CN103278502A - 启动子活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种启动子活性的检测方法，包括：农杆菌侵染植物胚；共培养至少2天；GUS鉴定。本发明启动子活性的检测方法仅需要对植物胚（特别是玉米胚）共培养3天，无需经历数星期甚至数月的组织培养过程，便可通过GUS染色分析和/或GUS蛋白含量测定对启动子活性进行鉴定，避免了玉米基因型转化特异性、诱导分化和生根难等环节，节省了时间，提高了筛选效率，降低了生产成本，同时实验结果直观、准确。

Description

启动子活性的检测方法

技术领域

本发明涉及一种启动子活性的检测方法，特别是涉及一种组成型启动子的快速检测方法。

背景技术

异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于具有在植物宿主中起作用的可操作地连接的启动子。启动子序列的选择将决定异源DNA序列在植物宿主中表达的时间和位置。因此，当需要在植物优选的组织中表达时，使用组织特异性启动子。相反，当需要在全部植物细胞中表达时，使用组成型启动子。可以通过直接处理植物胚的分生组织来获得转化的植物，通过对转化植株的分析以确定启动子序列是否在目标组织中启动目的异源DNA序列表达。

玉米转基因技术近年来得到了很大的发展，已建立了农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、碳化硅纤维介导法和花粉管导入法等一系列转化技术。相对而言，农杆菌介导法以其效率较高而成为目前应用最为广泛的植物转基因技术，该方法的基本流程为：外植体→愈伤组织→农杆菌介导转化→丛生芽→筛选→生根→转化株。因此，在利用农杆菌介导的玉米遗传转化进行启动子序列活性检测时，存在如下缺陷：

（1）愈伤组织形成时间往往长达数星期甚至数月，十分耗时，且工作量繁重；

（2）玉米胚性愈伤组织的诱导分化较水稻等作物困难，丛生芽的分化率十分不稳定；

（3）分化植株的生根难；

（4）由于转基因受体植物的基因型差异，不能够适用多样性品种或品系，表现出较为明显的玉米基因型转化特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种启动子活性的检测方法，有效克服现有技术耗时、工作量繁重、诱导分化和生根难、基因型转化特异性等技术缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种启动子活性的检测方法，包括：

农杆菌侵染植物胚；

共培养至少2天；

GUS鉴定。

在上述技术方案的基础上，所述农杆菌包含启动子序列。

优选地，所述启动子为组成型启动子。

进一步地，所述组成型启动子包括Ubi基因启动子、APX基因启动子、Actin1基因启动子或PGD1基因启动子。

在上述技术方案的基础上，所述植物为玉米。

所述共培养至少2天具体为共培养2-5天。进一步地，所述共培养至少2天具体为将农杆菌侵染后的玉米胚共培养3天。

在上述技术方案的基础上，所述GUS鉴定包括GUS染色分析和/或GUS活性测定。

进一步地，所述GUS染色分析具体为根据GUS染色面积的大小对启动子活性进行定性分析。所述GUS活性测定具体为对玉米胚的蛋白提取液进行GUS活性测定。

本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动子元件，它们影响转录起始速率。公认地，由于启动子区域核苷酸序列己经确定，从具体启动子区域上游的5’非翻译区内进一步分离和鉴定调节元件属于现有技术。因此，启动子区域进一步包括上游调节元件，它赋予与启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列进行表达。

本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域（例如植物可表达性启动子区域）控制下在细胞内含有被转录成RNA分子（例如mRNA）的DNA区域（“转录的DNA区域”）的任何DNA片段。因此，基因可能含有几种可操作性连接的DNA片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录的DNA区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基因。

本发明中术语“组成型启动子”是指在该类启动子的控制下，目的异源核苷酸序列的表达大体恒定在一定水平上，在植物的不同组织和/或不同生长发育阶段表达水平没有明显差异。所述组织为植物体中由来源相同和执行同一功能的一种或多种类型细胞集合而成的结构单位，例如保护组织、输导组织、营养组织、机械组织、分生组织，几种不同的组织有机配合、紧密联系，形成不同的器官（organ），不同的器官之间互相配合，更有效地完成有机体的整个生命活动过程。所述生长发育阶段可根据植物形态、机能的差异划分为胚胎阶段、幼苗阶段、成熟阶段和衰老阶段。来源于花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S RNA基因启动子被用作双子叶植物的主要启动子；而稻类植物的肌动蛋白启动子和谷类的泛素启动子通常适合用于单子叶植物。

本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进DNA结构使启动子序列与目的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和调节对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所述嵌合基因在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。

本发明提供了一种启动子活性的检测方法，具有以下优点：

1、直观。本发明启动子活性的检测方法中通过GUS染色可以用肉眼直接观察并对启动子活性进行定性分析，尤其是组成型启动子。

2、快速。本发明启动子活性的检测方法中仅需要对植物胚（特别是玉米胚）共培养3天，便可通过GUS染色分析和/或GUS蛋白含量测定对启动子活性进行鉴定，无需经历数星期甚至数月的组织培养过程，避免了玉米基因型转化特异性、诱导分化和生根难等环节，节省了时间，提高了筛选效率。

3、经济。本发明启动子活性的检测方法虽然利用了转基因手段，但是没有经历后续组织培养的过程，减少了因获得转基因植株而必需的消耗，从而极大地降低了生产成本。

4、准确。本发明启动子活性的检测方法虽然仅利用植物胚（特别是玉米胚），通过GUS染色分析和/或GUS活性测定对启动子活性进行鉴定，但与经历组织培养过程的转基因植株相比，启动子活性的趋势是吻合的，即检测结果是准确的。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明启动子活性的检测方法的重组克隆载体pT-prZmUbi构建流程图；

图2为本发明启动子活性的检测方法的重组表达载体p90001构建流程图；

图3为本发明启动子活性的检测方法的重组表达载体p90030示意图；

图4为本发明启动子活性的检测方法的重组表达载体p90031示意图；

图5为本发明启动子活性的检测方法的重组表达载体p90039示意图；

图6为本发明启动子活性的检测方法的重组表达载体p80000示意图；

图7为本发明启动子活性的检测方法的转基因玉米胚的GUS染色图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明启动子活性的检测方法的技术方案。

第一实施例、含有启动子序列的重组表达载体的构建

1、构建含有待测启动子序列的重组克隆载体

将prZmUbi核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体pT-prZmUbi，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；prZmUbi为玉米品种B73的Ubiqutin（泛素）基因启动子（SEQ ID NO:1）；MCS为多克隆位点）。

然后将重组克隆载体pT-prZmUbi用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体pT-prZmUbi），42℃水浴30秒；37℃培养1小时（200rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100mg/L）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mM Tris-HCl，10mM EDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入150μl新配制的溶液II（0.2M NaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（4M醋酸钾，2M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经NcoI和PstI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-prZmUbi中插入的玉米品种B73的Ubiqutin基因启动子序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

按照上述构建重组克隆载体pT-prZmUbi的方法，将prOsAPX核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体pT-prOsAPX，其中，prOsAPX为水稻品种日本晴的抗坏血酸过氧化物酶基因启动子（SEQ ID NO:2）。酶切和测序验证重组克隆载体pT-prOsAPX中所述prOsAPX核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体pT-prZmUbi的方法，将prOsAct1核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体pT-prOsAct1，其中，prOsAct1为水稻品种的肌动蛋白基因启动子（SEQ ID NO:3）。酶切和测序验证重组克隆载体pT-prOsAct1中所述prOsAct1核苷酸序列正确插入。

按照上述构建重组克隆载体pT-prZmUbi的方法，将prOsPGD1核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体pT-prOsPGD1，其中，prOsPGD1为水稻品种日本晴的磷酸葡萄糖脱氢酶基因启动子（SEQ ID NO:4）。酶切和测序验证重组克隆载体pT-prOsPGD1中所述prOsPGD1核苷酸序列正确插入。

2、构建含有待测启动子序列的重组表达载体

用限制性内切酶BamHI和HindIII分别酶切重组克隆载体pT-prZmUbi和表达载体p90000（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）），将切下的prZmUbi核苷酸序列插到表达载体p90000的BamHI和HindIII位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体p90001，其构建流程如图2所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；prZmUbi：玉米品种B73的Ubiqutin（泛素）基因启动子（SEQ ID NO:1）；GUS：β-葡萄糖苷酸酶基因（SEQ ID NO:5）；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ IDNO:6）；LB：左边界）。

将重组表达载体p90001用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体p90001），42℃水浴30秒；37℃培养1小时（200rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体p90001在BamHI和HindIII位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即玉米品种B73的Ubiqutin（泛素）基因启动子序列。

按照上述构建重组表达载体p90001的方法，将BamHI和HindIII酶切重组克隆载体pT-prOsAPX切下的所述prOsAPX核苷酸序列插入表达载体p90000，得到重组表达载体p90030。酶切和测序验证重组表达载体p90030在BamHI和HindIII位点间即为所述prOsAPX核苷酸序列，如图3所示。

按照上述构建重组表达载体p90001的方法，将KpnI和NotI酶切重组克隆载体pT-prOsAct1切下的所述prOsAct1核苷酸序列插入表达载体p90000，得到重组表达载体p90031。酶切和测序验证重组表达载体p90031在KpnI和NotI位点间即为所述prOsAct1核苷酸序列，如图4所示。

按照上述构建重组表达载体p90001的方法，将KpnI和NotI酶切重组克隆载体pT-prOsPGD1切下的所述prOsPGD1核苷酸序列插入表达载体p90000，得到重组表达载体p90039。酶切和测序验证重组表达载体p90039在KpnI和NotI位点间即为所述prOsPGD1核苷酸序列，如图5所示。

利用表达载体p90000获得重组表达载体p80000（正对照），如图6所示（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）；Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；LB：左边界）。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体p90001、p90030、p90031、p90039和p80000（空载体对照）用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，酶切验证结果表明重组表达载体p90001、p90030、p90031、p90039和p80000（空载体对照）结构完全正确。

第二实施例、转入待测启动子序列的玉米胚的获得

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31（Z31）的幼胚与第一实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组植物表达载体p90001、p90030、p90031、p90039和p80000（空载体对照）中的T-DNA（包括prZmUbi启动子序列、prOsAPX启动子序列、prOsAct1启动子序列、prOsPGD1启动子序列和GUS基因）转入到玉米染色体组中，获得了转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚、转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚和转入空载体对照玉米胚，同时以野生型玉米胚作为负对照。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将待测启动子传递至幼胚之一的至少一个细胞（步骤1：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.4-0.6，侵染培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2：共培养步骤）。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养。

第四实施例、待测启动子序列的活性测定

实验一、GUS染色

分别取50－100转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚、转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚和正对照玉米胚作为样品，参照Jefferson等（Jefferson R.A.,Burgess S.M.,Hirsh D.Beta-glucuronidase from Escherichia coliasa gene fusion marker.Proc.Natl.Acad.Sci.,1986,83:8447-8454）的方法并做了适当改进，通过在染色溶液中37℃密封染色两天，从组织化学上检验GUS的表达方式。所述染色溶液的主要成分为：0.1M NaPO₄、0.01M EDTA（pH8.0）、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.5mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸（X-gluc）。在表达转基因的细胞中产生的GUS酶会将X-gluc原位分解产生蓝色沉淀，从而可以定位转基因。

同时以野生型玉米胚作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复。

转基因玉米胚的GUS染色的实验结果如图8所示。实验结果表明除了野生型玉米胚（WT）和空载体对照玉米胚（NG）不显色外，转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚均显色，其中，转入prZmUbi启动子序列的玉米胚和转入prOsAct1启动子序列的玉米胚中GUS染色面积较大，其次是转入prOsAPX启动子序列的玉米胚，而转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚GUS染色不明显。

实验二、GUS活性的鉴定

分别取转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚、转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚和空载体对照玉米胚作为样品，参照Jefferson等（Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatilegene fusion marker in higher plants.EMBO J.,1987,3901-3907）的方法，用4-甲基伞形酮（4-MU）通过荧光法测定待测启动子驱动的GUS活性。同时以野生型玉米胚作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

测定GUS活性的具体方法如下：

步骤1、分别称取转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚、转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚和正对照玉米胚各20mg，加入500μl提取缓冲液（50mM NaPO₄（pH7.0）、1mM二硫苏糖醇（DTT）、10mM EDTA、0.1%十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100））在研钵中研成匀浆；

步骤2、在温度4℃、转速4000rpm下离心10min后，收集上清液，并置4℃下保存；

步骤3、在250μl预热（37℃、至少30min）的反应缓冲液（50mM NaPO₄（pH7.0）、1mM二硫苏糖醇（DTT）、10mM EDTA、0.1%十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、1mM4-甲基伞形酮酰-β-葡萄糖苷酸（MUG））中加入50μl所述上清液，混匀，于温度37℃下反应15min后，取出30μl加入到270μl反应终止液（2%（m/v）碳酸钠）中终止反应；

步骤4、制作4-MU的标准曲线（0、50、100、250、500、1000、1500和2000pmol4-MU稀释于2%碳酸钠），用SpectraMax M2测定各样品的Ex365/Em455值；

步骤5、取所述上清液30μl，用水定容至360μl，取出30μl后加入100μl BCA（二喹啉甲酸）反应物（BCA蛋白定量试剂盒），于温度37℃下反应30min后，再于室温下冷却10min；

步骤6、同时以牛血清白蛋白（BSA）制作标准曲线（0、25、50、75、100、150、200和250μg/ml），用SpectraMax M2测定各样品的560nm光吸收值；

步骤7、用4-甲基伞形酮（4-MU）的皮摩尔数与蛋白质含量及时间的比值（pmol4-MU/mg蛋白/min）表示GUS活性。

转基因玉米胚GUS基因活性的实验结果如表1所示。分别测得转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚、转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚、空载体对照玉米胚（NG）和野生型玉米胚（WT）的GUS活性值（pmol4-MU/mg蛋白/min）为49935±83、1008±23、18322±33、0±20、0±13和0±11。同时上述实验结果还表明，转入prZmUbi启动子序列的玉米胚、转入prOsAPX启动子序列的玉米胚、转入prOsAct1启动子序列的玉米胚、转入prOsPGD1启动子序列的玉米胚、空载体对照玉米胚（NG）和野生型玉米胚（WT）的GUS活性值的排序与其GUS染色面积的排序相对应。

表1、含有待测启动子的转基因玉米胚中GUS活性测定平均结果

综上所述，本发明启动子活性的检测方法仅需要对植物胚（特别是玉米胚）共培养3天，便可通过GUS染色分析和/或GUS蛋白含量测定对启动子活性进行鉴定，无需经历数星期甚至数月的组织培养过程，避免了玉米基因型转化特异性、诱导分化和生根难等环节，节省了时间，提高了筛选效率，更减少了因获得转基因植株而必需的消耗，从而极大地降低了生产成本；同时通过GUS染色可以用肉眼直接观察并对启动子活性进行定性分析，尤其是组成型启动子，且与GUS活性测定结果相对应，亦与经历组织培养过程的转基因植株中启动子活性的趋势吻合，检测结果准确。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种启动子活性的检测方法，其特征在于，包括：

农杆菌侵染植物胚；

共培养至少2天；

GUS鉴定。

2.根据权利要求1所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述农杆菌包含启动子序列。

3.根据权利要求2所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述启动子为组成型启动子。

4.根据权利要求3所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述组成型启动子包括Ubi基因启动子、APX基因启动子、Actin1基因启动子或PGD1基因启动子。

5.根据权利要求1所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述植物为玉米。

6.根据权利要求1所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述共培养至少2天具体为共培养2-5天。

7.根据权利要求5或6所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述共培养至少2天具体为将农杆菌侵染后的玉米胚共培养3天。

8.根据权利要求1所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述GUS鉴定包括GUS染色分析和/或GUS活性测定。

9.根据权利要求8所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述GUS染色分析具体为根据GUS染色面积的大小对启动子活性进行定性分析。

10.根据权利要求5或8所述启动子活性的检测方法，其特征在于，所述GUS活性测定具体为对玉米胚的蛋白提取液进行GUS活性测定。

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