编码的是一对重叠蛋白，P10A有344个氨基酸残基，P10B有397个氨基酸残基，是在P10A的phe341处翻译移码产生的，在野生型T7噬菌体中，P10B约占衣壳蛋白总量(415拷贝)的10%。T7噬菌体展示系统是一种新型的展示系统，对p10进行了改造，自然状态下的翻译移码位点被去除，并在348位氨基酸之后重组入了一个多克隆位点，使得基因组中仅表达改造后的P10B (415拷贝)，因而可以将外源肽段以融合蛋白的形式展示在P10B上。利用噬菌体作为抗原表位的载体，其表面展示的多肽是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；噬菌体有较强的免疫原性，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；由于噬菌体颗粒是由感染的细菌分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；噬菌体生长迅速，纯化简单、花费少；噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。

但是，以表面展示有抗原表位的噬菌体颗粒作为抗原制备的疫苗，其免疫效果也不能令人满意。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组噬菌体双表达载体，利用T7噬菌体的生物学特性，将其作为半抗原的表达和递呈载体又作为DNA疫苗的转运载体，实现外源基因在真、原核条件下的双表达，该方法操作简单，稳定性高，可作为外源基因表达的通用平台。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种重组噬菌体双表达载体，是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体。

所述重组噬菌体双表达载体的表面展示有目的基因1编码的多肽，同时又能在免疫细胞内真核表达目的基因2编码的多肽。

所述真核表达盒含有CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴。

所述T7噬菌体基因组中非编码区为T7噬菌体基因组左侧578-2746位的区域。

所述目的基因1为（1）或（2）或（3）的核苷酸序列：

（1）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列；

（2）编码在口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽氨基端添加了柔性Linker氨基酸后所得多肽的核苷酸序列；

（3）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍具有口蹄疫病毒VP1（129-169）位多肽的主要抗原活性的核苷酸序列。

所述目的基因2为（4）或（5）的核苷酸序列：

（4）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示；

（5）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍具有口蹄疫病毒VP1结构蛋白的主要抗原活性的核苷酸序列。

在T7噬菌体非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒的具体方法为：

在T7噬菌体的非编码区选择插入位点，分别PCR扩增该插入位点上、下游基因序列作为左、右同源臂，构建自上游到下游依次含有左同源臂和右同源臂的重组克隆载体；

将目的基因2插入CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴之间，得到真核表达盒；

将所述真核表达盒插入所述重组克隆载体的左、右同源臂之间，得到同源重组质粒；

所述同源重组质粒与T7噬菌体基因组进行同源重组，得到非编码区插入了含有目的基因2的真核表达盒的重组T7噬菌体。

一种以所述重组噬菌体双表达载体为抗原的疫苗。

本发明具有如下技术效果：

本发明重组噬菌体双表达载体，稳定性高，能够在噬菌体表面展示目的基因1编码的蛋白，同时能够将真核表达盒运到免疫细胞内部，实现目的基因2的真核表达，可作为各种抗原表位多肽表达的通用平台。

本发明将抗原表位的多肽（口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽）展示在噬菌体表面，同时又通过同源重组的方法将含有口蹄疫病毒VP1结构蛋白的真核表达盒导入T7噬菌体基因组左侧非编码区，得到重组噬菌体双表达载体。利用该重组噬菌体双表达载体作为免疫原制备的疫苗，重组噬菌体颗粒既可作为多肽抗原的半抗原载体，将抗原表位递呈给免疫细胞，同时又是DNA疫苗的转运载体，将DNA疫苗高效的转运到免疫细胞内部，实现亚单位抗原的表达。通过免疫效力检测发现，该疫苗免疫后，机体能够产生高水平的抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体，而且抗体持续期长。

本发明重组噬菌体双表达载体的制备方法简单，稳定性高，成本低，便于大规模生产。

附图说明

图1为T7-VP1_129-169重组噬菌体PCR鉴定的电泳图。泳道1为DL2000 DNA Marker；泳道2为T7 Select 415-1b的PCR产物；泳道3为T7-VP1_129-169重组噬菌体PCR产物。

图2为重组噬菌体T7- VP1_129-169-VP1酶切后的电泳鉴定图，其中泳道1为λ-HindⅢ digest DNA Marker；泳道2为重组噬菌体T7-VP1_129-169基因组SwaⅠ酶切产物；泳道3为重组噬菌体T7- VP1_129-169-VP1基因组SwaⅠ酶切产物。

图3重组噬菌体T7- VP1_129-169-VP1体外表达鉴定的荧光显微镜图像；其中图A为空白对照的荧光显微镜图像；图B为重组噬菌体T7- VP1_129-169-VP1体外表达鉴定的荧光显微镜图像。

图4 显示了UBI^?VP1多肽ELISA检测试剂盒检测各猪免疫后不同时间产生的平均抗体水平。

图5显示了采用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测各组猪免疫后第4周的抗体水平。

具体实施方式

编码如SEQ ID NO：1所示基因，CMV真核启动子、SV40 PolyA尾巴为常规技术。限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自大连宝生物生物工程公司。

T7噬菌体载体、E.coli BL21购自Novagen公司。

T7噬菌体滴度的测定为常规技术。

实施例1 构建重组噬菌体T7-VP1_129-169

重组噬菌体T7-VP1_129-169是在T7 Select 415-1b的p10B基因下游插入编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列后形成的，其衣壳蛋白p10B的羧基端融合表达了口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽。

在口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽（如SEQ ID NO:3所示）的氨基端添加柔性Linker氨基酸GGGGS，形成了多肽A。在编码多肽A的核苷酸序列的5’端添加酶切位点EcoRⅠ，3’端添加酶切位点HindⅢ，形成了SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

由商业公司合成SEQ ID NO：1所示的DNA序列，并克隆至pUC-19载体多克隆位点中。

用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将SEQ ID NO：1所示DNA序列从重组pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体。

插入SEQ ID NO：1的重组pUC-19载体双酶切体系：

ddH₂O	16.0 μL
		10×H Buffer	5.0 μL
插入SEQ ID NO：1的重组pUC-19载体	25.0μL
		EcoRⅠ	2.0 μL
HindⅢ	2.0 μL

混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4 小时，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

T7 Select 415-1b（T7噬菌体载体）双酶切体系：

ddH₂O	11.0 μL
		10×T Buffer	2.0 μL
T7 Select 415-1b	5.0μL
		EcoRⅠ	1.0 μL
HindⅢ	1.0 μL

混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4 小时，酶切产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

连接反应体系：

SEQ ID NO：1所示DNA序列回收产物	2.0 μL
		T7 Select 415-1b回收产物	0.5 μL
ddH₂O	1.75 μL
		T4 DNA Ligase	0.25 μL
10×T4 DNA Ligase Buffer	0.5 μL

16℃连接过夜，得到连接产物1。

重组噬菌体的包装：

连接产物1	5.0 μL
		T7 噬菌体Packing Extracts	25.0 μL

22℃包装2小时，在包装反应体系中加入270μL LB培养液终止反应，得到包装产物。

包装产物的平板扩增：

100μL包装产物与250μL新鲜过夜培养的BL21菌液(OD600=1.0)混匀后，迅速与3mL融化的45℃温浴的顶层琼脂混合均匀平铺LB平皿，待顶层琼脂凝固后，37℃倒置培养至形成噬菌斑。挑取噬菌斑，PCR方法筛选和鉴定阳性重组噬菌体T7-VP1_129-169，结果见图1。阳性重组噬菌体T7-VP1_129-169可以扩增出520bp目的片段。

实施例2 同源重组中间质粒载体的构建

分析重组噬菌体T7-VP1_129-169基因组，选择基因组左侧第578位A为真核表达盒的插入位点。将重组噬菌体T7-VP1_129-169基因组左侧1-578位的基因片段作为左同源臂，基因组左侧2746-2946位的基因片段为右同源臂。针对两个同源臂设计两对引物，并在引物5’端添加XhoⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点。左同源臂引物为L1-578UP和L1-578DOWN，右同源臂引物为R2746-2946UP和R2746-2946DOWN。

L1-578UP：5’- aactcgagTCTCACAGTGTACGGACCTA，

L1-578DOWN：5’-AAAAGCTTTCGTGCGACTTATCAGGCTG。

R2746-2946UP：5’- AAGAATTCcaGAATTCCAGAAAGAAATTGACCGCGC，

R2746-2946DOWN：5’-AAGGATCCTGACCCAGAGCATAGCGTTA。

以T7 Select 415-1b基因组为模板，分别PCR扩增左同源臂和右同源臂。

左同源臂扩增体系如下：

L1-578UP	1.0 μL
		L1-578DOWN	1.0μL
T7 Select 415-1b	1.0μL
		Mg²⁺	3.0μL
dNTP	2.0 μL
		10×Buffer	5.0 μL
Ex TaqE	0.5μL
		H₂O	36.5μL

反应程序为：94℃ 4min；94℃ 45sec，55℃ 45sec，72℃ 45sec，30个循环；72℃ 10min。

右同源臂扩增体系如下：

R2746-2946UP：	1.0 μL
		R2746-2946DOWN	1.0μL
T7 Select 415-1b	1.0μL
		Mg²⁺	3.0μL
dNTP	1.0 μL
		10×Buffer	5.0 μL
Ex TaqE	0.5μL
		H₂O	37.5μL

反应程序为：94℃ 4min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec， 30个循环；72℃ 10min。

将左同源臂PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收，酶切处理后插入pBluescript II SK载体，得到重组质粒pBluescript-L。

将右同源臂PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收，酶切处理后插入重组质粒pBluescript-L的左同源臂下游，构建重组质粒pBluescript-L-R。即重组质粒pBluescript-L-R中左、右同源臂的位置关系与重组噬菌体T7-VP1_129-169基因组中位置一致。

由商业公司合成口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列（如SEQ ID NO：2所示），该基因序列已克隆至商品化质粒pEGFP-N1（美国CLONTECH）的CMV真核启动子和SV40 polyA之间，命名为p-VP1。CMV真核启动子、口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列和SV40 polyA构成真核表达盒。以p-VP1为模板，针对CMV真核启动子和SV40 polyA设计引物Pcmv UP和SV40 polyA DOWN，扩增含有CMV真核启动子、口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列和SV40 polyA的真核表达盒。引物序列为：

Pcmv UP：AAAAGCTTattaatagtaatcaattacg；

SV40 polyA DOWN：AAGAATTCatacattgatgagtttggac。

PCR扩增真核表达盒的反应体系如下：

Pcmv UP：	1.0 μL
		SV40 polyA DOWN	1.0μL
p-VP1	1.0μL
		Mg²⁺	3.0μL
dNTP	2.0 μL
		10×Buffer	5.0 μL
Ex TaqE	0.5μL
		H₂O	36.5μL

反应程序为：94℃ 4min；94℃ 30sec，55℃ 1min，72℃ 1min 30个循环；72℃ 10min。

将PCR扩增的真核表达盒通过两端酶切位点插入重组质粒pBluescript-L-R的左同源臂和右同源臂之间，得到同源重组质粒pBluescript-L-VP1-R。将pBluescript-L-VP1-R送华大基因测序，序列完全正确的质粒用于同源重组。

实施例3 插入真核表达盒的重组T7噬菌体构建

同源重组质粒pBluescript-L-VP1-R与重组噬菌体T7-VP1_129-169DNA发生同源重组后，由CMV真核启动子、口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列和SV40 polyA构成的真核表达盒插入到重组噬菌体T7-VP1_129-169基因组左侧第578位A之后，替换了重组噬菌体T7-VP1_129-169基因组中579-2745位的片段，获得重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1。

同源重组的具体方法如下：将中间载体pBluescript-L-VP1-R导入E.coli BL21中，获得BL21-pBluescript-L-VP1-R。将BL21-pBluescript-L-VP1-R在含氨苄西林抗性的LB固体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种3mL在含氨苄西林抗性的LB液体培养基，37℃、200转/分震荡培养过夜，获得BL21-pBluescript-L-VP1-R菌液。同时，培养重组噬菌体T7-VP1_129-169。分别测定BL21-pBluescript-L-VP1-R菌液的菌落数、重组噬菌体T7-VP1_129-169噬斑数；在1mL LB液体培养基中加入BL21-pBluescript-L-VP1-R菌液10μL，按照MOI=0.001加入T7-VP1_129-169噬菌体培养液和适量的氨苄西林，37℃、200转/分震荡培养，2-3小时后培养液保持澄清即可停止，回收培养液。将回收的培养液进行10倍梯度稀释，通过双层琼脂夹心法测定培养液滴度，挑选平板上单个噬菌体噬斑，用引物Pcmv UP和SV40 polyA DOWN进行菌落PCR。能够扩增出含有VP1结构蛋白编码基因（SEQ ID NO：2）的真核表达盒的噬斑，即为插入了真核表达盒的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1。重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1的酶切鉴定电泳图如图2所示。从图2可以看出重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1通过酶切后可以切出6000bp目的片段。

另外，将同源重组中间载体pBluescript-L-VP1-R与T7噬菌体DNA发生同源重组，获得插入了真核表达盒的重组噬菌体T7-VP1。重组噬菌体T7-VP1将用于后续试验中的对照。

实施例4 T7-VP1_129-169-VP1重组噬菌体的扩增及基因组提取

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB固体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB液体培养基，37℃、200转/分震荡培养过夜。取3mL过夜培养物接种300mL LB液体培养基，培养至OD₆₀₀=0.8左右。挑取平皿上的单个重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清。用PEG-NaCl沉淀的方法回收噬菌体，并用双层琼脂夹心方法测定噬菌体滴度。在回收的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1中添加终浓度为1μg/mL的RNase A（核糖核酸酶A）、DNaseI（脱氧核糖核酸酶Ⅰ），37℃反应1小时，然后调整噬菌体浓度为2.0×10¹²pfu/mL，4℃保存。

取5mL回收的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1，添加50μL 10%SDS、50μL 0.5M EDTA，65℃消化30分钟，中间轻轻摇匀2-3次。加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，轻轻混匀，12000转/分钟离心5分钟，取上层清液到一新离心管，重复该操作一次。然后加等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀， 12000转/分钟离心5分钟，取上层清液到一新离心管，重复该操作一次。转移上清到一新离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置1小时，12000转离心10分钟，去除上清，用1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，瞬时离心，弃上清，将沉淀室温下晾干，然后溶于200μL TE缓冲液，即为提取的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1的DNA。取部分DNA用SmaⅠ进行酶切鉴定，剩余部分-20℃冻存备用。

实施例5 重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1的体外表达

将处于对数生长期的Vero细胞经胰酶消化后用无抗生素含10%FCS的MEM培养液轻轻吹下，调整细胞密度到1.0×10⁶个/mL，然后均匀分布于6孔细胞培养样板，用不含抗生素的MEM培养基调整体积到2mL，于二氧化碳培养箱37℃过夜培养。将提取的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1的DNA（实施例4制备）经脂质体(LipofectamineTM 2000)包裹，与Vero细胞共培养36h；另留两孔细胞不转染DNA，用作空白对照。弃去培养液，PBS缓冲液洗涤3次，75%乙醇固定细胞。加入抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白阳性血清（上海吉尔生化有限公司制备），于37℃孵育1h，PBS冲洗3次，加入荧光标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体（美国abcam公司），避光37℃反应30min。用PBS洗涤3次后用荧光显微镜观察。

如图3所示，荧光显微镜观察表明：转染重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1 DNA的Vero细胞有很强的荧光显色，说明插入的真核表达盒能够正确表达VP1结构蛋白；空白对照中的细胞内部未见荧光显色。

实施例6 重组噬菌体油乳剂疫苗的制备

重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1油乳剂疫苗的制备方法如下：

疫苗油相的制备：4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混匀，121℃高压20分钟。

疫苗水相的制备：将94mL滴度为2×10¹³pfu/mL的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1灭活后，加入4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均匀，即得疫苗水相。

在组织捣碎机加入150mL疫苗油相，一边缓慢搅拌一边缓慢加入50mL疫苗水相，待充分混匀后，10000转/分钟快速搅拌2分钟，形成稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1油乳剂疫苗（抗原含量为1.0×10¹¹pfu/mL），4℃保存备用。

按照上述方法，分别将重组噬菌体T7-VP1和T7-VP1_129-169制备成相应的油乳剂疫苗。各疫苗中的抗原含量为1.0×10¹¹pfu/mL。

实施例7 重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1疫苗免疫效力检测

采用实施例6中制备的各重组噬菌体疫苗进行下面的试验。

在仔猪40日龄时，分别采用重组噬菌体T7-VP1_129-169、T7-VP1、T7-VP1_129-169-VP1的油乳剂疫苗进行一次免疫，每头猪免疫2mL，期间定期采集血液样品检测抗体。具体操作如下：

挑选出生日龄相近的健康猪40头，同群饲养至40日龄，其中10头为重组噬菌体T7-VP1_129-169免疫组，接种重组噬菌体T7-VP1_129-169油乳剂疫苗；10头为重组噬菌体T7-VP1免疫组，接种重组噬菌体T7-VP1油乳剂疫苗；10头为重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1免疫组，接种重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1油乳剂疫苗；10头为商品化多肽疫苗免疫组，接种猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2570+7309，中牧兰州生物制药厂)。在免疫后的0、2、4、6、8周采血分离血清，分别用UBI^?VP1多肽ELISA检测试剂盒和口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（中国农业科学研兰州兽医研究所）检测抗体。

采用UBI^?VP1多肽ELISA检测试剂盒检测各猪免疫后不同时间产生的抗体水平，计算平均抗体水平，结果如图4所示。从图4可以看出，各疫苗免疫后机体均产生抗口蹄疫VP1结构蛋白抗体，其中重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1疫苗免疫后两周抗体迅速升高，OD₄₅₀值达到2.8以上，免疫后2到8周抗体水平仍有小幅上升，并能维持在OD₄₅₀3.0左右，抗体持续期长；猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后抗体上升缓慢，免疫后4周抗体到达高峰，但OD₄₅₀值仅有1.2。其他重组噬菌体疫苗免疫后，猪产生的抗体水平也显著低于重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1疫苗免疫后产生的抗体水平。

采用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测各组猪免疫后第4周的抗体水平，结果如图5。从图5可以看出，免疫后第4周，重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1免疫组中，有9头猪阻断抗体不低于1:64，即免疫后的保护率达到了90％，其中6头阻断抗体达到1:128的高水平；重组噬菌体T7-VP1疫苗免疫组中，有8头猪阻断抗体不低于1:64，其中4头达到1:128；重组噬菌体T7-VP1_129-169免疫组中，8头猪阻断抗体不低于1:64，但仅2头达到1:128；猪口蹄疫O型合成肽疫苗仅有一头猪阻断抗体达到1:64，满足免疫保护的要求。该结果说明，重组噬菌体T7-VP1_129-169-VP1疫苗免疫后，试验猪能够产生较高抗体水平，保护率能够达到90％。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种重组噬菌体双表达载体及应用

<130> 20130625

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 154

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> VP1结构蛋白（129-169）添加酶切位点及柔性Linker后形成的多肽的基因序

列

<400> 1

gaattcgggt ggtggtggta gcgtttataa tggcaattgt aaatatgccg gtggtagcct 60

gaccaatgtt cgtggtgatc tgcaggttct ggcacagaaa gcagcacgtt gtctgccgac 120

cagctttaac tatggtgcaa ttaaataaaa gctt 154

<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列

<400> 2

ctcgagacca cttcgacggg cgagtcggct gaccccgtga ctgccaccgt tgagaattac 60

ggtggcgaga cacaggtcca gaggcgccac cacacagacg tctcattcat attggacaga 120

tttgtgaaag tcacaccaaa agactcaata aatgtattgg acctgatgca gaccccctcc 180

cacaccctag taggggcgct cctccgcact gccacttact atttcgctga tctagaggtg 240

gcagtgaaac acgaggggga ccttacctgg gtgccaaatg gagcacctga agcagccttg 300

gacaacacca ccaacccaac ggcgtaccat aaggcgccgc ttactcggct tgcattgccc 360

tacacggcac cacaccgtgt tttggccacc gtttacaacg ggaactgcaa atacgccggg 420

ggctcactgc ccaacgtgag aggcgatctc caagtgctgg ctcagaaggc agcgaggtgt 480

ctgcctactt ctttcaacta cggtgccatc aaagccactc gggtgacaga actgctgtac 540

cgcatgaaga gggccgagac gtactgtcct cggcccctct tggctgttca cccgagtgcg 600

gccagacaca aacagaaaat agtggcgcct gtaaagcagt ccttgtaact gcag 654

<210> 3

<211> 41

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽

<400> 3

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val

1 5 10 15

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro

20 25 30

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys

35 40

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> L1-578UP

<400> 4

aactcgagtc tcacagtgta cggaccta 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> L1-578DOWN

<400> 5

aaaagctttc gtgcgactta tcaggctg 28

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> R2746-2946UP

<400> 6

aagaattcca gaattccaga aagaaattga ccgcgc 36

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> R2746-2946DOWN

<400> 7

aaggatcctg acccagagca tagcgtta 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> PCMV UP

<400> 8

aaaagcttat taatagtaat caattacg 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> SV40 polyA DOWN

<400> 9

aagaattcat acattgatga gtttggac 28

Claims

1.一种重组噬菌体双表达载体，其特征在于：是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体；所述T7噬菌体基因组中非编码区为T7噬菌体基因组左侧578-2746位的区域；

所述目的基因1为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

所述目的基因2为编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述重组噬菌体双表达载体，其特征在于：所述重组噬菌体双表达载体的表面展示有目的基因1编码的多肽，同时又能在免疫细胞内真核表达目的基因2编码的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述重组噬菌体双表达载体，其特征在于：所述真核表达盒含有CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴。

4.根据权利要求3所述重组噬菌体双表达载体，其特征在于：在T7噬菌体非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒的具体方法为：

5.一种以权利要求1－4之一所述重组噬菌体双表达载体为抗原的疫苗。