CN103232544A - 一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。IFNγ是由T细胞及NK细胞合成，具有广谱抗病毒功能和免疫调节的作用，对疾病的发生发展有着重要的影响。天然的猪IFNγ在机体内表达不足以供临床大量研究及应用，并存在在血浆中清除速度较快的缺陷。本发明提供了一种适于大肠杆菌原核表达体系的重组猪IFNγ-Fc融合蛋白。其中，猪IFNγ部分为猪IFNγ胞外区的全部序列，Fc片段部分包括抗体的铰链区、CH2区和CH3区，二者之间为直接融合。本发明的融合蛋白，不仅具有高于原蛋白IFNγ的生物活性，而且极大的延长了其半衰期，为其产业化发展提供了机遇。

Description

一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中，γ干扰素(interferon，IFN-γ)具有免疫干扰素之称，由T细胞及NK细胞合成，其生物学效应包括抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖、诱导MHCI级抗原表达、诱导MHCⅡ级抗原表达、激活M_φ，使其杀伤肿瘤细胞以及杀灭包内寄生虫。由此可见，干扰素γ不仅具有广谱抗病毒功能，还具有免疫调节的作用，对疾病的发生发展的控制有着重要的影响。

我国是养猪大国，猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有效控制疾病流行。基因工程动物用药干扰素-γ可有效增强猪仔的免疫功能，提高机体对病毒的防御作用，并且具有无药物残留、无副作用等特点，深受临床兽医和养殖户的青睐。但是干扰素-γ的生物学效应具有高度的种属特异性，而天然的猪干扰素γ在机体内表达甚微，很难直接从体内大量提取供临床研究及应用。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组猪干扰素γ表达系统和表达方法。

另一方面，作为小分子量蛋白，猪干扰素γ也与其他干扰素γ一样，存在血浆清除速度较快的缺陷，从而导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。因此，半衰期短及用药的频繁也将成为使用猪干扰素γ治疗猪病毒性疾病的瓶颈。IgG免疫球蛋白是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期约为20天。其稳定性是由于IgG的Fc片段可与新生Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。有鉴于此，本发明尝试考虑在猪干扰素γ上增加IgG的Fc片段来构成融合蛋白，以提高猪干扰素γ体内半衰期，达到长效的目的。由此，本发明的目的是提供一种既能保留猪干扰素γ原有活性，又可以延长体内半衰期的猪干扰素γ与Fc片段的融合蛋白。

然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体进行复性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪干扰素γ部分和Fc片段部分，其中，猪干扰素γ部分为猪干扰素γ胞外区的全部序列，Fc片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪干扰素γ与Fc片段部分之间为直接融合。

其中的Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白Fc，是Fc全长或是部分序列，Fc选自IgG、IgM、IgD、IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。本发明的融合蛋白中的Fc片段部分特别优选来自猪的IgG1。

优选地，本发明的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其中第2-144位氨基酸残基为猪干扰素γ的胞外区序列，第145-374位氨基酸残基为猪IgG1序列。

本发明提供了编码上述所述重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的基因的质粒，所述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。

本发明还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取1个或多个含有上述所述重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；

2.取适量过夜培养物，接入于所述过夜培养物的100倍量的LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期OD₆₀₀=1.0；

3.在培养物中加入浓度为1mmol/L的IPTG，于37℃，诱导表达4h后，于4℃以转速5000rpm，离心处理15min，收集含有重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体。

所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100μg/ml。

本发明的上述所述表达方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于表达重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。

本发明还提供了重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的包涵体纯化方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4℃高速离心处理；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A3-10mL，搅动缓冲液，使菌体悬起。

3.每克（湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。

4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4℃高速离心处理。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4℃高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30-60min。

7.充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液。

该纯化方法优选步骤如下：

1.将收集得到的上述含有诱导重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃，以12000rpm的转速离心15min；重复一次。

2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3.每克（湿重）菌体加入5μL浓度为100mmol/L的PMSF，5μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min。

4.用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。于4℃，以12000rpm的转速离心15min，弃上清。

5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，于4℃，以12000rpm的转速离心15min，沉淀包涵体，重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。

7.充分混匀后室温下以12000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液。

本发明还提供了优化后的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的包涵体复性方法，包括如下步骤：

取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液，用复性缓冲液Buffer D将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，4℃复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液用0.45μm滤膜过滤，即得到低浓度的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白溶液。并可进一步超滤脱盐、浓缩，低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白粉末。各缓冲液的成分及其含量如下表所示：

本发明还提供了猪干扰素γ或重组猪干扰素γ–Fc融合蛋白在制备治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征、猪流感以及猪蓝耳病疾病的药物中的用途。在猪仔疾病治疗过程中，猪干扰素γ或重组猪干扰素γ–Fc融合蛋白可以非特异性的发挥广泛的抗病毒效应，提高机体免疫应答和增强对病毒的防御能力。同时，猪干扰素γ或重组猪干扰素γ–Fc融合蛋白也可与其他疫苗联合使用，减轻疫苗的不良反应，增强整体抗病毒、细菌、寄生虫的效力。猪干扰素γ或重组猪干扰素γ–Fc融合蛋白也可与多种病原疫苗联合使用，可显著提高免疫水平，减少应激，降低疫苗的副作用,从而达到较强的治疗作用。

本发明的经优化过的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白重组基因序列，更适于大肠杆菌表达系统的表达，所表达的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白远高于猪干扰素γ-Fc融合蛋白天然基因序列在大肠杆菌表达系统的表达量，并且，与猪干扰素γ相比，本发明的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白在保证了猪干扰素γ生物活性的基础上较大程度上延长了其在生物体内的半衰期，实现了长效和避免反复用药的目的。同时，本发明所提供的是一种猪源型融合蛋白，更适于用针对猪类病毒性疾病兽药的制备，而本发明所提供的该融合蛋白的原核细胞表达、纯化和复性方法也极大的控制了其制备成本，为其实现产业化提供了可能。

附图说明

图1表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前后核苷酸序列比较

其中，奇数行（即“原始序列”对应的行）为猪干扰素γ-Fc融合蛋白天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行（即“优化序列”对应的行）为本发明的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a、图2-b为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。

其中，图2-a表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中CAI指数为0.64；图2-b表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数为0.84。

图3-a、图3-b为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中，图3-a表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前序列的低利用率密码子（<30%）出现百分比为8%；图3-b表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前序列的低利用率密码子（<30%）出现百分比为0。

图4-a、图4-b为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子中在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。

其中，图4-a表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：52.12%；图4-b表示重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化后在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为：50.94%。

图5-a、图5-b为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。

图5-a重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前mRNA的二级结构预测图，图5-b为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化后mRNA的二级结构预测图。

图6为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白表达质粒构建过程图。

图7为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白优化基因琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为NdeI和XhoI双酶切后的pET21b载体；泳道3为两端含有NdeI和XhoI酶切位点的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因PCR产物。

图8为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图及相应的免疫印迹图。

图8-a为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为未加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。

图8-b为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白免疫印迹图。

其中，泳道1（10-230KDa）宽范围的预染的蛋白上样Marker，泳道2为未加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液：泳道3为加入IPTG诱导的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。

图9重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白高效表达诱导条件优化SDS-PAGE凝胶电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为0.5mmol/L IPTG诱导1h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道3为0.5mmol/L IPTG诱导2h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道4为0.5mmol/L IPTG诱导3h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道5为0.5mmol/L IPTG诱导4h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道6为1mmol/L IPTG诱导1h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道7为1mmol/LIPTG诱导2h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道8为1mmol/L IPTG诱导3h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道9为1mmol/L IPTG诱导4h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道10为1.5mmol/L IPTG诱导1h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道11为1.5mmol/L IPTG诱导2h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道12为1.5mmol/L IPTG诱导3h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液；泳道13为1.5mmol/L IPTG诱导4h重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌裂解液。

图10为复性后的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白包涵体SDS-PAGE电泳图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为超声裂解含有重组重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的全菌裂解液；泳道3为用Buffer B第一次清洗后重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白包涵体沉淀；泳道4为Buffer B第二次清洗后重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白包涵体沉淀，泳道5为Buffer B复性后重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白。

图11为重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白在猪血清中稳定性免疫印迹图。

其中，泳道1为(10-230kDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker；泳道2为未加猪干扰素γ和重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白猪血清样品；泳道3为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白0h的猪血清样品；泳道4为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白1h的猪血清样品；泳道5为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白8h的猪血清样品；泳道6为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白24h的猪血清样品；泳道7为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白48h的猪血清样品；泳道8为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白72h的猪血清样品;泳道9为加入1μmol/mL猪干扰素γ和1μmol/mL重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白120h的猪血清样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因优化设计

发明人根据GenBank已公开的猪干扰素γ（Sus scrofa interferon,gamma）的cDNA序列(GenBank登录号：NM_213948.1)和猪IgG Fc片段（Sus scrofa IgG heavy chain）的cDNA序列(GenBank登录号：NM_213828.1)中铰链区、CH2区和CH3区，对这2个基因直接融合并进行密码子优化得到本发明的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的基因，如SEQ ID No：1所示。

下面是对重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(CAI)

由图2-a可知，密码子没有优化前，重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中密码子适应指数（codon adaptation index,CAI）为0.64。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中CAI指数为0.84。通常CAI=1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达水平。

2.最优密码子使用频率（FOP）

由图3-a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因序列的低利用率密码子出现百分比为8%。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因在大肠杆菌系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.GC碱基含量（GC curve）

GC含量理想分布区域为30%-70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因中在优化前GC碱基平均含量为52.12%，由图4-b中显示出优化后的序列消除了GC含量在30%-70%区域外的60个碱基，最终得到优化后重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的GC碱基平均含量为50.94%。

3.顺式作用元件

顺式作用元件	优化前	优化后
			E.coli_RBS(AGGAGG)	1	0
PolyT(TTTTTT)	1	0
			PolyA(AAAAAAA)	1	0
Ch位点(GCTGGTGG)	0	0
			T7Cis(ATCTGTT)	0	0

4.去除重复序列

5.mRNA的二级结构预测图

在DNA转录成mRNA后，由于mRNA是单链线性分子，通过自身回折使得互补的碱基对相遇，通过氢键结合而成的发卡结构(Hairpin)。5’发卡结构可以在翻译起始阶段起调控作用。但是如果发卡结构很长，解链所需的能量很高，就有可能影响到翻译。所以需要表达的序列应该尽量避免长而且能量高的发卡结构。通过密码子优化后，由图5-a、图5-b猪干扰素γ-Fc融合蛋白密码子优化前后mRNA的二级结构预测图可知，优化后的5’发卡结构和解链所需的能量更适于目的蛋白的表达。

实施例2：重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白基因的表达质粒构建

将优化后的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白全基因（如SEQ ID No：1所示）合成的片段，构建到pUC57质粒（由南京金斯瑞科技有限公司提供）中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-pIFNγ-Fc质粒。以pUC57-pIFNγ-Fc质粒为模板，上、下游分别引入NdeI和XhoI酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

P1:GGGAATTCCATATGCAGGCCCCGTTCTTCAAGG

下游引物：

P2:CCGCTCGAGTCATTTGCCTTGCGTTTTTGAG

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase（购自Theromo-Fisher scientific），2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5s、55℃45s、72℃30s，25个循环后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，产物大小与预期大小（1125bp）一致。（如图7所示）

将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）纯化。纯化后，用NdeI和XhoI（购自New England Biolabs公司）双酶切，用T4连接酶（购自New EnglandBiolabs公司）将双酶切后的产物连接到pET21b质粒（购自Merck公司）中，转化到DH5α感受态细胞（购自北京天根生化科技有限公司）中，在含有100μg/mL的氨苄青霉素（购自Amresco公司）的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌，测序，比对结果显示与预期序列完全一致，即得到重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白一种形式的表达质粒，记为pET21b-pIFNγ-Fc。

实施例3重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达和鉴定

具体步骤如下：

1．将实施例2中测序比对正确的pET21b-pIFNγ-Fc质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态菌株（购自北京天根生化科技有限公司）中，于37℃，在含氨苄青霉素平板中过夜培养。

2．第二天挑1-4个含有pET21b-pIFNγ-Fc质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液（购自Amresco公司），37℃培养过夜。

3．取50μL步骤2中过夜培养物，接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养。

4．接种后每隔1h测菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀=1.0时，用1mmol/L的IPTG（购自Amresco公司）进行诱导表达。

5．诱导表达4h后收集菌液，高速离心（转速：12000rpm）3min，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温高速离心（转速：12000rpm）1min，取上清。未加入IPTG的重组大肠杆菌培养物也按此步骤处理。

6．各取10μL未加入IPTG和加入IPTG诱导的按步骤5处理后的样品，10%SDS-PAGE凝胶电泳分析。

7．8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8．考马斯亮蓝染色和免疫印迹，观察表达产物条带，见图8-a和图8-b。

实施例4重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白高效表达诱导条件优化

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、培养温度、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制，生长过度或过速都会影响大肠杆菌中重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白包涵体的表达量。运用三因素四水平，建立IPTG浓度和诱导时间正交表，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析诱导重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白表达量。

具体步骤如下：

1．将实施例2中测序比对正确的pET21b-pIFNγ-Fc质粒转化到BL21（DE3）感受态菌株（购自北京天根生化科技有限公司）中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。

2．次日，挑取1-4个含有pET21b-pIFNγ-Fc质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。

3．取50μl步骤2中过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。

4．接种后测菌液OD₆₀₀值，待OD₆₀₀=1.0时，按照下表加入浓度为0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L IPTG进行诱导表达。

表1考察重组蛋白表达的诱导剂浓度和诱导时间

5．1，2，3，4h后依次收集重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白菌液，高速离心（转速：12000rpm）3min，用预冷的PBS清洗沉淀，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热10min，室温高速离心（转速：12000rpm）1min。

6．取10μL未加入IPTG诱导和加入不同浓度IPTG、不同诱导时间的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白培养物悬液，10%SDS-PAGE凝胶电泳分析。

7．8-15V/cm电泳，至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8．考马斯亮蓝染色，观察各条件下重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白表达产物条带。（见图9）

9．凝胶成像系统薄层扫描分析表达重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白含量鉴定猪干扰素γ-Fc融合蛋白的表达。最终确定适合本实施的诱导条件为1mmol/L IPTG，诱导时间为4h。

实施例5重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白包涵体纯化及复性

1．将实施例3中收集得到的含有诱导重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；重复一次。

2．吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A 5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

3．每克（湿重）菌体加入5μL 100mmol/L PMSF，5μL 100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。

4．用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min。

5．沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复一次。

6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。

7.充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液。

8.采用稀释复性法对步骤7中的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液进行复性。

稀释复性：取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液，用Quick Start Bradford 1x Dye Reagent（美国Bio-Rad公司）测其浓度，然后用复性缓冲液BufferD将蛋白浓度稀释到0.2mg/mL，4℃复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液用0.45μm滤膜（MerckMillipore公司）过滤，即得到低浓度的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白溶液。用截留分子量10KDa的超滤管（Merck Millipore公司）脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白粉末。

各缓冲液按下表配制：

表2各缓冲液成分

9.分别以步骤5中洗涤缓冲液Buffer B两次洗涤产物进行SDS-PAGE凝胶电泳（图10），在目的范围可见明显条带。

实施例6重组猪干扰素γ的制备（详细可参见申请人的在先申请：201210593705.X）

具体步骤如下：

1.构建可表达重组猪干扰素γ的重组大肠杆菌。

根据GenBank已公开的猪干扰素γ（Sus scrofa interferon,gamma）的cDNA序列(GenBank登录号：NM_213948.1)，按照大肠杆菌表达系统对该基因进行密码子优化后得到重组猪干扰素γ基因，如SEQ ID No：3所示。将优化后的重组猪干扰素γ全基因合成的片段，构建到pUC57质粒中，得到pUC57-prIFNγ质粒。

以pUC57-prIFNγ质粒为模板，上、下游引物分别引入NdeI和XhoI酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

P1：GGGAATTCCATATGCAGGCCCCGTTCTTCAAGG

下游引物：

P2：CCGCTCGAGTCATTTCGATGCGCGTTGGCC

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5s、55℃20s、72℃30s，25个循环。PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NdeI和XhoI双酶切，用T4连接酶连接到pET21b质粒中，并将质粒转化到DH5α感受态细胞中扩增。将扩增的表达质粒pET21b-prIFNγ转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中。

2.重组猪干扰素γ包涵体的表达

将含有pET21b-prIFNγ的大肠杆菌BL21（DE3）于37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。次日挑1-4个含有pET21b-prIFNγ质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。待OD₆₀₀=1.0时，用1mmol/L的IPTG进行诱导。4h后收集菌液，高速离心，用预冷的PBS清洗沉淀。

3.重组猪干扰素γ包涵体的复性及纯化

将步骤2中经预冷的PBS清洗沉淀用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；重复一次。弃上清，按每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，使菌体悬起。每克（菌体湿重）菌体加入5μL 100mmol/L PMSF，5μL 100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min。沉淀用洗涤缓冲液BufferB洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复一次。包涵体沉淀用变性缓冲液BufferC溶解，室温下搅拌30min。充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ变性溶液。采用透析复性法复性包涵体：用变性缓冲液Buffer C将重组猪干扰素γ变性溶液浓度稀释到0.2mg/mL，注入截留分子量10KDa的透析卡中，4℃透析复性，每隔6h换一次复性缓冲液Buffer D。复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液过0.45μm滤膜，即得到低浓度的重组猪干扰素γ复性溶液。用截留分子量10KDa的超滤管脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ粉末。各缓冲液配制如表2所示。重组猪干扰素γ粉末4℃冰箱存放待用。

实施例7重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白生物学活性测定

猪水泡性口炎病毒（VSV，其TCID50为5×10⁷/100μL，广东省农科院兽医研究所提供）可感染猪肾细胞（PK-15，广东省农科院兽医研究所提供），本发明利用猪干扰素γ的抗病毒机制检测在猪肾细胞在猪干扰素γ或者重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白存在条件下对猪水泡性口炎病毒的防御作用，通过检测PK-15细胞的病变情况得到猪干扰素γ或者重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白对PK-15细胞的保护效应曲线，从而测定重组猪干扰素γ或者重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白生物学活性。

1).阳性对照品溶液制备：取猪干扰素阳性对照品(猪基因工程重组细胞因子：IFN-LLS-2，购自香港曼普动物营养品有限公司。)，按说明书复溶后，用含有6％胎牛血清的MEM细胞培养液(Gibico产品)按10倍一级逐级稀释。

2).重组猪干扰素γ样品溶液制备：称取实施例6中复性后重组猪干扰素γ样品2.4mg，用500μL细胞培养液溶解后，用细胞培养液做10倍一级逐级稀释，分别得4.8mg/mL、4.8×10^-1mg/mL、4.8×10^-2mg/mL、4.8×10^-3mg/mL、4.8×10^-4mg/mL、4.8×10^-5mg/mL重组干扰素γ溶液。

3).重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白样品溶液制备：称取实施例5中复性后重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白干粉样品350ug，用500μL细胞培养液溶解后，用细胞培养液做10倍一级逐级稀释，分别得35μg/mL、3.5μg/mL、0.35μg/mL、3.5×10^-2μg/mL、5×10^-3μg/mL、5×10^-4μg/mL重组干扰素γ–Fc融合蛋白溶液。

4).在96孔板上每孔加入不同浓度的阳性对照组样品、重组猪干扰素γ或者重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白以及阳性对照样品溶液，再加入50μL新鲜传代的PK-15细胞悬液（细胞浓度约为1.8×10⁶-2.2×10⁶个/mL），总体系100μL，37℃、5％CO₂条件下孵育约24h至PK-15细胞贴壁生长至单层。弃去细胞培养液上清，每孔加入100μL含100个TCID50的VSV病毒的2％胎牛血清的MEM培养液。同时设立阴性对照病毒组（只加PK-15细胞和相同剂量的病毒，不加重组猪干扰素γ）和空白细胞对照组（只加PK-15细胞和细胞培养液，不加重组猪干扰素γ和病毒）。37℃、5％CO₂条件下培养24h，待病毒对照孔的细胞病变90％～100％时观察结果。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位（记为“U”）。

实验结果显示，阴性对照病毒组中的细胞均发生明显病变，空白细胞对照组中细胞生长正常。与阳性对照相比，当重组猪干扰素γ的浓度在4.8×10^-3mg/mL～4.8×10^-4mg/mL时，重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的浓度在0.35μg/mL～3.5×10^-2μg/mL时开始产生消除VSV病毒对PK-15细胞正常生长的影响的现象。通过结果换算确定阳性对照干扰素的效价为3.2×10⁴U/mL，重组猪干扰素γ稀释复性样品的效价为2.0×10⁴U/mL，重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白样品效价为5.8×10⁴U/mL。由此可见，本发明重组猪干扰素γ–Fc与阳性对照及原蛋白重组猪干扰素γ相比具有更强的抗病毒活性，且制备工艺简单，在猪仔疾病预防和治疗应用反面展现出广阔的应用前景，使工业化生产基因工程重组猪干扰素γ-Fc的可能得以实现。

实施例8重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白稳定性试验

为了检测重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白在血清中的稳定性，发明人特殊设计了一种体外模拟猪血清环境，将1μmol/ml的实施例6中制备重组猪干扰素γ和1μmol/ml的实施例5中本发明的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白共同置于新鲜的猪血清50μL中，37℃，120rpm，分别反应0，1，8，24，48，72，120h后保存-20℃。以鼠抗猪干扰素γ单克隆抗体（IFN gamma Antibody(P2F6),Catalog Number:MP700，Thermo Pierce）为一抗对猪血清中的猪干扰素γ及重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白进行蛋白免疫印迹试验，如图11可知猪干扰素γ在反应后很快在血清中就无法检测出，而重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白在血清中120h仍然保持稳定。由此可见，本发明制备的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白与猪干扰素γ相比具有较高的稳定性，延长了其体内半衰期，达到了长效给药的效果。

Claims (10)

1.一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括猪干扰素γ部分和Fc片段部分，所述猪干扰素γ部分为猪干扰素γ胞外区的全部序列，所述Fc片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪干扰素γ与Fc片段部分之间为直接融合。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种编码权利要求2中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种载体，所述载体含有权利要求3的基因。

5.如权利要求4所述的载体，所述载体为pET21b。

6.一种大肠杆菌，所述大肠杆菌具有权利要求4或5的载体。

7.如权利要求6所述的大肠杆菌，所述大肠杆菌为BL21（DE3）菌株。

8.一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的原核细胞表达方法，包括如下步骤：

（1）在合适的条件下于培养基中培育权利要求6或7中所述的大肠杆菌；

（2）从大肠杆菌和/或培养基中分离重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白。

9.如权利要求8所述的表达方法，包括如下步骤：

（1）挑取一个或多个含有权利要求6或7中所述的大肠杆菌菌落，接入含抗生素的LB培养液，培养过夜；

（2）取过夜培养物转接入于含抗生素的新鲜LB培养液中，于37℃震荡培养至对数中期OD₆₀₀=1.0；

（3）在培养物中加入浓度为1mmol/L的IPTG，37℃，诱导表达4h后，离心处理收集含有重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体沉淀。

10.一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白的纯化和复性方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）将收集得到的如权利要求9所述的含有诱导重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，PBS重悬，并于4℃高速离心处理，重复一次；

（2）吸去上清，称菌体沉淀重量，每克（湿重）加入裂解缓冲液Buffer A3-10mL，搅动缓冲液，使菌体悬起；

（3）每克（湿重）菌体加入3-10μL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100μL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动；

（4）破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4℃高速离心处理；

（5）沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4℃高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次；

（6）包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30-60min；

（7）充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液；

（8）取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液，用复性缓冲液Buffer D将重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白变性溶液的浓度稀释至0.2mg/mL，4℃透析复性24h，将复性后重组蛋白溶液用0.45μm滤膜过滤，即得到重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白复性溶液；

所述重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白复性溶液可进一步超滤浓缩、脱盐至最小体积，低温真空干燥，即获得重组猪干扰素γ-Fc粉末。

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