CN103276093A - 香鱼假单胞菌荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括SYBR Premix Ex TaqTMII试剂10.0μl，浓度为10μM的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8μl；检测方法通过细菌提取、细菌酶解、DNA粗提物制备、DNA粗提物纯化和检测；该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的香鱼假单胞菌，定性定量灵敏度可以达到103copies；可以检测水产养殖动物是否感染香鱼假单胞菌，养殖水体环境中香鱼假单胞菌含量，养殖饲料和鲜活饵料是否遭受香鱼假单胞菌污染等。
Description
技术领域
本发明涉及细菌的PCR检测技术，具体涉及香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）最早于上世纪90年代被报道为香鱼的一种细菌，近年发现该菌同时对大黄鱼也具有较强的致病性，该菌从感染、发病至死亡的延续流行时间长，感染性强，死亡率高，危害性大，平均发病率高达30%，平均死亡率达60%以上。我们在海水养殖的各规格大黄鱼中均发现了该病菌，由于该细菌宿于鱼体内脏（肝、脾、肾等），主要症状为内脏出现白色结节，而早期体表无明显症状，给鱼病检测和防治带来了困难。因此，建立香鱼假单胞菌的检测技术，尤其是早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒，该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的香鱼假单胞菌。本发明还提供了用该检测试剂盒检测香鱼假单胞菌的方法，为水产养殖细菌检测、养殖环境监测、养殖饲料细菌检测等均具有重要意义。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒，该试检测剂盒包括SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）试剂（购于TaKaRa公司）10.0μl，浓度为10μmol/L（μM）的上游引物溶液和下游引物溶液各0.8μl，所述上游引物的核苷酸序列为：5，TATCCTCGGC GAATATGACC3，，所述下游引物的核苷酸序列为：5，CTGCTTTCGG ACTCTTCTTC3，。
用香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒检测香鱼假单胞菌的方法，包括下述步骤：
1）细菌提取：取1.5ml样品液置于离心管中，在室温下6000rpm离心2min，弃上清液，在沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000rpm，离心5min，弃上清液，再在沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000rpm离心5min，弃上清液，然后在沉淀中加TE缓冲液（TE Buffer溶液）至半管，在室温下6000rpm离心5min，弃上清液，得到细菌提取物，所述TE Buffer溶液的pH8.0；TE Buffer溶液购于上海生工生物工程有限公司，也可以由浓度为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(Tris-HCl)与浓度为1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)自配成pH8.0的TE Buffer溶液；
2）细菌酶解：在上述细菌提取物加入TE Buffer溶液450μl和浓度为50mg/ml的溶菌酶20μl，置于37°C水浴中酶解24h，然后加入质量百分浓度为20%的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液25μl，置于56°C水浴中酶解30min，再加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液5μl，置于37°C水浴中酶解1h，加入500μl饱和酚，轻轻上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心15min，弃沉淀得到细菌酶解液；酶解的目的是：菌体破壁，释放DNA，溶菌酶可以裂解细胞壁，蛋白酶K可以降解蛋白质；溶菌酶和蛋白酶K购于上海生工生物工程有限公司；
3）DNA粗提物制备：将上述细菌酶解液置于第一微量离心管中，加入细菌酶解液等体积的第一有机溶液，所述第一有机溶液由酚、氯仿和异戊醇按体积比25：24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第一上清液，将第一上清液置于第二微量离心管中，加入第一上清液等体积的第二有机溶液，所述第二有机溶液由氯仿、异戊醇按体积比24：1配置得到，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第二上清液，将第二上清液置于第三微量离心管中，加入浓度为3mol/L的醋酸钠（NaAC）溶液，所述醋酸钠溶液与所述第二上清液的体积比1：10，再加入第二上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后以10000rpm离心10min，弃上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入质量百分浓度为70%的乙醇至半管，在4°C下以12000rpm离心洗涤2min，弃上清液，再用70%的乙醇离心洗涤一次，然后将DNA沉淀在室温下挥干乙醇，得到DNA粗提物；这样通过三级粗提可以去除蛋白质等杂质；
4）DNA粗提物纯化：在上述DNA粗提物中加入TE Buffer溶液400μl和浓度为10mg/ml的RNA酶溶液5μl，37°C下温育1h，再加入上述第一有机溶液5μl，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第一DNA上清液，将第一DNA上清液置于离心管中，加入上述第二有机溶液5μl，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第二DNA上清液，将第二DNA上清液置于另一离心管中，加入浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液与所述第二DNA上清液的体积比1：10，再加入所述第二DNA上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后以10000rpm离心10min，弃上清液，得到DNA纯化物，加入TE Buffer溶液50μl溶解DNA纯化物，得到模板DNA溶液，置于-20°C保存备用；RNA酶购于上海生工生物工程有限公司，RNA酶可以降解DNA粗提物中的RNA：
5）检测：取上述模板DNA溶液1μl，用所述香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒检测，反应体系20μL，在Mastercycler ep realplex2荧光定量PCR仪上扩增反应，扩增反应条件为第一步：预变性95°C，30sec，1循环；第二步：PCR反应，变性95°C，5sec、退火60°C，30sec、延伸72°C，30sec共40循环（Cycle）；第三步：95°C，15sec、60°C，15sec、95°C，15sec，PCR反应结束，得到扩增曲线图和熔解曲线图及Ct值，与已建立的香鱼假单胞菌DNA的PCR反应的扩增曲线和熔解曲线比较相似性，基本相同就含有香鱼假单胞菌，将检测出的Ct值代入已建立的香鱼假单胞菌DNA的标准曲线，计算出DNA含量。
与现有技术相比，本发明的优点在于香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括SYBR Premix Ex TaqTMII试剂10.0μl，浓度为10μM的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8μl，上游引物的核苷酸序列为：TATCCTCGGCGAATATGACC，下游引物的核苷酸序列为：CTGCTTTCGG ACTCTTCTTC；检测方法通过细菌提取、细菌酶解、DNA粗提物制备、DNA粗提物纯化和检测；该检测试剂盒可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出早期的香鱼假单胞菌，定性定量灵敏度可以达到103copies；可以检测水产养殖动物是否感染香鱼假单胞菌，养殖水体环境中香鱼假单胞菌含量，养殖饲料和鲜活饵料是否遭受香鱼假单胞菌污染等。该检测试剂盒及检测方法对水产养殖动物病害的发现和防治、无公害水产品生产及养殖饲料和鲜活饵料质量安全均具有重要意义，可为其它养殖动物病原菌早期检测提供借鉴模式，具有广泛的适用性。
附图说明
图1为香鱼假单胞菌DNA的荧光定量PCR检测的扩增曲线的示意图；
图2为香鱼假单胞菌DNA的荧光定量PCR检测的熔解曲线的示意图；
图3为香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
1、香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒：包括SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）专用试剂10.0μl，浓度为10μM的上游引物溶液、下游引物溶液各0.8μl，上下游引物根据登录号为JN688867的香鱼假单胞菌rpoD基因内转录间隔序列为模板，该序列大小为743bp，用引物设计软件Beacon Designer7设计了上述一对特异性较高的香鱼假单胞菌引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2、香鱼假单胞菌总DNA模板制备：将培养的香鱼假单胞菌菌悬液1.5ml置于微量离心管中6000rpm离心5min，弃去上清液，加入TE Buffer溶液450μl和浓度为50mg/ml的溶菌酶20μl，置于37°C水浴中酶解24h，然后加入质量百分浓度为20%的SDS溶液25μl，置于56°C水浴中酶解30min，再加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液5μl，置于37°C水浴中酶解1h，加入500μl饱和酚，轻轻上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心15min，弃沉淀得到香鱼假单胞菌酶解液；将香鱼假单胞菌酶解液置于第一微量离心管中，加入与香鱼假单胞菌酶解液等体积的第一有机溶液（酚、氯仿和异戊醇按体积比25：24：1配置），上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第一上清液，将第一上清液置于第二微量离心管中，加入与第一上清液等体积的第二有机溶液（氯仿、异戊醇按体积比24：1配置），上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第二上清液，将第二上清液置于第三微量离心管中，加入摩尔浓度为3mol/L的NaAC溶液，NaAC溶液的加入体积为第二上清液体积的1/10，再加入第二上清液二倍体积的-20°C的无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000rpm离心10min，弃第三上清液，得到DNA沉淀，DNA沉淀中加入质量百分浓度为70%的乙醇至半管，用冷冻离心机在4°C下以12000rpm离心洗涤2min，弃上清液，再同样加70%的乙醇离心洗涤一次，然后将DNA沉淀在室温下挥干乙醇，得到香鱼假单胞菌DNA粗提物；在香鱼假单胞菌DNA粗提物溶加入TEBuffer溶液400μl，再加入浓度为10mg/ml的RNA酶溶液5μl，37°C下温育1h，然后加入第一有机溶液5μl，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第一DNA上清液，将第一DNA上清液置于离心管中，加入第二有机溶液5μl，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第二DNA上清液，将第二DNA上清液置于另一离心管中，加入摩尔浓度为3mol/L的NaAC溶液，NaAC溶液的加入体积为第二DNA上清液体积的1/10，再加入第二DNA上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后用离心机以10000rpm离心10min，弃上清液，得到DNA纯化物，DNA纯化物溶于TE Buffer溶液，配成浓度为10-1μg/μl香鱼假单胞菌总DNA模板溶液。
3、荧光定量PCR检测：扩增体系包括：SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）试剂10.0μl，上游引物溶液和下游引物溶液各1.0μl，DNA模板溶液1μl，双蒸水补足至20μL。在Mastercycler ep realplex2荧光定量PCR仪上扩增反应进行检测，扩增反应条件为第一步：预变性95°C，30sec，1Cycle；第二步：PCR反应，变性95°C，5sec、退火60°C，30sec、延伸72°C，30sec共40Cycle；第三步：95°C，15sec、60°C，15sec、95°C，15sec，PCR反应结束，从荧光定量PCR仪上可以得到如图1所示的扩增曲线的示意图和图2所示的熔解曲线的示意图，建立的香鱼假单胞菌DNA的荧光定量PCR检测的标准扩增曲线和熔解曲线。
实施例2
DNA模板溶液稀至浓度为103--107copies/μl浓度梯度，进行实施例1相同的荧光定量PCR检测，经扩增曲线和熔解曲线相似性比较，103--107copies/μl浓度梯度都有相似如图1所示的扩增曲线的示意图和图2所示的熔解曲线，本发明的香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏度可以达到103copies/μl。
根据实施例1、2的Ct值，以Ct值为纵坐标，香鱼假单胞菌质粒模板溶液浓度拷贝数对数值（Log copies）为横坐标，得出如图3所示的香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测的标准曲线图，其中实施例1的Ct值为14.5、实施例2的Ct值依浓度分别为31.60、28.42、24.97、21.48、17.86。回归方程为y=-3.448x+42.69，回归直线决定系数R2=0.999，本发明的香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒的对浓度为103copies/μl及以上可以定量检测。
实施例3
将大黄鱼的内脏研磨成组织液，取1.5ml组织液置于微量离心管中，在室温下6000rpm离心2min，沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000rpm离心5min，沉淀中再加无菌水至半管，在室温下6000rpm离心5min，然后在沉淀中加TE Buffer溶液至半管，在室温下6000rpm离心5min，弃去上清液，得到细菌提取物；然后依实施例1相同的方法进行总DNA模板制备和荧光定量PCR检测，具有如图1和图2基本相同的扩增曲线图和熔解曲线图，Ct值为31.7，说明该大黄鱼有宿香鱼假单胞菌，又根据检测出的Ct值代入已建立香鱼假单胞菌DNA的标准曲线，得出DNA含量为1.0×103.187个拷贝。
实施例4
与实施例3基本相同，所不同的只是1.5ml组织液由富集的大黄鱼养殖水样替代，荧光定量PCR检测试剂检测得到具有如图1和图2基本相同的扩增曲线图和熔解曲线图，说明该大黄鱼养殖水样含有香鱼假单胞菌，Ct值为26.73，得出的DNA含量为1.0×104.628个拷贝。
实施例5
与实施例3基本相同，所不同的只是1.5ml组织液由富集的大黄鱼养殖饲料溶液替代，荧光定量PCR检测试剂后，未得到如图1和图2基本相同的扩增曲线图和熔解曲线图，说明大黄鱼养殖饲料没有香鱼假单胞菌。
Claims (2)
1.香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒，该试检测剂盒包括SYBR Premix ExTaqTMII试剂10.0μl，浓度为10μmol/L的上游引物溶液和下游引物溶液各0.8μl，其特征在于所述上游引物的核苷酸序列为：TATCCTCGGC GAATATGACC，所述下游引物的核苷酸序列为：CTGCTTTCGG ACTCTTCTTC。
2.用权利要求1所述的香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒检测香鱼假单胞菌的方法，其特征在于步骤如下：
1）细菌提取：取1.5ml样品液置于离心管中，在室温下6000rpm离心2min，弃上清液，在沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000rpm，离心5min，弃上清液，再在沉淀中加无菌水至半管，在室温下6000rpm离心5min，弃上清液，然后在沉淀中加TE缓冲液至半管，在室温下6000rpm离心5min，弃上清液，得到细菌提取物，所述TE缓冲液的pH8.0；
2）细菌酶解：在上述细菌提取物加入TE缓冲液450μl和浓度为50mg/ml的溶菌酶20μl，置于37°C水浴中酶解24h，然后加入质量百分浓度为20%的十二烷基硫酸钠溶液25μl，置于56°C水浴中酶解30min，再加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液5μl，置于37°C水浴中酶解1h，加入500μl饱和酚，轻轻上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心15min，弃沉淀得到细菌酶解液；
3）DNA粗提物制备：将上述细菌酶解液置于第一微量离心管中，加入细菌酶解液等体积的第一有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第一上清液，所述第一有机溶液由酚、氯仿和异戊醇按体积比25：24：1配置得到，将第一上清液置于第二微量离心管中，加入第一上清液等体积的第二有机溶液，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第二上清液，所述第二有机溶液由氯仿、异戊醇按体积比24：1配置得到，将第二上清液置于第三微量离心管中，加入浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液与所述第二上清液的体积比1：10，再加入第二上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后以10000rpm离心10min，弃上清液，得到DNA沉淀，在DNA沉淀中加入质量百分浓度为70%的乙醇至半管，在4°C下以12000rpm离心洗涤2min，弃上清液，再用70%的乙醇离心洗涤一次，然后将DNA沉淀在室温下挥干乙醇，得到DNA粗提物；
4）DNA粗提物纯化：在上述DNA粗提物中加入TE缓冲液400μl和浓度为10mg/ml的RNA酶溶液5μl，37°C下温育1h，再加入上述第一有机溶液5μl，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第一DNA上清液，将第一DNA上清液置于离心管中，加入上述第二有机溶液5μl，上下颠倒混合均匀，在4°C下10000rpm离心10min，得到第二DNA上清液，将第二DNA上清液置于另一离心管中，加入浓度为3mol/L的醋酸钠溶液，所述醋酸钠溶液与所述第二DNA上清液的体积比1：10，再加入所述第二DNA上清液二倍体积的-20°C无水乙醇，置于-20°C冰箱中培养，至大量丝状DNA沉淀出现，然后以10000rpm离心10min，弃上清液，得到DNA纯化物，加入TE缓冲液50μl溶解DNA纯化物，得到模板DNA溶液，置于-20°C保存备用；
5）检测：取上述模板DNA溶液1μl，用所述香鱼假单胞菌荧光定量PCR检测试剂盒检测，反应体系20μL，在Mastercycler ep realplex2荧光定量PCR仪上扩增反应，扩增反应条件为第一步：预变性95°C，30sec，1循环；第二步：PCR反应，变性95°C，5sec、退火60°C，30sec、延伸72°C，30sec共40循环；第三步：95°C，15sec、60°C，15sec、95°C，15sec，PCR反应结束，得到扩增曲线图和熔解曲线图及Ct值，若与建立的香鱼假单胞菌DNA的PCR反应的扩增曲线和熔解曲线基本相似，则含有香鱼假单胞菌，将检测出的Ct值代入建立的香鱼假单胞菌DNA的标准曲线，计算出DNA含量。
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