CN103271092B - 一种生物杀菌剂其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物杀菌剂其制备方法及用途，该种杀菌剂的活性成分由3种来自不同药用植物远志、三叶木通、丹参的内生细菌按接种量比例1∶2∶6组成，3种细菌分别为产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌，该杀菌剂还包括40-50份填充剂、1-10份表面活性剂、1-10份稳定剂，填充剂为白炭黑，表面活性剂选取十二烷基磺酸钠和木质素磺酸钠，稳定剂为磷酸二氢钾。本发明适用范围广、抗菌效果优良稳定、不含任何有害物质、无毒副作用、环保，制备方法简单、制备周期短、成本低廉，是生态农业和绿色无公害食品的理想产品，有显著的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于农药技术领域，涉及一种生物杀菌剂其制备方法及用途。
背景技术
化学农药的使用可以说是一把双刃剑。一方面，化学农药的合理应用在一定程度上确实减轻了病虫害对农作物生长发育的影响，提高了农作物产量，取得了一定的经济价值；但另一方面，化学农药的滥用也导致了农作物中农药残留物质和农药降解的有毒有害成分含量超标，这对人类的健康造成了巨大的威胁。现代社会科技高速发展和人类素质提升的同时，人们在面对农业生产中大量使用化学农药所导致的农作物受到不同程度污染这一现状，迫切需要一种绿色无污染且作用效果优良的杀菌物质取代化学农药或减少化学农药的使用来满足人类的日常生活。
作为一个农业大国，随着生态农业观念的普及，当前我国农业结构正处于由传统的农业模式向绿色无公害生态农业方向过渡和转变，过度重视农业产量的观念已逐渐开始被安全健康的绿色生态农业观念所取代，大力积极发展生态农业和绿色无公害食品是我国农业发展所面临的必然趋势。虽然大多数化学农药较生物农药的抑菌效果更显著，但生物技术在生态农业领域中显示出了诱人的优越性——生物杀菌剂抗菌效果优良且不会造成附带的污染。研究抗菌效果优良且无公害的生物杀菌剂是当前国内外农业研究中的重要课题，具有深远的理论意义与现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种生物杀菌剂其制备方法及用途。其技术方案为：
一种生物杀菌剂，该杀菌剂的活性成分由3种来自不同药用植物[远志(RadixPolygalae)、三叶木通(Akebiatrifoliate(Thunb.)Koidz)、丹参(Salviamiltiorrhiza)]的内生细菌按接种量比例1∶2∶6组成，3种细菌分别为产酶溶杆菌(Lysobacteryananisissp.nov)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacians)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，该杀菌剂还包括40-50份填充剂、1-10份表面活性剂、1-10份稳定剂，填充剂为白炭黑，表面活性剂选取十二烷基磺酸钠和木质素磺酸钠，稳定剂为磷酸二氢钾。
一种本发明所述生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌分别在LB培养基中进行活化，然后进行37℃发酵；
(2)当步骤(1)所述三种细菌发酵液OD600均为0.150时，接种量比例按解淀粉芽孢杆菌：产酶溶杆菌：多粘类芽孢杆菌为1∶2∶6接种混合发酵；
(3)48h后，向步骤(2)发酵获得的发酵液中加入40-50份填充剂、1-10份表面活性剂、1-10份稳定剂，填充剂为白炭黑，表面活性剂选取十二烷基磺酸钠和木质素磺酸钠，稳定剂为磷酸二氢钾，充分混合；
(4)将步骤(3)所得的混合物粉碎，然后过筛(孔径为200目)；
(5)检验过筛得到的粉剂的抑菌效果，若抑菌效率超过55％，则按要求进行包装。
制备过程中所采用的培养基均为LB液体培养基，按重量比，去离子水950份，胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，NaCl10份，溶质充分溶解后，用5mol/LNaOH调节pH至7.4。
组成细菌单独培养时，均表现出广谱的抑菌效果，但这三种细菌对同一病原菌的抗菌效果均有所不同。经研究发现按解淀粉芽孢杆菌：产酶溶杆菌：多粘类芽孢杆菌为1∶2∶6接种，37℃发酵48h后三种细菌菌体数目一致。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明适用范围广、抗菌效果优良稳定、不含任何有害物质、无毒副作用、环保，制备方法简单、制备周期短、成本低廉，是生态农业和绿色无公害食品的理想产品，有显著的经济效益和社会效益。
发明用途
1)减轻病原菌对农作物生长发育的影响，增加农作物产量；
2)有效降低使用化学农药所造成的污染；
3)满足绿色无公害生态农业发展的需要。
附图说明
图1是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌、混合菌对番茄灰霉的抑菌效率，J，S，D，H分别代表解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌以及三种菌按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌，误差线代表相应的标准误；
图2是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌、混合菌对纹枯的抑菌效率，J，S，D，H分别代表解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌以及三种菌按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌，误差线代表相应的标准误；
图3是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌、混合菌对螺纹的抑菌效率，J，S，D，H分别代表解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌以及三种菌按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌，误差线代表相应的标准误；
图4是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌、混合菌对根腐的抑菌效率，J，S，D，H分别代表解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌以及三种菌按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌，误差线代表相应的标准误；
图5是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对番茄灰霉的抑制效果图，其中，S，J，D，H分别表示产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和三种菌依次按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌；
图6是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对纹枯的抑制效果图，其中，S，J，D，H分别表示产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和三种菌依次按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌；
图7是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对罗纹的抑制效果图，其中，S，J，D，H分别表示产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和三种菌依次按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌；
图8是解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对根腐的抑制效果图，其中，S，J，D，H分别表示产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和三种菌依次按接种量比例1∶2∶6组成的混合菌。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。下述实例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特别说明均为质量百分比，所有容剂均为去离子水。
实施例1
一种生物杀菌剂的制备方法，按照以下步骤进行：
(1)液体培养产酶溶杆菌(Lysobacteryananisissp.nov)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，温度为37℃，转速为180r/min。培养基为胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，NaCl10份，去离子水950份。待溶质充分溶解后，用5mol/LNaOH调节pH至7.4；
(2)产酶溶杆菌(Lysobacteryananisissp.nov)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefa-ciens)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)三株细菌OD600为均0.150时，按接种量比例解淀粉芽孢杆菌∶产酶溶杆菌∶多粘类芽孢杆菌为1∶2∶6接种，37℃发酵；
(3)48h后，向混合菌发酵液中加入40-50份填充剂、1-10份表面活性剂、1-10份稳定剂等。填充剂为白炭黑，表面活性剂选取十二烷基磺酸钠和木质素磺酸钠，稳定剂为磷酸二氢钾，充分混合；
(4)将上述混合物粉碎，然后过200目的筛子；
(5)检验过筛后得到的粉剂的效果，如果检验抑菌效果合格，则按要求进行包装。
选取感染番茄灰霉的实验田，在其中设置6块面积菌为9m2的样方(3块为处理组，3块为对照组)；
按质量比，以混合菌剂∶水＝1∶50的质量比向上述混合菌剂中加入蒸馏水配制成悬浊液，以相同质量的蒸馏水为对照，采用喷雾法分别使得相应的处理组和对照组植株地上部分湿润即可。
效果极为明显，第一次喷洒后48h番茄灰霉症状已经消失，该种农用生物杀菌剂对番茄灰霉的杀菌率达到100％。
相对杀菌率(％)＝(对照染菌面积一处理染菌面积)/对照染菌面积×100％
实施例2
生物杀菌剂的制备方法同实例1。
选取感染番茄灰霉的实验田，在其中设置6块面积菌为9m2的样方，3块为处理组，3块为对照组；
按质量比，以混合菌剂∶水＝1∶100的质量比向上述混合菌剂中加入蒸馏水配制成悬浊液，以相同质量的蒸馏水为对照，采用喷雾法分别使得相应的处理组和对照组植株地上部分湿润即可。
第一次喷洒后48h番茄灰霉症状已经很少，杀菌率可达93.7％；第二次喷洒后48h番茄灰霉症状消失。
实施例3
生物杀菌剂的制备方法同实施例1。
选取感染番茄灰霉的实验田，在其中设置6块面积菌为9m2的样方，3块为处理组，3块为对照组；
按质量比，以混合菌剂∶水＝1∶200的质量比向上述混合菌剂中加入蒸馏水配制成悬浊液，以相同质量的蒸馏水为对照，采用喷雾法分别使得相应的处理组和对照组植株地上部分湿润即可。
第一次喷洒后48h番茄灰霉明显减少，杀菌率达到84.4％；第二次后48h番茄灰霉症状已经很少，只出现在极个别地上部位；第三次喷洒后48h番茄灰霉症状完全消失。
实施例4
生物杀菌剂的制备同实例1。
选取感染番茄灰霉的实验田，在其中设置6块面积菌为9m2的样方，3块为处理组，3块为对照组；
按质量比，以混合菌剂∶水＝1∶300的质量比向上述混合菌剂中加入蒸馏水配制成悬浊液，以相同质量的蒸馏水为对照，采用喷雾法分别使得相应的处理组和对照组植株地上部分湿润即可。
第一次喷洒后48h番茄灰霉明显减少，杀菌率达到78.3％；第二次和第三次喷洒后，番茄灰霉症状已经很少，只出现在极个别地上部位；第四次喷洒后48h，番茄灰霉症状完全消失。
实施例5混合菌剂抑制番茄灰霉试验
制备微生物复合菌液，产酶溶杆菌(Lysobacteryananisissp.nov)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)三株细菌OD600为均0.150时，按接种量比例解淀粉芽孢杆菌∶产酶溶杆菌∶多粘类芽孢杆菌为1∶2∶6接种，37℃培养48h；
配置PDA固体培养基，称取去皮的新鲜土豆200份，切成小块，置于烧杯中，加入500份蒸馏水加热至可以用玻璃棒捣碎土豆块，将土豆块与蒸馏水混合物用12层纱布过滤，向滤液中加入20份葡萄糖、18份琼脂粉和700份去离子水，加热至充分溶解。灭菌，倒平板，待培养基凝固后用打孔器在培养基上打孔(每份培养基打5个孔，培养基中央一个，培养基周围距中心孔1.2-1.8cm处均匀分布四个)。然后将用相同规格打孔器打的番茄灰霉菌饼接种于培养基中央的孔中，30℃培养24h后按逆时针方向将混合菌、解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌分别移取200uL接利于有番茄灰霉的培养基周围的四个孔中，37℃边培养边观察。
由图1解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对番茄灰霉的抑菌效率看出，混合菌对番茄灰霉病病原菌的抑菌效率大于解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌分别对番茄灰霉病病原菌的抑菌效率。
实施例6混合菌剂抑制纹枯病病原菌试验
按照混合菌剂抑制番茄灰霉病原菌试验的方法抑制纹枯。由图2解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对纹枯的抑菌效率可以看出，混合菌对纹枯病病原菌的抑菌效率大于解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌分别对纹枯病病原菌的抑菌效率。
实施例7混合菌剂抑制螺纹病病原菌试验
按照混合菌剂抑制番茄灰霉病原菌试验的方法抑制螺纹。由图3解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对螺纹的抑菌效率可以看出，混合菌对螺纹病病原菌的抑菌效率大于解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌分别对螺纹病病原菌的抑菌效率。
实施例8混合菌剂抑制根腐病病原菌试验
按照混合菌剂抑制番茄灰霉病原菌试验的方法抑制根腐。图4解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌及混合菌对根腐的抑菌效率说明，混合菌对根腐的抑菌效率大于解淀粉芽孢杆菌、产酶溶杆菌、多粘类芽孢杆菌分别对根腐病病原菌的抑菌效率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种生物杀菌剂，其特征在于该杀菌剂的活性成分由3种来自不同药用植物：远志、三叶木通、丹参的内生细菌按接种量比例1∶2∶6组成，3种细菌分别为产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌，该杀菌剂还包括40-50份填充剂、1-10份表面活性剂、1-10份稳定剂，填充剂为白炭黑，表面活性剂选取十二烷基磺酸钠和木质素磺酸钠，稳定剂为KH2PO4；
其制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述产酶溶杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌分别用LB液体培养基进行活化，然后在37℃，180r/min，PH为7.4的条件下进行发酵；
(2)当步骤(1)所述三种细菌发酵液OD600均为0.150时，接种量比例按解淀粉芽孢杆菌∶产酶溶杆菌∶多粘类芽孢杆菌为1∶2∶6接种，在37℃，180r/min，PH为7.4的条件下混合发酵；
(3)48h后，向步骤(2)获得的发酵液中依次加入1-10份表面活性剂、1-10份稳定剂、40-50份填充剂，填充剂为白炭黑，表面活性剂选取十二烷基磺酸钠和木质素磺酸钠，稳定剂为KH2PO4，充分混合；
(4)将步骤(3)所得的混合物粉碎，然后过筛，孔径为200目，粒度为75um；
(5)检验过筛得到的粉剂的抑菌效果，若抑菌效率超过60％，则按要求进行包装。
2.根据权利要求1所述生物杀菌剂，其特征在于，制备过程中所采用的培养基均为LB液体培养基，按重量比，去离子水950份，胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，NaCl10份，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.4。
3.根据权利要求1所述生物杀菌剂，其特征在于，当接种量比例解淀粉芽孢杆菌∶产酶溶杆菌∶多粘类芽孢杆菌为1∶2∶6时，37℃发酵48h后三种细菌数目一致。
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