CN103251573B - 携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球,优选的当蛋白为TNFSF蛋白并且抗肿瘤化疗药物为难溶性药物时，该组合物包括由TNFSF蛋白形成的基本上完全封闭的壳体，以及位于所述壳体内部的含有所述抗肿瘤化疗药物的内核，壳体的最大直径小于500nm。本发明的有益效果在于，提供了一种基于膜乳化技术的制备可以携带难溶性抗肿瘤药物的蛋白微纳米球，特别是提供了以TRAIL为代表的TNFSF蛋白、HSA蛋白的蛋白微纳米球的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，特别涉及一种携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球及其制法。
背景技术
微纳米球，是指药物分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的，大小在10-1000nm的纳米级分散体系，按照载体的不同可分为聚氰基丙烯酸酯毫微粒、白蛋白毫微粒、聚乳酸类毫微粒、脂质纳米粒等不同类型。
将蛋白质或多肽制成微纳米球系统给药，不仅能有效防止药物在体内很快降解，还可能靶向送达体内有效部位，达到缓释长效目的。但是蛋白质的稳定性差、包封率低、载药量小、易聚集而使生物活性降低，及可能引起免疫反应、体内外释放时具有明显突释效应等问题严重影响着这类制剂的发展。制备多肽及蛋白类药物微纳米球的常用方法包括复乳溶媒蒸发/萃取法、喷雾冷冻干燥法、相分离法、喷雾干燥法等，但是各种方法都有缺陷。
比如复乳溶媒蒸发/萃取法制备微纳米球时，蛋白质易在油水界面聚集而变性。又比如可生物降解聚合物PELA，亲脂性强，对水溶性多肽、蛋白质及疫苗的亲和力不高。现有技术中，也有用膜乳化技术的制备蛋白质微纳米球的报道。
膜乳化法被认为是获得高质量单分散稳定乳液的有效方法，可用于功能性单分散微纳米球和微囊的制备。但是由于影响膜乳化过程的参数主要包括膜微的径和分布、膜的孔隙率、膜表面类型、乳化剂类型及含量、分散相流量、连续相速度和操作压差等非常多，很多用膜乳化法制得的蛋白质微纳米球无法实际应用，特别是对于应用较广的HSA-DOC（人血白蛋白-紫杉醇）微纳米球来说，现有技术中还没有用膜乳化技术成功得到HSA-DOC的报道。
肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily；TNFSF）属II型跨膜蛋白，其胞外区C端含长约150个氨基酸的序列（THD），包含芳香族和疏水性残基的保守骨架。
以TRAIL为代表的TNFSF蛋白可以特异性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，也可以与其他肿瘤化疗药物联合应用。比如吴刚等在中国科技论文在线（www.paper.edu.cn）上发表的“TRAIL及联合阿霉素治疗骨肉瘤的动物实验研究”；乐箐华等发表在安徽医药（2009,12；13（12））的“TRAIL联用化疗药物抗妇科肿瘤的研究进展”。刘征等发表在华中科技大学学报（医学版）（第36卷第3期第352页）的“紫杉醇联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对前列腺癌细胞的抑制作用”。仇波等发表在中国肿瘤生物治疗杂志（Feb.2013,Vol.20，No.1）上的“TRAIL联合紫杉醇对人脑胶质瘤U87细胞的抑制效应及其可能的机制”。刘言厚等发表在山东医药（2011年第51卷第17期）的“紫杉醇对TRAIL诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的影响”，还有英文文献如Avi Ashkenazi等发表在JOURNAL OFCLINICALONCOLOGY（VOLUME 26 NUMBER 21 JULY 202008）的“Ligand-Based Targeting of Apoptosis in Cancer:ThePotential of Recombinant Human Apoptosis Ligand 2/TumorNecrosis Factor–Related Apoptosis-Inducing Ligand(rhApo2L/TRAIL)”以及Frank A.E.Kruyt发表在Cancer Letters 263(2008)14–25的“TRAIL and cancer therapy”。以上的联合应用的方法，涉及到了TRAIL与化疗药物在骨肉瘤、妇科肿瘤、前列腺癌、脑胶质瘤、胃癌等的联合应用，共同的给药方式均是属于联合用药，也就是TRAIL与化疗药物分属于不同的药剂学单元，临床应用时临时组合在一起。虽然普通技术人员根据上述文献，可能会将TRAIL与难溶性化疗药物制成一个制剂单位，但由于TRAIL为水溶性的，将其与难溶性药物混合在一起制成复方药物几乎无法实现。
虽然对于难溶性的抗肿瘤化疗药物，普通技术人员可以考虑制成纳米球，可以供制备混悬液供注射或口服用。比如中国专利CN101352420B所公开的以聚乳酸包合羟基喜树碱。但现有技术中尚没有将TNFSF蛋白与难溶性的抗肿瘤药物制成合适的微纳米球的报道。
另外，TRAIL为代表的TNFSF蛋白还存在半衰期过短的缺陷，从而导致影响药物的体内药代动力学特征。紫杉醇为代表的抗肿瘤化疗药物，需要进入细胞内才能发挥最佳疗效，研究如何增强局部紫杉醇类药物浓度进而使紫杉醇为代表的抗肿瘤化疗药物更多进入靶向细胞具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中的诸多技术问题，提供了一种利用膜乳化技术制得的能够携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球。具体地说，本发明的第一个目的是提供了一种能够携带抗肿瘤化疗药物的TNFSF蛋白微纳米球，该微纳米球能够发挥TNFSF蛋白在体内与相应受体结合，发挥抗癌作用的同时，也能够携带难溶性的抗肿瘤化疗药物到达体内，发挥了协同作用。本发明的第二个目的是提供了一种利用膜乳化能够携带紫杉醇的HSA蛋白微纳米球。本发明的第三个目的是提供了上述能够携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球的制备方法。
本发明的一种携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球，优选的第一种蛋白为TNFSF蛋白，并且抗肿瘤化疗药物为难溶性药物，组合物包括由所述TNFSF蛋白形成的基本上完全封闭的壳体，以及位于壳体内部的含有抗肿瘤化疗药物的内核，壳体的最大直径小于500nm。
本发明优选的粒子粒径范围在340nm-400nm，最优选的粒子粒径范围在200nm以下。
本发明的携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球，优选的难溶性的抗肿瘤化疗药物，包括但不限于铂类、长春碱类、紫杉醇类、喜树碱类、阿霉素、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、卡氮芥、依托泊苷、干扰素、苯芥胆甾醇、激素类、他莫昔芬；长春碱类包括长春花碱、长春新碱及其他类似于长春碱的药物；紫杉醇类包括紫杉醇及其衍生物、紫杉醇前体药物、紫杉烷以及其它类似于紫杉醇的药物；喜树碱类包括喜树碱及其类似物、羟基喜树碱及其类似物；铂类包括卡铂、顺铂；激素类包括雌激素、孕激素。
特别需要指出的是，本发明的蛋白微纳米球非常适合携带紫杉醇。
本发明的携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球，TNFSF蛋白包括EDA-A1、TNFSF1、TNFSF2、TNFSF3、TNFSF3L、TNFSF4、TNFSF5 4、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TRAIL、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18之中的一种或几种的野生型及变构型。
特别优选的是，TNFSF蛋白为TRAIL。TRAIL(TNF–related apoptosis inducing ligand)是一个重要的凋亡调节蛋白,TRAIL分子以转录本形式存在于人体的大多数器官和细胞,更重要的是被激活的T、B淋巴细胞和NK细胞也表达TRAIL蛋白。成熟的TRAIL蛋白主要以Ⅱ型跨膜蛋白或可溶性的形式存在。其胞外区由747个氨基酸组成。TRAIL胞外区与其特异性受体结合,能迅速地诱导多种肿瘤细胞系的凋亡,而对正常组织细胞无凋亡诱导作用。
本发明特别意外的发现了一种携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球的制法，包括如下步骤：
a.将抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂作为油相；
b.将蛋白溶于水作为水相；
c.采用膜乳化方法将水相和油相制得膜乳化液；
d.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
e.将微纳米球冷冻干燥。
第一种对蛋白微纳米球的制法的改进为，当蛋白为TNFSF蛋白时，按如下步骤制备：
a.将抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂作为油相；
b.将TNFSF蛋白水溶液作为水相；
c.将油相与水相制成油/水初乳液；
d.将油/水初乳液进行膜乳化，得膜乳化液；
e.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
f.将微纳米球冷冻干燥。
在此实验中不用连续相冲刷，一次打出产品。原理为初乳液是颗粒较大的水包油体系，通过膜后被挤压成纳米级的水包油结构，进而固化形成颗粒
更进一步说，当抗肿瘤药物为紫杉醇、并且TNFSF蛋白为TRAIL，由如下步骤制得：
a.将20-40重量份的紫杉醇溶于乙酸乙酯作为油相；
b.将50重量份TRAIL水溶液作为水相；
c.在冰水浴条件下，采用超声破碎将油相分散于水相中制备油/水初乳液；
d.将初乳液倒入快速膜乳化装置中，于常温下，以0.5-1.0MPa氮气压力下，将初乳液反复压过膜孔进行膜乳化，得膜乳化液；
e.将膜乳化液在常温下磁力搅拌挥发去除有机溶剂使其固化制得微纳米球；
f.将固化后的微纳米球用去离子水离心洗涤5次，并冷冻干燥制成所述组合物。
令人惊奇的是，在乙酸乙酯与水的重量份配比为20∶50时，效果最为理想。
第二种对蛋白微纳米球的制法的改进为，当蛋白为TNFSF蛋白时，也可按如下步骤制备：
a.将抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂作为油相；
b.将TNFSF蛋白水溶液作为水相；
c.将油相作为分散相，将水相作为连续相进行膜乳化，得膜乳化液；
d.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
e.将微纳米球冷冻干燥。
第三种的蛋白微纳米球的制法，是当蛋白为HSA蛋白并且抗肿瘤化疗药物为紫杉醇，包括如下步骤：
a.将紫杉醇溶于有机溶剂作为油相；
b.将HAS蛋白溶于水作为水相；
c.将油相与所述水相制成油/水初乳液；
d.将油/水初乳液进行膜乳化，得膜乳化液；
e.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
f.将微纳米球冷冻干燥。
本发明的人血清白蛋白（Human Serum Albumin，简称HSA）是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60%。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等：同时维持血液正常的渗透压。
本发明的有益效果在于，提供了一种基于膜乳化技术的制备可以携带难溶性抗肿瘤药物的蛋白微纳米球，特别是提供了以TRAIL为代表的TNFSF蛋白、HSA蛋白的蛋白微纳米球的制备方法，该方法的包封率高、合理的控制了突释效应。下面以TRAIL为例帮助理解说明本发明的有益效果，但不应受此举例限制本发明的有益效果，TRA-DOC微纳米球能够在联合抗癌产生协同作用的同时，又具备如下特点：
1、TRA-DOC是微纳米球，可以制成单一制剂；而“TRAIL-紫杉醇联合应用”只是临用现配，不是单一制剂；
2、TRA-DOC是靶向给药，而且能够将药物带入带存在TRA受体（死亡受体Death receptor）的细胞中，而“TRAIL-紫杉醇联合应用”无此作用；
3、TRA-DOC微纳米球解决难溶性化疗药物不易溶解的问题，发挥TRI和DOC的双重疗效，而“TRAIL-紫杉醇联合应用”中紫杉醇需要其他高分子材料包合。
4、TRA-DOC微纳米球的协同作用，要高于“TRAIL-紫杉醇联合应用”的协同作用。
5、TRA-DOC微纳米球的半衰期较单独的TRAIL为代表的TNFSF延长约20%-200%。
下面通过试验例进一步说明本发明。
试验例1：H460细胞细胞毒性试验
试验方法：H460细胞接种于96孔板，置于培养箱24h后，待细胞附壁后小心吸出各孔内培养液。设置空白组即H460细胞未加任何药物，对照组分别为TRA-IBU(TRA为TRAIL，IBU为布洛芬),HSA-DOC（HSA人血清白蛋白，DOC为紫杉醇，非本发明的膜乳化技术HAS-DOC），实验组为TRA-DOC。将供试品（以DOC计算，初始浓度为1mg/mL）以及对照组加入至96孔版中，每组药品分别稀释为100倍、1000倍、4000、16000、64000倍。
试验结果：该纳米粒子在各个浓度上均对H460细胞呈现出显著的抑制作用，且均好于对照组效果。其中以稀释4000倍时杀伤效果最优，如图7，TRA-DOC对H460的抑制率为87.4±1.6%，明显好于HSA-DOC组65.4±1.3%、TRA-IBU组31.1±0.6%。
试验例2：L929细胞细胞毒性试验
试验方法同试验例1。
试验结果：该纳米粒子在各个浓度上均对L929细胞呈现出显著的抑制作用，且均好于对照组效果。其中以稀释4000倍时杀伤效果最优，如图8，TRA-DOC对L929的抑制率为49.1±2.2%，明显好于HSA-DOC组5.3±1.8%、TRA-IBU组7.0±1.3%。
试验例3对S180腹水瘤小鼠抑制作用
试验方法：无菌条件下取S180腹水瘤小鼠瘤液，配制细胞悬液，以1×106/只的浓度接种于实验小鼠右侧腋后皮下。次日，将动物随机分组，每组10只。
设阴性对照组、对照组HSA-DOC（非本发明的膜乳化技术HAS-DOC）和试验组TRA-DOC，以10mg/kg/日剂量腹腔注射；以相同剂量（10mg/kg）相同体积（0.2ml/20g）与实验观察样品同时给药。连续给药7次。待阴性对照组动物肿瘤生长至一定体积结束观察。
实验结束时，秤体重，剥离肿瘤，秤瘤重，用t检验法比较各组动物肿瘤重量的统计学差别。
肿瘤生长抑制率的计算公式为：
实验结果：如下表所示，TRA-DOC组、HSA-DOC组的抑瘤率（%）分别为54.58%和33.47%，试验组抑瘤效果明显好于对照组。
试验例4 靶向性试验
实验仪器 流式细胞仪
试验方法 取两个培养皿，当细胞达到对数生长期时，分别加入HSA-DOC和TRA-DOC，和HeLa细胞共同培养24小时（5小时）。然后用PBS缓冲溶液冲洗三次以除去未被内吞的纳米粒子和部分死细胞。接着使用胰酶溶液消化并制备成细胞悬液，使用流式细胞仪检测细胞对两种粒子的内吞效率。用未经过任何处理的细胞作为参照系。将HSA-DOC和TRA-DOC纳米粒子通过荧光染料标记。
试验结果结合图9所示，图9的横坐标为荧光强度信号，纵坐标为相对细胞个数；曲线向右移动表示细胞内的荧光强度增大，而纳米粒子是带荧光的，荧光增强只能是细胞内吞的粒子多导致的。曲线右移代表细胞内TRA-DOC粒子多于HSA-DOC粒子，从而证明TRA-DOC粒子的靶向性更强。
附图说明
图1.本发明粒子结构示意图；图中，1表示纳米粒子；2表示难溶性抗肿瘤药物内核；3表示由TNFSF蛋白组成外壳，外壳的厚度为5-50nm，外壳的直径为1-500nm。
图2.本发明的扫描电子显微镜图；图中，可以看出本发明微纳米球的表面包合完整，尺寸分布均匀。
图3.Zeta电位仪；图中，纵坐标Intensity表示强度，横坐标size表示粒径，statistics graph表示统计图形；measurements表示量度。图中表明，本发明的微纳米球的粒径分布90%的粒子分布在160-190nm之间。
图4.X射线光电子能谱；图中，counts/s表示计数次数/秒，bindingenergy（ev）表示结合能，survey表示测量图，图中表明，本发明的微纳米球在399eV处检测到N元素的特征能量峰，表明在该粒子表面存在氮元素，进而证明纳米粒子中含有TNFSF蛋白。
图5.圆二色谱；图中，intensitiy表示强度，wavelength表示波长；图中表明，在本发明微纳米球内存在蛋白质，而该蛋白的二级结构没有明显的改变。
图6.激光共聚焦显微镜；1表示微纳米球；2表示HeLa肿瘤细胞，图中表明，微纳米球1被HeLa肿瘤细胞2的细胞膜内吞的过程，证明本发明的微纳米球容易进入到细胞内部，从而发挥紫杉醇的作用；
图7.H460细胞的细胞毒性试验细胞杀伤情况统计图；
图中，纵坐标Inhibition Ratio表示抑制率；control表示空白组；
图8.L929细胞的细胞毒性试验细胞杀伤情况统计图；
图中，纵坐标Inhibition Ratio表示抑制率；control表示空白组；
图9.靶向性试验；
图10.扫描电子显微镜图片：HSA-DOC；
图11.Zeta电位仪：粒径分布80%的粒子分布在300-400nm之间。
具体实施方式
实施例1 TRA-DOC微纳米球
实验材料:
重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），通过大肠杆菌表达、提取。紫杉醇（纯度≥98.00%）；乙酸乙酯；PBS缓冲溶液；去离子水。
实验仪器：
超声破碎机，高速离心机，带有亚微米粒径分析功能的Zeta电位仪，冷场发射扫描电子显微镜，流式细胞仪，激光共聚焦显微镜，X射线光电子能谱衍射仪，高效液相色谱，圆二色谱仪，SPG膜乳化器。
实验过程：
将20mg紫杉醇（DOC）溶于20ml乙酸乙酯中配成1mg/mL的溶液作为油相，将50mg的TRAIL溶于50ml水中配成1mg/mL的溶液作为水相，在冰水浴条件下，采用超声破碎将油相分散于水相中制备油/水初乳液。将此初乳液倒入快速膜乳化装置中，常温下以0.5-1.0MPa的氮气压力将其反复压过SPG膜的膜孔（孔径800-1000nm），将所得乳液在常温下磁力搅拌挥发去除有机溶剂使其固化成微纳米球，将固化后的微纳米球用去离子水离心洗涤5次，并冷冻干燥制成成品。
试验结果：如图1所示，TRA-DOC微纳米球1包括TRAIL蛋白形成的基本上完全封闭的壳体3，以及位于壳体内部的含有紫杉醇的内核。如图2所示的扫描电子显微镜图表明，该微纳米球的表面包合完整，尺寸分布均匀。结合图3的Zeta电位仪测试结果，该微纳米球的粒径分布90%的粒子分布在160-190nm之间。
如图4的X射线光电子能谱表明，本发明的微纳米球在399eV处检测到N元素的特征能量峰，表明在该粒子表面存在氮元素，进而证明纳米粒子中含有TRAIL蛋白。如图5的圆二色谱表明，在本发明微纳米球内存在蛋白质，而该蛋白的二级结构没有明显的改变。
如图6所示的激光共聚焦显微镜证明了微纳米球1被HeLa肿瘤细胞2的细胞膜内吞的过程，因而本发明的微纳米球容易进入到细胞内部，从而发挥紫杉醇的作用。
实施例2 HSA-DOC微纳米球
实验材料:
人血清白蛋白（HSA），通过大肠杆菌表达、提取。紫杉醇（纯度≥98.00%）；乙酸乙酯；PBS缓冲溶液；去离子水。
实验仪器：
超声破碎机，高速离心机，带有亚微米粒径分析功能的Zeta电位仪，冷场发射扫描电子显微镜，SPG膜乳化器。
实验过程：
将20mg紫杉醇（DOC）溶于20ml乙酸乙酯中配成1mg/mL的溶液作为油相，将50mg的HSA溶于50ml水中配成1mg/mL的溶液作为水相，在冰水浴条件下，采用超声破碎将油相分散于水相中制备油/水初乳液。将此初乳液倒入快速膜乳化装置中，常温下以0.5-1.0MPa的氮气压力将其反复压过SPG膜的膜孔（孔径800-1000nm），将所得乳液在常温下磁力搅拌挥发去除有机溶剂使其固化成微纳米球，将固化后的微纳米球用去离子水离心洗涤5次，并冷冻干燥制成成品。
试验结果：如图10所示的扫描电子显微镜图片表明HSA-DOC微纳米球的表面包合完整，尺寸分布均匀；如图11所示的Zeta电位仪结果表明，粒径分布80%的粒子分布在300-400nm之间。
实施例3 TNF-α与DOC微纳米球
实验材料:
TNF-α，通过大肠杆菌表达、提取。紫杉醇（纯度≥98.00%）；乙酸乙酯；PBS缓冲溶液；去离子水。
实验仪器：
超声破碎机，高速离心机，带有亚微米粒径分析功能的Zeta电位仪，冷场发射扫描电子显微镜，SPG膜乳化器。
实验过程：
将20mg紫杉醇（DOC）溶于20ml乙酸乙酯中配成1mg/mL的溶液作为油相，将50mg的TNF-α溶于50ml水中配成1mg/mL的溶液作为水相，在冰水浴条件下，采用超声破碎将油相分散于水相中制备油/水初乳液。将此初乳液倒入快速膜乳化装置中，常温下以0.8MPa的氮气压力将其反复压过孔径为800nm的SPG膜，将所得乳液在常温下磁力搅拌挥发去除有机溶剂使其固化成微纳米球，将固化后的微纳米球用去离子水离心洗涤5次，并冷冻干燥制成成品。
试验结果：TNF-α-DOC微纳米球的表面包合完整，尺寸分布均匀；粒径分布80%的粒子分布在350-400nm之间。
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球，其特征在于，所述蛋白为TNFSF蛋白，所述抗肿瘤化疗药物为难溶性药物，所述蛋白微纳米球包括由所述TNFSF蛋白形成的基本上完全封闭的壳体，以及位于所述壳体内部的含有所述抗肿瘤化疗药物的内核，所述壳体的最大直径小于500nm；所述难溶性的抗肿瘤化疗药物为紫杉醇；所述TNFSF蛋白为TRAIL。
2.一种制备权利要求1所述的携带抗肿瘤化疗药物的蛋白微纳米球的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将所述抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂作为油相；
b.将所述蛋白溶于水作为水相；
c.采用膜乳化方法将所述水相和所述油相制得膜乳化液；
d.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
e.将微纳米球冷冻干燥。
3.如权利要求1所述的蛋白微纳米球的制法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将所述抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂作为油相；
b.将所述TNFSF蛋白水溶液作为水相；
c.将所述油相与所述水相制成油/水初乳液；
d.将油/水初乳液进行膜乳化，得膜乳化液；
e.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
f.将微纳米球冷冻干燥。
4.如权利要求1所述的蛋白微纳米球的制法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将所述抗肿瘤化疗药物溶于有机溶剂作为油相；
b.将TNFSF蛋白水溶液作为水相；
c.将所述油相作为分散相，将所述水相作为连续相进行膜乳化，得膜乳化液；
d.将膜乳化液的固化制得微纳米球；
e.将微纳米球冷冻干燥。
5.如权利要求1所述的蛋白微纳米球的制法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将20-40重量份的紫杉醇溶于乙酸乙酯作为油相；
b.将50重量份TRAIL水溶液作为水相；
c.在冰水浴条件下，采用超声破碎将油相分散于水相中制备油/水初乳液；
d.将所述初乳液倒入快速膜乳化装置中，于常温下，以0.5-1.0MPa氮气压力下，将所述初乳液反复压过膜孔进行膜乳化，得膜乳化液；
e.将所述膜乳化液在常温下磁力搅拌挥发去除有机溶剂使其固化制得微纳米球；
f.将固化后的所述微纳米球用去离子水离心洗涤5次，并冷冻干燥制成所述组合物。
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