CN103285123B - 黄皮果提取物在防治药源性肝炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄皮果提取物的制备方法和黄皮果提取物在防治药源性肝炎药物中的应用。本发明的黄皮果提取物的制备方法，包括以下步骤：（1）取晒干的芸香科黄皮属植物有核黄皮的果实，去核，粉碎，过40目筛，得到黄皮果粉末；（2）用乙醇浸泡上述黄皮果粉末，连续回流提取5次；（3）过滤，合并滤液，离心，取上清液浓缩，然后再用正己烷萃取3次，每次正己烷萃取后分去上层萃取液，取下层液体挥去正己烷，然后浓缩；（4）真空干燥成浸膏即得黄皮果提取物。本发明制备的黄皮果提取物可以应用在防治药源性肝炎的药物中，作为一种防治药源性肝炎的新方法，可以有效缓解药源性肝炎的发病，对防治肝纤维化有较好的效果。

Description

黄皮果提取物在防治药源性肝炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及黄皮果的新用途，具体涉及黄皮果提取物的制备及在制备防治药源性肝炎药物中的应用。

背景技术

药源性肝损害(drug induced liver injury,DILI)是指药物和(或)化学物质经呼吸道、消化道或静脉等途径进入人体而导致的肝脏损害。近年来,药物性肝损害的发病率呈上升趋势。肝脏是药物在人体内代谢最主要的场所,在药物代谢过程中起着十分重要的作用。绝大多数药物在此进行聚合、氧化、还原、羟基化以及去甲基化等一系列的代谢过程,从而在全身诸个脏器发挥效应。因此,肝脏是最易遭受药物影响造成损害的器官。据统计,有1000余种药物可能导致肝损害,其中抗肿瘤药、抗结核药发生肝损害所占比例较高，药源性肝损害占药物不良反应的10%-15%,抗结核药联合应用时,肝损害的发生率可高达15%-30%。普遍认为,药源性肝炎的发生机制与细胞色素P450酶系或机体免疫系统相关，某些药物经细胞色素P450酶系生物转化后,活化产生毒性物质如亲电子基、自由基、氧自由基等,与蛋白质、核酸、脂质等大分子物质共价结合或发生脂质过氧化,最终导致肝细胞坏死。

芸香科黄皮属植物黄皮（Clausena lansium）具有很高的药用价值，其果、叶、种等均可入药，过去的研究发现黄皮叶和黄皮果核中含有黄皮酰胺类化合物有保肝、促智的作用。但将黄皮果提取物用于制备防治药源性肝炎的药物还未见报道。

发明内容

本发明提供一种黄皮果提取物的制备方法，制得的黄皮果提取物可以应用于制备防治药源性肝炎的药物。

本发明还提供一种防治药源性肝炎的药物，可以有效缓解药源性肝炎的发病，尤其对防治肝纤维化具有重要作用。

本发明还提供黄皮果提取物在防治药源性肝炎药物中的应用，开辟了药源性肝炎治疗的新方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种黄皮果提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取晒干的黄皮果，去核，粉碎，过40目标准筛，得到黄皮果粉末；

（2）用乙醇浸泡上述黄皮果粉末，连续回流提取5次；

（3）过滤，合并滤液，离心，取上清液浓缩，然后再用正己烷萃取3次，每次正己烷萃取后分去上层萃取液，取下层液体挥去正己烷，然后浓缩；

（4）真空干燥成浸膏即得黄皮果提取物。

进一步地，所述第（3）步骤与第（4）步骤之间还进行如下步骤：通过大孔树脂吸附，采用适度乙醇和双蒸水梯度洗脱，然后将洗脱液浓缩。

进一步地，所述第（2）步骤中，选用浓度为70～80%乙醇，乙醇用量是5倍黄皮果粉末重量，浸泡时间为12-14h，回流时间是每次1.5h。

再进一步，离心的转速是3000rpm/min，离心时间为10min。

更进一步，所述第（3）步骤中，上清液浓缩至相对密度1.15-1.35。

进一步地，所述的黄皮果提取物的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：（5）采用紫外分光光度法测定黄皮果提取物中的总黄酮（以芦丁计），总酚酸（以没食子酸计）及总还原糖（以葡萄糖计）含量，选用总黄酮含量≥4.50%，总酚酸含量≥10.80%且还原糖含量≥12.00%的黄皮果提取物。

一种黄皮果提取物，其特征在于，通过权利要求1～6任一所述的黄皮果提取物的制备方法得到。

作为一种应用，本发明是对所述的黄皮果提取物在防治药源性肝炎药物中的应用。

一种防治药源性肝炎的药物，其特征在于，包括药物成分和制药辅料，所述药物成分选用上述制备得到的黄皮果提取物。

进一步地，所述的防治药源性肝炎的药物，其特征在于，所述防治药源性肝炎的药物制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了去核黄皮果提取物在防治药源性肝炎的新用途，为防治药源性肝炎提供了一种新的方法。采用本发明的黄皮果提取物及由该黄皮果提取物制成的药物，可以有效缓解药源性肝炎的发病，对防治肝纤维化取得了较好的效果。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1黄皮果提取物的制备：

取黄皮果干品，去核，粉碎，过40目筛，备用。取适量，置2000mL圆底烧瓶中，加入5倍药材重量的70-80%乙醇浸泡12-14h，回流提取5次，每次1.5h，过滤，合并滤液，3000rpm/min离心10min，取上清浓缩至相对密度1.15-1.35，用等体积正己烷进行萃取3次，发明人分别考察了黄皮果提取物正己烷萃取部分和剩余部分的体外抗氧化活性及对体内药源性肝损伤的疗效发现：正己烷部分对体外肝细胞无保护作用，且体内对抗结核药物引起的急性肝损伤无治疗效果。因此，正己烷萃取3次都是分去上层萃取液（正己烷萃取部分），下层液体（剩余部分）挥去正己烷后，浓缩至相应体积，通过大孔树脂吸附，采用适度乙醇和双蒸水梯度洗脱，洗脱液浓缩，并真空干燥成浸膏即为黄皮果提取物。采用紫外分光光度法测定黄皮果提取物中的总黄酮（以芦丁计），总酚酸（以没食子酸计）及总还原糖（以葡萄糖计）含量，选用总黄酮含量≥4.50%，总酚酸含量≥10.80%且还原糖含量≥12.00%的黄皮果提取物。

实施例2黄皮果提取物对H₂O₂致人胎肝细胞L-02损伤的保护作用

1、实验材料

人胎肝细胞株L-02：购自中南大学湘雅中心实验室；

甲基噻唑蓝(MTT)：购自广州威佳科技有限公司；

Annexin V-FITC试剂盒：购自碧云天生物技术研究所；

磷酸盐缓冲液（PBS）：购自广州威佳科技有限公司；

黄皮果提取物：按实施例1的制备方法制备，以蒸馏水作溶剂，配成含生药1g/L的母液，4℃保存备用。

2、实验方法

（1）细胞分组

人胎肝细胞L-02细胞用1640培养基(内含10%新生小牛血清)在37℃、5%CO₂条件下培养。取对数生长期细胞，以细胞数3×10⁴/mL接种于96孔板,待细胞长到铺满板底的70%～80%时,将其分为六组：

其中第一组（正常对照组）加入10μL蒸馏水；

第二组（模型组）加入H₂O₂溶液，使H₂O₂最终浓度达到800mmol/L；

第三组（黄皮果提取物+H₂O₂）加入黄皮果提取物，其最终浓度为1mg/L，细胞培养12h后,换为无血清的1640培养基，再加入H₂O₂溶液，H₂O₂最终浓度达到800mmol/L；

第四组（黄皮果提取物+H₂O₂）加入黄皮果提取物，其最终浓度为2mg/L，细胞培养12h后,换为无血清的1640培养基，再加入H₂O₂溶液，H₂O₂最终浓度达到800mmol/L；

第五组（黄皮果提取物+H₂O₂）加入黄皮果提取物，其最终浓度为5mg/L，细胞培养12h后,换为无血清的1640培养基，再加入H₂O₂溶液，H₂O₂最终浓度达到800mmol/L；

第六组（黄皮果提取物+H₂O₂）加入黄皮果提取物，其最终浓度为20mg/L，细胞培养12h后,换为无血清的1640培养基，再加入H₂O₂溶液，其最终浓度达到800mmol/L。

（2）黄皮果提取物对H₂O₂损伤的人胎肝细胞L-02细胞存活率的影响

对以上六个组别：3h后换成无血清1640培养基,以MTT法检测细胞存活率，细胞存活率(%)=(本组存活数量平均值/对照组存活数量平均值)×100%。

MTT结果显示，与模型组比较,以上各浓度的黄皮果提取物组都能够提高细胞存活率，但仅2mg/L以上的黄皮果提取物提高细胞存货率有统计学意义（P<0.01）,当黄皮果提取物的浓度达到5mg/L时,细胞存活率最高，从55.2%升高至73.9%，说明该浓度下的黄皮果提取物能显著提高细胞存活率，结果见表1。

表1各组人胎肝细胞L-02细胞的存活率结果（n=6）

*表示与模型组比较P<0.05，△表示与模型组比较P<0.01

（3）黄皮果提取物对细胞凋亡率的影响

对以上六个组别：3h后收集细胞，PBS洗2次，染色结合缓冲液重悬并调整细胞数为2×10⁶/mL,加入Annexin V-FITC10μL，室温染色15min，用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡率。

研究黄皮果提取物对H₂O₂诱导人胎肝L-02细胞凋亡的影响,采用AnnexinV-FITC染色法检测细胞凋亡率的变化。结果显示,正常对照组细胞凋亡率为7.15±1.42%。而模型组中经H₂O₂诱导的细胞凋亡率显著上升至30.23±4.06%。第三组～第六组经以上各浓度的黄皮果提取物预处理后,各组晚期凋亡率有所降低，其中第五组中5mg/L黄皮果提取物使晚期凋亡率减少了10%左右,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。说明黄皮果提取物能在一定程度上抑制H₂O₂诱导细胞发生晚期凋亡,减轻L-02细胞损伤。

表2各组人胎肝细胞L-02细胞的凋亡率结果（n=5）

*表示与H₂O₂比较P<0.05，△表示与H₂O₂比较P<0.01

实施例3黄皮果提取物对大鼠药源性肝炎模型的保护作用

1、实验动物

60只SD大鼠：购自广东医学院实验动物中心，每只350-420g。

2、实验材料

利福平胶囊：购自广东华南药业有限公司；

异烟肼片：购自山西天源制药有限公司；

水飞蓟宾：购自天津天士力制药股份有限公司；

ALT、AST、SOD、GSH、MDA试剂：购自南京建成生物工程研究所；

黄皮果提取物：按实施例1制备，配成含生药100g/L的母液，4℃保存备用。

3、实验方法

（1）动物分组：

将60只SD大鼠随机分为6组,每组10只,分别取名为：正常对照组、模型组、水飞蓟宾组、黄皮果提取物高剂量组、黄皮果提取物中剂量组和黄皮果提取物低剂量组。正常对照组灌胃给予0.9%氯化钠注射液10mL/(kg*d)，共8d；模型组分别灌胃给予利福平75mg/(kg*d)和异烟肼75mg/(kg*d)，共10d；水飞蓟宾组在给予利福霉素钠和异烟肼(剂量及给药方式同模型组)1h后灌胃给予水飞蓟宾40mg/(kg*d),共10d；黄皮果提取物低、中、高3个剂量组,分别在给予利福平和异烟肼(剂量及给药方式同模型组)1h后分别灌胃给予不同剂量黄皮果提取物50mg/(kg*d)、100mg/(kg*d)、200mg/(kg*d)，共10d。全部动物末次给药后禁食16h。第11天将大鼠拉颈椎脱臼致死,取血后，剖腹取肝。

（2）血清ALT、AST检测

每组大鼠全血以3000r/min离心10min，分离血清，-20℃冰箱保存，按照试剂盒说明方法检测血中ALT、AST。

与正常组比较，模型组大鼠血清ALT和AST活性显著升高（P<0.01），与模型组相比黄皮果提取物各剂量组的ALT和AST水平均有明显降低的趋势，说明黄皮果提取物能有效缓解由抗结核药物引起的药源性肝损伤。（结果见表3）

表3各组大鼠血清ALT、AST的检测结果（n=10）

*表示与模型组比较P<0.05，△表示与模型组比较P<0.01

（3）肝组织匀浆SOD、MDA和GSH检测

采血后，立即剖腹取肝，于冰冻生理盐水中漂洗2次，吸干，取同一部位肝组织1小块加生理盐水制备成10％的肝匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，按试剂盒说明书测定肝组织SOD、MDA和GSH含量。

与模型组相比，黄皮果提取物各浓度组的GSH水平和SOD活力均有显著提高（P<0.05），而MDA含量则较模型组有明显降低，中、高剂量组的MDA含量降低有统计学差异（P<0.05）。提示了摄入黄皮果提取物能有效提高肝脏的抗氧化能力。（结果见表4）

表4各组大鼠的SOD、MDA和GSH结果（n=10）

*表示与模型组比较P<0.05，△表示与模型组比较P<0.01

（4）形态学检测

处死大鼠后迅速剖腹取出肝脏，取部分肝组织用10%福尔马林固定36h后，石蜡包埋、切片，常规HE染色和MASSON染色后于光学显微镜下观察肝组织病理学改变；根据肝脏病变程度以半定量方法积分，并按各种病变重要性乘以不同加权数。HE染色观察炎症损伤评分标准：每处肝细胞坏死3分，每处肝细胞水样变1分，每处淤血或出血l分，每处炎性细胞浸润1分。Masson染色观察肝组织纤维化程度，S0:无纤维化，评0分；S1:有些汇管区纤维化±短纤维隔，评1分；S2:汇管区纤维化、纤维隔形成，评2分；S3:多数汇管区纤维化，偶有P-P汇管桥接纤维化，评3分；S4:汇管区纤维化伴明显的P-P汇管桥接纤维化和P-C汇管-中央桥接纤维化，评4分；S5:明显P-P汇管桥接纤维化/P-C汇管-中央桥接纤维化,偶有结节，评5分；S6:肝硬化，评6分。计算每只动物肝炎炎症损伤的总积分和纤维化积分，然后进行统计学处理。

与正常对照组相比,模型组大鼠肝小叶结构破坏,肝细胞索排列紊乱,肝组织内出现大面积融合性坏死，汇管区扩大伴桥接坏死,较多嗜酸性粒细胞与单核细胞浸润，部分可见假小叶形成；黄皮果提取物中、高剂量组有肝小叶坏死面积显著减少、仅有散在的炎症细胞浸润。Masson染色:正常对照组仅见汇管区和中央静脉周围有少量细小的胶原纤维,未见纤维增生；模型组可见小叶间及汇管区有明显的胶原纤维增生,形成粗大的纤维间隔并向肝小叶内伸展，肝纤维化分期主要集中在4-5期，与模型组相比，黄皮果提取物各剂量组胶原纤维增生均有不同程度减轻,形成的纤维间隔较纤细，肝纤维化分期主要介于2-3期之间。(见表5)

表5各组大鼠药源性肝炎炎症评分及纤维化分期结果（n=10）

*表示与模型组比较P<0.05，△表示与模型组比较P<0.01

（5）免疫组化染色

常规免疫组化染色检测α-SMA在肝脏组织中的表达情况，每组均用PBS代替一抗作为阴性对照。石蜡切片二甲苯透明，梯度乙醇至水，3％过氧化氢孵育10min，PBS洗3min×3，微波修复15min；加入正常山羊血清封闭液，37℃孵育15min，然后加入一抗（1：100稀释），4℃过夜，PBS洗3min×3；加入二抗，37℃孵育15min，PBS洗3min×3；最后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作（SABC）液，37℃孵育15min，PBS洗3min×3；DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗，苏木紫复染，中性树胶封片。肝组织中α-SMA免疫组织化学染色图像，用Image-Pro Plus6.0分析软件进行图像分析，每张切片取5个视野测定α-SMA蛋白阳性产物的积分光密度值（IOD值），取平均值表示α-SMA蛋白表达强度。IOD值越大表示阳性产物表达越强。

光镜下，大鼠肝组织α-SMA的阳性细胞呈明显的棕黄色或深棕色，分布于细胞质和细胞核，表达强度不一，以中央静脉周围表达多；而肝组织中α-SMA表达以肝细胞胞浆为主，着色为黄色或棕黄色，以中央静脉壁和周围血管壁表达多。与正常组比较，模型组中和α-SMA的表达均明显升高（P<0.01）；与模型组比较，黄皮果高各剂量组α-SMA的表达均明显减弱（P<0.01），其中以高剂量组效果更显著。（见表6）

表6各组大鼠的凋亡率α-SMA的表达结果（n=10）

*表示与模型组比较P<0.05，△表示与模型组比较P<0.01

实施例4黄皮果提取物片剂的制备

取实施例1制备的黄皮果提取物100±2g，微晶纤维素25g，羧甲基淀粉钠20g，混匀，70%-80%乙醇润湿后制粒，过20目筛，加入硬脂酸镁5g，混匀，压成片重为0.15g的口服片1000片，每片含黄皮果提取物不低于98mg，用法：每次3粒，每天三次。

实施例5黄皮果提取物胶囊剂的制备

取实施例1制备的黄皮果提取物100±2g，可溶性淀粉25g，硬脂酸镁25g，过80目筛并充分混匀，干法制粒，灌注胶囊1000粒，每粒胶囊含黄皮果提取物不低于98mg，用法：每次3粒，每天三次。

实施例6黄皮果提取物颗粒剂的制备

取实施例1制备的黄皮果提取物100±2g，糊精300g，过80目筛并充分混匀，70%-80%乙醇润湿后制粒，干燥，包装成每袋4g的颗粒剂1000袋，每袋含黄皮果提取物不低于98mg，用法：每次2袋，每天三次。

实施例7黄皮果提取物口服液的制备

取实施例1制备的黄皮果提取物100±2g，20%乙醇8000mL，充分搅拌溶解，过滤，滤液中加入蔗糖50g，橘子香精5mL，用注射用水调至10000mL，灌装成每支10mL的口服液1000支，每支口服液含黄皮果提取物不低于98mg，用法：每次2支，每天三次。

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种黄皮果提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取晒干的芸香科黄皮属植物有核黄皮的果实，去核，粉碎，过40目筛，得到黄皮果粉末；

(2)选用浓度为70％～80％乙醇浸泡上述黄皮果粉末，乙醇用量是5倍黄皮果粉末重量，浸泡时间为12-14h，回流时间是每次1.5h，连续回流提取5次；

(3)过滤，合并滤液，离心，取上清液浓缩，然后再用正己烷萃取3次，每次正己烷萃取后分去上层萃取液，取下层液体挥去正己烷，然后浓缩；

(4)真空干燥成浸膏即得黄皮果提取物；

(5)采用紫外分光光度法测定黄皮果提取物中的以芦丁计的总黄酮及以没食子酸计的总酚酸含量及以葡萄糖计的总还原糖含量，选用总黄酮含量≥4.50％，总酚酸含量≥10.80％，且总还原糖含量≥12.00％的黄皮果提取物。

2.根据权利要求1所述的黄皮果提取物的制备方法，其特征在于，所述第(3)步骤与第(4)步骤之间还进行如下步骤：通过大孔树脂吸附，采用适度乙醇和双蒸水梯度洗脱，然后将洗脱液浓缩。

3.根据权利要求1所述的黄皮果提取物的制备方法，其特征在于，离心的转速是3000rpm/min，离心时间为10min。

4.根据权利要求1所述的黄皮果提取物的制备方法，其特征在于，所述第(3)步骤中，上清液浓缩至相对密度1.15-1.35。

5.一种黄皮果提取物，其特征在于，通过权利要求1～4任一所述的黄皮果提取物的制备方法得到。

6.如权利要求5所述的黄皮果提取物在制备防治药源性肝炎药物中的应用。

7.一种防治药源性肝炎的药物，其特征在于，由药物成分和制药辅料组成，所述药物成分选用权利要求5所述的黄皮果提取物。

8.根据权利要求7所述的防治药源性肝炎的药物，其特征在于，所述防治药源性肝炎的药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。