CN103288925A - 一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法，所述蜂毒肽反序类似物的氨基酸序列为RKRKRWSILAPLG。蜂毒肽反序类似物的制备方法包括取料、反应、纯化、质谱分析鉴定等步骤。本发明蜂毒肽反序类似物及其制备方法提高抑菌活性。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，具体地说是一种蜂毒肽（Melittin）反序类似物及其制备方法。
背景技术
抗菌肽以其高效、广谱、快速、特异性作用及抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性且对真核细胞低毒的特性，成为具有重要潜在价值的新型药物。在传统抗生素面临病原菌耐药性不断提高的今天，抗菌肽的出现，无疑成为有价值的新型抗菌药物而受到人们的重视。最大限度地发挥其活性和降低毒性，是抗菌肽新药开发的首要问题。用分子设计手段改造抗菌肽已成为解决这一问题的关键。以两亲α-螺旋抗菌肽为对象，对分子设计过程中遵守阳离子性和两亲性的原则及影响活性的物理化学参数，可以采取序列修饰或全新设计的方法，以达到定向改造的目的。
抗菌肽在序列和结构上表现出多样性，但其分子设计都有2个共同的要求，即阳离子性和两亲性。前者决定其选择性，即能特异地跟显负电性的细菌细胞膜外表面相互吸引，而不与呈中性的真核生物细胞膜外表面产生相互作用。这就是它们对哺乳动物细胞没有毒害作用的主要原因，后者决定其能否有效插入细菌细胞膜内，形成疏水通道。
蜂毒肽是意大利蜂（Apismellifera）毒液的主要活性成分，由26个氨基酸组成，一级结构为：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-COOH，蜂毒肽能够形成两亲性的α-螺旋结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端（KRKR），是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。蜂毒肽对钙调素具有很高的亲和作用，根据钙调素可结合多肽结合部位的模型，预测并通过实验证明，蜂毒肽与钙调素的结合部位为12～26片段Mel(12～26)，并发现此片段仍保留一定的抗菌活性，但溶血活性消失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法，其提高抑菌活性。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物的氨基酸序列为RKRKRWSILAPLG。
优选地，所述蜂毒肽反序类似物为采用固相化学合成技术合成的多肽产品。
本发明还提供一种蜂毒肽反序类似物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
（1）将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；
（2）精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL
DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin
两次；
（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；
（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得肽树脂；
（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；
（17） NH4HCO3
自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml 的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；
（18）将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，并得到蜂毒肽反序类似物；
（19）将纯化并经质谱分析鉴定合格的蜂毒肽反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
本发明的积极进步效果在于：本发明在动物消化道中具有良好稳定性，同时具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌甚至能够杀真菌、原虫且不产生耐药性菌株等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。
附图说明
图1是固相化学合成的蜂毒肽（Melittin）反序类似物的质谱分析图，经分析测得反序肽的分子量与理论值相符合；
图2是蜂毒肽（Melittin）反序类似物对金黄色葡萄球菌的抗菌实验结果，图中： 1表示氨苄青霉素的抗菌活性；2为阴性对照ddH2O；3、4、5、6、7为1mg/ml的反序肽的抗菌活性。
具体实施方式
一、蜂毒肽（Melittin）反序类似物的固相化学多肽合成反应
我们设计并合成了具有不同碱性氨基酸残基数和不同疏水性片段链长的基于Mel(12～26)的系列反序肽类似物，结果表明，反序肽的正电荷和疏水性对于抑菌活性都很重要，N端至少保留3个碱性氨基酸(正电荷>4)和C端的疏水性片段的链长至少为8个氨基酸残基的类似物具有较高的抑菌活性，这些反序肽的溶血活性都很小。
根据蜂毒肽（Melittin）的核心功能序列，将Melittin(12～24)的反向序列：RKRKIWSILAPLG-COOH中的第五位的I替换为R，增加一个碱性氨基酸从而进一步增强正电性，同时保持C端的8个疏水性氨基酸不变，其氨基酸序列为：RKRKRWSILAPLG-COOH，该反序肽分子N端带有正电荷，能够与带负电荷的细胞膜结合，C端的疏水氨基酸形成α-螺旋结构，能够在细胞膜表面穿孔，从而导致细菌死亡。该反序肽摒弃了蜂毒肽的溶血活性，其抗菌活性和稳定性均优于单一蜂毒肽分子。该反序肽经过杀菌活性检测，对Gram+菌、Gram—菌及真菌等均有明显的抑制作用，而且溶血活性很小。
蜂毒肽（Melittin）反序类似物的氨基酸序列为RKRKRWSILAPLG，蜂毒肽反序类似物为采用固相化学合成技术合成的多肽产品。琼脂空穴扩散法测得蜂毒肽（Melittin）反序类似物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、铜绿假单胞菌、猪伤寒沙门氏菌四种细菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibition
concentration,MIC)分别为0.5、1、1和1μg·mL-1，在抑菌浓度范围内未表现出溶血活性。获得了一种具有较高抗菌活性且安全无毒的新型抗菌肽，为研究开发理想的新型抗菌肽分子提供了新的思路。本发明为抗菌肽产品的研发和应用提供新的思路，可以广泛应用于抗感染药品、化妆品和畜牧业健康养殖等领域。
采用Fmoc保护的氨基酸固相合成法，以Rink
Amide MBH树脂作载体，
HBTU/HOBt作缩合剂，肽从树脂上的切割试剂为三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1,2-二巯基乙醇（体积比8∶0. 5∶0. 5∶0. 5∶0. 25），于室温反应4~6 h，旋转蒸发除去大部分三氟乙酸后，在0℃滴加乙醚得絮状沉淀，离心后得粗肽，用Sephadex G-15柱初步分离，柱用5%醋酸平衡，上样后在流速为1 mL/min下用5%醋酸洗脱， 280 nm检测，收集第一个峰，冷冻干燥。用半制备型高效液相色谱仪进行纯化，收集丰度最大峰。多肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)和氨基酸分析确定。蜂毒肽（Melittin）反序类似物的制备方法的具体操作步骤如下：
（1）取料，将存放于冰箱中的原料试剂（如：氨基酸、乙醚、苯酚等试剂）取出，置于干燥器中复温待用；
（2）精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF（Dimethyl Fumarate，富马酸二甲酯）冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL
DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin
两次；
（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；
（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得Peptide-Resin（肽树脂）；
（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1（体积比）的比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；
（17） NH4HCO3 自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3（pH8.2）溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml
的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜。之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；
（18）将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定（具体如后面的“二、 蜂毒肽（Melittin）反序类似物的反向高效液相色谱纯化及质谱鉴定”所述），并得到蜂毒肽（Melittin）反序类似物；
（19）将纯化并经质谱分析鉴定合格的蜂毒肽（Melittin）反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
二、 蜂毒肽（Melittin）反序类似物的反向高效液相色谱纯化及质谱鉴定
在高效液相色谱仪进行纯化，使用Hypersil BDS C18 反相柱(300 Ǻ, 5 μm, 4.6 mm×300
mm)。将氧化后的粗肽样品溶于2mL 超纯水中，10000g离心5min，加载到已用Buffer A（0.1%TFA）平衡好的反相柱上。用Buffer B（含 0.1% TFA 的乙腈）梯度洗脱（表1）。流速为 1 ml/min，215
nm及254nm双通道检测，收集洗脱峰，用MOLDI-TOF质谱分析，鉴定结果见图1，质谱分析的突变体的分子量与理论值相符合。将纯化的样品用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。粗肽的纯度通过分析型高效液相色谱(C18)和氨基酸分析确定。
表1 反相高效液相色谱洗脱梯度
A:
0.1%TFA B: 乙腈（含0.1% TFA）
| 时间(min) | 流速(ml/min) | A﹪ | B﹪ | 曲线 |
| ﹡ | 1 | 95 | 5 | ﹡ |
| 28 | 1 | 5 | 95 | 6 |
| 29 | 1 | 5 | 95 | 6 |
三、蜂毒肽（Melittin）反序类似物的抗菌活性检测
3.1蜂毒肽（Melittin）反序类似物的抗菌活性测定：
琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸取60 μL的生测菌（OD600＝0.3），加入20 mL琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9 cm的无菌平面皿内，厚度约为1.5 mm，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2.7 mm的圆孔，分别在孔中加入已纯化的蜂毒肽（Melittin）反序类似物样品各10μL，用无菌水做阴性对照，用Amp做阳性对照。加样后将平皿放入4℃冰箱中，待样品充分扩散到琼脂后，将平皿倒置于37℃培养过夜，次日观察结果如图2所示。本试验中供试细菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）。
3.2 蜂毒肽（Melittin）反序类似物最小抑菌浓度（MIC）的测定
MIC：将测试菌株培养至对数生长期的菌液稀释为约5×106CFU/mL，加入96孔培养板中，测试孔每孔加入菌液90uL，然后加入倍比稀释的不同浓度的反序肽溶液，10uL/孔。阳性对照为100uL/孔的菌液，阴性对照为相应的100uL培养基。然后于37℃慢摇培养约16h，用酶标仪测OD630。抑制细菌生长的最低浓度即为MIC，结果见表2。
表2 蜂毒肽（Melittin）反序类似物的 MIC
| 菌株 | MIC (ug/mL) |
| 金黄色葡萄球菌 | 0.5 |
| 大肠杆菌K12D31 | 1 |
| 铜绿假单胞菌 | 1 |
| 猪伤寒沙门氏菌 | 1 |
| 溶血葡萄球菌 | 2 |
| 大肠埃希菌 | 4 |
| 腐生葡萄球菌 | 4 |
| 沃氏葡萄球菌 | 5 |
| 尿肠球菌（耐药） | 5 |
| 摩根氏菌 | 40 |
| 创伤弧菌 | 150 |
3.3溶血活性实验
将人血红细胞用PBS缓冲液(35mmol/L磷酸盐缓冲液，含150 mmol/L NaCl，pH=7.4)洗4次后悬浮在PBS缓冲液中，得血红细胞悬浮液(体积分数2.5% )。将反序肽溶解在PBS缓冲液中，配成储备液，取不同体积的多肽储备液于0.5 mL 2.5%血红细胞悬浮液中，补加PBS缓冲液至终体积1 mL，摇匀，于37℃保温60min后，以4000r/min离心10 min，取上清夜在414 nm下比色，以血红细胞悬浮在PBS缓冲液中为空白，以血红细胞悬浮在TritonX 100中为100%溶血。经试验检测，制备的反序肽无明显溶血活性。
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改型和改变。因此，本发明覆盖了落入所附的权利要求书及其等同物的范围内的各种改型和改变。
< 110> 广州格拉姆生物科技有限公司
< 120> 一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法
< 160> 1
< 210> 1
< 211> 25
< 212> PRT
< 213> 人工序列
< 220>
< 222>（1）…（13）
< 400> 1
Arg
Lys Arg Lys
Arg Trp Ser
Ile Leu Ala
Pro Leu Gly
1 5 10
Claims (3)
1.一种蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物的氨基酸序列为RKRKRWSILAPLG。
2. 根据权利要求1所述蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物为采用固相化学合成技术合成的多肽产品。
3. 一种蜂毒肽反序类似物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
（1）将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；
（2）精确称量Fmoc-AA-Resin
0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin 两次；
（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；
（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得肽树脂；
（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；
（17） NH4HCO3
自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml 的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |