CN103237553A - 治疗和/或逆转神经退行性疾病和/或病症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用从脊髓组织获得的神经干细胞（NSC）来治疗神经系统疾病/病症的方法。所述方法可以包括使用NSC群来治疗脑的神经系统疾病/病症。这样的方法可以包括向脑中引入外源性培养及增殖的NSC，所述NSC分化成神经元，所述神经元能够在体内整合到脑组织中，整合的方式足以改善与神经系统疾病/病症相关的症状。

Description

治疗和/或逆转神经退行性疾病和/或病症的方法

背景技术

中风是局部区域中由于血流量不足引起的脑细胞突然死亡。当流向一部分脑的血流被中断时，发生中风。在没有血液来供应氧气和营养物以及移除废产物的情况下，脑细胞迅速开始死亡。取决于受影响的脑区域，中风可以引起瘫痪、语言障碍、记忆和推理能力的丧失、昏迷或死亡。

发明内容

本公开涉及治疗和/或逆转与脑中神经元细胞损失（例如由脑缺血性中风、出血性中风、脑性麻痹或者创伤性脑损伤引起的细胞死亡）相关的神经系统疾病或病症的方法。这样的方法可用于治疗由中风或其它脑损伤引起的症状。

本公开也提供了用于治疗与脑中神经元细胞损失相关的疾病或病症的方法，包括例如用于治疗由中风或其它脑损伤引起的症状的方法，所述方法包括：获得增殖的神经干细胞群以及向对象的脑的至少一个区域引入治疗有效量的所述增殖的神经干细胞群，其中所述神经干细胞群分化成在体内整合到对象的脑中的神经元。不希望受限于本发明的理论，据信，该整合的神经元然后通过替换死亡的神经元、重新产生宿主神经元和/或诱导宿主神经回路的可塑性以重建包括供体神经元的受损神经元连接，来促进损伤组织的修复。

在一些实施方案中，引入治疗有效量的增殖群包括向对象的脑的一个至多个区域中注射至少一部分的所述治疗有效量。

在一些实施方案中，增殖所述至少一种神经干细胞包括在没有血清的条件下培养神经干细胞。

在一些实施方案中，增殖所述至少一种神经干细胞包括将所述至少一种神经干细胞暴露于至少一种生长因子。在一些实施方案中，所述生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、aFGF及其组合。

在一些实施方案中，所述增殖的干细胞群的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能够在对象的脑组织中产生神经元。

在一些实施方案中，引入治疗有效量的所述增殖的干细胞群包括向对象的脑组织的多个区域中注射至少一部分的所述治疗有效量。

在一些实施方案中，脑的区域涉及运动传导通路—向管控肌肉收缩的脑、脑干和脊髓以及从管控肌肉收缩的脑、脑干和脊髓传导电信号的神经元纤维。这样的区域包括运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、中脑、脑干和小脑。由于中风或创伤，该通路中的离散区域可能受损，导致瘫痪、痉挛、强直及其它运动功能障碍的症状。

在另一个实施方案中，将脊髓来源的人神经干细胞的悬液注射到受影响的区域中、附近或周围。注射的细胞分化成神经元和神经胶质，所述神经元和神经胶质整合到受影响的区域中以促进运动传导通路的修复，从而恢复运动功能和/或改善运动功能障碍。

在一些实施方案中，所述对象具有导致脑缺血的事件，诸如心脏病发作或中风。

本公开也提供了在有需要的对象中治疗中风的方法，所述方法包括：从人的脊髓组织分离至少一种神经干细胞；体外增殖所述神经干细胞以形成增殖群；浓缩所述增殖群；以及向对象的脑的至少一个区域引入治疗有效量的所述增殖群。

在其它实施方案中，所述增殖的神经干细胞群源自于脊髓组织，包括例如死后的人类胎儿脊髓组织。

在一些实施方案中，死后胎儿的胎龄在约5和约20周之间。

在一些实施方案中，增殖所述至少一种神经干细胞包括在没有血清的条件下培养神经干细胞。

在一些实施方案中，增殖所述至少一种神经干细胞包括将所述至少一种神经干细胞暴露于至少一种生长因子。在一些实施方案中，所述生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、aFGF及其组合。

在一些实施方案中，所述增殖的干细胞群的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能够在对象的脑组织中产生神经元。

在一些实施方案中，引入治疗有效量的所述增殖的干细胞群包括向对象的脑组织的多个区域中注射至少一部分的所述治疗有效量。

下面在本文中对本发明的这些和其它实施方案进行了进一步的详细描述。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本公开的以下详细描述。

图1显示了移植人脊髓来源的神经干细胞（HSSC）改善了脑缺血后的神经行为。在植入HSSC的大鼠（n=10）和注射缓冲剂的对照大鼠（n=10）中进行MCA结扎之前和之后，使用神经行为测量方案评估神经功能。在身体摇摆测试中，HSSC大鼠与对照大鼠相比表现出显著降低的身体不对称性（A板）。检查了所有动物中在脑缺血之前和之后的自主活动性。与对照大鼠相比，在接受HSSC移植的大鼠中，在脑缺血后，垂直活动性、垂直移动时间以及垂直移动次数显示出显著增加（B-D板）。而且，在两种处理的每一种之后，执行握力测量来检查所有实验大鼠的前肢力量（E板）。结果显示出HSSC组中比对照组中高的握力比率。

图2A-B显示的是从植入在缺血大鼠脑中的外源性移植HSSC的免疫组织化学（IHC）分析获得的图像。用针对人特异性核抗体（HuNu）（图2A）以及神经元特异性烯醇酶（NSE）（图2B）的抗体对HSSC处理过的缺血大鼠脑的半影进行免疫染色。

具体实施方式

本公开的方法涉及与脑中神经元细胞损失相关的神经系统疾病或病症的治疗。现已发现，当将人脊髓干细胞系（HSSC）移植到脑内梗死周围区域中时，所述干细胞系能够存活并在受损组织中整体分化成神经元。值得注意的是，分化的神经元整合（即，与其它神经元建立起互联性）到周围脑组织中并逆转了运动缺陷。这样，本公开的方法可用于治疗包括例如脑的疾病在内的神经退行性疾病，所述治疗包括逆转。具体而言，本公开的方法可用于治疗任何由脑缺血引起的运动症状（例如，轻瘫、瘫痪、痉挛或强直）。所述运动症状可处于疾病的急性、亚急性或慢性期（例如，处于慢性中风）。

本公开提供了用于治疗和/或逆转与脑（例如脑组织，如大脑半球、大脑皮质、皮质下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑）中神经元细胞损失（例如，细胞死亡）相关的神经系统或神经退行性疾病或病症的方法，所述方法包括：获得增殖的神经元干细胞群（例如人脊髓干细胞系）以及向对象的脑一个至多个区域引入治疗有效量的所述增殖的神经元干细胞群，其中所述神经元干细胞群能够分化成在体内整合到对象的脑中的神经元。

本公开还提供了在有需要的对象中治疗和/或逆转与脑缺血相关的轻瘫、瘫痪、痉挛、强直或肌肉多动症的方法，所述方法包括：从哺乳动物中分离至少一种神经干细胞（例如，人脊髓干细胞系）；使所述神经干细胞体外增殖成增殖群；浓缩所述增殖群；以及将治疗有效量的所述增殖群引入到对象的脑的至少一个区域（例如脑组织，如大脑半球、大脑皮质、皮质下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑）中。在一个实施方案中，所述增殖群的至少20%能够在对象的脑中产生神经元。

本公开的方法包括使用NSC来改善神经退行性病状。在本文中使用时，术语“NSC”还可以指神经祖细胞或神经元祖细胞，或者神经上皮前体细胞。根据NSC分化成三种主要的CNS细胞类型中的每一种的能力，可以从功能上对NSC进行限定，所述三种主要的CNS细胞类型为：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一些实施方案中，“治疗”疾病、病症或病状至少部分包括：（1）防止所述疾病、病症或病状，即，使得在暴露于或容易罹患所述疾病、病症或病状但还没有经历或表现出所述疾病、病症或病状的症状的哺乳动物中，所述疾病、病症或病状的临床症状不会发展；（2）抑制所述疾病、病症或病状，即，阻止或减少所述疾病、病症或病状或其临床症状的发展；或者（3）缓解所述疾病、病症或病状，即，引起所述疾病、病症或病状或其临床症状的复原。

在一些实施方案中，在本文中使用时，“有效量”指的是赋予对象治疗效果所需要的活性组合物的量。在本文中使用时，“治疗有效量”指的是所施用的试剂或化合物的足够量，该量将在一定程度上缓解正在治疗的疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施方案中，结果是减轻和/或缓和疾病的病征、症状或病因，或者任何其它需要的生物系统改变。例如，在一些实施方案中，用于治疗用途的“有效量”是需要用来提供疾病症状的临床显著性减轻而没有过度不良副作用的组合物的量，所述组合物包括本文中公开的化合物。在一些实施方案中，使用诸如剂量递增研究的技术来确定任何个别情况下的适当的“有效量”。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。在其它实施方案中，本文中公开的化合物例如式（A）或式（I）的化合物的“有效量”，是能够有效实现需要的药理效果或治疗改善而没有过度不良副作用的量。在其它实施方案中，应当理解，由于对象的代谢、年龄、重量、一般状况、正在治疗的病状、正在治疗的病状的严重性以及处方医师的判断方面的变化，“效果量”或“治疗有效量”在对象和对象之间存在变化。

在一个实施方案中，NSC为多潜能细胞，以致每个细胞都有能力分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在另一个实施方案中，NSC为双潜能细胞，以致每个细胞都有能力分化成三种CNS细胞类型中的两种。在另一个实施方案中，NSC至少包括在体外产生神经元和星形胶质细胞二者的双潜能细胞，并至少包括在体内产生神经元的单潜能细胞。

生长条件能够影响细胞向一种或另一种细胞类型分化的方向，表明所述细胞并非定向于单一细胞系。在有利于神经元分化的培养条件下，细胞、特别是来自于人CNS的细胞，主要是能够分化成神经元和星形胶质细胞的双潜能细胞，向少突胶质细胞的分化是最小化的。因此，本公开方法的分化的细胞培养物可以产生神经元和星形胶质细胞。在一个实施方案中，神经元与星形胶质细胞的比率为约20：80至约80：20，例如约50：50。

在本公开方法的一个实施方案中，待移植到对象中的细胞源自于脑组织。在另一个实施方案中，NSC分离自胎龄在约5至约20周之间的人类胎儿脑组织。应当理解，可分离的神经干细胞群的比例可以随供者的年龄而变化。细胞群的增殖能力也可以随供者的年龄而变化。NSC的这种时空特异性表明，NSC的行为像命运受限（fate-restricted）的祖细胞，而不像空白细胞或单一细胞群。

例如，腹侧中脑的NSC不同于在相同的妊娠阶段从脊髓获得的NSC。具体而言，来自于腹侧中脑的NSC专门产生表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元，而来自于脊髓的NSC专门产生产乙酰胆碱的胆碱能神经元。然而，这两种细胞类型均同时产生更普遍的产谷氨酸的神经元和产GABA的神经元。因此，在实施方案中，本公开的方法包括从腹侧中脑获得NSC，以治疗通过植入表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元而得到至少部分改善或减弱的病状。

NSC也可分离自产后组织和成人组织。源自于产后组织和成人组织的NSC在它们分化成神经元和神经胶质的能力上以及在它们的生长和分化特征上是在数量上相当的。然而，从各种产后和成人CNS体外分离NSC的效率会远远低于从胎儿组织分离NSC的效率，胎儿组织含有更丰富的NSC群。不过，正如与胎儿来源的NSC一样，本公开的方法使得至少约30%的源自于新生儿来源和成人来源的NSC能够在体外分化成神经元。因此，可以如上在胎儿来源的NSC的情况下所描述的，使用产后组织和成人组织。

通过操纵在培养物中增殖的胚胎干细胞，能够获得各种神经元亚型。因此基于本公开的方法，可以在需要时从其它不相关或不需要的细胞中分离和纯化特定的神经元亚型以改善结果，并且所述特定的神经元亚型可用于治疗相同的神经退行性病状。

本公开的方法中的NSC可以源自于一个部位并作为自体移植物被移植到同一对象中的另一个部位。而且，本公开的方法中的NSC可以源自于基因相同的供体并作为同系移植物被移植。再进一步，本公开的方法中的NSC可以源自于相同物种的基因不相同的成员并作为同种异体移植物被移植。或者，NSC可以源自于非人类来源并作为异种移植物被移植。随着强力免疫抑制剂的发展，能够将非人类神经前体细胞例如猪源神经前体细胞的同种异体移植物和异种移植物移植到人类对象中。

可以通过任何标准方法解离样品组织。在一个实施方案中，通过使用移液管和不含二价阳离子的缓冲剂（例如盐水）进行柔和的机械研磨使组织解离以形成解离后细胞的悬液。需要进行充分解离以主要获得单个细胞，从而避免过高的局部细胞密度。

为了在商业上成功应用NSC，理想的是在多次连续传代中维持具有稳定的增殖和分化能力的强大而一致的培养物。如上所述，可以优化培养方法以实现来自于CNS发育的不同区域和阶段的各个NSC细胞系的长期稳定的增殖，同时还维持所述NSC独特的祖细胞性质。在一个实施方案中，可以根据以下专利所述方法培养干细胞：U.S.7,691,629、U.S.5,753,506、U.S.6,040,180或U.S.7,544,511，所述专利在此以其全文引作参考。

在实施方案中，本公开的方法的NSC可以包括用于移植的预分化细胞。为了使细胞收率最大化并简化过程，收获主要包含未分化细胞群的汇合培养物用于移植。然而，应当认识到，由于细胞密度增加，也可以存在一小群刚开始自发分化的细胞。

在实施方案中，NSC被浓缩在如上所述的诸如临床上可用的休眠或冷冻溶液的溶液中。在实施方案中，将NSC浓缩至适当的细胞密度，所述细胞密度与用于施用细胞的细胞密度可以相同或不同。在实施方案中，取决于诸如注射部位、注射部位的神经退行性状态、有益效果必需的最小剂量以及毒性副作用考虑的因素，用于施用的细胞密度可以在约1,000个细胞/微升至约1,000,000个细胞/微升之间变化。在实施方案中，本公开的方法包括以约5,000至约50,000个细胞/微升的细胞密度注射NSC。

其中悬浮有增殖的NSC、用于递送至治疗区域的介质的体积在本文中被称为注射体积。注射体积取决于注射部位以及组织的退行性状态。更具体而言，注射体积的下限可以由高细胞密度粘性悬液的实际液体操作以及细胞发生簇集的倾向性决定。注射体积的上限可以由避免损伤宿主组织所必需的由注射体积所施加的压缩力的限度以及实际手术时间决定。

在使用已知方法时，供体细胞的低细胞存活使得有必要将大量细胞递送至相对小的区域中以尝试有效治疗。然而，注射体积是施加在宿主组织上的流体静压，与高注射体积相关的延长的注射时间加剧了手术风险。此外，过量注射供体细胞导致对宿主薄壁组织的压缩及随后的损伤。在尝试弥补体积限制时，已知方法要求制备高细胞密度悬液用于注射。然而，高细胞密度促进移植的细胞紧密簇集并抑制细胞迁移或扩散，防止了在有限区域外的有效治疗并且不利于无缝整合到宿主组织中。

相反，因为用本公开的方法制备的细胞的体内存活得到改善，所以每次注射只需要较少数量的细胞。实际上，据显示，在自注射时间六个月后，存在高达三至四倍的注射细胞数量，这证明，在使用本公开方法时具有显著的数量存活（quantitative survival）。还有，由于所述数量存活，可以实现需要的细胞剂量的可重复性施用。相应地，在一个实施方案中，将NSC浓缩至约1,000至约200,000个细胞/微升的密度。在另一个实施方案中，使用了约5,000至约50,000个NSC/微升用于有效的植入。在另一个实施方案中，使用了约10,000至30,000个NSC/微升。在另一个实施方案中，可以将悬浮在小于约100微升/注射部位的注射体积中的NSC递送到治疗区域。例如，在治疗人类对象的神经退行性病状中，其中可以进行多次注射，可以使用的注射体积为0.1和约100微升/注射部位。

在本公开的方法中可以使用用于将细胞注射到需要的区域中的任何适合的装置。在实施方案中，使用的是能够在一定时间段内以基本上恒定的流速递送亚微升体积的注射器。通过针或柔性管或任何其它合适的传输装置将细胞装载到所述装置中

在一个实施方案中，用于治疗神经退行性病状的所需注射部位包括脑的至少一个区域。在另一个实施方案中，细胞被植入到脑的至少一个特定区段或区域中，诸如大脑皮质、大脑半球、丘脑、下丘脑、中脑、小脑、脑桥或延髓。

在另一个实施方案中，细胞被注射在脑中约5至约50个部位处。在实施方案中，细胞被注射在脑中约10至约30个部位处。所述部位中至少两个可以被隔开约100微米至约5000微米的距离。在实施方案中，注射部位之间的距离为约400至约600微米。可以基于产生在整个脑组织中存在基本上不间断且连续的供体细胞，以及基于在诸如大鼠或猪的动物模型中被证明可实现约2-3个月存活的平均注射体积，来确定注射部位之间的距离。在人类中的实际注射次数可以从动物模型中的结果推算出来。

本公开方法的NSC能够在体内产生大量神经元。当NSC在移植前没有明显预分化时，NSC可以在分化前体内增殖多达二至四次细胞分裂，从而进一步增加有效供体细胞的数量。在分化后，神经元分泌特定的神经递质。此外，神经元向移植物周围的环境分泌体内生长因子、酶和对不同病状有利的其它蛋白质或物质。相应地，本公开的方法能治疗各种病状，因为植入的细胞能够在体内产生大量神经元，以及因为神经退行性病状可能是由于缺少要素、包括神经元来源的要素而引起的，或者因为神经退行性病状可能导致缺少所述要素。因此，本公开的方法可以有效治疗由于缺乏这样的神经元来源的要素诸如生长因子、酶和其它蛋白质而患有CNS组织退行性疾病的对象。

本公开的方法也可用于治疗轻瘫、瘫痪、痉挛、强直或由脑缺血引起的任何其它运动、语言或认知症状。脑缺血的发生可以是脑中中风事件的结果或者源于心脏病发作，在心脏病发作中，进入脑的血液循环被中断了显著的一段时间段。因此，这类似于上述的脊髓缺血。一些中风对象发展出中枢起源的发作（seizure of central origin），以及其它缺陷诸如记忆丧失、瘫痪或轻瘫。这些源于脑缺血的缺陷也可能是由于海马和/或其它脑区域中抑制性中间神经元的选择性损失而引起的。因此，本公开的方法可用于治疗患有轻瘫、瘫痪、痉挛、或者其它运动、语言和认知症状的中风对象。

不用再进一步说明，据信，本领域的普通技术人员通过使用以上描述和以下示例性实施例，能够制备并利用本公开的试剂，并实施所要求保护的方法。以下实施例被提供用来促进本公开的实施，而不能被解释为以任何方式限制了本公开的其余部分。

实施例

实施例1：人脊髓神经干细胞/祖细胞的增殖

从胎龄为约7-8.5周的至少一个供体获得脊髓。在不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的磷酸缓冲盐溶液中使用机械研磨将单个连续的脊髓组织解离。然后将所得细胞悬液接种到用聚-L-鸟氨酸或聚-D-赖氨酸以及人纤连蛋白或其它胞外基质蛋白两者预涂覆的组织培养板中。然后将组织培养处理的板或烧瓶与100μg/ml聚-D-赖氨酸在室温下温育1小时。然后将它们用水洗涤三次并干燥。然后将它们与25mg/ml在室温下温育5分钟。有时，使用的是在室温下与10mg/ml纤连蛋白温育1小时。有时，使用的是在37℃下与1mg/ml纤连蛋白温育18小时。将1种人重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）补充到由N2（DMEM/F12加上胰岛素、转铁蛋白、硒、腐胺和孕酮）组成的培养基中。在实施方案中，可以使用的范围是0.1ng/ml-100ng/ml。在实施方案中，最佳情况下，使用10ng/ml的bFGF。

所得初始培养物由有丝分裂后神经元和增殖性NSC以单层构成。随后，在培养约五至约二十天后，分裂中的、巢蛋白-阳性的NSC在培养物中超过非分裂中的神经元或缓慢分裂的神经胶质。在这些培养条件下，有利于进行NSC选择性增殖。通过温和的酶处理诸如使用胰蛋白酶，将增殖中的NSC群传代。然后将细胞培养在不含血清或基本上不含血清的培养基中。尽管细胞可以耐受低浓度的血清，但最好还是避免使细胞暴露于血清，因为血清含有很多细胞因子诸如LIF和CNTF，所述细胞因子促进NSC的神经胶质分化。因此，在传代期间，通过添加特定的酶抑制剂例如胰蛋白酶抑制剂而不是血清，来停止所使用的酶。在每次传代时，对收获的细胞的数目进行计数，一部分被重新接种用于进一步增殖。使用该方法，可将人NSC增殖到在数量上提高超过10¹⁸倍，同时维持它们的生长和分化性质。在增殖期间，几乎所有细胞都表达有丝分裂的神经上皮细胞的体内标志物巢蛋白，并且没有分化的神经元和神经胶质的抗原诸如3型β微管蛋白和GFAP。在对以下标志物进行免疫染色时，细胞也为阴性：定向神经元祖细胞的可能标志物PSA-NCAM；少突胶质细胞的标志物O4和GalC；以及放射状神经胶质的标志物RC2。因此，通过免疫染色确定，在整个延长的增殖期内，NSC都稳定维持它们的抗原表达谱。

实施例2：人脊髓神经干细胞/祖细胞的分化

在NSC增殖期间的任一点处，可以通过取出培养物中的促分裂原例如bFGF，来使培养物分化。NSC的分化在移除促分裂原后约1-3天内发生，而且不同的异质细胞的形态是明显的。到分化约第4-7天时，神经元特异性抗原诸如MAP2c、tau、及III型β微管蛋白能够通过免疫染色被观察到。到约第12-14天时，在整个培养物中明显出现细长成束状的轴突过程，以及亚细胞蛋白运输的明显极化。到约第28天时，突触蛋白质诸如突触蛋白和突触泡蛋白定位到轴突末梢中，表现为点状染色。可以提供额外的星形胶质细胞滋养层以进一步促进神经元的长期成熟。人脊髓NSC的分化产生神经元和神经胶质的混合培养物，其中神经元稳定表达神经元特异性抗原诸如tau、MAP2ab和3型β微管蛋白并构成培养物的约50%。另外，所述培养物自发产生延伸数厘米的长束状轴突链（axon cable）。显著比例的神经元是GABA能神经元，其中培养物中也存在胆碱能运动神经元。培养物中存在显著的GABA神经元预示了人脊髓NSC可用于治疗由于某些神经回路中产生的GABA减少而引起的各种神经系统病状。类似地，胆碱能神经元的存在证实了人脊髓NSC能够进行运动神经元分化，并预示了它们可用于治疗由运动神经元的逐渐退化引起的各种运动神经元疾病。为了用于治疗，可以用或不用其它增强表型的条件来增殖NSC，收获NSC并将其注射到神经缺陷区域中。

实施例3：向脑中移植脊髓来源的神经干细胞

可以从哺乳动物中分离神经元干细胞，在体外进行增殖，然后将其引入（例如移植）到患有神经退行性疾病和/或病症的对象（例如，对象的脑）中的一个或多个区域。

在用于治疗神经退行性病症的示例性方法中，在第0天，通过使用先前描述的改良方法（参见Chen等，1986；Shyu等2004）使成年雄性Sprague-Dawley大鼠（重250-300g）经受三血管结扎，在所述大鼠中诱导脑缺血（例如中风）。简言之，用水合氯醛（0.4g/kg，腹腔注射）对大鼠进行麻醉，并用非创伤性动脉夹夹住两侧的CCA。接着，使用手术显微镜，在颧骨与鳞骨融合处钻开2x2mm进行颅骨切开术。然后用l0-O尼龙缝线结扎右侧MCA。在麻醉的大鼠中使用激光多普勒血流仪（PF-5010，Periflux system，Perimed AB，Stockholm，Sweden）连续测量皮质血流量。接着，在右侧额顶区产生钻孔（直径lmm）以允许放置光检测器。然后将探针（直径0.45mm）立体定向放置在皮质中（在前囟后方l.3mm，与前囟的横向距离为2.8mm，并在硬脑膜下方l.0mm）。然后，在结扎90分钟后，移除MCA上的缝线和CCA上的动脉夹以允许再灌注。当大鼠处于麻醉状态下时，用热敏探示器监测它们的核心体温并在麻醉期间用加热垫将其体温维持在37℃。从麻醉状态恢复过来后，用热灯将其体温维持在37℃。

接着，将经受三血管结扎过程的大鼠分为两组。第一组（“移植组”）接受NSI-566RSC细胞（人脊髓干细胞系，“HSSC”细胞系；临床批次，Neuralstem，Inc.，USA），第二组（“对照组”）接受介质对照。NSI-566RSC干细胞系源自于胎儿脊髓组织。本研究中使用的是来自于cGMP临床批次（第12代）的干细胞。在手术当天，根据Neuralstem的方案，将一小瓶冷冻保存的细胞融化、洗涤并浓缩。研究中的所有动物通过腹腔注射接受每天一次的1mg/kg FK506（或者Prograf）注射以抑制它们的免疫系统。

在第7天分别向移植组和对照组施用NSI-566RSC细胞或对照介质。将5μl悬液中的约2x10⁵个NSI-566RSC细胞通过30号哈密尔顿（Hamilton）注射器立体定向注射到移植组大鼠的3个皮质下区域中，所述皮质下区域在硬脑膜下方3.0至5.0mm处。这些部位的近似坐标为：在前囟前方l.0至2.0mm并且与中线的横向距离为3.5至4.0mm，在前囟后方0.5至l.5mm并且与中线的横向距离为4.0至4.5mm，以及在前囟后方3.0至4.0mm并且与中线的横向距离为4.5至5.0mm。在每次注射后使针保持原位5分钟，并将一块骨蜡施加到颅骨缺损处以防止注射溶液的渗漏。仅用没有细胞的悬液缓冲剂对介质对照组中的实验大鼠进行立体定向处理。

在脑缺血前3天，以及在处理后第1、7、14、21和28天进行神经行为评估。该测试测量了（a）身体不对称性，（b）自主活动性以及（c）握力。记录处理前的分数，以便将脑缺血后获取的那些分数标准化。对于身体不对称性，如前所述（Borlongan等，1998），使用升高的身体摇摆测试（EBST）来评估MCA结扎后的身体不对称性，并对所述测试进行定量评价。最初，通过动物的尾巴将其悬挂，检查动物的横向移动。如前所述（Chang等，2003），在二十次连续的测试中对最初头部向缺血侧对侧摆动的频率进行计数，并将其标准化（图1，A板）。对于自主活动性，对大鼠进行VersaMax动物活动监测（AccuscanInstruments，Inc.，Columbus，OH）约2小时，以对每一只实验大鼠的行为进行记录。VersaMax动物活动监测器含有间隔87cm的16个水平和8个垂直红外传感器。垂直传感器位于距离腔室底部10cm处。自主活动性被计数为被腔室中大鼠的移动打断的光束数。在夜间经2小时计算制造商的清单选项中定义的三个垂直参数：（i）垂直活动性，（ii）垂直时间，以及（iii）垂直移动次数（图1，B-D板）。对于握力，按照以前所述方法，在修改后（Dunnett等，1998），使用握力测试仪（TSE-Systems，Germany）来分析大鼠。简言之，分别测量每个前肢的握力比率并将其计算为向缺血侧对侧拉20次的平均力度和向缺血侧同侧拉20次的平均力度之间的比率。此外，还计算了处理后和处理前的握力比率，并将变化表示为处理前数值的百分比（图1，E板）。整体而言，研究者在测量细胞处理过的组和对照组的行为变化时是不知情的。

在大鼠经受三血管结扎过程后约二十七天，将大鼠用水合氯醛（0.4g/kg，腹腔注射）麻醉，通过穿心灌注用盐水固定它们的脑，然后在4%的多聚甲醛中进行灌注和浸泡，接着将脑移出并包埋在30%的蔗糖中。从每个脑的冠状面中切出一系列相邻的20μm厚的切片，用H&E染色，并用光学显微镜（Nikon，E600，Japan）进行观察。然后通过各种人特异性抗体（HuNu、突触泡蛋白（synptophysin）、hNSE、hNF等）鉴定移植的人类细胞（参见图2A-2B）。对于BrdU免疫染色，首先通过以下操作使DNA变性：在含50%甲酰胺的2X标准柠檬酸盐溶液中在65℃下将每个切片温育2小时，然后在2N HCl中在37℃下温育30分钟，最后在0.1M、pH8.5的硼酸中进行清洗。其次，将切片用Tris缓冲剂清洗，并用1%的H2O2处理以阻断内源性过氧化物酶。然后使用标记的抗生物素蛋白-生物素（LSAB）方法（DAKO LASB-2试剂盒，过氧化物酶，DAKO，USA）来执行免疫染色过程。然后，在脱蜡和复水之后，在硅烷涂覆的玻片上的脑组织被两次置于在750W的微波炉中的沸腾的柠檬酸缓冲剂（pH6，ChemMate，DAKO，USA）中5分钟。其次，使组织与适当稀释的针对BrdU的第一抗体（用于核鉴定，稀释1：400，Sigma，USA）在室温下温育1小时。在用含0.1%吐温-20（TBS-T）的Tris缓冲盐溶液洗涤后，使标本依次与生物素化的抗兔和抗小鼠（1：200，R&D Systems，USA）免疫球蛋白以及过氧化物酶标记的抗生物素蛋白温育10至30分钟。在温育10分钟后，用新鲜配制的含3%的3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化氢的底物显色溶液进行染色。最后，将玻片用苏木精稍微复染，用水洗涤，然后固定。用除了没有使用第一抗体外相同的脑组织标本制备对阴性对照切片进行染色。使用60X物镜（Carl Zeiss LSM510，Germany）经由计算机图像分析系统（Imaging Research，Canada）通过数码记数进行BrdU免疫反应性细胞的定量。

此外，可以通过激光扫描共聚焦显微镜用免疫荧光共定位分析来鉴定与外源性移植的NPC和内源性归巢干细胞（BrdU免疫反应性的）共定位的细胞类型特异性标志物。在免疫荧光共定位研究中，用细胞特异性抗体处理每个冠状切片，所述细胞特异性抗体例如：胶质纤维酸性蛋白（用于星形胶质细胞的GFAP，1：400，Sigma，USA）、血管性血友病因子（Von-Willebrand factor）（用于内皮细胞的vWF，1：400，Sigma，USA）、神经元核抗原（用于神经元核的Neu-N，1：200，Chemicon，CA）、巢蛋白（用于神经元树突，1：200，Chemicon，CA）、微管相关蛋白2（用于神经元树突的MAP-2，1：200；BM，Germany）、来自于趋化因子的基质细胞衍生因子1（SDF-1，1：200）以及4型CXC受体（CXCR4，1：200）、以及用Cy3（Jackson Immunoresearch PA USA，1：500，USA）染色的PrPC（1：300；M20，SantaCruz）。

如图1所示，与用对照介质处理的动物相比，用NSI-566RSC细胞处理的动物在身体摇摆、垂直移动、垂直活动性、垂直移动时间和握力上均表现出改善。

以上所述本发明主题的各方面，包括实施方案，可以单独使用或者与一种或多种其它方面或实施方案组合使用。在不限制前述描述的情况下，根据本文中主题的一个方面，提供了用于治疗与脑中神经元细胞损失相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：从人的脊髓组织获得至少一种干细胞；增殖所述至少一种干细胞以形成增殖的干细胞群；以及向对象的脑的至少一个区域引入治疗有效量的所述增殖的干细胞群。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述增殖的干细胞群分化成在体内整合到对象的脑中的神经元。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述疾病或病症由脑缺血、脑出血和脑创伤引起。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述疾病或病症包括瘫痪、语言障碍、记忆丧失、或推理能力丧失。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述疾病或病症包括运动功能障碍或认知缺陷。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述人的胎龄为约5至约20周。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，增殖所述至少一种神经干细胞包括在没有血清的条件下培养神经干细胞。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，增殖所述至少一种神经干细胞包括将所述至少一种神经干细胞暴露于至少一种生长因子。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、aFGF及其组合。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述增殖的干细胞群的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能够在对象的脑组织中产生神经元。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述增殖的干细胞群的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能够在体外分化成神经元。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，引入治疗有效量的所述增殖的干细胞群包括向对象的脑组织的多个区域中注射至少一部分的所述治疗有效量。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述区域包括大脑半球、大脑皮质、皮质下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述对象经历引起脑缺血的事件。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述事件为中风。

在不限制前述描述的情况下，根据本文中主题的另一个方面，提供了在有需要的对象中治疗中风的方法，所述方法包括：从人的脊髓组织分离至少一种神经干细胞；体外增殖所述神经干细胞以形成增殖群；浓缩所述增殖群；以及向对象的脑的至少一个区域引入治疗有效量的所述增殖群。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述脊髓来自于约5至约20周的胎龄。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，增殖至少一种神经干细胞包括在没有血清的条件下培养神经干细胞。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，增殖至少一种神经干细胞包括将至少一种神经干细胞暴露于至少一种生长因子。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、aFGF及其组合。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，所述增殖群的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%能够在对象的脑组织中产生神经元。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，引入治疗有效量的所述增殖群包括向接受者的脑的一个至多个区域中注射至少一部分的所述治疗有效量。

根据另一个可与任何在前或在后的方面一起使用或者相组合的方面，接受者的脑的区域包括大脑半球、大脑皮质、皮质下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑。

尽管在本文中参照各种具体的材料、过程和实施例对本公开进行了描述和说明，但应当理解，本公开并不限于为描述和说明的目的所选择的材料和过程的特定组合。正如本领域的技术人员将会认识到的，本公开暗含了这样的细节的众多变化。本说明书和实施例意欲仅被视为示例性的，而本公开的真实范围和精神由权利要求书指明。在本申请中涉及的所有文献、专利和专利申请在此以其全文引作参考。

Claims (24)

1.用于治疗与脑中神经元细胞损失相关的疾病或病症的方法，所述方法包括：

a）从人的脊髓组织获得至少一种干细胞；

b）增殖所述至少一种干细胞以形成增殖的干细胞群；以及

c）向对象的脑的至少一个区域引入治疗有效量的所述增殖的干细胞群。

2.权利要求1的方法，其中所述增殖的干细胞群分化成在体内整合到对象的脑中的神经元。

3.权利要求1的方法，其中所述疾病或病症由脑缺血、脑出血和脑创伤引起。

4.权利要求3的方法，其中所述疾病或病症包括瘫痪、语言障碍、记忆丧失、或推理能力丧失。

5.权利要求3的方法，其中所述疾病或病症包括运动功能障碍或认知缺陷。

6.权利要求1的方法，其中所述人的胎龄为约5至约20周。

7.权利要求1的方法，其中增殖所述至少一种神经干细胞包括在没有血清的条件下培养神经干细胞。

8.权利要求1的方法，其中增殖所述至少一种神经干细胞包括将所述至少一种神经干细胞暴露于至少一种生长因子。

9.权利要求8的方法，其中所述生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、aFGF及其组合。

10.权利要求1的方法，其中所述增殖的干细胞群的至少30%能够在对象的脑组织中产生神经元。

11.权利要求1的方法，其中所述增殖的干细胞群的至少50%能够在体外分化成神经元。

12.权利要求1的方法，其中引入治疗有效量的所述增殖的干细胞群包括向对象的脑组织的多个区域中注射至少一部分的所述治疗有效量。

13.权利要求12的方法，其中所述区域包括大脑半球、大脑皮质、皮质下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑。

14.权利要求1的方法，其中所述对象经历引起脑缺血的事件。

15.权利要求14的方法，其中所述事件为中风。

16.对有需要的对象治疗中风的方法，所述方法包括：

a）从人的脊髓组织分离至少一种神经干细胞；

b）体外增殖所述神经干细胞以形成增殖群；

c）浓缩所述增殖群；以及

d）向对象的脑的至少一个区域引入治疗有效量的所述增殖群。

17.权利要求16的方法，其中所述增殖群的至少20%能够在对象的脑组织中产生神经元。

18.权利要求16的方法，其中所述脊髓来自于约5至约20周的胎龄。

19.权利要求16的方法，其中增殖至少一种神经干细胞包括在没有血清的条件下培养神经干细胞。

20.权利要求16的方法，其中增殖至少一种神经干细胞包括将至少一种神经干细胞暴露于至少一种生长因子。

21.权利要求20的方法，其中所述生长因子选自bFGF、EGF、TGF-α、aFGF及其组合。

22.权利要求16的方法，其中所述增殖群的至少30%能够在对象的脑组织中产生神经元。

23.权利要求16的方法，其中引入治疗有效量的所述增殖群包括向接受者的脑的一个至多个区域中注射所述治疗有效量的至少一部分。

24.权利要求23的方法，其中接受者的脑的区域包括大脑半球、大脑皮质、皮质下运动皮层、纹状体、内囊、丘脑、下丘脑、海马、中脑、脑干和小脑。

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