CN103282049A - 免疫原性组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的免疫原性或免疫刺激性组合物在药物中的用途和用于制备所述组合物的方法。
Description
发明领域
本发明提供了包括免疫原性和免疫刺激性组合物的组合物，用于制造所述组合物的方法，疫苗以及用于制造疫苗的方法。
蛋白体一般是脑膜炎球菌外膜蛋白的疏水性、膜质、多分子制剂。在两个临床方案中，蛋白体佐剂化的疫苗已经施用于约2,000名受试者。尽管存在强大的安全性、免疫原性和效力记录，但是使用脑膜炎奈瑟氏菌野生型菌株8047用于蛋白体制备需要增强的防护(BL-3)。
第一代蛋白体最初包含脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMP)，且用作疫苗佐剂。
志贺氏菌疫苗Protollin包含来自脑膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白组合来自弗氏志贺氏菌的LPS(参见Jones等人, Vaccine. 2004年9月9日;22(27-28):3691-7。)
产生组合的奈瑟氏菌OMP/脂多糖的蛋白体产生方法公开于WO2009132244中。
仍然寻求作为药物和药物佐剂的可替代的免疫原性和免疫刺激性组合物。
发明概述
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物。
在一个方面，本发明涉及包含以下步骤的方法产生的组合物：
生长志贺氏菌菌株，
破碎志贺氏菌细胞；和
分离包含外膜蛋白和LPS的级分，合适地通过涉及一个或多个离心步骤和去污剂溶解步骤的方法。
在一个方面，本发明涉及用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括：
生长志贺氏菌菌株；
破碎志贺氏菌细胞；和
分离包含外膜蛋白和LPS的部分，合适地通过涉及一个或多个离心步骤和去污剂溶解步骤的方法。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物，其用于药物中。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物，其用作疫苗佐剂。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物，其用作针对志贺氏菌感染或疾病的疫苗。
在一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含
1 能够引发针对传染性病原体的免疫应答的抗原，和
2 志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子，
其用于预防由传染性病原体引起的感染或疾病。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物在药物中的用途。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物在制备疫苗佐剂中的用途。
在一个方面，本发明涉及志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子在制备针对志贺氏菌感染或疾病的疫苗中的用途。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物在制备用于预防传染性病原体引起的感染或疾病的药物中的用途，所述药物包含能够引发针对所述传染性病原体的免疫应答的抗原。
在一个方面，本发明涉及引发佐剂化免疫应答的方法，所述方法包括将包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物递送给个体。
在一个方面，本发明涉及引发针对传染性病原体的免疫应答的方法，所述方法包括将包含下列的组合物递送给需要其的个体：
能够，任选地当佐剂化时能够，引发针对传染性病原体的免疫应答的抗原，和
包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物。
在一个方面，本发明涉及治疗或降低传染性病原体引起的感染或疾病的方法，所述方法包括将组合物递送至需要其的个体，所述组合物包含能够(任选地当佐剂化时)引发保护免于传染性病原体引起的感染或疾病的免疫应答的抗原，所述组合物包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子。
在一个方面，本发明涉及包含用于同时或相继递送的志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的药剂盒。
附图简要说明
图1 通过颗粒大小评价的稳定性
图2 电子显微镜
图3 通过SDS-PAGE/考马斯蓝染色的SFOMP、Protollin、和V2蛋白体中的主要蛋白
图4 SFOMP包含在基于细胞的测定中触发剂量应答性激活的TLR1-2和TLR4通路激动剂
图5 鼻内施用的SFOMP-佐剂化的preF抗原保护小鼠免于RSV感染
图6 制备用于中试佐剂研究的SFOMP研究批次的过程
图7 使用SFOMP微阵列分析人树突状细胞
图8 鼻内施用的SFOMP-佐剂化的preF抗原引发血清和肺中和抗体
图9 在3 mg裂解抗原和5 mg佐剂的两次IN免疫后在BALB/c小鼠中的抗-A/New Caledonia HAI应答
图10 在3 mg裂解抗原和5 mg佐剂的两次IN免疫后在BALB/c小鼠中的抗-A/New Caledonia血清IgG应答
图11 在3 mg裂解抗原和5 mg佐剂的两次IN免疫后在BALB/c小鼠中的抗-A/New Caledonia肺IgA应答
图12 表明SfOMP、Protollin和V2 Protollin之间的差异，且表明LPS/OMP比例。
图13 在C57BL/6小鼠中以1 ug剂量腹膜内注射SFOMP (1 ug/每只小鼠)或弗氏志贺氏菌脂多糖(LPS)后24小时脑内的先天激活
图14 用SFOMP或弗氏志贺氏菌LPS与人小鼠小神经胶质细胞系(CHME)孵育后在体外测量的Aβ42胞吞作用。
发明详述
本发明涉及源自细菌(例如志贺氏菌)的免疫原性和免疫刺激性组合物。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物。
在一个方面，本发明的组合物是由弗氏志贺氏菌菌株BS103产生的外膜制剂，在本文中被称为SFOMP(Shigella
Flexneri Outer Membrane Protein preparation，弗氏志贺氏菌外膜蛋白制剂)。我们已经确定，该组合物含有LPS和OMP，正如根据WO2009132244制备的Protollin和Proteosomes(蛋白体)，但是与两者相比具有某些优势；即它是从无毒菌株产生的，这需要低防护，其可以从1次发酵产生，且因此从一次工艺产生，且消除了对B组脑膜炎球菌PS的有害免疫应答的理论风险。SFOMP也表明了与奈瑟氏菌LPS/OMP组合相比增强的保护作用。
本发明的组合物可以是“免疫原性组合物”，其能够引发、加强、激活、引起、刺激、增强、加强、扩大或强化适应性(特异性)免疫应答，所述免疫应答可以是细胞的(T细胞)或者体液(B细胞)，或其组合。优选地，适应性免疫应答是保护性的，其可以包括病毒的中和(减少或者消除病毒感染力)。免疫原的代表性实例是微生物抗原(如一种或多种RSV抗原或者一种或多种流感抗原)。在这个方面，组合物可以作为预防剂和/或治疗剂直接使用。
在一个方面，本发明的组合物可以是“免疫刺激性组合物”，当施用于哺乳动物(包括人)时，所述“免疫刺激性组合物”增强了免疫应答，合适地增强了对另一种抗原的免疫应答。免疫刺激性组合物可以增强哺乳动物的粘膜和/或适应性免疫应答和/或细胞和/或体液免疫应答和/或先天免疫应答。例如，当与抗原共同施用时，免疫刺激性组合物可以增强哺乳动物的对特定抗原的免疫应答。在这个方面，组合物可以用作预防剂或治疗剂的佐剂。
因此，本发明的组合物可以是有用的，例如，作为疫苗的佐剂或作为疫苗本身。
本发明的组合物包含志贺氏菌LPS。本文使用的"LPS"涉及天然的(与天然结构分离的或合成制备的)或修饰的脂多糖。包括在LPS的定义内的还有脂寡糖(LOS)，其在本领域中一般被理解为，具有由10个或更少的单糖亚单位组成的聚糖链的脂糖。LPS还涵盖具有包含超过10个单糖亚单位的聚糖链的脂多糖。
脂糖可以是解毒形式(即去除脂质A核心)或可以是尚未解毒的形式。
脂糖可以是内源性的(即天然地与OMP制剂被包含)，可以与来自外源性地制备脂糖的OMP制剂混合或结合(即从与OMP制剂不同的志贺氏菌结构制备，或合成地)，或可以是它们的组合。这种外源添加的LPS可能来自与制备OMP制剂的志贺氏菌菌株相同的志贺氏菌菌株或者来自不同的志贺氏菌菌株。在一个方面，优选包含内源LPS的组合物。
组合物包含外膜蛋白(OMP)。组合物可以包含一种、两种、三种、四种或更多种OMP。志贺氏菌外膜蛋白合适地是发现连接至或结合至志贺氏菌种的外膜的任何蛋白，合适地是具有被视为暴露在细菌外部的结构域的蛋白，且因此当人被细菌感染时可以被人的免疫系统看到。
在本文中提及的OMP包括天然存在的OMP的变体，例如该抗原的缺失、插入和取代突变，或本文所述的抗原的其它特定变体，或(在所述抗原是多肽的情况下)与所述多肽具有至少80%或更多、合适地至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的多肽，合适地是免疫原性的。
在一个方面，所述组合物不包含内膜蛋白。
在另一个方面，志贺氏菌 OMP和志贺氏菌 LPS是分离的。“分离的”是指，志贺氏菌OMP和志贺氏菌LPS与下列中的一种或多种部分、或基本上、或完全分离：细胞质细胞膜蛋白、和/或DNA、和/或脂筏。
在另一个方面，该组合物至少70％、至少80％、或至少90％基本上不含内膜蛋白。
OMP可以是弗氏志贺氏菌OMP 1b、或OMP 3a或OMPX、或者其组合，在一个方面，包括所有三种抗原。
在本发明的一个方面，外膜蛋白具有酸性pI。每种蛋白的pI可介于4.47至5.30的范围内。
在一个方面，本发明的组合物具有TLR2和/或TLR4通路激动剂活性，在一个方面，能够激活细胞内被TLR2或TLR4激动剂刺激的一种或多种成分。在一个方面，体外评价组合物的TLR激动剂活性。
在一个方面，LPS是TLR4通路激动剂。在另一个方面，OMP是TLR-2通路激动剂。在一个方面，本发明的LPS组合物具有TLR4激动剂活性，合适地使用实施例4中公开的技术评价。“TLR激动剂”或“TLR通路激动剂”是指能通过TLR信号转导通路而引起信号转导反应的成分，或者是作为直接配体或者间接通过产生内源或外源配体。
在另一个方面，外膜蛋白具有TLR-2激动剂活性，合适地使用实施例4中公开的技术评价。
在一个方面，在组合物中不包含志贺氏菌持家基因产物。
在一个方面，按重量，组合物具有0.6:1.3之间的LPS与OMP的比例。该比例可以是0.8:1.1，例如0.9:1。
组合物的总蛋白含量可以通过测定如Lowry或二辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒(Peirce)进行测量。
在一个方面，志贺氏菌菌株是弗氏志贺氏菌，但也可以使用其他志贺氏菌。在一个方面，这些试剂可以在低BL1和BL2防护水平进行处理。
在一个方面，组合物能够上调下列基因中的一种或多种：IL6、CSF2；CSF3；CXCL10。基因的上调合适地是与当细胞、合适地树突状细胞与PBS接触时看到的基因表达水平相比，当与本发明的组合物接触时相同细胞中的基因表达增加。在一个方面，与用PBS看到的相比，表达增加高至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90倍、或甚至100倍。实施例7中提供了用于评价基因表达的合适方法。
本发明的组合物可以包含小泡中含有的OMP和/或LPS，合适地是具有可测量直径的膜封闭的微粒结构。
OMP和LPS可以与下列存在：磷脂如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰乙二醇(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、和心磷脂(CL)，合适地磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰乙二醇(PG)，这可以是由于纯化方法导致的源自志贺氏菌的，或被添加至OMP或LPS的。
在本发明的一个方面，组合物包含颗粒大小为30 – 180
nm直径的颗粒。在一个方面，组合物包含颗粒大小不超过200 nm直径的颗粒。颗粒大小可以通过例如测量散射光进行测量。
在本发明的一个方面，颗粒在4℃下持续3个月是稳定的，如通过测量颗粒大小所测定的。
本发明的组合物还可以包含去污剂。
在一个方面，本发明的的组合物通过20µm滤器过滤。
在一个方面，组合物包含除OMP和LPS以外的抗原。
在一个方面，提到本文中的抗原包括志贺氏菌OMP蛋白或LPS是指或单独或组合或与另一种物质连接或融合而刺激细胞和/或体液免疫应答的任何试剂或物质。抗原经常源自或是外源微生物，如细菌或病毒，或它们产生的物质，包括但不限于肽、蛋白、脂质、碳水化合物、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖和上述中两种或更多种的复合物。抗原可以是至少约5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸长度或更长的肽、多肽或蛋白或其片段。抗原可以通过化学合成或分子生物学技术人工产生。经常，设计人工抗原以便在一次或多次暴露后引发免疫应答，而没有获得已经刺激免疫应答以保护免于其的疾病的潜在后果。该抗原可以包含“载体”多肽和半抗原，例如，与另一种组合物融合或连接(化学或其他方式)的融合蛋白或载体多肽。抗原可以在免疫载体中重组表达，其可以是包含与启动子可操作连接的抗原的编码序列(例如，简单的表达盒)的简单的裸露DNA。
在一个方面，组合物通过简单混合与一种或多种抗原一起配制。
额外的抗原可以来自志贺氏菌或志贺氏菌以外的物种。
在一个方面，抗原是人或动物产生的免疫应答可以提供保护免于感染或疾病的抗原，且优选疫苗抗原。在一个方面，抗原来自微生物，如病毒、细菌、真菌或原生动物。在一个方面，抗原是人抗原，或植物抗原如花粉抗原，或选自下列的抗原：流感病毒、患疟疾的原生动物、HIV、桦树花粉、DerP1、草花粉、RSV、非典型流感嗜血杆菌和莫拉克斯氏菌(Morexella)。
合适的抗原包括流感抗原。
流感病毒抗原或其抗原性制剂可以通过众多商业适用方法中的任一种生产。所述流感病毒或其抗原性制剂可以源自常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的源自卵的尿囊液。或者，流感病毒或其抗原性制剂可以是使用细胞或细胞培养物而衍生的细胞培养物，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基底
(cell substrate)包括例如狗肾细胞，例如MDCK或来自MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞包括Vero细胞，合适的猪细胞系或适于生产用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基底还包括人细胞，例如MRC-5细胞或Per.Cό细胞系。合适的细胞基底不限于细胞系；例如还包括原代细胞(例如鸡胚成纤维细胞)，和禽细胞系，例如鸡或鸭细胞系(例如EBx细胞系，例如分别源自鸡或鸭胚干细胞的EB14或EB24)。合适的昆虫细胞为Sf9、Sf2或Hi5。可替代的细胞是用于重组甲型流感抗原的酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)，例如，或植物。
在一个实施方案中，根据本发明使用的流感病毒或其抗原性制剂可以是裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制剂。在可替代的实施方案中，流感制剂可以包含另一类型的灭活流感抗原，如灭活的完整病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)或流感病毒体。在又进一步实施方案中，流感病毒可以是活减毒流感制剂。根据本发明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制剂合适地是灭活的病毒制剂，其中用去污剂或其他试剂溶解脂质包膜，从而破坏病毒颗粒。裂解病毒或其裂解病毒抗原性制剂合适地是通过以下方法制备的：用溶解浓度的有机溶剂或去污剂使传染性或灭活的完整流感病毒断裂，随后除去溶解剂的所有或大部分以及病毒脂质材料的一些或大部分。其裂解病毒抗原性制剂表示这样的裂解病毒制剂：与裂解病毒相比，其可以进行某种程度的纯化，同时保留裂解病毒组分的大部分抗原性特性。例如，当在卵中产生时，可以从裂解病毒清除卵污染蛋白，或当在细胞培养物中产生时，可以从裂解病毒清除宿主细胞污染物。裂解病毒抗原性制剂可以包含一种病毒株以上的裂解病毒抗原性组分。含裂解病毒的疫苗(称作“流感裂解疫苗”)或裂解病毒抗原性制剂通常含有残留的基质蛋白和核蛋白(有时候含脂质)以及膜包膜蛋白。所述裂解病毒疫苗通常含有大部分或全部病毒结构蛋白，但不必与它们在完整病毒中存在时的比例相同。商购裂解疫苗的实例是例如FLUARIX™、FLUSHIELD™或FLUZONE™。裂解流感可以使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚与Tween™的组合 (称作“Tween-醚”分裂)，或通过使用其他裂解剂产生，包括去污剂或蛋白水解酶或胆盐，例如脱氧胆酸钠。可用作裂解剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)；其它离子型去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐，或非离子型去污剂，如上述的一种，包括Triton X-IOO (例如在Lina等人，2000，Biologicals 28，95-103描述的方法中)和Triton N-101，或者任何两种或更多种去污剂的组合。用于裂解疫苗的制备方法可包括多个不同的过滤和/或其它分离步骤，例如以多种组合的超速离心、超滤、区带离心和色谱法(例如离子交换)步骤，以及任选例如可在裂解之前或之后进行的用热、甲醛或β-丙内酯或紫外线或其任何组合的灭活步骤。裂解方法可按分批方法、连续方法或半连续方法进行。WO
02/097072中描述了用于裂解免疫原性组合物的优选的裂解和纯化方法。本发明的优选裂解流感疫苗抗原制剂包含生产过程剩余的残余量的Tween
80和/或Triton
X-100，但这些物质可以在裂解抗原制备后加入或调整其浓度。在一个实施方案中，Tween
80和Triton X-100都存在。来自抗原性制剂的疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为：
- Tween 80: 0.01至1%，或约0.1% (v/v)
- Triton X-100: 0.001至0.1 (% w/v), 或0.005至0.02% (w/v)。或者，流感病毒可以是完整病毒疫苗的形式。
对于大流行状况，这种形式可以证明相对于裂解病毒疫苗是有利的，因为它避免了关于针对流感病毒的新株是否能够成功产生裂解病毒疫苗的不确定性。对于一些株，用于产生裂解病毒的常规去污剂会破坏病毒并且使它不可用。尽管总是可能使用不同的去污剂和/或开发生产裂解疫苗的不同方法，这将需要时间，在大流行状况下可能不可获得。除了采用完整病毒方法的更高程度的确定性，也存在比裂解病毒更高的疫苗生产能力，因为在制备合适的裂解疫苗所必须的额外纯化步骤中损失显著量的抗原。
在另一个实施方案中，流感病毒制剂是纯化的亚单位流感疫苗的形式。亚单位流感疫苗通常含有两种主要的包膜蛋白HA和NA，并且相对于完整的病毒体疫苗可能具有额外的优点，因为它们通常具有较低的反应原性，特别是在年轻的疫苗接种者中。可以重组产生或从破坏的病毒颗粒纯化亚单位疫苗。商购亚单位疫苗的实例是例如AGRIPPAL™或FLUVIRTN™。在特定实施方案中，从至少一种主要的包膜组分例如血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或M2，合适地从HA制备亚单位疫苗。合适地，它们包含两种或更多种抗原的组合，例如流感结构蛋白HA、NA、Matrix 1 (Ml)和M2中的至少两种的组合，合适地是HA和NA这两者的组合，任选包含Ml。合适地，通过重组DNA技术生产流感组分，即，由从重组DNA操作得到的核酸得到或由所述核酸表达流感组分，包括活的重组载体(牛痘)或重组亚单位蛋白(杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、酵母、植物或细菌)。合适的昆虫细胞是草地夜蛾(Sf9)昆虫细胞或从粉纹夜蛾开发的High Five (Hi5)昆虫细胞(Invitrogen)，合适的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV) (Baculogold, Becton Dickinson,
PharMingen)或所谓的杆粒系统。
在一个实施方案中，流感病毒制剂是病毒体的形式。
病毒体是球形、单层小泡，其将功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA保持为真实构象，插入病毒体的磷脂双层膜中。商购病毒体疫苗的实例是例如INFLEXAL V™或INVA VAC™。
在另一个实施方案中，亚单位流感组分以病毒样颗粒(VLP)或壳粒形式表达，合适地是植物制造或昆虫细胞制造的VLPs。VLPs以其天然形式呈递抗原。VLP亚单位技术可以完全基于流感蛋白，或可以依赖于它们的病毒如鼠白血病病毒(MLV)，并且可以因此包含非流感抗原如MLV gag蛋白。合适的VLP包含至少一种，合适地至少两种流感蛋白，任选具有其他流感或非流感蛋白，如Ml和HA，HA和NA，HA、NA和Ml或HA、NA和MLA gag。它可以在植物细胞或昆虫细胞中产生。VLPs也可以携带来自一种以上流感病毒株的抗原，例如从两种季节性株(例如HlNl和H3N2)或从一种季节性和一种大流行株(例如H3N2和H5N1)制备的VLPs。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物及其用途包含来自在卵或细胞培养物上生长的流感病毒的流感病毒抗原或其抗原性制剂。在另一个实施方案中，所述流感病毒抗原或其抗原性制剂包含完整病毒、裂解病毒、病毒体或选自HA、NA、Ml、M2的一种或多种纯化的抗原。在另一个实施方案中，一种或多种所述纯化的抗原从在哺乳动物、禽类或昆虫细胞中生长的流感病毒制备。特别地，一种或多种所述纯化的抗原是重组生产的。它们可以是病毒样颗粒的形式。
流感病毒株可以是通过经典重组技术或通过反向遗传学技术产生的重组毒株，重组毒株在辅助病毒存在或不存在的情况下拯救产生。这些技术是本领域中众所周知的。
当流感病毒是细胞衍生的时，残留的宿主细胞DNA的量降低到低水平，以使疫苗的致肿瘤潜能最小化。宿主细胞DNA通常不超过10 ng/每剂量疫苗，且合适地小于1 ng，小于100 pg，小于50 pg或小于25 pg/每剂量。用于评价残留DNA水平的验证方法是，例如：印迹技术或定量PCR，如Southern印迹、狭缝印迹、来自Molecular devices 的Threshold™系统。
在一个实施方案中，流感制剂在低水平硫柳汞存在的情况下制备，或在没有硫柳汞的情况下制备。在另一个实施方案中，获得的流感制剂在不存在有机汞防腐剂时是稳定的，具体而言，制剂不含残余硫柳汞。具体而言，流感病毒制剂包含在不存在硫柳汞或在低水平的硫柳汞下(一般为5 μg/ml或以下)稳定化的血凝素抗原。具体而言，通过α生育酚的衍生物，例如琥珀酸α生育酚(也称为琥珀酸维生素E，即VES)进行乙型流感毒株的稳定化。这类制剂及其制备方法公开于WO 02/097072。
本发明可以用包括大流行间、大流行或大流行前流感毒株的疫苗进行操作。疫苗可以包括不严格匹配那时循环的毒株且例如针对“流感漂移变体(influenza
drift variant)”有效的流感病毒株，所述“流感漂移变体”即已经足够改变足以在普通群体中再次引起流行病的新毒株；这通过被称为“抗原漂移”的过程。
合适地，待包含在免疫原性或疫苗组合物中的一种或多种流感病毒株是一种或多种大流行间(季节性)株，即循环的流感病毒涉及那些以前的传染病，或与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜能的一种或多种毒株(本文为"前大流行毒株")。不同的毒株可以包括在多价组合物中，例如大流行间毒株的混合物、大流行毒株的混合物或者两者的混合物。
大流行间毒株是例如在大流行间阶段全球循环的毒株，例如但不限于：HlNl、H1N2、H3N2或B。可商购的流感疫苗是三价组合，包括一种乙型流感病毒株和两种甲型流感病毒株(HlNl、H3N2)。因此，合适的组合物含有从三株WHO推荐的适当的流感季节的毒株(通常两株甲型流感毒株和一株乙型流感毒株)制备的抗原。通过单一放射免疫扩散(SRD) (J.M. Wood等人: An improved single radial immunodiffusion technique for
the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency
determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand.
5 (1977) 237-247; J. M. Wood等人，International
collaborative study of single radial diffusion and Immunoelectrophoresis
techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol.
Stand. 9 (1981) 317-330)所测量的，在大多数情况下，标准0.5 ml注射剂量(至少)含有来自每株的15 μg血凝素抗原组分。另一种合适的组合物含有四种流感毒株，例如三种经典毒株和一种额外的乙型毒株(Commun Dis
Intell 2006, 30, 350-357)或一种额外的H3N2毒株(Vaccine 1992, 10, 506-511)。
用于本发明中的另一种合适的组合物包含大流行性流感毒株，或易于与大流行相关的流感毒株，其形式为单价大流行或大流行前组合物，单独地，结合地或另外添加一种或多种季节性(即大流行间)毒株。大流行或大流行前毒株，例如来自禽来源或猪来源。
给予流感病毒株引起与大流行流感病毒株相关的流感疾病大流行或爆发的潜能的流感病毒株特征是：(i) 流感病毒必须经历重大的变化，导致完全的新病毒 (例如相对于目前循环毒株的血凝素，新的血凝素);
(ii) 新病毒对人是致病的，以及 (iii)新病毒必须能在人与人之间循环。新的血凝素可以以不可预测的水平出现，具有与之前季节循环的毒株完全不同的亚型，与先前在人类循环的毒株的相应蛋白质相比，所得抗原可变化20%到50%，虽然称为“抗原性转变”的这种现象导致病毒逃逸“群体免疫”并形成大流行。因此，新的HA长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血凝素，例如存在于禽类物种(鸟类)中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大多数或至少大比例的或甚至整个群体以前都没有遇到该抗原，且在免疫学上对该抗原是幼稚的。目前，WHO已经鉴定为可能能够导致人类中的大流行的甲型流感病毒是高致病性H5N1禽流感病毒。因此，本发明的大流行疫苗将合适地包含H5N1病毒。用于引入要求保护的组合物中的两种其他合适的毒株是H9N2或H7N1。
合适地，用于本发明中的疫苗将包括对于甲型流感病毒已经鉴定的下列16种HA亚型(Hl-H 16)中的任一种和/或9种NA亚型(N1-N9) 中的任一种。合适地，疫苗将包括HA和NA部分，但疫苗还可以包括来自重组来源的抗原，在这种情况下，它可能仅仅是HA，或者它可以是HA、NA、Ml、和M2中的一种或多种的任何组合。合适地，存在三种季节性(例如HlNl、H3N2、B)毒株。合适地，存在四种毒株时，它们来自下组：四种季节性毒株(例如HlNl 、H3N2、两种乙型毒株; 或HlNl、B、两种H3N2毒株) 或一种大流行(例如禽流感)毒株加上三种季节性毒株(如HlNl、H3N2、B)。合适的甲型毒株是但不限于：大流行间毒株例如：HlNl、H3N2，一种或多种易与大流行有关的大流行毒株，例如具有至少一种H5、H2、H7、H9或H10亚型，特别是H2N2、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H9N2 和H10N7的毒株。在给定的亚型中，不同的变体是可能的，如在H5亚型内存在下列变体：进化枝1、进化枝2、进化枝3等。
合适地，HA来自至少三种、至少四种流感病毒株。可以包括来自两种不同谱系(如B/yamagata或B/Victoria)的一种或两种乙型毒株。
在特定的实施方案中，免疫原性组合物包含：(i) 来自单一流感毒株的血凝素(HA)，被称为“单价”流感组合物，或(ii) 来自超过一种流感毒株的HA，被称为“多价”流感组合物。
合适的用于本发明中的多价组合物是二价组合物(其包含来自两株流感病毒株如但不仅限于与大流行相关或易于与大流行相关的两种毒株(例如H5或H2)的血凝素(HA))，三价组合物(其包含来自三种流感病毒株、任选地来自两种甲型毒株和一种乙型毒株(如但不限于B/Yamagata或B/Victoria)的HA)，四价组合物(其包含来自四种流感病毒株的血凝素(HA))或五价组合物(其包含来自五种流感病毒株的血凝素(HA))。合适的四价组合物包含两种甲型毒株和两种来自不同谱系(如B/Yamagata或B/Victoria)的乙型毒株的血凝素。可替代地，四价组合物包含来自三种甲型毒株(任选地HINI、H3N2，和一种与大流行或易于与大流行相关的甲型毒株)和一种乙型毒株(如B/Yamagata或B/Victoria)的血凝素。另一种可选的四价组合物包含来自4种大流行间甲型毒株或来自4种与大流行相关或易于与大流行相关的甲型毒株的血凝素，例如禽毒株，例如H5 + H2 + H7 +
H9。具体而言，多价佐剂化的大流行组合物例如大流行二价(例如H5+H2)或三价或四价(例如H5 + H2 + H7 + H9)提供针对大流行甲型流感威胁亚型的先占免疫和针对威胁亚型的持久引发的优势。任选这类大流行疫苗可与季节性疫苗组合。多价组合物也可以包含5种以上流感病毒株，如6、7、8、9或10种流感病毒株。当多价季节性组合物中使用两种乙型毒株时，它们可以合适地来自两个不同的谱系(任选来自B/Victoria和B/Yamagata)。所述乙型毒株中至少一种，合适地两种乙型毒株，将来自循环谱系。所述组合物特别适用于儿童。
合适地，HA/每毒株为通常15 μg HA/每毒株，如通过单一放射免疫扩散法(SRID)所测定的。HA/每毒株可替代地是低量的HA(任选地10 μg HA/每毒株或更低)。合适地，HA/每毒株为约5 μg或更低，约2.5 μg或更低。所述低量的HA可以低至实际上可行的，条件是其允许配制符合结合药典的需求，如下述国际(例如EMEA或FDA)功效标准的疫苗(参见表1和表2及给出的具体参数)。HA的量/每毒株可以是和3.8 μg/人疫苗剂量一样少，或者甚至和1.9 μg/剂量一样少。合适地使用0.5 ml的疫苗剂量。有利的是，可以比常规注射的裂解流感疫苗(一般为约0.5、0.7或1ml/剂量)更小体积，提供本发明的疫苗剂量，特别但不完全是低HA量的疫苗。本发明的小体积剂量合适每剂量低于500 μl、通常低于300 μl、合适不超过约200 μl或更低。0.2 ml的剂量体积适合用于鼻内施用且可以以0.1 ml/每鼻孔的两部分进行施用。按常规，可根据原始原液样品中的HA浓度，或根据具有通过鼻内或皮内途径给予的较小剂量的递送途径，或根据目标人群(例如婴儿可接受成人剂量的一半)，对剂量体积略作改动。
本发明的流感药物合适地符合疫苗的某些国际标准。标准在国际上适于测量流感疫苗的功效。按照欧洲药品评价局(European Agency
for the Evaluation of Medicinal Products)人用标准评价血清学变量(CHMP/BWP/214/96，专利药品委员会(Committee for Proprietary Medicinal Products，CPMP)。用于临床试验的Note for
harmonization of requirements for influenza vaccines,
1997.CHMP/BWP/214/96通知N°96-0666:1-22涉及流感疫苗的年度许可程序(表3)。对成年群体(18-60岁)和老年群体(>60岁)的要求不同(表3)。对于大流行间流感疫苗的每年重新登记，至少一种评价(血清转化因子、血清转化率、血清保护率)应符合对疫苗中所包括的全部流感毒株的欧洲要求。等于或大于1:40的HI滴度比例被视为最相关，因为预期这些滴度对保护有最佳相关性[Beyer
W等人1998. Clin Drug Invest.;15: l-12]。
如在“Guideline on dossier structure and content for pandemic
influenza vaccine marketing authorisation application (CHMP/VEG/4717/03，2004年4月5日，或2007年1月24日更近期的EMEA/CHMP/VWP/263499/2006，由欧洲药品管理局委员会(the
European Medicines Agency's Committee)发出的标题为‘Guidelines
on flu vaccines prepared from viruses with a potential to cause a pandemic’，可获自www.emea.eu.int)中规定的一样，在有关源自非循环毒株的流感疫苗的具体标准不存在的情况下，预期大流行候选疫苗应(至少)能够在未接触抗原的(unprimed)成人或年长受试者中，在2个剂量疫苗后引发足够的免疫应答以合适地符合为现有疫苗设定的所有3个现行标准。EMEA指导描述了以下情况：在大流行的情况下群体将是未免疫的，并因此预期大流行候选疫苗应当满足用于季节性疫苗的所有3个CHMP标准。未明确要求需要在接种前血清阴性受试者中证实该情况。然而，大流行前疫苗的指导预计，对于用于以前没有免疫的群体的初次免疫的疫苗，用于大流行预防的流感疫苗应当诱导高血清保护率，优选在一个或最多两个剂量之后。应当满足如指导CPMP/BWP/214/96中所定义的所有三个标准(血清保护率、GMT增加和应答率)。
用于本发明的组合物对于组合物中所包括的毒株合适地符合至少一个所述标准(一个标准足以获得批准)，合适地至少两个，或通常表1所示的至少所有3个保护标准。
表1 (CHMP标准)
70%的血清保护率由欧洲药品管理局人用医药产品(CHMP) 定义为每年的季节性流感疫苗通常需要满足，并且CHMP预期大流行候选疫苗也满足的三个标准之一。但是，数学建模已经表明，在群体水平针对某些漂移毒株仅仅30%有效的疫苗在帮助减少大流行强度方面也可以是有效的，并且，使用在针对感染(易感性30%降低)针对大流行毒株(30%的交叉保护)方面30%有效的(大流行前)疫苗的大流行接种活动也可以使临床攻击率有效降低75%，并且因此降低群体内的发病率/死亡率(Ferguson等人, Nature 2006)。
U.S.
FDA已经发表了关于支持大流行流感疫苗的批准所需的临床数据的草拟指南(CBER草拟标准)(可以从联系、训练和制造商协助办公室(HFM-40),
1401 Rockville Pike, Suite 200N, Rockville, MD 20852-1448, 或通过拨打电话1-800-835-4709或301-827-1800,或从网站http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm获得)，并且所述提议的标准也是基于CHMP标准。FDA使用略微不同的年龄截止点。合适的终点类似地包括：1)达到HI抗体滴度> 1:40的受试者的百分比，和2)血清转变率，定义为接种后HI抗体滴度增加4倍。几何平均滴度(GMT)应该包括在结果中，但数据应该不仅包括点估计值，也应该包括血清转化出现率的95%置信区间的下限，并且第42天时HI滴度> 1:40的出现率必须超过目标值。因此，应该提供这些数据和这些评价的点估计值的95%置信区间(CI)。FDA草拟指南需要满足这两项标准。这些FDA-发行标准概括在表2中。
表2 (CHMP草拟标准)
相应地，在本发明的一个方面，提供了疫苗组合物将能够诱导针对流感病毒的免疫应答，其满足上述保护的至少一个标准，合适地两个，合适地所有三个标准。具体而言，在一个单一剂量后，对于疫苗中存在的毒株或所有毒株，满足以下标准中的至少一个。相应地，还提供了一个剂量鼻内流感疫苗，或较低量的流感疫苗，其中所述佐剂是本文中所定义的。
接种群体是儿童、成人和老人。接种的目标群体是整个群体，例如健康年轻成人(例如年龄为18-50或18-60)、老年人(典型地年龄大于60岁)或婴儿/儿童/青少年。目标群体可以特别是首次用于实验的、或免疫功能低下的或免疫抑制的。和健康成人相比，免疫功能低下的或免疫抑制的人一般不能很好地对抗原、尤其是流感抗原应答。在特定的方面，疫苗鼻内施用。典型地，疫苗局部施用于鼻咽区，合适地没有吸入到肺中。理想的是使用将疫苗制剂递送入鼻咽区而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内递送装置。本发明疫苗的合适的鼻内施用装置是喷雾装置。合适的商购鼻喷雾装置包括AccusprayTM(Becton
Dickinson)。雾化器产生非常细小的雾，其可被容易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。用于鼻内用途的合适喷雾装置是这样的装置：其性能不依赖于使用者提供的压力。这些装置称为压力阈装置。只有在提供阈压力时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压力阈装置在本领域是已知的，描述于例如WO
91/13281和EP311863B和EP516636，这些文献通过引用并入本文。这种装置可由Pfeiffer GmbH购买，还描述于Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe，1999年9月。合适的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体测量)范围为1-200 μm，合适地是10-120 μm。小于10 μm存在吸入风险，因此理想的是10 μm以下的液滴不超过约5%。120 μm以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120 μm以上的液滴不超过约5%。
双剂量送递是用于本发明疫苗的鼻内递送系统的更合适特征。双剂量装置包含单疫苗剂量的两个亚剂量，每个鼻孔施用一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于单一室中，装置的构造允许每次有效送递单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置施用本发明疫苗。
因此，在一个方面，本发明提供了非活流感病毒抗原制剂和如本文中定义的佐剂化的物质在制备疫苗制剂中的用途，所述疫苗制剂用于一个剂量的针对流感的鼻接种。疫苗可以用单剂量形式或双剂量形式(通常一个亚剂量，为每个鼻孔任选地施用0.1 ml)施用。
在另一个方面，本发明在另一个方面提供了低剂量的非活流感病毒抗原和如本文中定义的佐剂化的物质在制备粘膜疫苗中的用途，所述粘膜疫苗用于针对流感的免疫。尽管本发明的疫苗可以作为单一剂量施用，其组分也可以同时或在不同时间一起共同施用(例如，流感抗原可以与佐剂的施用分开施用或合适地同时施用)。除了单一施用途径，当施用两次注射时，可以使用两种不同的施用途径。例如，佐剂化的流感抗原的第一次施用(例如引发剂量)可以IM(或ID)施用，第二次使用(例如增强剂量)可以IN(或ID)施用。此外，本发明的疫苗对于引发剂量可以IM施用，对于增强剂量可以IN施用，或反之亦然。
在进一步的方面，本发明提供了药物药剂盒，其包含鼻内喷雾装置和单剂量流感病毒疫苗。合适地，单剂量流感疫苗是非活病毒疫苗，任选地是裂解的病毒疫苗。合适地，该装置是双剂量递送装置，其用于两个亚剂量的疫苗，任选地用于两个亚剂量的各自0.1
ml疫苗。
在一个方面，组合物额外地包含药学上可接受的赋形剂以形成药物组合物。在一个方面，本文所使用的“赋形剂”是指加入组合物中且不负责组合物的主要活性的任何物质。赋形剂可以用于例如增加活性成分的稳定性、一致性或递送性。如本文所使用的，赋形剂可以包括稀释剂或载体。
本发明涉及用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括
生长志贺氏菌菌株，
破碎志贺氏菌细胞；和
通过涉及将外膜蛋白与内膜蛋白分离的方法分离包含外膜蛋白和LPS的级分。
在一个方面，该方法包括一个或多个离心步骤。
在一个方面，该方法包括去污剂溶解步骤。
在一个方面，通过细胞质内膜蛋白的选择性溶解而提供外膜蛋白与内膜蛋白的分离。
本发明涉及通过本发明的方法制备的产物。
在一个方面，该方法包含两个或更多个离心步骤。
在一个方面，该方法包括通过超声处理破碎细胞，合适地在45 AMP, 5X 45秒和/或持续5x 60秒。在另一个方面，可以通过均质化或其他机械方式破碎细胞。
在一个方面，该方法包括通过选自下列的至少一种方法从破碎的志贺氏菌细胞的细胞混合物中去除细胞碎片：离心、过滤、深度过滤或阴离子交换层析。
在另一个方面，分离包含外膜蛋白和LPS的级分包括一个或多个选自离心、过滤、深度过滤或阴离子交换层析的步骤。
在一个方面，该方法包括2个超声处理步骤，用于破碎细胞和用于破碎可能形成的聚集体，以形成均匀的组合物。
在一个方面，该方法包括通过N-月桂酰肌氨酸溶解细胞膜蛋白。可以使用的可替代去污剂包括下列中的一种或多种：十二烷基二甲基甜菜碱(LDB)、脱氧胆酸钠(DOC)、十二烷基二甲基胺氧化物(LDAO)、溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸、辛基硫酸钠、Triton、Trizma(R) 硫酸十二烷酯、Nonidet(TM)
P 40、戊乙二醇和衍生物、聚氧乙烯(20) 脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯40硬脂酸酯、皂苷、TWEEN(R)
20和相关物质、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(Mega-10)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2 –羟基- 1-丙磺酸盐(CHAPSO)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span-20)、聚氧乙烯[23] 月桂基醚(BRIJ)和二甲基辛基膦氧化物(APO)。在本发明的一些方面，仅使用约200
ppm或更少的去污剂来保持基于OMP的免疫刺激剂可溶。
具体而言，本发明提供了制备组合物的方法，所述方法包括下列步骤：志贺氏菌在37℃生长，细胞在RT下以2,770g离心30 min，弃去上清液，沉淀重悬浮在10mM Hepes中，以43 AMP, 5 x 45 sec超声处理。重悬浮物在RT下以1,700g离心20 min，弃去沉淀，且上清液在4℃下以100,000g离心60 min。弃去上清液，且将沉淀重悬浮于1％N-月桂酰肌氨酸中，然后在4℃下以100,000g离心60 min。弃去上清液，且将沉淀重悬浮于10mM Hepes中，以43
AMP, 5 x 45 sec超声处理(电力)，添加MgCl2且过滤(0.2 um)。
在本发明的一个方面，所述志贺氏菌细菌是工程改造的细菌。细菌可以进行工程改造以过表达某种蛋白和/或工程改造以低表达至少一种其他蛋白。可以通过本领域中已知的各种方法工程改造细菌，所述方法包括位点定向诱变、或破坏或缺失编码基因的部分或全部。细菌也可以进行工程改造以便在选择性生长条件下培养时过表达或低表达某些多肽，如外膜蛋白。此外，且如本领域中所理解的，可以通过将某些编码序列添加至细菌基因组中或通过表达载体而将细菌工程改造。
在一个方面，志贺氏菌菌株是弗氏志贺氏菌，任选地弗氏志贺氏菌2a BS103。也可以使用其他志贺氏菌种和弗氏志贺氏菌菌株。
在一个方面，志贺氏菌菌株是能够在BL1和BL2条件下生长的非致病菌株。在一个方面，本发明的组合物可以在BL1或BL2条件下产生。
在一个方面，志贺氏菌属种相对于野生型志贺氏菌具有降低的毒力或毒性。合适地，志贺氏菌种可以在BL1和BL2设施中生长和操作，且不需要BL3或更高的设施。在一个方面，通过基因操作修饰菌株的毒力和/或毒性。在另一个方面，用降低的毒力和/或毒性选择菌株。在一个方面，菌株具有LPS突变。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物，其用于药物中。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物，其用作免疫佐剂。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物，其用作粘膜免疫佐剂。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物，其用作针对志贺氏菌感染或疾病的疫苗。
在一个方面，本发明涉及组合物，其包含
1 能够引发针对传染性病原体的免疫应答的抗原，和
2 志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子，
其用于预防传染性病原体引起的感染或疾病。
在一个方面，本发明涉及组合物，其包含
1 抗原，和
2 志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物，其用于药物中。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物在制备佐剂中的用途。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物在制备粘膜佐剂中的用途。
在一个方面，本发明涉及志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子在制备针对志贺氏菌感染或疾病的疫苗中的用途。
在一个方面，本发明涉及志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子在制备针对感染或疾病的疫苗中的用途。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物在制备用于预防传染性病原体引起的感染或疾病的药物中的用途，所述药物包含能够引发针对传染性病原体的免疫应答的抗原。
在一个方面，本发明涉及引发佐剂化的免疫应答的方法，所述方法包括将包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物递送至个体。
在一个方面，本发明涉及引发针对传染性病原体的免疫应答的方法，所述方法包括将组合物递送至需要其的个体，所述组合物包含：
能够引发针对传染性病原体的免疫应答的抗原，和
包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物。
在一个方面，本发明涉及治疗/降低/改善传染性病原体引起的感染或疾病的方法，所述方法包括将药物组合物递送至需要其的个体，所述组合物包含能够引发保护免于传染性病原体引起的感染或疾病的免疫应答的抗原，所述药物组合物包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子。
在一个方面，本发明涉及其中传染性病原体是细菌或病毒传染性病原体(例如流感或RSV)的方法。
在一个方面，本发明涉及方法，其中能够引发保护免于感染或疾病的免疫应答的抗原是RSV F / G，或流感HA/ NA。在另一个方面，抗原源自室内尘螨、草花粉、豚草花粉、猫、树、霉菌和食物。
使用的抗原可以是至少完整的或破碎的微生物。微生物可以选自病毒、细菌、真菌和原生动物。抗原可以来自流感病毒。抗原可以包含至少一种血凝素；它可能是单价的或三价的。此外，抗原可以包含来自下列的片段和/或变体和/或杂合抗原：人抗原如癌抗原、流感病毒、患疟疾的原生动物、HIV、桦树花粉、DerPl、草花粉、RSV、非典型流感嗜血杆菌和莫拉克斯氏菌(Morexella)。抗原可以是重组抗原或合成的抗原和/或杂合/嵌合抗原。
在一个方面，本发明涉及治疗/降低/改善志贺氏菌感染的方法，所述方法包括将如本文公开的组合物递送至需要其的个体。
在一个方面，本发明涉及方法，其中药物组合物通过鼻内途径或其他粘膜途径递送。
本发明的免疫刺激和免疫原性组合物和疫苗可以用作治疗现有疾病或预防地以防止疾病的发生或恶化。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的药剂盒，所述药剂盒用于同时、基本上同时或相继递送。
本发明的组合物和/或免疫原性组合物可以通过选自下列的途径进行施用：口服、鼻内、舌下、直肠、肌内、静脉内、腹膜内、粘膜、肠内、肠胃外和吸入。粘膜途径是经由鼻粘膜、口咽粘膜、眼粘膜或泌尿生殖道粘膜。
在另一个方面，将所述组合物施用于哺乳动物诱导针对感染(包括病毒和细菌感染)的先天免疫应答。
当提供抗原时，那么合适地选择组合物中的抗原量作为诱导免疫原性应答或免疫刺激效应的量。这种量可随所用的特定组分以及如何提供它们而变化。通常，预期每个剂量将包含1
-100μg蛋白抗原或OMV制剂，合适地5-50μg，且最一般在5-25μg的范围内。
通过标准研究可以确定对于特定组合物的最佳量，所述标准研究包括：观察受试者中的合适免疫应答。
在本发明的组合物的初次剂量后，受试者可接受一次或若干次适当间隔的增强剂量。
通过多种试验，可以评价疫苗的功效。在动物模型中的保护试验是本领域众所周知的。
本发明的进一步方面涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含外膜蛋白(OMP)和LPS分子，其合适地都来自另外的病原性生物体的无毒菌株，所述组合物合适地能够引发针对病原性生物体的免疫应答。
在不同的方面，本发明涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据本发明的方法从任何合适物种制备的外膜蛋白(OMP)和LPS分子。在一个方面，合适的物种选自(1) 原核生物，包括但不限于(a) 细菌(l)(um), 意味着以下属的成员：链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特菌属(Bordetella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌(Streptomycetes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、Fancisella、Pasturella、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、毒丝菌属(Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链杆菌属(Streptobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、荚膜菌属(Calymma
tobacterium)、布氏杆菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克氏杆菌属(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、文氏菌属(Erwinia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、螺旋菌属(Spirillum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团杆菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和支原体(Mycoplasma)，并且进一步包括，但不限于，以下种或组的成员：A组链球菌(Group
A Strep tococcus)、B组链球菌、C组链球菌、D组链球菌、G组链球菌、肺炎链球菌(Streptococcus
pneumonia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、粪链球菌(Streptococcus
faecalis)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、坚忍链球菌(Streptococcus durans)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria
gonorrheae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus
epidermidis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae)、阴道加德菌(Gardnerella vaginalis)、结核分支杆菌(Mycobacteri-tuberculosis)、牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)、溃疡分支杆菌(Mycobacterium
ulcerans)、麻风分支杆菌(Mycobacteriumleprae)、衣氏放线菌(Actinomyctes israelii)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、百日咳博德特菌(Bordetell apertusis)、副百日咳博德特菌(Bordatella
parapertusis)、支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、痢疾志贺氏菌(Shigella
dysenteriae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus
parainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus
ducreyi)、博德特菌(Bordetella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌(Citrobacter
freundii)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、鼠疫耶尔森(氏)菌(Yersinia
pestis)、肺炎克氏杆菌(Kleibsiellapneumoniae)、Serratia marcessens、Serratia
liquefaciens、霍乱弧菌(Vibriocholera)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenterii)、弗氏志贺氏菌(Shigella
flexneri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Franscisella tularensis、Brucella
abortis、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、产气荚膜梭菌(Clostridium
perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、苍白密螺旋体(Treponema
pallidum)、立克次(氏)立克次(氏)体(Rickettsia rickettsii)和Chlamydia
trachomitis，(b)古细菌(archaeon)，包括但不限于Archaebacter，和(2)单细胞的或丝状的真核生物，包括但不限于原生动物、真菌、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluveromyces)或念珠菌属(Candida)属的成员以及酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)或白色念珠菌(Candida
albicans)种的成员。
在不同的方面，本发明涉及包含至少一种志贺氏菌外膜蛋白的组合物，且所述组合物或直接或作为对于另一种成分的佐剂用于治疗或预防疾病。
在又另一个方面，本发明涉及在受试者中预防和/或降低淀粉样蛋白沉积或阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括用本文所述的组合物治疗受试者，且本发明的组合物用于预防和/或降低淀粉样蛋白沉积或阿尔茨海默氏病。在一个方面，组合物是如本文实施例6中制备的SFOMP。
我们已经确定，如本文实施例6中制备的SFOMP组合物增加人小胶质细胞在β淀粉样蛋白1-42的胞吞作用中的活性。与单独的β淀粉样蛋白的递送相比，SFOMP特别地增加人小胶质细胞对β-淀粉样蛋白1-42肽的胞吞作用水平(27％细胞含有β淀粉样蛋白相比于当使用SFOMP时56％细胞含有β淀粉样蛋白)。
此外，与PBS相比，Sfomp(在5ug剂量LPS/每只小鼠)可以使C57BL6小鼠的血液中谱系阴性CD11b阳性的单核细胞的百分比增加三倍的系数。这些细胞被认为在能够吞噬β淀粉样蛋白的小胶质细胞在脑中的发育中是重要的。
如本文所使用的，“淀粉样蛋白”涵盖在体内沉积的任何不溶性纤维蛋白聚集物。淀粉样蛋白沉积可以是器官特异性的(例如中枢神经系统、胰腺等)或全身性的。根据本发明的该方面，经历沉积的促淀粉样变蛋白包括β蛋白前体、朊病毒、α-突触核蛋白(α-synuclein)、tau、ABri前体蛋白、ADan前体蛋白、糊精、载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、凝溶胶蛋白、心钠素、降钙素、角膜上皮素、乳铁蛋白、免疫球蛋白轻链、运甲状腺素蛋白、A淀粉样变性(A amyloidosis)、β2-微球蛋白、免疫球蛋白重链、纤维蛋白原α链、催乳素、角蛋白和medin。淀粉样蛋白沉积可以作为其自身实体或由于其他疾病(例如多发性骨髓瘤、慢性感染、或慢性炎症性疾病)所导致而发生。
因此，本发明的方法可以进一步用于治疗患有状况或疾病的受试者，所述状况或疾病与促淀粉样蛋白沉积相关或者由促淀粉样蛋白沉积所导致。这样的状况包括但不限于阿尔茨海默氏病、弥漫性路易体病、唐氏综合征、遗传性淀粉样变性的脑出血、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、致死性家族性失眠症、英国家族性老年痴呆症、丹麦家族性老年痴呆症、家族性角膜淀粉样变性、家族性角膜营养不良、甲状腺髓样癌、胰岛瘤、2型糖尿病、分离的心房淀粉样变性、脑垂体淀粉样变性、主动脉淀粉样变性、浆细胞病症、家族性淀粉样变性、老年性心脏淀粉样变性、炎症相关的淀粉样变性、家族性地中海热、透析相关的淀粉样变性、系统性淀粉样变性以及家族性系统性淀粉样变性。
阿尔茨海默氏病的治疗或预防是本发明的一个优选特征。
在该方面，本发明涉及在受试者中预防或治疗疾病的方法。在一个方面，用于预防或治疗的受试者可能已经被诊断具有淀粉样蛋白沉积表征的疾病的症状。在一个方面，用于治疗的受试者还没有被诊断具有淀粉样蛋白沉积表征的疾病的症状。
在一个方面，本发明涉及对淀粉样蛋白沉积的作用，且另一个方面涉及对与疾病状态相关的行为、和特别是预防或降低与阿尔茨海默氏病相关的行为的作用。
在一个方面，本发明的方法和组合物对于淀粉样蛋白沉积和与疾病相关的行为、如与阿尔茨海默氏病相关的行为具有作用，尽管在另一个方面，本发明的方法和组合物在淀粉样蛋白沉积水平或在行为水平具有作用。
在一个方面，预防或降低阿尔茨海默病的严重度包含预防或降低记忆的丧失。在进一步方面，本发明涉及记忆的改善。记忆可以是空间记忆。
在一个进一步方面，本发明涉及本文公开的组合物用于β淀粉样蛋白的改善的胞吞作用的用途。
在一个方面，本发明涉及本文公开的组合物刺激小胶质细胞活性的用途。
在一个方面，本发明涉及包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子与抗原组合的组合物的用途，所述抗原例如，多肽或其部分或模拟物，如β淀粉样蛋白。当使用β淀粉样蛋白时，那么可以使用N末端片段，如在氨基酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10开始且在氨基酸6、7、8、9、10、11、12、13、14 或15结束的具有至少5个氨基酸的片段。
本申请中的所有参考文献(包括专利申请和授权的专利)的教导，都通过引用完整地并入本文。本申请要求其优先权的任何专利申请以本文中关于出版物和参考文献所述的方式通过引用整体并入本文。
为了避免疑问，发明人在本文中意图用术语“包含”和“包括”表示，在每种情况下，任选地可被术语“由……组成”替换。如在本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含”(和包含的任意形式)、“具有”(和具有的任意形式)、“包括”(和包括的任意形式)或“含有”(和含有的任意形式)是包括性的或开放式的，且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。
本文中关于本公开内容的“疫苗组合物”的实施方案也适用于关于本公开内容的“免疫原性组合物”的实施方案，反之亦然。
在所有数值中的术语“约”(或“大约”)允许5%的偏差，即约1.25%的值是指1.19%-1.31%。
当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，使用的词语“一个”或“一种”可以表示“一个(种)”，但是也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或超过一个(种)”相一致。在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确地指出仅表示替代方案，或所述替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅表示替代方案和“和/或”的定义。在本申请的通篇中，术语“约”用于表示，数值包括测定所述数值所用的测量、方法所固有的误差变化，或者研究受试者之间存在的变化。
本文使用的术语“或其组合”表示，在所述术语前面列出的项目的所有变换和组合。例如，“A、B、C或其组合”意图包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，且如果在特定背景下次序是重要的，也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，特别地包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员会理解，通常不存在关于任意组合中的项目或术语的数目的限制，除非从上下文中另外显而易见。
考虑到本公开内容，无需过多实验，可以制备和执行在本文中公开的和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经以特定实施方案的方式描述了本公开内容的组合物和方法，本领域技术人员会明白，可以对所述组合物和/或方法和本文所述方法的步骤或步骤的次序做出变化，而不脱离本公开内容的概念、精神和范围。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替代和修改视作在所附权利要求书定义的本公开内容的精神、范围和概念内。应该理解，本文所述的特定实施方案以例证的方式显示，而不是显示为本公开内容的限制。本公开内容的基本特征可以用于不同的实施方案中，而不脱离本公开内容的范围。本领域技术人员仅仅使用常规研究会认识到或能够确定本文所述的具体操作的众多等效方式。这样的等效方式被视作在本公开内容的范围内，且被权利要求覆盖。在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都指示本公开内容所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同特别地且单个地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入。
本公开的任何方面可以与本公开的任何其他方面组合，除非这样特征组合从上下文中另外显而易见。
将通过参考下述的非限制性的实施例，进一步描述本公开内容：
实施例1 通过颗粒大小评价的SFOMP稳定性和颗粒的表征
根据实施例6的方法制备SFOMP颗粒，且通过测量散射光评价随着时间推移的平均直径。图1。
颗粒大小在4摄氏度经3个月是稳定的。
蛋白与LPS平均比值变化范围为(0.7 – 1.1):1，如表3中所示。
表3 SFOMP研究批次和中试稳定性和电子显微镜数据的概述
实施例2 电子显微镜(EM)
根据实施例6制备的SFOMP颗粒的EM显示，弗氏志贺氏菌在颗粒的外膜中包含LPS，如通过抗弗氏志贺氏菌LPS抗体结合所测量的。图2。
实施例3 通过SDS-PAGE/考马斯蓝染色的SFOMP、Protollin、和V2蛋白体中的主要蛋白
SFOMP颗粒根据实施例6的过程进行制备，且通过使用标准技术的凝胶电泳以V2蛋白体和Protollin进行比较(后者包含脑膜炎奈瑟氏菌OMP和志贺氏菌LPS，例如如美国专利申请公开号2003/0044425中所公开的) 。
如图3中所示，SFOMP中的OMP不同于Protollin和V2蛋白体中的OMP。SFOMP制剂包含OMP1b、OMP3a和OMPX。表4
表4 SFOMP中三种主要蛋白的MS/MS鉴定的概述
实施例4 SFOMP包含在基于细胞的测定中触发剂量应答性激活的TLR1-2和TLR4通路激动剂
HEK细胞用SFOMP、Protollin、V1和V2蛋白体处理。V1蛋白体仅含有脑膜炎奈瑟氏菌OMP，而V2此外还含有LPS。Protollin含有脑膜炎奈瑟氏菌OMP和弗氏志贺氏菌LPS。
在TLR1-2人胚肾(HEK)细胞中，通过用SFOMP 以剂量依赖的方式处理而激活NFkB，显示SFOMP包含TLR1-2激动剂。图4。
在TLR4 Hek细胞中，通过用SFOMP 以剂量依赖的方式处理而激活NFkB，显示SFOMP包含TLR- 4激动剂。
实施例5 鼻内施用的SFOMP-佐剂化的preF抗原保护小鼠免于RSV感染
在D0和D21用RSF蛋白F和V2蛋白体或根据实施例6制备的SFOMP中任一种鼻内接种小鼠。然后小鼠在第47天用RSV病毒攻击，且在第51天处死。攻击后小鼠的肺均质物进行测试以观察病毒的LD50值。
结果显示在图5中。
仅SFOMP针对RSV感染不是有效的，但是相比于单独的F抗原和V2蛋白酶显著改善了保护。
实施例6 制备用于中试佐剂研究的SFOMP研究批次
使用的细胞为在37℃ 250
rp振荡3h而生长的弗氏志贺氏菌2a
BS103(GMP细胞库)。将细胞在RT以2,770g离心30 min；且弃去上清液。在10mM Hepes中重悬浮沉淀。以43
AMP, 5 x 45秒对细胞进行超声处理。将细胞在RT 以1,700g离心20 min，且弃去沉淀。将上清液在4℃下以100,000g离心60 min；且弃去上清液。在1％N-月桂酰肌氨酸中重悬浮沉淀。将重悬浮物在4℃下以100,000g离心60 min；且弃去上清液。在10mM Hepes中重悬浮沉淀，且以43 AMP, 5 x 45秒进行超声处理。添加MgCl2且进行过滤(0.2 μm)。产生的组合物在本文中被称为SFOMP。图6。
实施例7 微阵列分析使用SFOMP的人树突状细胞
通过微阵列分析人树突状细胞而评价树突状细胞表达中的基因表达。结果显示在图7中。与用PBS缓冲液处理的树突状细胞相比，SFOMP能够引起树突状细胞中某些基因的上调和下调。
实施例8 鼻内施用的SFOMP-佐剂化的preF抗原引发血清和肺中和抗体
1μg RSV pre F抗原与3或0.3μg SFOMP组合且鼻内递送至小鼠。获得中和抗体。(图8)。
实施例9 在3 mg裂解抗原和5 mg佐剂的两次IN免疫后在BALB/c小鼠中的应答
在3 mg流感裂解抗原和5 mg
SFOMP佐剂的两次鼻内免疫后评价小鼠中的免疫应答。评价针对HA和还有IgG和IgA的几何平均抗体滴度。使用流感New Caladonian A株以产生裂解抗原。测定几何平均滴度(GMT)。SFOMP+抗原给出了与用单独的PBS或单独的抗原相比显著改善的应答。(图9、10和11)。
图12表明SfOMP、Protollin和V2 Protollin之间的差异，且表明LPs /OMP比例。
实施例10 在C57BL/6小鼠中以1 ug剂量腹膜内注射SFOMP (1 ug/每只小鼠)或弗氏志贺氏菌脂多糖(LPS)后24小时脑内的先天激活。图13。
通过由原位杂交测定的TLR2 mRNA的存在指示先天激活。脑室区域周围的黑色沉积显示，与阴性对照(A)相比，TLR2 mRNA存在于用SFOMP注射的小鼠脑中(B)。来自弗氏志贺氏菌LPS注射的小鼠的脑还显示，在脑实质、皮质和脑室区内的先天激活(C)。在原位杂交显微图中对TLR2的Iba1免疫组织化学显示，TLR2 mRNA主要存在于小胶质细胞(Iba1+细胞)中。
实施例11 用SFOMP或弗氏志贺氏菌LPS与人小鼠小神经胶质细胞系(CHME)孵育后在体外测量的Aβ42胞吞作用。图14。用Hi-Lyte Fluo488 (Anaspec Inc.)标记Αβ42肽，且以1 ug/ml使用。24小时的时间点足以观察到，在与SFOMP孵育后对于56％细胞的Aβ42摄取，或者与阴性对照(单独Αβ42肽)相比，在75％的水平(图14)。Αβ42肽在其摄取后位于溶酶体内(lysotracker red)，表明Aβ42 肽被胞吞。显示了SFOMP孵育后的代表性图(图14B)。箭头指示Aβ42肽和溶酶体标记(lysotracker)的共定位。
Claims (37)
1.免疫原性组合物，包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述OMP是OMP 1b、OMP
3a或OMPX或其组合。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述LPS是TLR4通路激动剂。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述OMP是TLR2通路激动剂。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不包含志贺氏菌持家基因产物。
6.根据权利要求1所述的组合物，具有酸性pI。
7.根据权利要求1所述的组合物，具有30–180 nm的颗粒直径大小。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒在4℃持续3个月具有稳定直径。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述LPS与OMP的比例在0.6:1.3和0.8:1.1之间，优选0.9:1。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述志贺氏菌菌株是弗氏志贺氏菌。
11.根据权利要求1所述的组合物，包含额外的抗原。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述额外的抗原是来自除志贺氏菌以外的物种。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是来自呼吸道合胞病毒 (RSV)或流感病毒 。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物能够上调树突状细胞中下列基因的一种或多种：IL6、CSF2、CSF3、CXCL10。
15.根据权利要求1所述的组合物，额外地包含药学上可接受的赋形剂以形成药物组合物。
16.根据前述权利要求中任一项的组合物，其通过包括以下步骤的方法产生
生长志贺氏菌菌株，
破碎所述志贺氏菌细胞；和
分离包含外膜蛋白和LPS的级分，其任选地通过涉及一个或多个离心步骤和去污剂溶解步骤的方法。
17.用于制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括
生长志贺氏菌菌株，
破碎所述志贺氏菌细胞；和
分离包含外膜蛋白和LPS的级分，其任选地通过涉及一个或多个离心步骤和去污剂溶解步骤的方法。
18.根据权利要求16或17所述的方法或组合物，其中所述方法额外地包括下列步骤中的一个或多个：
通过超声处理破碎细胞，
通过N-月桂酰肌氨酸溶解细胞膜蛋白。
19.根据权利要求16-18所述的方法或组合物，其中所述方法包括下列步骤：
志贺氏菌在37℃生长；
将细胞在RT 以2,770g离心30 min；
弃去上清液；
在10mM Hepes中重悬浮沉淀；
以43 AMP, 5 x 45秒(电力)进行超声处理；
在RT 以1,700g离心20 min，弃去沉淀；
在4℃以100,000g离心60 min；弃去上清液；
在1％N-月桂酰肌氨酸中重悬浮沉淀；
在4℃以100,000g离心60 min；弃去上清液；
在10mM Hepes中重悬浮沉淀；
以43 AMP, 5 x 45秒进行超声处理
添加MgCl2且过滤(0.2 um)。
20.包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物，其用于药物中。
21.包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物，其用作疫苗佐剂。
22.包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物，其用作粘膜疫苗佐剂。
23.包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌LPS分子的组合物，其用作针对志贺氏菌感染或疾病的疫苗。
24.志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子在制备佐剂中的用途。
25.志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子在制备粘膜佐剂中的用途。
26.志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子在制备针对志贺氏菌感染或疾病的疫苗中的用途。
27.志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子在药物中的用途。
28.佐剂化免疫应答的方法，所述方法包括将包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子的组合物递送至个体。
29.引发针对传染性病原体的免疫应答的方法，所述方法包括将药物组合物递送至需要其的个体，所述药物组合物包含能够引发保护免于所述传染性病原体引起的感染或疾病的免疫应答的抗原，所述药物组合物还包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子。
30.治疗/降低/改善传染性病原体的感染的方法，所述方法包括将药物组合物递送至需要其的个体，所述药物组合物包含能够引发保护免于所述传染性病原体引起的感染或疾病的免疫应答的抗原，所述药物组合物包含志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述传染性病原体是细菌或病毒。
32.治疗或降低或改善志贺氏菌感染的方法，所述方法包括将包含权利要求1-16的组合物的组合物递送至需要其的个体.
33.根据权利要求28-33所述的方法，其中所述药物组合物通过鼻内途径递送.
34.药剂盒，包含用于同时、基本上同时或相继递送的志贺氏菌外膜蛋白(OMP)和志贺氏菌 LPS分子.
35.在患者中预防和/或减少淀粉样蛋白沉积或阿尔茨海默氏病的方法，所述方法包括用有效量的权利要求1-16的组合物治疗受试者.
36.权利要求1-16的组合物，其用于预防和/或减少淀粉样蛋白沉积或阿尔茨海默氏病.
37.权利要求1-16的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或减少淀粉样蛋白沉积或阿尔茨海默氏病。
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