CN103275210A

CN103275210A - 脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法

Info

Publication number: CN103275210A
Application number: CN2013102564216A
Authority: CN
Inventors: 黄亮; 曹春来; 肖拥军; 曹永恒
Original assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-06-25
Also published as: CN103275210B

Abstract

本发明公开了一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法。该色谱纯化方法利用中低压色谱系统对脂肪酸单酰化胰岛素进行分离，使用有机聚合物反相色谱材料为固定相，洗脱的流动相为含有至少一种可与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂物质、pH值为2～4。该色谱纯化方法步骤简单，可以一步将样品从初始纯度50～60%提高到纯度为98%，且易于放大，经济成本低。

Description

脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法

技术领域

本发明涉及一种色谱纯化方法，特别涉及一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法。

背景技术

氨基酰化是常见的蛋白修饰方法，酰化的通用方法常见于C.H.W.Hirs主编的由Elsevier出版的《酶学方法》，25:494-499（1972）。

目前丹麦诺和诺德公司出产的地特胰岛素即是常见的利用该原理在B29位Lys残基的ε-氨基酰化修饰后得到的胰岛素衍生物。而在胰岛素的氨基酰化反应中，目前业内一般使用活性酯、酰卤或酸酐，与胰岛素原或类似物反应制备单酰化胰岛素，但由于胰岛素原或类似物中含有位于A1、B1位置的氨基酸的游离α-氨基和其他氨基酸侧链上的游离ε-氨基（比如Lys的ε-氨基），这三种游离氨基皆可以与活性酯、酰卤或酸酐形成共价键结合，从而形成了以上常见的不同位点修饰的单取代胰岛素或者双取代胰岛素蛋白产物。因此，如何能够较好地选择性修饰胰岛素及其后续纯化便成为了重要难题。在生物学杂志Biochem.J121：737-745（1971）刊登的The acylation of insulin一文中Lindsay等提供了胰岛素和乙酸N-琥珀酰亚胺酯反应的实验数据，主要生成了Phe^B1-乙酰基单取代胰岛素、Gly^A1-乙酰基单取代胰岛素、Lys^B29-单取代乙酰基胰岛素及少量双取代胰岛素，之后其采用DEAE离子交换填料研究产物的纯化研究。发现使用该方法具有一定的纯化效果但并不如人意，因为尽管其文献上纯度结果显示能够达到90%以上，但由于在纯度结果判定方法上，Lindsay只是使用了等电凝胶电泳方法作为检测方法，而该方法与目前业界中常用的HPLC方法相比较，灵敏度低。在protein&peptide letters,13:135-142（2006）刊出的Synthesis，Characterization and Biological Activity of Chemically Modified Insulin DerivativeWith Alpha Lipoic Acid一文中，Tao Huang等采用硫辛酰苯并三唑与人胰岛素在碱性条件下反应，生成了以ε-Lys^B29-lipoyl-insulin为主的单酰化修饰产物。之后，其主要运用了以C18反相硅胶为固定相的RP-HPLC进行纯化，得到了纯度高于95%的单酰化胰岛素。中国专利CN1171742提供了一种选择性反应酰化修饰人胰岛素原及其类似物的ε-氨基的方法，在该专利申请中，其采用了以C4反相硅胶为固定相的RP-HPLC或者半制备柱，流动相为含0.1%TFA、乙腈和水的溶剂系统进行梯度洗脱的方法，并于53%乙腈浓度时得到单酰化胰岛素（纯度数据未披露）。

由此可见，目前对于酰化修饰后的胰岛素更多的是采用RP-HPLC或者高压制备液相在反相硅胶固体基质上进行液相分离纯化。术语RP-HPLC是指在高效液相仪器上采用反相固定相分离纯化的方法，高压制备液相是指在高压下（一般使用压力在5-15Mpa）运行的液相色谱。而反相硅胶则应理解为憎水基质已涂覆在上面的氧化硅材料，其中憎水基质例子为链长为C3-C20、特别是C4-C18的烷烃。

虽然采用在HPLC或者高压制备液相上用反相硅胶材料作为固定相可以达到较高的分离纯度，但该方法具有一些明显的缺点。比如反相硅胶仅在pH2-10范围内稳定，而脂肪酸酰化修饰胰岛素时容易产生大量疏水性很强的杂质，例如游离脂肪酸或脂肪酸修饰的二聚体或多聚体，他们在硅胶上容易吸附的很牢，且皆不容易被常规的再生洗脱，随着时间的延长，杂质容易在填料上浓缩。只能采用碱洗方法清洗，但是碱液容易破坏反相硅胶的化学性质进而影响填料的分离效果。同时，如果采用RP-HPLC或者高压半制备液相仪器作为分离纯化仪器，虽然其具有精确高效的特点，但是其成本高维护麻烦，尤其是成本至少要比中低压层析系统高出50%。

发明内容

为克服上述的缺点和不足，本发明的目的在于提供以一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法。该纯化方法是运用一种比反相硅胶更方便使用、廉价的色谱材料，并在其上色谱纯化酰化修饰胰岛素。使用该法可以达到使用一步色谱纯化即可得到高纯度的酰化修饰胰岛素。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，包含如下步骤：利用中低压色谱系统对脂肪酸单酰化胰岛素进行分离，使用有机聚合物反相色谱材料为固定相，洗脱的流动相为含有至少一种可与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂物质、pH值为2～4；

所述的脂肪酸单酰化胰岛素指的是在母体胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基处或者在B链上存在的Lys残基的ε-氨基处连接了侧链的天然存在的长链脂肪酸或者其类似物，该侧链具有如下一般通式：

-X-Y；

其中X为与母体胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基或者与母体胰岛素B链Lys残基的ε-氨基之间的共价键；

X为：-CO-；

Y为：-(CH₂)m-，其中m为6～32的整数；

而其中母体胰岛素选自人胰岛素、des（B1）人胰岛素、des（B30）人胰岛素、Gly^A21人胰岛素、Gly^A21des（B30）人胰岛素、Asp^B28人胰岛素、猪胰岛素、Lys^B28Pro^B29人胰岛素、Gly^A21Arg^B31Arg^B32人胰岛素或Lys^B3Glu^B29人胰岛素。

所述的脂肪酸单酰化胰岛素优选为（N^εB29-十四烷酰）Lys^B29des（B30）人胰岛素、（N^εB29-十四烷酰）Lys^B29人胰岛素或（N^εB29-十六烷酰）Lys^B29des（B30）人胰岛素；更优选为（N^εB29-十四烷酰）Lys^B29des（B30）人胰岛素；

所述的中低压色谱系统指的是工作压力为2～25bar（巴）的色谱系统；优选为工作压力为2～20bar的色谱系统，更优选为工作压力为5～10bar的色谱系统，最优选为工作压力为5～8bar的色谱系统；色谱系统包括分析色谱系统、半制备色谱系统、制备色谱系统；

所述的有机聚合物反相色谱材料为聚甲基丙烯酸酯（PMA）或是聚苯乙烯（PS）-二乙烯基苯（DVB）为基质的用于反相色谱分离纯化的材料，优选为聚苯乙烯（PS）-二乙烯基苯（DVB）材料；其平均粒度优选5～300μm，更优选为10～50μm；粒度越小，分离度越好，但是粒度越小颗粒的压力稳定性较低；

所述的有机聚合物反相色谱材料可选择如表1所示的可商购的有机聚合物反相色谱材料：

表1

制造商	商品名	材料	最小粒度	孔径
					三菱化学	MCI GEL CHP	PS/DVB、PMA	4μm	10nm
GE	Source15、30	PS/DVB	5μm	10nm
					AMBERCHROM	CG161、CG300、CG1000	PS/DVB	35μm	15nm
纳微	UniPS	PS/DVB	3μm	10nm

所述的有机聚合物反相色谱材料更优选为纳微Uni PS30-300填料或GEsource30填料；

所述的洗脱可以等度洗脱，也就是其中具有恒定的缓冲物质浓度和恒定的有机溶剂比例，或者可以线性梯度洗脱进行，即有机溶剂比例随时间递增，优选等度洗脱；

所述的可与水混溶的有机溶剂优选为乙腈、酮或碳原子数为C1～C4的醇；优选为乙腈、异丙醇或乙醇；

所述的可与水混溶的有机溶剂在流动相中的体积浓度为1～90%，优选为30～60%；

所述的缓冲剂物质可选自磷酸盐、醋酸盐或柠檬酸盐，优选为磷酸二氢钠或醋酸钠；

所述的pH值可以通过加入醋酸、磷酸、盐酸或者氢氧化钠进行调节；

所述的pH值优选为3.0～3.5。

本发明相对于现有技术的优点和效果为：

1、操作步骤简洁：本发明的纯化方法是运用一种比反相硅胶更方便使用、廉价的有机聚合物反相色谱材料，并在其上色谱纯化酰化修饰胰岛素。使用该法可以达到使用一步色谱纯化即可得到高纯度（纯度达到98%-98.5%）的酰化修饰胰岛素。

2、纯化初始样品纯度要求低：样品的初始纯度为50～60%即可应用本发明的纯化方法进行纯化，纯化后的样品的纯度可达98%。

3、采用中低压色谱系统：采用本发明的另一个好处是其可以在中低压色谱系统中运行，且能够得到比较好的分离纯化效果。

4、本发明的方法适用于各种色谱系统，分析色谱、半制备色谱、制备色谱，尤其是中低压色谱。使用该方法进行分离纯化，可以有着较好的成本优势。

总之，本发明提供的纯化方法步骤简单，可以一步将样品纯度从50～60%提高到98%，且易于放大，经济成本低。

附图说明

图1是实施例1中pH值为4.0时得到的组分1的RP-HPLC图。

图2是实施例1中pH值为4.0时得到的组分2的RP-HPLC图。

图3是实施例1中pH值为4.0时得到的组分3的RP-HPLC图。

图4是实施例1中pH值为4.0时得到的组分4的RP-HPLC图。

图5是实施例1中pH值为4.3时得到的组分1的RP-HPLC图。

图6是实施例1中pH值为4.3时得到的组分2的RP-HPLC图。

图7是实施例1中pH值为4.3时得到的组分3的RP-HPLC图。

图8是实施例1中pH值为4.3时得到的组分4的RP-HPLC图。

图9是实施例1中pH值为7.0时得到的组分1的RP-HPLC图。

图10是实施例1中pH值为7.0时得到的组分2的RP-HPLC图。

图11是实施例1中pH值为7.0时得到的组分3的RP-HPLC图。

图12是实施例1中pH值为7.0时得到的组分4的RP-HPLC图。

图13是实施例2中工作压力为2bar时得到的纯度最高组分的RP-HPLC图。

图14是实施例2中工作压力为5bar时得到的合格组分混合的RP-HPLC图。

图15是实施例2中工作压力为8bar时得到的合格组分混合的RP-HPLC图。

图16是实施例3中的待纯化样品的RP-HPLC图。

图17是实施例3中的组分1的RP-HPLC图。

图18是实施例3中的组分2的RP-HPLC图。

图19是实施例3中的组分3的RP-HPLC图。

图20是实施例3中的组分4的RP-HPLC图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

（1）待纯化样品的制备：

参照专利WO98/02460中披露的实施例7，将0.50g Des B30人胰岛素原溶解于7.0ml二甲基亚砜（DMSO）与3.5ml水的混合溶液中，并往其中加入0.4ml三乙胺调节pH为10.2-10.5，得到混合溶液。之后将0.025g N-琥珀酰亚胺基豆蔻酸溶解于1.8ml N-甲基吡咯烷酮溶液，并将其滴加入前述混合溶液中，最后将混合均匀的溶液置于0℃环境下搅拌2小时反应，即可得到含有酰化修饰的胰岛素衍生物，即（N^εB29-十四烷酰）Lys^B29des（B30）人胰岛素的反应液。之后用含醋酸的水溶液（醋酸的浓度为体积百分比10%）将其酸化稀释10倍得到待纯化样品。该待纯化样品的纯度如图16所示。

（2）使用QuickSep中压层析系统纯化：

在直径16mm和长250mm的层析柱上进行试验，层析柱中所装载填料为30ml的纳微Uni PS30-300填料（粒径30μm，孔径300埃），床层高度为150mm。上样目的蛋白量为100mg。

层析缓冲液为：A相，含有50mM无水硫酸钠的0.1M磷酸二氢钠缓冲液，调节缓冲液中磷酸或磷酸氢二钠比例，使之pH值分别为4.0、4.3和7.0；B相，异丙醇溶液。柱子先用30%B（即B相和A相按体积比3:7混合）相平衡，调节上样样品洗脱采用38%B相等度洗脱，洗脱流速70ml/h，工作压力5bar，280nmUV检测仪监测出峰后分段收集，每段10ml。

（3）纯度检测方法：

采用RP-HPLC方法检测步骤（2）收集到组分，仪器为岛津LC-2010CHT，柱子采用Sepax GP-C4反相柱。以硫酸铵溶液（硫酸铵40g，加水1900ml溶解后，用1mol/L硫酸调pH值至2.3，加水至2000ml）：乙腈按体积比1800:200得到的混合溶液作为流动相A；以乙腈-水（按体积比800:225混合）为流动相B，流速为1.0ml/min；柱温为50℃，检测波长214nm。30～68%B相梯度洗脱75min。保留时间在30～31min的单峰即为目的产物。纯度计算采用面积归一法。

图1～12为各组分的RP-HPLC图谱。

表2中列出了使用聚合物材料纳微Uni PS30-300在不同pH下异丙醇洗脱的各收集组分的纯度，可以看出，在pH4.0时可以得到纯度大于98.0%的收集组分，而在pH4.3和pH7.0则不能得到纯度大于98.0%的组分。

表2

实施例2：

（1）待纯化样品的制备：同实施例1中步骤（1）。

（2）使用QuickSep中压层析系统纯化：

在直径11mm和长250mm的层析柱中装填10ml的纳微Uni PS30-300填料（粒径30μm，孔径300埃），床层高度110mm。

流动相配制比例同实施例1，调节流动相A的pH为3.0。调节上样样品量，使柱子中填料目的蛋白负荷量为4.0g/L。调节层析系统运行压力，使之分别为2bar、5bar和8bar。洗脱方式同实施例1。280nm UV检测仪监测出峰后分段收集，每段10ml，再将纯度大于98.0%的组分混合后，再检测纯度和浓度，计算回收率。

（3）纯度检测方法：同实施例1中步骤（3）。

图13为使用Uni PS30-300聚合物材料在2bar压力条件下洗脱的最高纯度的RP-HPLC图谱。

图14～15为使用Uni PS30-300聚合物材料在5bar和8bar压力条件下洗脱合格组分混合后的RP-HPLC图谱。

表3中列出了实验结果，分析如下：在不同的层析系统工作压力条件下，5bar和8bar压力条件下可以达到98.0%以上的纯度，且产率可以达到70%以上。而在2bar的工作压力下，组分的最高纯度只能达到96.24%，故其收率为0。

表3

实施例3：

（1）待纯化样品的制备：同实施例1中步骤（1）。

（2）使用QuickSep中压层析系统纯化：

在直径140mm和长500mm的层析柱中装填2.5L的GE source30填料（粒径30μm），床层长165mm。

层析缓冲液为：A相，0.15M醋酸钠缓冲液，pH3.0；B相，含TFA（三氟乙酸）的乙腈溶液，TFA的浓度为体积百分比0.1%。

柱子先用10%B相平衡，即A相和B相按体积比9:1混合，平衡后，上样使填料目的蛋白负荷量为4.0g/L，40%B相等度洗脱，洗脱速度5.7L/h，工作压力为8bar，280nmUV检测仪监测出峰后分段收集，每段1.0L体积。

（3）纯度检测方法：同实施例1中步骤（3）。

图16为上样前的待纯化样品的RP-HPLC图谱，其纯度面积为58.31%。

图17～20为各收集组分的RP-HPLC图谱。

表4中列出了各收集组分的结果可以清楚地看到，使用该方法在2.5L规模的GE source30聚合物填料也可以有着很好的分离纯化效果，且纯度可以从待纯化样品的58.31%提高到98%，以纯度大于98%的组分为合格，则收率达到71.90%。

表4

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于包含如下步骤：利用中低压色谱系统对脂肪酸单酰化胰岛素进行分离，使用有机聚合物反相色谱材料为固定相，洗脱的流动相为含有至少一种能与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲剂物质、pH值为2～4。

2.根据权利要求1所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的脂肪酸单酰化胰岛素是在母体胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基处或者在B链上存在的Lys残基的ε-氨基处连接了侧链的天然存在的长链脂肪酸或者其类似物，该侧链具有如下一般通式：

-X-Y；

X为：-CO-；

Y为：-(CH₂)m-，其中m为6～32的整数；

3.根据权利要求2所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的脂肪酸单酰化胰岛素为（N^εB29-十四烷酰）Lys^B29des（B30）人胰岛素、（N^εB29-十四烷酰）Lys^B29人胰岛素或（N^εB29-十六烷酰）Lys^B29des（B30）人胰岛素。

4.根据权利要求1所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的中低压色谱系统是工作压力为2～25巴的色谱系统。

5.根据权利要求1所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的有机聚合物反相色谱材料为聚甲基丙烯酸酯或是聚苯乙烯-二乙烯基苯。

6.根据权利要求5所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的有机聚合物反相色谱材料的平均粒度为5～300μm。

7.根据权利要求6所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的有机聚合物反相色谱材料为MCI GEL CHP、Source15、Source30、CG161、CG300、CG1000和Uni PS中的一种或至少两种。

8.根据权利要求1所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的能与水混溶的有机溶剂为乙腈、酮或碳原子数为C1～C4的醇。

9.根据权利要求1所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的缓冲剂物质为磷酸盐、醋酸盐或柠檬酸盐。

10.根据权利要求1所述的脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法，其特征在于：所述的pH值为3.0～3.5。