CN103290049B - 阻断hiv-1膜融合的小环型dna重组载体及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供一种能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212的核苷酸序列和小环DNA载体。本发明还提供阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包含能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其有效成分是编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的核苷酸，该核苷酸通过小环型DNA载体方式，转染真核细胞后，在细胞内表达并通过外分泌或者细胞外膜表达方式释放到细胞外，通过阻断病毒进入宿主细胞过程，发挥抑制HIV-1病毒感染的作用。本发明还提供编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。
Description
技术领域
本发明属于病毒学领域，具体涉及一种能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212的核苷酸序列和小环DNA载体。本发明还涉及一组阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包含能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其有效成分是编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的核苷酸。本发明还涉及编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。
背景技术
HIV感染已经是全球性的公共安全问题，过去两次有代表性的疫苗临床试验的失利显示了HIV疫苗开发的难度、短期内疫苗上市期望的渺茫。因而开发新的HIV抑制剂也将是长期的任务。现有的HIV小分子抑制剂是控制HIV感染后患者疾病发展的主要手段，但是这些药物的副作用以及HIV病毒的高变异能力，是激发寻求现有药物基础以外的其它治疗药物的源动力。寻求非传统形式的预防HIV特定途径感染的药物，是目前发展的一个重要方向，特别是随着感染人数的增加，生活观念的改变，出现易感人群开始向普通大众转移的趋势。寻找更多其它类型的治疗性药物，仍有重要的意义。
1.HIV药物的耐药性以及膜融合抑制剂的优点：
目前，HIV治疗的主流药物是逆转录酶抑制剂与蛋白酶抑制剂，近年来Merck开发的整合酶抑制剂也是有效的小分子抑制剂，还有许多其它正在研究的HIV病毒释放、包装相关的抑制剂等。
但是，艾滋病病毒是一种突变率极高的病毒，美国疾病控制和预防中心，对美国10个城市700多例尚未治愈病人的抗逆转录病毒药耐药情况调查后发现，抗艾滋病病毒药耐药发生率因危险程度、种族、地区和检查时间差异而不同。因此，艾滋病病毒的流行并非单一不变，而是呈多样化、重叠式地方性流行。这些都将增加单一药物治疗艾滋病的困难，
由于艾滋病病毒的多变与顽固，临床上提倡多种药物配伍使用治疗。使用两种不同的核苷类逆转录酶抑制剂(如齐多夫定、拉米夫定、斯它夫定、扎西它宾、双脱氧肌苷等等)，加上一种(或两种)蛋白酶抑制剂(如英迪那菲、里托那菲等等)的鸡尾酒疗法是常用的策略。但是其仍不能解决小分子药物本身靶位点局限性，微小的突变就可能使药物失效，而产生新的耐药株。
目前，研究发现HIV病毒感染宿主细胞时，需要通过一个膜融合的过程。在该过程中，HIV病毒参与这一膜融合过程的囊膜上的gp41分子中有相对保守的两段区域，可作为构建病毒抑制剂的元件。
由于该类抑制剂具有广泛的抑制活性及高抗变异HIV株的特性，使得该类产品的潜在需求巨大，如防止母婴传播、机会感染等预防型用药，以及对于现有药物产生耐药性时的替代用药等，市场需要明确。
本发明中用到的HR212，是我们找到的一种有效的七肽重复三螺旋HIV抑制剂的组合方式(Ni，L.，G.F.Gao，et al.2005)。通过真假病毒实验，严格地按《抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则》(国食药监注[2006]639号)的要求检测的结果，可以确认它在纳摩尔浓度抑制HIV复制，其抗HIV活性与FDA批准上市的多肽融合抑制剂T-20相似；它同时也在纳摩尔浓度抑制T-20耐药株复制；而且该蛋白稳定性高，其药效时间比T-20要长10倍以上。对酸、蛋白酶、温度有较强的耐受力(Pang，W.，R.R.Wang，et al.2008)。因而外分泌表达该蛋白更具潜力。
2.小环型DNA制剂的优势
使用小环DNA作为基因治疗的载体，由于它去除了复制子、抗性基因以及其它一些易于产生免疫原性区和易于产生基因沉默的序列，有较高的安全性且易于表达。同时，小环DNA由于去除非必需基因后，序列长度变短，更有利于将基因转染进细胞。另外，小鼠体内实验证实，体内基因给药时，小环DNA作用存活的时间长达三周，比一般质粒多一周。这几个方面共同决定了小环DNA具有其它载体不可替代的优势。
3.本发明的重要特点
使用小环型载体表达特定基因，是一项容易获知的技术。但是使用已知的技术，将能表达HR212的基因克隆到小环载体上，表达HR212蛋白是可以实现的，但要将HR212蛋白分泌到细胞外，相当艰难。目前为止，还没有人能够实现将HR212蛋白分泌到真核细胞外的表达。
本发明中，主要通过以下几个方面的研究，实现了HR212蛋白的真核外分泌表达：
(1)筛选信号肽序列并优化其核酸序列，在研究中使用过抗体、白介素-2、卵白蛋白、以及本发明中提及的信号肽38sp；
(2)信号肽序列与HR212序列之间的短序列、三段七肽重复序列之间接头(linker)在长度以及核酸序列上的优化；
(3)通过对密码子使用频率的差异，修饰编码核酸序列来解决HR212序列本身重复性造成的质粒稳定性问题；
(4)使用GPI锚定蛋白增强外分泌功能。在HR212编码核酸序列中增加该GPI锚定后，表达的HR212蛋白容易通过内膜系统运输到细胞外膜上，其又可以自脱落或者基质相关酶切释放该蛋白到外细胞外基质。由于定位于膜上以及游离的蛋白均有抑制能力，因此该方法总体上提高表抑制效果。
所有以上的优化结果直接体现在本发明经过大量的筛选优化获得的序列中。
发明内容
本发明的目的是通过小环DNA方式在体内表达抑制HIV感染的七肽重复三螺旋蛋白HR212，并将HR212蛋白分泌到真核细胞外，从而能够阻断HIV-1膜融合过程，起到抑制HIV感染的作用。
为实现该目的，本发明提供一种能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212的核苷酸序列和小环DNA载体。本发明还提供一组阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包含能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其有效成分是编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的核苷酸，该核苷酸通过小环型DNA载体方式，转染真核细胞后，在细胞内表达并通过外分泌或者细胞外膜表达方式释放到细胞外，通过阻断病毒进入宿主细胞过程，发挥抑制HIV-1病毒感染的作用。本发明还提供编码七肽重复三螺旋蛋白HR212的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。
在本发明的第一方面中，为了实现HR212蛋白的真核外分泌表达，本发明人经过大量的筛选和优化工作，成功构建了能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212的核苷酸序列和小环DNA载体。优选地，所述小环型DNA重组载体的骨干序列是由HIV-1的一个氨基端七肽重复序列以及两个羧基端的七肽重复序列构成的三螺旋蛋白HR212，其排列顺序为：
NH2HR2-linker2-HR1-linker1-HR2COOH，
其中HR1的氨基酸序列为sgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqar(SEQ IDNo.33)，HR2的氨基酸序列为wmewdreinnytslihslieesqnqqekneqell(SEQ IDNo.34)，
其中linker表示接头序列，linker1和linker2为长度可以在5-15个氨基酸残基之间的接头序列，优选地，所用的接头序列为富含甘氨酸和丝氨酸的长度5-15个氨基酸残基的短肽，更优选地，linker1和linker2两个接头的氨基酸序列可以独立地选自SEQ ID Nos.12，14，16，和18。
优选地，其中HR212蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。更优选地，所述小环型DNA重组载体还在HR212蛋白的氨基端和/或羧基端添加较短的标签序列，如Flag、或Strep II标签。更优选地，所述小环型DNA重组载体还带有细胞外膜锚定蛋白，如GPI(SEQ ID No.30)。在一个实施方案中，在HR212蛋白的N端使用信号肽38sp，其氨基酸序列所SEQ IDNo.20所示。
按照本发明，构建所述小环型DNA重组载体所用的小环DNA载体为pMC-BESPX-MCS2；密码子优化的HR212蛋白的编码核酸序列为SEQID No.2，其编码的HR212蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所用的信号肽为38sp(SEQ ID No.20)。
在本发明的优选实施方案中，所述能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体为克隆05、克隆06、克隆07、克隆08、和克隆09，所述克隆所包含的元件和构建方法可参见实施例部分。
在本发明的第二方面中，本发明提供本发明第一方面构建的能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。
在本发明的第三方面中，本发明提供一种阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包含本发明第一方面构建的能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体作为活性成分。
因此，本发明提供下述：
1.能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212蛋白的核苷酸序列和小环DNA载体。
2.根据第1项的小环型DNA重组载体，其中骨干序列是编码HR212蛋白的核苷酸序列，所述HR212蛋白是由HIV-1的一个氨基端七肽重复序列以及两个羧基端的七肽重复序列构成的三螺旋蛋白，其排列顺序为：
NH2HR2-linker1-HR1-linker2-HR2COOH，
其中HR1的氨基酸序列如SEQ ID No.33所示，HR2的氨基酸序列如SEQID No.34所示，
其中linker表示接头序列，linker1和linker2为长度可以在5-15个氨基酸残基之间的接头序列。
3.根据第2项的小环型DNA重组载体，其中linker1和linker2两个接头的氨基酸序列独立地选自SEQ ID Nos.12，14，16，和18。
4.根据第3项的小环型DNA重组载体，其中HR212蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
5.根据第1项的小环型DNA重组载体，其还在HR212蛋白的氨基端和/或羧基端添加较短的标签序列，如Flag、或Strep II标签。
6.根据第1项的小环型DNA重组载体，其还带有细胞外膜锚定蛋白，如GPI，其氨基酸序列如SEQ ID No.30所示。
7.根据第1项的小环型DNA重组载体，其中在HR212蛋白的N端使用信号肽38sp，其氨基酸序列所SEQ ID No.20所示。
8.根据第1项的小环型DNA重组载体，其中所述小环DNA载体为pMC-BESPX-MCS2。
9.根据第1-8项中任一项的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。
10.一种阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包括根据第1-8项中任一项的小环型DNA重组载体作为活性成分。
综上所述，本发明的优点在于：
第一，本发明提供了一组多种真核外分泌表达的组合方式。
1：外分泌蛋白在通过内质网时，核糖体上翻译的信号肽序列，以及信号肽序列使用密码子情况会影响蛋白穿膜的可能性，这是我们的优化第一个方面；2：进入内质网的HR212蛋白自身折叠速度情况，决定该蛋白最终是留在膜上还是进入内质网内，这是我们要优化的第二个方面；3：要表达的HR212蛋白之后的附加序列，对于整个蛋白是否完全穿膜有着重要影响。这是要优化的第三个方面。由于这三个元件位于同一个核酸区内，这三个方面的优化必须互相协调、正确组合才能实现其外泌表达。
第二，本发明的组合了小环DNA基因治疗手段的在基因转导中安全、高效优势以及HIV膜融合抑制剂抗HIV-1病毒的安全、高效、抗突变优势，具有实用价值。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示细胞锚定表达时的抑制率，结果显示，转染的HR212-GPI质粒(即克隆09)，在7天内能维持半数的病毒抑制能力。
图2显示小环型DNA重组载体克隆06和09在小鼠体内的表达效果，结果显示，以锚定方式表达的质粒(即克隆09)，于第5天过到最高峰后，下降比较缓慢。而用非锚定表达的方式(即克隆06)，病毒达到高峰快，下降速度也高。但都能在一周内维持其半数抑制能力。
图3显示质粒pGEX-6p-1的图谱。
图4显示质粒pMC-BESPX-MCS2的图谱；
图5显示基于2A的GFP筛选体系的原理，基于该筛选体系选择正确的HR1序列用于有效表达HR212，其中蓝色：用DAPI染的细胞核；绿色：eGFP在293T细胞内的状况；红色：用Alexa594二抗检测的带有Flag一抗的HR212蛋白染色结果。
图6显示用Western Blot方法检测克隆05在293T，3T3细胞中表达的情况，其中M：蛋白Mark；Cell lysis：细胞裂解样品结果；Supernatant：细胞上清的结果；T3：小鼠胚胎成纤维细胞；293T：转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系；CK：为不转染DNA的对照组；Trans：为转染DNA的实验组。
实施例
下面是本发明的一些实施例，但是所述实施例仅是举例说明性的，而对本发明的范围不起限定作用。
本领域技术人员应该理解，除非另外说明，下述实施例中所用的原始质粒、试剂、细胞等均是可商购获得的。
实施例1：在HR212上添加不同标签对病毒抑制效果的影响
为了方便检测、纯化及分析，经常在一个蛋白的N端以及C端添加标签，但是，标签的添加有时候将影响目的蛋白的功能效果。本实施例的目的是分析添加了标签的HR212蛋白，其功能是否受到影响。
实验设计：分别将Flag标签、Strep II标签添加到HR212蛋白(氨基酸序列为SEQ ID No.1；本发明进行密码子优化的编码HR212的核苷酸序列为SEQ ID No.2)的两侧，用GST融合蛋白的形式纯化、酶切得到该蛋白后，用HIV假病毒抑制来检测带有不同标签的重组HR212蛋白的HIV-I病毒的膜抑制活性。实验分别设计了以下四种型式的HR212：HR212-Flag(即，Flag标签克隆在HR212的C端)，HR212-Strep II(即，Strep II标签克隆在HR212的C端)，Flag-HR212(即，Flag标签克隆在HR212的N端)，Flag-HR212-Strep II(即，Flag标签克隆在HR212的N端，且Strep II标签克隆在HR212的C端)；对应的克隆分别是克隆01、克隆02、克隆03和克隆04。
实验内容：
1：克隆01-pGEX6p-1-HR212-Flag：克隆01以是以基础克隆91(一种完全人工合成的HR212序列，其N端有Flag序列，其序列为SEQ ID No.3)为基础，在HR212序列的C端加上Flag标签；基因序列通过两次PCR搭桥完成。由于本发明构建的克隆数目多，所有克隆将分别用以下形式表述克隆过程：
引物：
cgGAATTC TGGATGGAATGGGATCGTGAAAT[正向引物]
ATCGTCATCCTTGTAGTCTGAACCTAGAAGTTCCTGTTCGTTCTTTTC[反向引物1]
ccgCTCGAGTTA CTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTGAACCTAG[反向引物2]
其中下划线表示酶切位点。
PCR：
正向引物+反向引物1+基础克隆91(作为模板) 获得产物Step1(368bp)；Ta＝52-57℃
正向引物+反向引物2+产物Step1 获得终产物(386bp)；Ta＝52-57℃
本领域技术人员应该理解，根据所用的引物、退火温度、模板长度等信息，本领域技术人员能够设计合乎需要的PCR条件和PCR循环数，进而得到所需要的PCR产物。
克隆：
使用的酶切位点是EcoRI-XhoI，定向连于克隆pGEX6p-1(购自Amersham公司，质粒图谱见图3)上。
克隆01包含HR212编码序列的重组部分的最终序列(即，插入部分的核苷酸序列，未显示pGEX6p-1载体序列)：
pGEX6p-1--HR212-Flag(SEQ ID No.4)
[EcoRI]-tggatggaatgggatcgtgaaatcaataactacacttcacttatccactcacttattgaagaatcacaaaaccaacaagaaaaaaatgaacaagaattattaggtggatcaggtggatcaggtatcgttcaacaacaaaataatttacttcgtgctattgaagctcaacaacaccttttgcaacttacagtttggggtattaagcaacttcaagctcgtggttcatcaggtggttggatggagtgggaccgcgaaattaacaattataccagcttaattcacagtctgatcgaggaaagccagaatcagcaggaaaagaacgaacaggaacttctaggttcagactacaaggatgacgatgacaag-TAA-[XhoI]
克隆01编码的重组蛋白序列为SEQ ID No.3：
wmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellggsggsgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqargssggwmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellgsdykddddk
2：克隆02-pGEX6p-1-HR212-Strep II：克隆02以是以基础克隆91为基础，在HR212序列的C端加上Strep II标签；基因序列通过PCR完成。
引物：
cgGAATTC TGGATGGAATGGGATCGTGAAAT[正向引物]
ccgCTCGAGTTA CTTTTCGAATTGTGGGTGGCTCCATGCGCCGGCTAG[反向引物]
其中下划线表示酶切位点。
PCR：
正向引物+反向引物+基础克隆91 获得终产物(389bp)；Ta＝57℃
克隆：
使用酶切位点是EcoRI-XhoI，定向连于克隆pGEX6p-1上。
克隆02包含HR212编码序列的重组部分的最终序列(即，插入部分的核苷酸序列，未显示pGEX6p-1载体序列)：
pGEX6p-1--HR212-Strep II(SEQ ID No.6)
[EcoRI]-tggatggaatgggatcgtgaaatcaataactacacttcacttatccactcacttattgaagaatcacaaaaccaacaagaaaaaaatgaacaagaattattaggtggatcaggtggatcaggtatcgttcaacaacaaaataatttacttcgtgctattgaagctcaacaacaccttttgcaacttacagtttggggtattaagcaacttcaagctcgtggttcatcaggtggttggatggagtgggaccgcgaaattaacaattataccagcttaattcacagtctgatcgaggaaagccagaatcagcaggaaaagaacgaacaggaacttctagccggcgcatggagccacccacaattcgaaaag-TAA-[XhoI]
克隆02编码的重组蛋白序列为SEQ ID No.5：
wmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellggsggsgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqargssggwmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellagawshpqfek
3：克隆03-pGEX6p-1-Flag-HR212：克隆03以是以基础克隆91为基础，扩增出HR212序列的N端有Flag标签的部分；基因序列通过PCR完成。
引物：
cgGAATTC GGTTCAGACTACAAGGATGAC[正向引物]
ccgCTCGAGTTA TAGAAGTTCCTGTTCGTTCTT[反向引物]
其中下划线表示酶切位点。
PCR：
正向引物+反向引物+基础克隆91 获得终产物(389bp)；Ta＝52℃
克隆：
使用酶切位点是EcoRI-XhoI，定向连于克隆pGEX6p-1上。
克隆03包含HR212编码序列的重组部分的的序列(即，插入部分的核苷酸序列，未显示pGEX6p-1载体序列)：
pGEX6p-1--Flag-HR212(SEQ ID No.8)
[EcoRI]-ggttcagactacaaggatgacgatgacaagactagttggatggaatgggatcgtgaaatcaataactacacttcacttatccactcacttattgaagaatcacaaaaccaacaagaaaaaaatgaacaagaattattaggtggatcaggtggatcaggtatcgttcaacaacaaaataatttacttcgtgctattgaagctcaacaacaccttttgcaacttacagtttggggtattaagcaacttcaagctcgtggttcatcaggtggttggatggagtgggaccgcgaaattaacaattataccagcttaattcacagtctgatcgaggaaagccagaatcagcaggaaaagaacgaacaggaacttcta-TAA-[XhoI]
克隆03编码的重组蛋白序列为SEQ ID No.7：
gsdykddddktswmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellggsggsgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqargssggwmewdreinnytslihslieesqnqqekneqell
4：克隆04-pGEX6p-1-Flag-HR212-Strep II：克隆02以是以基础克隆91为基础，在Flag-HR212序列的C端再加上Strep II标签；基因序列通过PCR完成。
引物：
cgGAATTC GGTTCAGACTACAAGGATGACGAT[正向引物]
ccgCTCGAGTTA CTTTTCGAATTGTGGGTGGCTCCATGCGCCGGCTAG[反向引物]
其中下划线表示酶切位点。
PCR：
正向引物+反向引物+基础克隆91获 得终产物(425bp)；Ta＝57℃
克隆：
使用酶切位点是EcoRI-XhoI，定向连于克隆pGEX6p-1上。
克隆04包含HR212编码序列的重组部分的最终序列(即，插入部分的核苷酸序列，未显示pGEX6p-1载体序列)：
pGEX6p-1-Flag-HR212-Strep II(SEQ ID No.10)：
[EcoRI]-ggttcagactacaaggatgacgatgacaagactagttggatggaatgggatcgtgaaatcaataactacacttcacttatccactcacttattgaagaatcacaaaaccaacaagaaaaaaatgaacaagaattattaggtggatcaggtggatcaggtatcgttcaacaacaaaataatttacttcgtgctattgaagctcaacaacaccttttgcaacttacagtttggggtattaagcaacttcaagctcgtggttcatcaggtggttggatggagtgggaccgcgaaattaacaattataccagcttaattcacagtctgatcgaggaaagccagaatcagcaggaaaagaacgaacaggaacttctagccggcgcatggagccacccacaattcgaaaag-TAA-[XhoI]
克隆04编码的重组蛋白序列为SEQ ID No.9：
gsdykddddktswmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellggsggsgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqargssggwmewdreinnytslihslieesqnqqekneqellagawshpqfek
基础克隆91：是一个完全人工合成的HR212序列(由上海旭冠生物公司合成)；其N端有Flag序列，其序列为SEQ ID No.11：
GgttcagactacaaggatgacgatgacaagactagttggatggaatgggatcgtgaaatcaataactacacttcacttatccactcacttattgaagaatcacaaaaccaacaagaaaaaaatgaacaagaattattaggtggatcaggtggatcaggtatcgttcaacaacaaaataatttacttcgtgctattgaagctcaacaacaccttttgcaacttacagtttggggtattaagcaacttcaagctcgtggttcatcaggtggttggatggagtgggaccgcgaaattaacaattataccagcttaattcacagtctgatcgaggaaagccagaatcagcaggaaaagaacgaacaggaacttctaTAA
5：蛋白纯化
将上述重组克隆用标准化学法转化购自北京博迈德的E.coli BL21感受态细胞，在100ug/mL的氨苄青霉素平板上得到单个的阳性克隆后，接种于含有100ug/mL的氨苄青霉素的2*YT培养基中，37℃200rpm培养至OD600达到0.7时，再次按1/100(v/v)转接于新的含同样浓度的氨苄青霉素抗生素的2*YT培养中，37℃200rpm培养至OD到0.7时，降温至25℃，加入IPTG(购自sigma)至终浓度1mM，25℃诱导表达4小时，7000g，4℃离心收集菌体，经超声破碎后，用标准的GST亲和层析纯化蛋白(GST柱构于GE healthcare，按其标准程序)后，用鼻蛋白3C酶(购于北京义翘神州生物技术有限公司)酶切后，经GST柱再次亲和层析以及分子筛纯化后，用bioRAD的蛋白定量，冷冻保存于-20℃。
6：假病毒功能的测定
将纯化的蛋白用millipore的0.22um滤器除菌后，备用。
HIV-1假病毒的制备。使用大提质粒试剂盒(N001，购自威格拉斯)纯化HIV假病毒包装质粒pMT-HXB2-env，pNL4-3.Luc.R-E-(两种质粒购自美国NIH)，转染前24小时，消化293T细胞(购自中国科学院细胞库)并传代至10cm培养皿中，浓度为4-5*106个细胞/培养皿。24小时后细胞大约80％时，用两种质粒各12ug，转染试剂为PEI 48ug(购自Sigma-Aldrich)共转染293T细胞，6小时后换DMEM培养基(购自Gibco)。48小时后收集培养基上清，上清内含HIV-1假病毒。
消化GHOST-CXCR4细胞(细胞购自美国NIH)传代至24孔板(购自美国corning公司)中。等细胞密度达到80％时，将上述蛋白分别2倍梯度稀释后分别与等量的HIV-1假病毒(制备方法见前述)(Deng，1997)混合，同时以GST蛋白为阴性对照。然后将这种蛋白病毒混合物分别加入到GHOST-CXCR4细胞中，2h后，吸弃病毒和蛋白的混合物，加入新鲜培养基(DMEM，90％；胎牛血清，10％；G418，500μg/ml；潮霉素，100μg/ml；嘌呤霉素，1μg/ml)继续培养，每个稀释度做3个重复，48-72后收获并裂解细胞，通过测定细胞上清中萤火虫荧光酶的活性来计算这培养液的阻断HIV-1gp41介导的膜融合。
实验结果
表1：不同标签对HR212病毒抑制效果的影响
从表1的结果可以看出，在HR212的未端添加不同的标签，对其功能有一定的影响，其中在羧基端添加Flag或Strep II标签，对其活性影响较小。原始的HR212假病毒抑制活性也是10nM。
实施例2：HR212使用不同长度的接头时的假病毒效果
实验设计：在HR2(SEQ ID No.34)与HR1(SEQ ID No.33)之间的接头，其长度可能影响到真核细胞表达的蛋白的膜转位能力，本实施例分别用了不同长度的接头组合形式，构建真核表达载体，大提并纯化质粒后，转染Hela细胞，收集上清做假病毒抑制实验，用来比较不同接头对HR212功能的影响。实验的组合型式如下：
克隆05：HR212-5-5：HR2-link05a-HR1-link05b-HR2-Flag
克隆06：HR212-15-5：HR2-link15a-HR1-link05b-HR2-Flag
克隆07：HR212-5-15：HR2-link05a-HR1-link15b-HR2-Flag
克隆08：HR212-15-15：HR2-link15a-HR1-link15b-HR2-Flag
其中link表示接头，其氨基酸序列分别如下：
Link05a：ggstg(SEQ ID No.12)
Link05b：tssgg(SEQ ID No.14)
Link15a：ggstgsggsggsgsg(SEQ ID No.16)
Link15b：ggsggssggtssgg(SEQ ID No.18)
上述接头的编码核苷酸序列分别如SEQ ID Nos.13，15，17，和19所示。
实验内容：
1：克隆05：
克隆05是将信号肽序列是一个构建于pcDNA3.0(购自Invitrogen)上的真核外分泌表达克隆，其由信号肽38sp(完全合成，SEQ ID No.20)，HR2，link05a，HR1，link05b，HR2，Flag标签组成。其全部序列是通过基于2A的真核的筛选体系得到的(该筛选体系将在后附的补充实施例1中详细描述)，克隆05序列如下：
其中涉及的元件有：
信号肽38sp：mwwrlwwllllllllwpmvwamns(氨基酸序列为SEQ ID No.20)
HR2：wmewdreinnytslihslieesqnqqekneqell(SEQ ID No.34)
Link05a：ggstg(SEQ ID No.12)
Link05b：tssgg(SEQ ID No.14)
HR1：sgivqqqnnllraieaqqhllqltvwgikqlqar(SEQ ID No.33)
Flag：gsdykddddk(SEQ ID No.23)
克隆05插入部分的完整序列为SEQ ID No.22：
Atcgatgccgccatgtggtggagactctggtggttattgctgctgctgctgctgctgtggccaatggtgtgggcaatgaactcatggatggaatgggatcgggagattaacaattacacaagcctgatccacagtctcattgaggaatctcagaatcaacaagaaaagaacgaacaggaactactcggaggttctaccggtagcggcatcgttcaacaacagaacaatctgcttagggctattgaggcacagcaacatctcctccaacttactgtgtggggaatcaaacaattgcaggcacgtacgagtagcggaggttggatggaatgggacagagagattaacaattacacaagcctgatccactcactcattgaggaatcccagaaccaacaggagaagaacgaacaggaattgctcggaagcgattacaaggatgacgacgataagtaatctaga，5’端的酶切位点是ClaI，3’端的酶切位点是XbaI。该序列通过这两个位点连接在改造过的pcDNA3.0re上(即，基础克隆92，其构建方法见下文详述)。
2：克隆06：
克隆06由克隆05经由如下一对引物退火后，
p-15-5FP：ccggttctggaggttctggcggatctggtt
p-15-5RP：ccggaaccagatccgccagaacctccagaa
连接于经过AgeI酶切的克隆05上，经过CMV引物测序验证插入位点的正确。
插入后克隆05的link05a序列变为的link15a，其氨基酸序列为：ggstgsggsggsgsg，
克隆06的位于Cla I与XbaI酶切位点之间的插入部分的核酸序列为SEQ ID No.24：
atcgatgccgccatgtggtggagactctggtggttattgctgctgctgctgctgctgtggccaatggtgtgggcaatgaactcaggtacctggatggaatgggatcgggagattaacaattacacaagcctgatccacagtctcattgaggaatctcagaatcaacaagaaaagaacgaacaggaactactcggaggttctaccggttctggaggttctggcggatctggttccggtagcggcatcgttcaacaacagaacaatctgcttagggctattgaggcacagcaacatctcctccaacttactgtgtggggaatcaaacaattgcaggcacgtacgacgagtagcggaggttggatggaatgggacagagagattaacaattacacaagcctgatccactcactcattgaggaatcccagaaccaacaggagaagaacgaacaggaattgctcggtagcgctggaagcgattacaaggatgacgacgataagtaatctaga
3：克隆07：HR212-5-15
克隆07由克隆05经由如下一对引物退火后，
p-5-15FP：gtacgggaggttcaggtggatcaagcggag
p-5-15RP：gtacctccgcttgatccacctgaacctccc
连接于经过BsiWI酶切的克隆05上，经过CMV引物测序验证插入位点的正确。
插入后克隆05的Link05b序列变为Link15b’，其氨基酸序列为：tggsggssggtssgg。
克隆07位于Cla I与XbaI酶切位点之间的插入部分的核酸序列为SEQID No.25：
Atcgatgccgccatgtggtggagactctggtggttattgctgctgctgctgctgctgtggccaatggtgtgggcaatgaactcaggtacctggatggaatgggatcgggagattaacaattacacaagcctgatccacagtctcattgaggaatctcagaatcaacaagaaaagaacgaacaggaactactcggaggttctaccggtagcggcatcgttcaacaacagaacaatctgcttagggctattgaggcacagcaacatctcctccaacttactgtgtggggaatcaaacaattgcaggcacgtacgggaggttcaggtggatcaagcggaggtacgagtagcggaggttggatggaatgggacagagagattaacaattacacaagcctgatccactcactcattgaggaatcccagaaccaacaggagaagaacgaacaggaattgctcggtagcgctggaagcgattacaaggatgacgacgataagtaatctaga
4：克隆08
克隆08由克隆06经由如下一对引物退火后，
p-5-15FP：gtacgggaggttcaggtggatcaagcggag
p-5-15RP：gtacctccgcttgatccacctgaacctccc
连接于经过BsiWI酶切的克隆05上，经过CMV引物测序验证插入位点的正确。
插入后克隆06的Link05b序列变为Link15b”，其氨基酸序列为：tggsggssggtssgg
克隆08位于Cla I与XbaI酶切位点之间的插入部分的核酸序列为SEQID No.26：
atcgatgccgccatgtggtggagactctggtggttattgctgctgctgctgctgctgtggccaatggtgtgggcaatgaactcaggtacctggatggaatgggatcgggagattaacaattacacaagcctgatccacagtctcattgaggaatctcagaatcaacaagaaaagaacgaacaggaactactcggaggttctaccggttctggaggttctggcggatctggttccggtagcggcatcgttcaacaacagaacaatctgcttagggctattgaggcacagcaacatctcctccaacttactgtgtggggaatcaaacaattgcaggcacgtacgggaggttcaggtggatcaagcggaggtacgagtagcggaggttggatggaatgggacagagagattaacaattacacaagcctgatccactcactcattgaggaatcccagaaccaacaggagaagaacgaacaggaattgctctaatctaga
基础克隆92-pcDNA3.0re的构建方法：
pcDNA3.0re是一个改造后的pcDNA3.0载体，在载体pcDNA3.0(购自Invitrogen)上加入了ClaI位点，并且将EcoRI位点移到加尾信号的后面。改造方法如下：
删除EcoRI位点，Klenow片段补平之后，连接，再用四个引物4条引物为：
A：EcoR-Xba-FP GCATCTAGAGGGCCCTATTCT
B：EcoR-GAA-RP cgcctcagaattcgccatagagcccaccgcatc
C：EcoR-GAA-FP CTATGGCGAATTCTGAGGCGGAAAGAACCAGC
D：EcoR-Sma-RP TCCCGGGAGCTTTTTGCAAAAG
利用引物A和B进行PCR，模板为pCDNA3.0，扩增出298bp，回收，
利用引物C和D进行PCR，模板为pCDNA3.0，扩增出836bp，回收，
用上述两个PCR的胶回收片段为底物，用引物A，引物D PCR扩增，回收(1282bp)长底的片段。
连T载体，转化，选克隆，测序，选定用XbaI，SmaI双酶切，连接于XbaI，SmaI双酶切的载体pcDNA3.0上，即可获得pcDNA3.0re。
以下是经过改造后的pcDNA3.0re的序列(SEQ ID No.35)：
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttgccgccatgtggtggagactctggtggttattgctgctgctgctgctgctgtggccaatggtgtgggcaatgaactcatggatggaatgggatcgggagattaacaattacacaagcctgatccacagtctcattgaggaatctcagaatcaacaagaaaagaacgaacaggaactactcggaggttctggtggaagcggcatcgttcaacaacagaacaatctgcttagggctattgaggcccagcaacatctcctccaacttactgtgtggggaatcaaacaattgcaggcaagaggaagtagcggaggttggatggaatgggacagagagattaacaattacacaagcctgatccactcactcattgaggaatcccagaaccaacaggagaagaacgaacaggaattgctcggaagcgattacaaggatgacgacgataagtgatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcgaattctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc
5：质粒大提，以及转染
将正确的克隆05，06，07，08，使用大提质粒试剂盒(N001，购自威格拉斯)纯化质粒后，用PEI(购自Sigma-Aldrich)转染到hela细胞(每10cm培养皿加入PEI 2mg/ml 60ul，上述纯化的质粒24ug)，转染36小时后收上清，用实施例1中的假病毒功能的测定方法测定其病毒抑制活性。
实验结果
表2：不同接头下真核表达的HR212的假病毒抑制活性
从结果看，添加不同长度的接头对于HR212的功能影响差别较小。
实施例3：使用GPI锚定以及非锚定表达的效果
实验设计：在克隆06的HR2基因后面加上GPI锚定序列，比较使用锚定序列与不使用锚定序列时，其外分泌蛋白以及膜上蛋白对于HIV病毒入侵的抑制能力。
克隆09：HR212-GPI：HR2-link05-HR1-link05-HR2-Flag
实验内容：
1：制备克隆09：
合成如下NewHR2段-Flag-GPI
Cgtacgggaggttcaggtggatcaagcggaggttggatggagtgggacagagagattaataactacaccagcctgattcactcactcatcgaagagtcccagaaccaacaggagaagaatgagcaggaattgctcggtagcgctggaagcgattacaaggatgacgacgataagggaggttctccccccgccggcaccaccgacgccgcgcatccggggcggtccgtggtccccgcgttgctgcctctgctggccgggaccctgctgttgctcgagacggccactgctcccggaggttctgctccagctaagc
酶切位点是BsiWI-BlpI，将它连接于用同样的酶进行酶切的克隆05上，形成新的克隆。新的克隆增加了GPI锚定序列，其氨基酸序列如下：ppagttdaahpgrsvvpallpllagtlllletatap(SEQ ID No.30)
2：克隆05，09小环型DNA的制备。
将克隆05和09用SpeI和EcoRI双酶切，连接在载体pMC-BESPX-MCS2小环载体(购于System Biosciences，Inc.，质粒图谱见图4)，用CMV，bGH引物测序正确后，转化于ZYCY10P3S2T E.coli菌株中(购于System Biosciences，Inc.)，按该公司标准程序，在含卡那霉素50μg/ml的LB培养基中，在30℃初步扩增2小时后，再在400ml体系用TB培养基中，30℃，250rpm扩增后24小时后，用400ul 20％的L-阿拉伯糖(购自上海惠诚生物科技有限公司标准品)以及1.0ml 10N HaOH诱导5.5小时，其温度与转速不变。收集菌体，用标准大提质粒的试剂(威格拉斯N001)分离小环DNA，用PEI转化Hela细胞，转化方法为(PEI每10cm培养皿60ul，小环DNA24ug)转化36小时后，取上清，用实施例1中的假病毒功能的测定方法测定其病毒抑制活性。测定结果如下表3所示。
表3：锚定与非锚定方式表达的HR212细胞上清的功能比较
克隆05和克隆09都能有效抑制HIV-1病毒的感染，但没有统计上的显著差别。
3：细胞锚定形式HR212的抑制HIV感染效果
将GHOST细胞转染上述两种小环DNA，感染36小时后，PBS清洗细胞，并更换培养基(DMEM+10％FBS)，同时用HIV假病毒感染该GHOST细胞，48小时后测定荧光素酶活性。结果如下：
表4：锚定与非锚定方式表达的HR212细胞功能比较
克隆05和克隆09都能有效抑制HIV-1病毒的感染，但锚定方式下其抑制效果显著高于非锚定方式(P＞0.05)。
4：细胞锚定表达的时间稳定性
将上述实验2克隆09的转染于Hela细胞的上清，分别于第2天取样，第3天换液后，第5天取样，第6天换液后，第8天取样，第9天换液后，第11天取样，取样的上清冻于-80度，全部样品取样束后，通过假病毒实验来测其病毒抑制效果，按阳性对照计算抑制率，结果参见图1。
图1的结果显示，转染的HR212-GPI质粒(即克隆09)，在7天内能维持半数的病毒抑制能力。
实施例4：小环型DNA重组载体在小鼠体内的表达效果
将实施例3制备的克隆06和09的小环型DNA重组载体，采用小鼠尾静脉高压注射方式，分别注射到随机分组的雌性BALB/c小鼠(购自中国医科大学实验动物中心，日龄45天)，每只用量100ug，用800-200ulPBS溶解。每只注射量体积按体重的1.5％。分别于第2，5，8，11日采全血，同样用假病毒实验检测其血清对于HIV病毒的抑制能力。按抑制率比较两者对于HIV病毒的抑制效果。结果见图2。
图2的结果显示，以锚定方式表达的质粒(即克隆09)，于第5天过到最高峰后，下降比较缓慢。而用非锚定表达的方式(即克隆06)，病毒达到高峰快，下降速度也高。但都能在一周内维持其半数抑制能力。
补充实施例1：基于2A的GFP筛选体系对于HR212序列的筛选
为了寻找适合的表达HR212蛋白的核酸序列以及相关表达元件，我们构建了基于2A的GFP筛选系统。图5表示了这一个筛选平台的原理。由于2A具有自剪切能力，在融合蛋白表达时，当HR212部分跨膜后，2A剪切使得GFP部分留于细胞膜内。这样，可以通过流式细胞对GFP荧光强度中绿光与红光的差异的筛选，来找到适合于外分泌的HR212的核酸序列。
载体的构建：序列中合成的序列以及PCR扩增的两段组成
第一段：全合成如下序列
Atcgatgccgccatgtggtggagactctggtggttattgctgctgctgctgctgctgtggccaatggtgtgggcaatgaactcatggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattgggaggttctaccggttctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagacgtacgtggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattgggaagcgattacaaggatgacgacgataaggctccagctaagcaacttcttaatttcgatcttcttaagcttgctggtgatgtggagagcaatccaggtccagctagc
其内部含有信号肽序列，HR212的原始核酸序列，2A剪切位点以及两侧的酶切位点ClaI，Nhe I，
第二段PCR扩增的是含有GFP基因序列
GFP上游：GCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
GFP下游：TCTAGATTATTACTTGTACAGCTCGT
扩增底物是在pEGFP-N1载体(购自ClonTech)。扩增后的片段带有eGFP基因。
将上述第一段用ClaI，NheI酶切，第二段用NheI，XbaI酶切，产生的两个片段，连于用ClaI，XbaI双切的改造过的pcDNA3.0re(基础克隆92)。就形成了筛选用的载体克隆10(SEQ ID No.32)。
分别使用易错PCR以及定点突变等方法，通过流失比较黄色与绿色光的差异，筛选其中容易分泌到膜外的细胞，经PCR扩增后测序，寻找不改变HR212氨基酸序列的克隆。其中一个易于实现外分泌的序列是克隆05；其用Western Blot方法检测在293T，3T3细胞中表达的情况如图6所示。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
参考文献：
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4.Barouch，D.H.(2008).″Challenges in the development of an HIV-1vaccine.″Nature 455(7213)：613-9.
Claims (8)
1.能真核外分泌表达HIV-1膜融合抑制蛋白HR212的小环型DNA重组载体，其包含编码HR212蛋白的核苷酸序列和小环DNA载体，
其中骨干序列是编码HR212蛋白的核苷酸序列，所述HR212蛋白是由HIV-1的一个氨基端七肽重复序列以及两个羧基端的七肽重复序列构成的三螺旋蛋白，其排列顺序为：
NH2HR2-linker1-HR1-linker2-HR2COOH，
其中HR1的氨基酸序列如SEQ ID No.33所示，HR2的氨基酸序列如SEQ ID No.34所示，
其中linker表示接头序列，linker1和linker2所示的两个接头的氨基酸序列独立地选自SEQ ID Nos.12，14，16，和18，
其中在HR212蛋白的N端具有信号肽38sp，其氨基酸序列所SEQ IDNo.20所示，
其中所述小环型DNA重组载体通过将选自SEQ ID Nos.22和24-26的任一种核苷酸序列经由限制性酶切插入到小环DNA载体中构建而成。
2.根据权利要求1的小环型DNA重组载体，其中HR212蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1的小环型DNA重组载体，其还在HR212蛋白的氨基端和/或羧基端添加标签序列Flag或Strep II标签。
4.根据权利要求1的小环型DNA重组载体，其还带有细胞外膜锚定蛋白GPI，其氨基酸序列如SEQ ID No.30所示。
5.根据权利要求4的小环型DNA重组载体，所述重组载体通过将SEQ ID No.29所示的核苷酸序列经由限制性酶切插入到小环DNA载体中构建而成。
6.根据权利要求1的小环型DNA重组载体，其中所述小环DNA载体为pMC-BESPX-MCS2。
7.根据权利要求1-6中任一项的小环型DNA重组载体在制备用于抗HIV-1的感染的基因治疗剂中的应用。
8.一种阻断HIV-1膜融合过程的小环型DNA基因治疗剂，其包括根据权利要求1-6中任一项的小环型DNA重组载体作为活性成分。
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