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CN103282509A - 动物细胞的培养方法 - Google Patents

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CN103282509A CN2011800629499A CN201180062949A CN103282509A CN 103282509 A CN103282509 A CN 103282509A CN 2011800629499 A CN2011800629499 A CN 2011800629499A CN 201180062949 A CN201180062949 A CN 201180062949A CN 103282509 A CN103282509 A CN 103282509A
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岸下昇平
奥井友子
篠田康晴
田熊晋也
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Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明通过培养产生希望得到的蛋白质的动物细胞而产生所述蛋白质而制造希望得到的蛋白质之时、以通常的培养温度培养一定期间之后，通过使培养温度降低至25℃～35℃而继续培养来抑制所述蛋白质的不均质成分的生成。

Description

动物细胞的培养方法
【技术领域】
本发明涉及用于抑制培养生产希望得到的蛋白质的动物细胞而制造所述蛋白质之时的，希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）的培养方法及使用该方法制造希望得到的蛋白质的方法。具体而言，本发明涉及在培养生产希望得到的蛋白质的细胞而制造所述蛋白质的方法中，以通常的培养温度培养一定期间之后，使培养温度降低至25℃～35℃而继续培养为特征的方法。
【背景技术】
要培养动物细胞而得到该动物细胞产生的天然型蛋白质时，或者培养导入编码希望得到的蛋白质的基因的动物细胞而制造希望得到的蛋白质等之时、如何抑制那样的天然型蛋白质或希望得到的蛋白质的，脱酰胺体或氨基酸的取代－缺失体、由糖链结构的差异等而形成的电荷不均一性（酸性峰、碱性峰）或会合体等的不均质成分（heterogeneity）的生成是课题。
近年、免疫原性等的问题成为悬念，安全性的方面或，为了防单离－纯化步骤的复杂化，也期望尽可能抑制这些的不均质成分的生成的细胞培养方法的出现。
以往、为了解决如上述一样的问题，进行各种的动物细胞的培养方法的开发。具体而言，为了降低错折叠或凝集的形态的蛋白质的产生，开发了在27℃～30℃的低温或低pH培养细胞（专利文献1：WO2008/131374）、或铜或谷氨酸的添加（专利文献2：WO2008/109410）。但是，关于控制电荷不均一性的方法，至今未见报告。
作为在CHO细胞的培养中使培养温度向低温变化的培养法，公开有使用在低温示目的蛋白质的每细胞生产性的升高的，具有特定的表征的CHO细胞，升高目的蛋白质的产生量的方法（专利文献3；特开平9-75077）。但是，对于通过降低培养温度来抑制目的蛋白质（优选为抗体）的不均质，特别是抑制抗体的电荷不均一性完全无提示。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:WO2008/131374
专利文献2:WO2008/109410
专利文献3:特开平9-75077
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明旨在抑制培养生产希望得到的蛋白质的动物细胞而制造所述蛋白质之时发生的，希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）。
【解决课题的技术方案】
本发明人为达成如上述一样的课题而重复锐意研究的结果，发现通过操作细胞培养的温度条件，可抑制希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）。具体而言，发现以通常的培养温度培养一定期间之后，通过降低培养温度而继续培养，可抑制希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity），基于此见解完成本发明。
即，本发明提供以下技术方案。
（1）抑制通过培养产生希望得到的蛋白质的动物细胞而产生所述蛋白质来制造希望得到的蛋白质之时的，希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）成分的生成的方法，其特征在于，以通常的培养温度（36℃～38℃）培养一定期间之后，使培养温度降低至25℃～35℃而继续培养。
（2）（1）的方法，其中动物细胞是有如下表征的细胞：在相比通常的培养温度（36℃～38℃）更低温，希望得到的蛋白质的每细胞的生产性不升高或生产性减少。
（3）上述方法，其中抑制希望得到的蛋白质的不均质成分的生成包括抑制酸性峰的生成。
（4）上述方法，其特征在于，从培养开始日起3天后～7天后在通常的培养温度培养，其后降低培养温度。
（5）上述方法，其特征在于，于36℃～38℃培养一定期间之后，使培养温度降低至32℃～35℃而继续培养。
（6）上述方法，其中将细胞用分批培养法（batch culture）、重复分批培养法（repeated batch culture）、流加培养法（fed-batchculture）、或者，重复流加培养法（repeated fed-batch culture）、连续培养法（continuous culture）、灌流培养法（perfusion culture）培养。
（7）上述方法，其中将动物细胞用流加培养法培养。
（8）上述方法，其中动物细胞导入有编码希望得到的蛋白质的基因。
（9）上述方法，其中希望得到的蛋白质是抗体。
（10）上述方法，其中动物细胞是哺乳动物细胞。
（11）（10）的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
（12）（11）的方法，其中CHO细胞选自下列细胞系：DG44、DXB-11、K-1或CHO-S。
（13）希望得到的蛋白质的制造方法，其特征在于，使用上述方法培养产生希望得到的蛋白质的细胞而制造所述蛋白质。
（14）（13）的制造方法，其包括培养产生希望得到的蛋白质的细胞，从培养液中回收所述蛋白质的步骤。
（15）以由上述方法制造的蛋白质作为有效成分的药物的制造方法。
（16）上述方法，其中希望得到的蛋白质是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体或抗IL-31RA抗体。
【发明效果】
本发明可极其有利地在生理活性肽或蛋白质的生产中使用。作为本发明的特征，可抑制培养生产希望得到的蛋白质的动物细胞而制造所述蛋白质之时发生的，希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）。因此得到更均一的蛋白质的可能性高，单离－纯化步骤变得简便，对于工业生产有利。具体而言，例如，可大大贡献于药品用抗体等的大量供给。
【附图说明】
【图1】示关于由温度变动所致的抗体的酸性峰抑制的实施例（实施例1）的结果。
【图2】示关于由温度变动所致的抗体的酸性峰抑制的实施例（实施例2）的结果。
【图3】示关于由温度变动所致的抗体的酸性峰抑制的实施例（实施例3）的结果。
【实施方式】
以下，更详细地说明本发明的实施方式。
本发明的方法的特征在于抑制培养生产希望得到的蛋白质的细胞而制造所述蛋白质之时发生的，希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）成分的生成。具体而言，特征在于在培养生产希望得到的蛋白质的细胞而制造所述蛋白质的方法中，以通常的培养温度培养一定期间之后，使培养温度降低至25℃～35℃而继续培养。
作为本发明之一例，在本发明的培养法中，动物细胞是有在相比通常的培养温度（36℃～38℃）更低温希望得到的蛋白质的每细胞的生产性不升高或减少的表征的细胞。
以通常的培养温度培养一定期间之后，降低培养温度培养，在本说明书中称为变动培养温度，或者“温度变动”。通常的培养温度一般是作为适宜于恒温动物来源的细胞的细胞增殖的温度的36℃～38℃，最一般是37℃。另一方面，将降低的培养温度称为“变动温度”。变动温度是相比通常的培养温度更低，并且不足37℃的温度，例如25℃～35℃、优选为30℃～35℃、再优选为32℃～35℃。
本发明人对于温度变动对产生重组人源化抗体的CHO细胞系的影响，检查了细胞密度、细胞生存率、培养基成分的变化、产生的抗体蛋白质浓度、及抗体的不均质成分的变化。
结果知，相比经过培养期间维持37℃而培养的对照，在温度变动的条件下维持活细胞数和生存率，葡萄糖的消费和乳酸的蓄积被抑制。再者，对于产生的抗体的性质，知说由温度变动而酸性峰的生成被抑制，作为目的物的品质得到优选的结果。此现象示，由温度变动，可抑制不均质（heterogeneity）成分的生成。仅是，抗体蛋白质的产生量相比在通常的温度条件下培养的时若干降低。
在本发明的再别的方面，抑制希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）成分的生成包括抑制电荷不均一性。电荷不均一性是指，脱酰胺体或氨基酸的取代－缺失体、糖链结构的相违所致，通过生成pI相比主成分更高的成分（碱性峰）及低的成分（酸性峰），蛋白质的电荷变得不均一的现象。
在本发明的再别的方面，抑制希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）成分的生成包括抑制酸性峰的生成。
蛋白质的酸性峰是指pI相比主成分更低的成分，由脱酰胺体或糖链结构的差异等而形成。酸性峰由离子交换层析测定，作为相对于主成分的比例（%）算出。
温度变动之时期根据使用的动物细胞及培养条件而不同。对于使用的动物细胞，实施实验，以目的蛋白质的生产性和不均质（heterogeneity）成分的生成的平衡作为指标进行优化。
一般而言，细胞培养方法被分类为分批培养法（batch culture）、连续培养法（continuous culture）、流加培养法（fed-batch culture）。分批培养法是向培养基加少量的种培养液，在培养中新加培养基或不排出培养液，使细胞增殖的培养方法。连续培养法是在培养中连续地加培养基，并且，使连续地排出的培养方法。再有，在连续法中包括灌流培养（perfusion culture）。流加培养法介于分批培养法和连续培养法之中间，所以也被称为半分批培养法（semi-batch culture），是在培养中连续地或依次地加培养基，不进行如连续培养法一样的连续的培养液的排出的培养方法。
在本发明的方法中，使用任何的培养方法均可，优选为使用流加培养法或连续培养法，特别优选为，使用流加培养法。流加培养之时加的培养基（以下，称为流加培养基）没必要是与已经在培养中使用的培养基（以下，称为初始培养基）相同的培养基，添加不同的培养基也可，添加仅特定的成分也可。典型而言，流加培养基的组成制备成补给在培养中消费的成分。例如，可将作为用于动物细胞增殖的主要的能源的葡萄糖通过流加补给。
温度变动的时机由目的蛋白质的表达量和酸性峰的生成的平衡决定。具体而言，通过进行实施例2所示的实验，可知最适的温度变动时机。优选细胞成充分地高密度之时期开始温度变动，由于根据使用的细胞或培养条件而可达成的细胞密度不同，无法以窄的范围限定，一般而言是106细胞/mL～108细胞/mL左右。
作为在本发明的方法中使用的培养液中的成分，可适宜使用通常在细胞（优选为，动物细胞）培养基中使用的各成分，在这些中包括氨基酸、维生素类、脂质因子、能源、渗透压调节剂、铁源、pH缓冲剂。除上述成分之外，添加例如，微量金属元素、表面活性剂、增殖辅助因子、核苷等也可。
作为培养液中的其他成分具体而言，例如，可例示L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等、优选为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等的氨基酸类；i-肌醇、生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、烟酸、p-氨基安息香酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆素、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等、优选为生物素、叶酸、硫辛酸、烟酸酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等的维生素类；氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸、胆甾醇等、优选为氯化胆碱等的脂质因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、优选为葡萄糖等的能源；氯化钠、氯化钾、硝酸钾等、优选为氯化钠等的渗透压调节剂；EDTA铁、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、硝酸铁等、优选为氯化铁、EDTA铁、柠檬酸铁等的铁源类；碳酸氢钠、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES、MOPS等、优选为碳酸氢钠等的pH缓冲剂。
除上述成分之外，添加例如，硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁、亚硅酸钠等、优选为硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁等的微量金属元素；Tween80、Pluronic F68等的表面活性剂；及重组型胰岛素、重组型IGF、重组型EGF、重组型FGF、重组型PDGF、重组型TGF-α、盐酸乙醇胺、亚硒酸钠、视黄酸、盐酸腐胺等、优选为亚硒酸钠、盐酸乙醇胺、重组型IGF、盐酸腐胺等的增殖辅助因子；脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、腺苷、胞苷、鸟苷、尿苷等的核苷等也可。再有，在上述本发明的适宜例中，包括链霉素、青霉素G钾及庆大霉素等的抗生物质或，酚红等的pH指示药也可。
另外，培养液中的其他成分的含量适当为，氨基酸是0.05-1500mg/L、维生素类是0.001-10mg/L、脂质因子是0-200mg/L、能源是1-20g/L、渗透压调节剂是0.1-10000mg/L、铁源是0.1-500mg/L、pH缓冲剂是1-10000mg/L、微量金属元素是0.00001-200mg/L、表面活性剂是0-5000mg/L、增殖辅助因子是0.05-10000μg/L及核苷是0.001-50mg/L的范围，可根据培养的细胞的种类、希望得到的蛋白质的种类等而适宜决定。
培养液的pH根据培养的细胞而不同，一般而言是pH6.8～7.6、多种情况pH7.0～7.4是适当的。
在本发明中，可使用溶解上述的成分的完全合成培养基，培养细胞。或者，将以往公知的动物细胞培养用培养基作为基础培养基使用，根据需要补充其他成分也可。例示的作为动物细胞培养用培养基市售的基础培养基，可使用D-MEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、D-MEM/F-121:1混合物（Dulbecco's Modified EagleMedium:Nutrient混合物F-12）、RPMI1640、CHO-S-SFMII（Invitrogen公司）、CHO-SF（Sigma-Aldrich公司）、EX-CELL301（JRH biosciences公司）、CD-CHO（Invitrogen公司）、IS CHO-V（Irvine Scientific公司）、PF-ACF-CHO（Sigma-Aldrich公司）等。在用流加培养法培养细胞时，作为在细胞培养的最初的阶段使用的初始培养基，可使用这样的市售的培养基。
本发明的方法的优选的实施方式是培养通过基因工程学操作整合入编码希望得到的蛋白质的基因的COS细胞或CHO细胞等的动物培养细胞、或者，以产生抗体的小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等的杂交瘤为代表的融合细胞之时，抑制希望得到的蛋白质的不均质（heterogeneity）成分的生成的方法。本发明的方法在为培养动物细胞而得到该动物细胞产生的天然型蛋白质时也可使用。
在本发明中在希望得到的蛋白质的表达中使用的动物培养细胞无特别限定，哺乳动物细胞是优选的。作为哺乳动物细胞，人、黑猩猩等的灵长类、小鼠、大鼠、仓鼠等的啮齿类等任何哺乳动物来源的细胞均可，但CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Vero细胞等一般使用的动物培养细胞是优选的，在以大量表达为目的时，特别CHO细胞是优选的。另外，为了制造希望得到的蛋白质，特别是，作为缺损DHFR基因的CHO细胞的dhfr-CHO细胞（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1980）77,4216-4220）或CHO K-1细胞（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1968）60，1275）等适宜导入希望得到的基因的细胞是优选的。
作为上述的CHO细胞，特别是，DG44株、DXB-11株、K-1、CHO-S是优选的，特别是DG44株及DXB-11株是优选的。
向宿主细胞的载体的导入可用例如，磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子脂质体DOTAP（Boehringer Mannheim公司制）的方法、电穿孔法、脂转染等的方法进行。
在本发明中特别优选的动物细胞是导入编码希望得到的蛋白质的基因的CHO细胞。希望得到的蛋白质不特别限定，天然抗体、抗体片段、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等的抗体（例如，抗IL-6受体抗体、抗IL-6抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体、抗NR10（IL-31RA）抗体、抗神经节苷脂GM3抗体、抗TPO受体激动剂抗体、凝固第VIII因子代替抗体、抗IL-31受体抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、因子IX和因子X的双特异性抗体等）或生理活性蛋白质（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素、干扰素、IL-1或IL-6等的白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、等）等任何蛋白质均可，但特别是抗体是优选的。
在抗体中，不仅是人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴等的动物来源的单克隆抗体，也包括嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等人为地改变的基因重组型抗体。另外，抗体的免疫球蛋白类无特别限定，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等任何的类均可，但作为药物使用时，IgG及IgM是优选的。再者作为本发明的抗体，不仅是全抗体，也包括Fv、Fab、F（ab）2等的抗体片段，或将抗体的可变区域用肽接头等的接头结合的1价或2价以上的单链Fv（scFv、sc（Fv）2等）的低分子化抗体等。
在优选的实施方式中，本发明，以抗体的制造作为目的，培养导入编码抗体的基因的CHO细胞之时，作为用于抑制抗体的酸性峰的生成的方法，以从培养开始日起3天后～7天后在通常的培养温度培养，其后降低培养温度作为特征。即，例如，从培养开始起第3天，或者从培养开始起第4天，或者从培养开始起第5天，或者从培养开始起第6天，或者从培养开始起第7天，在通常的培养温度培养之后，开始温度变动，往后在变动温度继续培养。
作为从温度变动到低温之后至结束培养的期间，一般而言是1天～50天，优选为，5天～15天，再优选为，7天～12天。
培养条件根据使用的细胞的种类而不同，所以可决定适宜的条件。例如如果是CHO细胞，通常、在气相的CO2浓度是0-40%、优选为，2-10%的气氛下、培养1-50天、再优选为培养1-14天也可。
另外，作为动物细胞培养用的各种的培养装置，可使用例如发酵槽型箱培养装置、气升型培养装置、培养瓶型培养装置、旋转瓶型培养装置、微载体型培养装置、流动层型培养装置、空心纤维型培养装置、滚瓶型培养装置、填充槽型培养装置等进行培养。
在本发明中，适宜的培养条件选择抑制动物细胞产生的目的蛋白质的不均质（heterogeneity）成分的生成，生产性的降低少的条件。实际上，在本申请中本发明人确认，由温度变动而每细胞的抗体产生量若干降低，可调节变动温度和时机，使目的蛋白质的表达量降低保持在最小限度，抑制不均质（heterogeneity）成分的生成。
动物细胞的蛋白质的产生，仅简单将其培养也可，也存在需要特殊的操作的，它们的操作或条件等根据培养的动物细胞适宜决定即可。例如在由基因工程学操作用含编码小鼠-人嵌合抗体、人源化抗体等的抗体或其他蛋白质的基因的载体转化的CHO细胞中，通过在如上述一样的条件下实施培养，在1-50天、优选为5-21天、再优选为7-14天左右在培养基中可得到希望得到的蛋白质。通过将其根据常规方法（例如，参照抗体工程学入门、地人书馆、（1994）p.102-104；AffinityChromatography Principles&Methods、GE HEALTHCARE（株）、（2003）p.56-60等）单离、纯化，可得到希望得到的蛋白质。
从动物培养细胞分泌到培养基中的蛋白质可从其培养液用常用的方法回收。或者，蛋白质也可从宿主细胞的细胞溶解物用常用的方法回收。具体而言，希望得到的蛋白质的回收可将细胞培养液或细胞溶解物通过离心等，除去细胞及细胞的破片之后，适用一般蛋白质的单离－纯化技术而进行。即，可使用盐析法（例如，硫酸铵分级分离法）、醇沉淀法（例如，乙醇沉淀）、PEG法、电泳法、离子交换层析、超离心法、凝胶过滤法、疏水性层析、亲和层析等。希望得到的蛋白质是抗体时，可适宜地使用蛋白A层析法，但不限于此。再者，使用利用亲和性的各种各样的分离或分级分离法，将抗体分为免疫球蛋白的类，或者可根据抗原结合性分离。
由本发明，可以高的生产量并且保持高的均质性而制造重组抗体（天然抗体、抗体片段、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等）、基因重组蛋白质（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素、干扰素、IL-1或IL-6等的白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、等）等。
在由本发明的方法制造的蛋白质或多肽（也称为本发明的蛋白质）有可作为药物利用的生物学活性时，可通过将那样的蛋白质或多肽与药学容许的载体或添加剂混合而制剂化来制造药品。本发明的蛋白质及以本发明的蛋白质作为有效成分的药品也包括在本发明的范围内。
作为药学容许的载体及添加剂的例，可举出水、药学容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂基醇、硬脂酸、人血清白蛋白（HSA）、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加物容许的表面活性剂等。
实际的添加物根据作为本发明的药品的治疗剂的剂型，从上述之中单独或适宜组合选择，当然不限于这些。例如，作为注射用制剂使用时，可将纯化的多肽溶解于溶剂、例如生理盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等，使用向其加吸附防止剂、例如Tween80、Tween20、明胶、人血清白蛋白等的制剂。或者，为了作为使用前溶解再构成的剂形而是冷冻干燥的也可，作为用于冷冻干燥的赋形剂，可使用例如，甘露糖醇、葡萄糖等的糖醇或糖类。
多肽的有效施用量可根据多肽的种类、作为治疗或预防的对象的疾病的种类、患者的年龄、疾病的重症度等适宜选择。例如，在本发明的蛋白质是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体等的抗体时，其有效施用量选择为每一次每体重1kg是0.001mg～1000mg的范围。或者，可选每患者0.01～100000mg/身体的施用量。但是，不限于这些的施用量。
本发明的药品的施用方法是，经口、非经口施用之任何均可能，优选为非经口施用，具体而言，可举出注射（例如，由静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等的全身或局部施用）、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。
【实施例】
以下，基于实施例及参考例具体说明本发明。再有，这些的实施例等仅旨在说明本发明，而非限定本发明的范围。
【实施例1．由温度变动所致的抗体的酸性峰抑制（变动温度的检查）】
【初始培养基】
向市售的动物细胞培养用无血清培养基添加植物来源的水解物，溶解后过滤灭菌。
【流加培养基】
向市售的动物细胞培养用无血清培养基添加葡萄糖，溶解后过滤灭菌。
【细胞】
产生重组型抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）人源化抗体（用WO2006/006693的实施例24中记载的方法人源化，用实施例25的方法L链改变的人源化GC33抗体、抗体类是IgG1）的CHO细胞系（DXB-11株；G.Urlaub et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,1980；可从ATCC购入）。
【培养法】
向1L的罐型细胞培养装置（5台）加初始培养基，向其接种上述CHO细胞系至成为2x105细胞/mL，于37℃开始培养。由培养第5天进行温度变动。变动温度从培养槽1依次是，32℃、33℃、34℃、35℃、37℃（无温度变动），往后的培养在各自变动的温度进行。DO控制为40%、pH控制为6.9。流加培养基自培养第3天，以一定流速添加。
【分析方法】
活细胞数－生存率测定由锥虫蓝染色法进行。向细胞自动测定装置Cedex设置细胞悬浮液1mL，实施生死细胞数测定。使用数据解析软件Cedex Loader（Innovatis，ver.1.51往后）自动地进行生死细胞数测定及活细胞密度（105细胞/mL）和生存率（%）的计算。
葡萄糖及乳酸浓度测定是将采样的培养液的离心（1000rpm，5min）上清使用生物化学分析仪（model2700，YSI）测定。
抗体浓度是将采样的培养液的离心（1000rpm，5min）上清使用蛋白A-HPLC法测定。
关于IEC是使用阳离子柱（ProPac WCX-10）进行离子交换层析。
【结果】
结果示于图1。
到达细胞密度是无温度变动的37℃的培养最高，有温度变动的是细胞的增殖被抑制。但是，变动温度越变低，生存率有维持的倾向，在培养后期也保持高的活细胞数。抗体产生量是，无温度变动的37℃是3.61g/L为最高，有温度变动的全部成3.2g/L以下，由温度变动而抗体产生量降低。这我认为是，由温度变动而细胞自体的活性降低。关于葡萄糖及乳酸的培养，成为伴随变动温度的降低而葡萄糖消费量减少，乳酸产生量也降低的结果。这也被认为是由于由温度变动而细胞自身的活性降低。IEC的酸性峰是，无温度变动是47.5%，与此相比35℃的温度变动是29.1%、34℃的温度变动是18.7%、33℃的温度变动是19.4%、32℃的温度变动是14.7%，由温度变动而生成被抑制，伴随变动温度的降低而有降低的倾向。
【实施例2．由温度变动所致的抗体的酸性峰抑制（变动时机的检查：（1）】
【初始培养基】
向市售的动物细胞培养用无血清培养基添加植物来源的水解物，溶解后过滤灭菌。
【流加培养基】
向市售的动物细胞培养用无血清培养基添加葡萄糖，溶解后过滤灭菌。
【细胞】
产生重组型抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）人源化抗体的CHO细胞系。
【培养法】
向1L的罐型细胞培养装置（5台）加初始培养基，向其接种上述CHO细胞系至成为2x105细胞/mL，于37℃开始培养。将变动温度作为33℃，变动时机从培养槽1.起依次设为培养第3天、第4天、第5天、第6天、无温度变动，往后的培养在变动的温度进行。DO控制为40%、pH控制为6.9。流加培养基自培养第3天以一定流速添加。
【分析方法】
活细胞数－生存率测定由锥虫蓝染色法进行。向细胞自动测定装置Cedex设置细胞悬浮液1mL，实施生死细胞数测定。使用数据解析软件Cedex Loader（Innovatis，ver.1.51往后）自动地进行生死细胞数测定及活细胞密度（105细胞/mL）和生存率（%）的计算。
葡萄糖及乳酸浓度测定是将采样的培养液的离心（1000rpm，5min）上清使用生物化学分析仪（model2700，YSI）测定。
抗体浓度是将采样的培养液的离心（1000rpm，5min）上清使用蛋白A-HPLC法测定。
关于IEC，使用阳离子柱（ProPac WCX-10）进行离子交换层析。
【结果】
结果示于图2。
到达细胞密度是无温度变动的培养最高，有温度变动的是细胞的增殖被抑制。温度变动的时机越快速，越成为到达细胞密度降低的结果，生存率有维持的倾向。抗体产生量是无温度变动是3.61g/L为最高，从培养第6天的温度变动是3.57g/L、从培养第5、4、3天的温度变动依次是2.91、2.13、1.61g/L，伴随温度变动的时机变早，呈现抗体产生量的降低。葡萄糖浓度是变动时机越快速，葡萄糖的蓄积量越多。关于乳酸产生量，仅无温度变动的培养在培养后期见到蓄积，有温度变动的全部是0.5g/L以下的浓度。IEC的酸性峰是无温度变动是47.5%，与此相比从培养第6天的温度变动是21.9%、从培养第3、4、5天的温度变动全部成为20%以下。即使是从培养6天的温度变动，IEC的酸性峰生成被抑制。
【实施例3．由温度变动所致的抗体的酸性峰抑制（变动时机的检查：（2）】
【初始培养基】
将市售的动物细胞培养用无血清培养基溶解后，过滤灭菌。
【流加培养基】
向市售的动物细胞培养用无血清培养基添加葡萄糖，溶解后过滤灭菌。
【细胞】
产生抗NR10（IL-31RA）人源化抗体（用WO2009/072604的实施例12中记载的方法制备的完全人源化NS22抗体）的CHO细胞系（DXB-11株；G.Urlaub et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220,1980；可从ATCC购入）、所述抗NR10人源化抗体的抗体类是IgG2。
【培养法】
用与实施例2同样的方法进行培养。即，于37℃开始培养，将变动温度作为33℃，变动时机设为培养第5天、第7天、无温度变动，往后的培养在变动的温度进行。
【分析方法】
用与实施例2同样的方法进行。
【结果】
与实施例2同样地进行温度变动，抗体的酸性峰的生成被显著地抑制（图3）。

Claims (16)

1.抑制通过培养产生希望得到的蛋白质的动物细胞而产生所述蛋白质来制造希望得到的蛋白质之时的、希望得到的蛋白质的不均质成分的生成的方法，其特征在于，以通常的培养温度培养一定期间之后，使培养温度降低至25℃～35℃而继续培养。
2.权利要求1所述的方法，其中动物细胞是有如下表征的细胞：在相比通常的培养温度更低温，希望得到的蛋白质的每细胞的生产性不升高或生产性减少。
3.权利要求1或2所述的方法，其中抑制希望得到的蛋白质的不均质成分的生成包括抑制酸性峰的生成。
4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，从培养开始日起3天后～7天后在通常的培养温度培养，其后降低培养温度。
5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，于36℃～38℃培养一定期间之后，使培养温度降低至32℃～35℃而继续培养。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中将细胞用分批培养法（batch culture）、重复分批培养法（repeated batch culture）、流加培养法（fed-batch culture）、或者，重复流加培养法（repeatedfed-batch culture）、连续培养法（continuous culture）、灌流培养法（perfusion culture）培养。
7.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中将动物细胞用流加培养法培养。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中动物细胞导入有编码希望得到的蛋白质的基因。
9.权利要求8所述的方法，其中希望得到的蛋白质是抗体。
10.权利要求1～9所述的方法，其中动物细胞是哺乳动物细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中CHO细胞选自下列细胞系：DG44、DXB-11、K-1或CHO-S。
13.希望得到的蛋白质的制造方法，其特征在于，使用权利要求1～12所述的方法培养产生希望得到的蛋白质的细胞而制造所述蛋白质。
14.权利要求13所述的制造方法，其包括培养产生希望得到的蛋白质的细胞，从培养液中回收所述蛋白质的步骤。
15.药物的制造方法，所述药物以由权利要求13或14所述的方法制造的蛋白质作为有效成分。
16.权利要求1～15之任一项所述的方法，其中希望得到的蛋白质是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体或抗IL-31RA。
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