CN103217498A - 一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法及样品前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，包括下列步骤：样品前处理：样品用水溶解，并加入有机提取液进行提取，随后加入MgSO₄和NaCl使所述有机提取液与水相分层，离心得第一上清液，在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化后，离心得第二上清液，取第二上清液经浓缩、复溶、过滤，制得待测样品；接着，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对奶粉中含有的双氰胺进行检测。本发明所述适用于液-质联用检测的样品前处理方法通过提取、净化除去了干扰分子，使得样品检测具有较高的精确度。

Description

一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法及样品前处理方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种快速检测奶粉中双氰胺的方法，以及液-质联用检测双氰胺的样品前处理方法。

背景技术

双氰胺（DCD），又名二氰二胺、二聚氰胺，化学式为C₂H₄N₄，是一种工业原料，常作为复合肥料的添加剂使用，以控制硝化菌的活动，调节氮肥在土壤中的转化速度，减少铵态氮的流失，达到提高肥料使用效率的目的。2013年1月，新西兰乳业巨头恒天然集团被爆出其生产的部分奶粉中含有双氰胺，其缘由是由于新西兰奶农使用了含有双氰胺的化肥，从而导致奶粉中产生了双氰胺残留。双氰胺是生产三聚氰胺的原料，同样属于非蛋白高氮物质，其安全性尚未得到评估，此外，双氰胺作为单氰胺的二聚体，其对小鼠毒害症状与单氰胺三聚体三聚氰胺类似，13000mg/kg剂量的双氰胺和三聚氰胺给药后的小鼠出现一致毒害症状，均出现不安，跳跃，呼吸急促，随后在几十分钟内便死亡。鉴于其可能会像三聚氰胺一样对婴幼儿产生危害，新西兰政府禁止销售含有双氰胺的奶制产品。我国是新西兰奶粉的主要进口国，目前市面上约40%的奶粉来自新西兰，此次事件再度引起了人们对奶粉安全的高度关注和质疑。

中国专利文献CN102419354A公开了一种液态奶中小分子有害物质的通用快速检测方法，并具体公开了采用超高效液相色谱与三重四级杆质谱联用测定其中的小分子有害物质的方法；所述方法适用于检测液态奶中三聚氰胺、双氰胺等小分子有害物质。中国专利CN102435699A公开了一种液相色谱串联质谱快速检测乳与乳制品中三聚氰胺的方法，并具体公开了在待测乳制品中加入内标，用乙腈提取三聚氰胺，以正相色谱柱串联质谱MRM定性、定量的分析、测量乳制品中三聚氰胺的步骤。可见，目前检测乳或奶制品中双氰胺或三聚氰胺等小分子有害物质时，液相-质谱连用的方式成为最快速准确的检测方式。

但在实际研究中发现，上述以液相-质谱联用的方式进行检测奶粉中的双氰胺时发现，由于奶粉的性质不同于液态奶或是乳制品，使得采用上述方法进行奶粉中双氰胺检测时的检出效果并不理想，最主要的是上述两种方法中的样品的前处理方法并不适用于奶粉中双氰胺的检测，无论是中国专利CN102419354A提及的以保护剂和乙腈-乙醇混合液进行提纯处理的方式还是中国专利CN102435699A中提及的以乙腈提取三聚氰胺提纯的前处理方式，得到的上样液（即待测样品），其中均不可避免的仍然存有大量蛋白质分子、脂肪分子以及一些与双氰胺分子量相近的干扰分子，从而即使采用具有干扰性小、检出限低、灵敏度高、重现性好等优势的超高效液相色谱与三重四级杆联用对上述待测液进行测定时，精确度仍然较差，这主要是由于奶粉在制备待测样品时，一般均是简单的以水溶解，导致很多蛋白质分子和脂肪分子无法因有效的溶解而利用乙腈提纯，也就直接影响了后续的检出灵敏性，因此，亟需开发出一种新的适用于奶粉中双氰胺快速检测的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的高效灵敏的样品前处理的方法。

发明内容

本发明所要解决的问题在于现有技术中对奶粉中双氰胺的检测由于样品前处理方式导致检测结果精度较差的问题，进而提供一种适用于快速检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的样品前处理方法；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种能够快速检测出奶粉中双氰胺的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其包括下列步骤：

（1）将奶粉样品溶解得水溶液，并加入有机提取液进行双氰胺的提取；

（2）向提取后的混合液中加入MgSO₄和NaCl使所述有机提取液与水相分层，离心得第一上清液；

（3）在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；

（4）将所述第二上清液经浓缩、复溶、过滤步骤，得到所需的待测样品。

所述步骤（1）中，所述有机提取液提取双氰胺的步骤是在超声条件下进行的，并优选超声的频率为40kHz。

所述步骤（1）中，所述有机提取液为乙腈、酸化乙腈、氨化乙腈、乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的一种或几种的混合物。

所述有机提取液可以根据样品水溶液的浓度高低或体积的变化一次或多次分批加入提取，达到提取双氰胺的目的即可，优选所述有机提取液的体积与所述样品水溶液的体积比为5:1。

所述步骤（2）中，所述MgSO₄的添加量与所述奶粉样品的质量为1:1-3:1，所述NaCl的添加量与所述奶粉样品的质量为0.5:1-1:1。

所述步骤（3）中，所述吸附剂为粒径40-60μm的C18吸附剂。

所述吸附剂的添加量与所述奶粉样品的质量比为0.15:1-0.3:1。

所述步骤（4）中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行。

所述复溶步骤是采用乙腈和0.1%的甲酸水溶液的混合液进行的，所述乙腈与所述甲酸溶液的体积比为3:7。

所述过滤采用孔径为0.22μm滤膜。

进一步地，本发明还提供一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其包括如下步骤：

（a）按照权利要求1-9任一所述的方法对所述奶粉进行前处理，得到所需的待测样品；

（b）采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对奶粉中含有的双氰胺进行检测。

所述步骤（b）中所述高效液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm；

柱温：30℃；

流动相A：10mmol/LNH₄Ac水溶液，流动相B：乙腈；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述三重四级杆质谱的检测条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

毛细管电压：4kV；

锥孔电压：25V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：400℃；

中心气体流速：50L/Hr；

脱溶剂气体流速：800L/Hr；

碰撞气流速：0.15mL/min。

所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

（1）本发明所述的样品前处理方法，以有机提取液对样品进行双氰胺的提取后，以MgSO₄和NaCl对样品进行分层提取，利用水中盐浓度的增加，进一步降低双氰胺在水相中溶解度，进而增加其在有机相中的溶解浓度，使其通过液液分配而更多的进入有机相，最大化的增加双氰胺的提取效率；同时由于MgSO₄在水中的溶解度较小，并具有很强的吸水性，且在吸水的同时产生自发热，能够进一步增加双氰胺在有机相中的溶解度，从而提高提取效率；另外，借助于MgSO₄和NaCl的盐析作用，促进有机相与水相分层，提高分离效率；并通过对提取后溶液的吸附、分离、浓缩、复溶、过滤等步骤的处理，最大程度的将可能干扰检出结果的因素处理，进一步提升了检测准确性及检测灵敏度；

（2）本发明所述的样品前处理方法，当称取奶粉样品的质量为1g时，所述MgSO₄的用量为1-3g，并优选2g，既避免了MgSO₄用量太少，导致吸水及放热效应比较弱，起不到提高提取效率的问题，也避免了MgSO₄用量太大，将会产生大颗粒状的结块，导致MgSO₄与样品基质分散不均匀，影响提取效率的问题；并且研究显示，在优选MgSO₄用量的条件下，分散的MgSO₄固体颗粒与奶粉基质形成混合体，并在涡旋过程中起到摩擦和放热作用，有效地提高了提取效率；所述NaCl的用量为0.5-1g，并优选0.5g，既解决了NaCl用量太少，导致盐析作用不明显，而用量过大，会有部分NaCl进入乙腈层，在后续吹干过程中会有部分盐析出，盐的浓度过高会抑制质谱响应信号的问题，既保证盐析效率又保证了后续的检测准确性；

（3）本发明所述样品前处理方法，利用吸附剂C18对样品进行净化处理，从而能够除去待测样品中本身含有的蛋白质分子、脂肪分子以及一些与双氰胺分子量相近的干扰分子，同时由于C18是非极性吸附剂，而目标分子双氰胺是极性分子，使用吸附剂C18对样品进行净化处理，在吸附样品中杂质分子的同时，避免对目标分子的吸附；

（4）本发明所述样品前处理方法，所述浓缩步骤采用氮气吹干的方式，不仅可以同时对多个样品进行浓缩处理，效率较高，而且相较于旋转蒸发的方式，氮气吹干更适用于少量样品，并避免了样品在转移中的浪费而造成的实验误差；

（5）本发明所述样品前处理方法，所述复溶步骤采用乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合液，优选乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为3:7，在此条件下，复溶液能有效的将玻璃试管壁上的残渣溶解，避免目标物因未有效复溶而降低回收率；少量的甲酸有利于双氰胺质子化，提高仪器的响应值；

（6）本发明所述样品前处理方法，采用孔径为0.22μm滤膜进行过滤，以防止样品中含有大粒径杂质分子而对色谱的损坏，同时也在一定程度上起到净化样品的作用；

（7）本发明采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测样品中含有的双氰胺，该检测方法具有干扰性小、检出限低、灵敏度高、重现性好的特点，且适于对奶粉中含有的痕量物质双氰胺进行检测。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1A、1B、1C分别为本发明所述双氰胺标准品在三重四级杆质谱上的总离子流和两个选择离子图；

图2为双氰胺的标准曲线；

图3A、图3B为全脂奶粉阴性样品中双氰胺的总离子流和选择离子图;

图4A、图4B分别为全脂奶粉阳性样品中双氰胺的总离子流和选择离子图;

图5A、图5B分别为脱脂奶粉阳性样品中双氰胺的总离子流和选择离子图；

图6A、图6B分别为婴幼儿奶粉阴性样品中双氰胺的总离子流和选择离子图。

具体实施方法

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。

仪器与试剂：

UPLC-Xevo TQ MS型超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司）；

氮吹仪（美国Organomation公司）

微孔滤膜(0.22μm，美国Pall公司)；

超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)；

高速离心机（德国Sigma公司）；

Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm色谱柱，美国Waters公司；

双氰胺标准品购自中国药品生物制品检定所；乙酸铵（色谱级，美国TEDIA公司）；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；无水MgSO₄（分析纯）、NaCl（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；C18吸附剂购自艾杰尔公司（CleanertC18,40-60μm）；实验用水均由Milli-Q超纯水系统制备；

1.质谱条件的优化

图1A、1B、1C所示分别为本发明所述双氰胺标准品在三重四级杆质谱上的总离子流和两个选择离子图，标准品的奶粉基质实验中双氰胺母离子（[M+H]⁺）的质量数为85，定性子离子的质量数分别为68和43，其中，图1B所示为子离子m/z68的选择离子图，图1C所示为子离子m/z43的选择离子图，由于m/z43的子离子在保留时间处有干扰峰（图1C所示），因此选择m/z68为定量子离子（图1B），随着碰撞能量的增加，母离子丰度逐渐减少，子离子m/z43、m/z68的丰度逐渐下降，所以双氰胺最终选用在12ev的碰撞能量下荷质比为m/z68的子离子为定量离子，在10ev的碰撞能量下荷质比为m/z43的子离子为辅助定性子离子。

2.标准曲线

取双氰胺标准溶液，以乙腈和0.1%甲酸水溶液（3:7，v/v）为溶剂，逐级稀释得到一系列双氰胺的标准工作溶液，所述标准工作溶液中双氰胺的浓度分别为5、10、25，50、100ng/mL，分别进样，获得色谱峰面积，以色谱峰面积对双氰胺的质量浓度作线性回归，得到双氰胺的标准曲线为：Y=17.5x+60.24，r=0.9994，线性范围为5-100ng/mL，线性关系良好（见图2）。

3.样品的测定

实施例1

本实施例所述奶粉样品为全脂奶粉阴性样品，所述液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，具体包括如下步骤：

a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：

（1）称取1g奶粉样品，加入2mL水使奶粉溶解，加入10mL乙腈提取液，在40kHz的超声波下提取10分钟，得到混合溶液；

（2）向所述混合溶液中加入2gMgSO₄和0.5gNaCl，涡旋振荡1分钟，然后于7000rpm的离心机上进行离心的第一上清液；

（3）取所述第一上清液5mL，转移到含有150mg吸附剂C18(粒径为40-60μm)的玻璃试管中，涡旋1min以使吸附剂与溶液混合均匀，然后于1500rpm进行离心得第二上清液；

（4）取所述第二上清液4mL，转移至干净的玻璃试管中，经45℃氮气的吹干浓缩后，用0.80mL乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合液进行复溶，所述混合液中所述乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为3:7，最后过孔径0.22μm滤膜，制得待测样品。

b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测：

（1）所述高效液相色谱条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm色谱柱；

柱温：30℃；

流动相A：10mmol/LNH₄Ac水溶液，流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：

流速为0.3mL/min；

进样体积：10.0L。

（2）所述质谱条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

检测模式：多反应监测模式（MRM）；

毛细管电压：4kV；

锥孔电压：25V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：400℃；

中心气体流速：50L/Hr；

脱溶剂气体流速：800L/Hr；

碰撞气流速：0.15mL/min。

其中，监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数如表1所示。

表1三重四级杆质谱检测参数

如图3A、图3B所示分别为全脂奶粉阴性样品中双氰胺的的总离子流和子离子m/z68的选择离子图，该样品中双氰胺为未检出。

实施例2

本实施例所述奶粉为脱脂奶粉阳性样品，所述液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品方法，具体包括如下步骤：

a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：

（1）称取1g奶粉样品，加入2mL水使奶粉溶解，加入10mL乙腈提取液，在40kHz的超声波下提取10分钟，得到混合溶液；

（2）向所述混合溶液中加入3gMgSO₄和1gNaCl，涡旋振荡1分钟，然后于7000rpm的离心机上进行离心的第一上清液；

（3）取所述第一上清液5mL，转移到含有200mg吸附剂C18（粒径为40-60μm）的玻璃试管中，涡旋1min以使吸附剂与溶液混合均匀，然后于1500rpm进行离心得第二上清液；

（4）取所述第二上清液4mL，转移至干净的玻璃试管中，经45℃氮气的吹干浓缩后，用0.80mL乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合液进行复溶，所述混合液中所述乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为3:7，最后过孔径0.22μm滤膜，制得待测样品。

b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测：

（1）所述高效液相色谱条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm色谱柱；

柱温：30℃；

流动相A：10mmol/LNH₄Ac水溶液，流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：

流速为0.3mL/min；

进样体积：10.0L。

（2）所述质谱条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

检测模式：多反应监测模式（MRM）；

毛细管电压：4kV；

锥孔电压：25V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：400℃；

中心气体流速：50L/Hr；

脱溶剂气体流速：800L/Hr；

碰撞气流速：0.15mL/min。

其中，监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数值与实施例1相同，如表1所示。

如图4A、图4B所示分别为全脂奶粉阳性样品中双氰胺的的总离子流和子离子m/z68的选择离子图，采用外标法以峰面积定量，测得双氰胺的含量为0.30mg/kg。

实施例3

本实施例所述奶粉为脱脂奶粉阳性样品，所述液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品方法，具体包括如下步骤：

a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：

（1）称取1g奶粉样品，加入2mL水使奶粉溶解，加入10mL乙腈提取液，在40kHz的超声波下提取10分钟，得到混合溶液；

（2）向所述混合溶液中加入2gMgSO₄和0.5gNaCl，涡旋振荡1分钟，然后于7000rpm的离心机上进行离心的第一上清液；

（3）取所述第一上清液5mL，转移到含有150mg吸附剂C18（粒径为40-60μm）的玻璃试管中，涡旋1min以使吸附剂与溶液混合均匀，然后于1500rpm进行离心得第二上清液；

（4）取所述第二上清液4mL，转移至干净的玻璃试管中，经45℃氮气的吹干浓缩后，用0.80mL乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合液进行复溶，所述混合液中所述乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为3:7，最后过孔径0.22μm滤膜，制得待测样品。

b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测：

（1）所述高效液相色谱条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm色谱柱；

柱温：30℃；

流动相A：10mmol/LNH₄Ac水溶液，流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：

流速为0.3mL/min；

进样体积：10.0L。

（2）所述质谱条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

检测模式：多反应监测模式（MRM）；

毛细管电压：4kV；

锥孔电压：25V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：400℃；

中心气体流速：50L/Hr；

脱溶剂气体流速：800L/Hr；

碰撞气流速：0.15mL/min。

其中，监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数值与实施例1相同，如表1所示。

如图5A、5B所示分别为脱脂奶粉阳性样品中双氰胺的总离子流及子离子m/z68选择离子图，采用外标法以峰面积定量，测得双氰胺的含量为0.40mg/kg。

实施例4

本实施例所述奶粉为婴幼儿奶粉阴性样品，所述液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，具体包括如下步骤：

a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：

（1）称取1g奶粉样品，加入2mL水使奶粉溶解，加入10mL乙腈提取液，在40kHz的超声波下提取10分钟，得到混合溶液；

（2）向所述混合溶液中加入1gMgSO₄和0.5gNaCl，涡旋振荡1分钟，然后于7000rpm的离心机上进行离心的第一上清液；

（3）取所述第一上清液5mL，转移到含有300mg吸附剂C18的玻璃试管中，涡旋1min以使吸附剂与溶液混合均匀，然后于1500rpm进行离心得第二上清液；

（4）取所述第二上清液4mL，转移至干净的玻璃试管中，经45℃氮气的吹干浓缩后，用0.80mL乙腈和0.1%甲酸水溶液的混合液进行复溶，所述混合液中所述乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为3:7，最后过孔径0.22μm滤膜，制得待测样品。

b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测：

（1）所述高效液相色谱条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm色谱柱；

柱温：30℃；

流动相A：10mmol/LNH₄Ac水溶液，流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序：

流速为0.3mL/min；

进样体积：10.0L。

（2）所述质谱条件：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

检测模式：多反应监测模式（MRM）；

毛细管电压：4kV；

锥孔电压：25V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：400℃；

中心气体流速：50L/Hr；

脱溶剂气体流速：800L/Hr；

碰撞气流速：0.15mL/min。

其中，监测离子对、锥孔电压和碰撞能量等参数值与实施例1相同，如表1所示。

如图6A、6B所示分别为婴幼儿奶粉阴性样品中双氰胺的总离子流和子离子m/z68选择离子图，采用外标法以峰面积定量，该样品中双氰胺为未检出。

4.方法的验证：

4.1最低检出限和最低定量限

将一定量的双氰胺的标准溶液加入到奶粉样品中，使添加后奶粉中双氰胺的浓度分别为5、10、25，50、100ng/g,按照本发明实施例1所述液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法和检测方法进行实验。

根据信噪比S/N≥3为该物质的最低检出限，奶粉中双氰胺的检出限为10ng/g，根据信噪比S/N≥10为该物质的最低定量限，最低定量限为30ng/g。

4.2精确度

先后准确称取三份1g的奶粉样品（精确至0.01g），并分别编号A-1、A-2、A-3，按照本发明实施例1所述方法对样品进行前处理与检测，对所述A-1、A-2、A-3奶粉样品进行平行测定，分析结果见表2，平行样中双氰胺的相对标准偏差为5.67%；进一步地，对第一个样品A-1进行重复测定5次，分析结果见表3，重复性测试的相对标准偏差为3.05%。

表2样品的平行测定

表3A-1样品的重复测定

4.3回收率

将双氰胺的标准溶液加入到空白奶粉样品（即奶粉的阴性样品）中，控制加标浓度分别为25、50、100ng/g，按照本发明实施例1所述液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法和检测方法进行实验，每个加标浓度下进行6次平行测量，取平均值，根据实际加标量和检测结果，计算奶粉样品的加标回收率，见表4，样品的加标回收率在95.2%～105.7%。

表4加标样品的平行测量

对比例1

本对比例所述奶粉样品为实施例4中婴幼儿奶粉阴性样品添加双氰胺量为100ng/g制得，采用与实施例4完全相同的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测，区别仅在于对样品进行前处理的步骤（2）中没有向所述混合溶液中加入MgSO₄和NaCl，而是将提取后的混合液直接涡旋振荡1分钟，后于7000rpm的离心机上进行离心的第一上清液。

在100ng/g的添加水平下，测得奶粉样品中双氰胺的含量为59.7ng/g，即添加回收率为59.7%，因此，采用上述样品前处理方法，将会导致回收率偏低，测量误差较大。

对比例2

本对比例所述奶粉样品为实施例4中婴幼儿奶粉阴性样品添加双氰胺量为100ng/g制得，采用与实施例4完全相同的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测，区别仅在于对样品进行前处理的步骤（2）为：向所述混合溶液中加入0.5gMgSO₄和2gNaCl，涡旋振荡1分钟，然后于7000rpm的离心机上进行离心的第一上清液。

在100ng/g的添加水平下，测得奶粉样品中双氰胺的含量为61.8ng/g，即添加回收率为61.8%，因此，采用上述样品前处理方法，将会导致回收率偏低，测量误差较大。

对比例3

本对比例所述奶粉样品为实施例4中婴幼儿奶粉阴性样品添加双氰胺量为100ng/g制得，采用与实施例4完全相同的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测，区别仅在于样品的前处理方法不同。

本对比例采用的样品前处理方法，其具体步骤为：

称取1g奶粉样品，加入2mL水使奶粉溶解，加入75mgEDTA-Na₂混匀，再加入2.5mL乙腈-乙醇混合液（90:10，v/v）混匀30s，0℃冷冻离心10min得到第一上清液，取2.25mL第一上清液于离心管中，加入15.5mL乙腈-乙醇混合液，充分混匀，0℃冷冻离心得到第二上清液，将第二上清液转移至50mL鸡心瓶，40℃旋转蒸发至干，用乙腈-乙醇-水混合液定容至0.5mL得到样品液，摇匀后样液通过0.22μm微孔滤膜过滤得到待测液。

在100ng/g的添加水平下，测得奶粉样品中双氰胺的含量为56ng/g，即添加回收率为56%，因此，采用上述样品前处理方法，将会导致回收率偏低，测量误差较大。

对比例4

本对比例所述奶粉样品为实施例4中婴幼儿奶粉阴性样品添加双氰胺量为100ng/g制得，采用与实施例4完全相同的超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的双氰胺进行检测，区别仅在于样品的前处理方法不同。

本对比例采用的样品前处理方法，其具体步骤为：

（1）称取1g奶粉样品至50mL的离心管中；（2）加入25mL的体积比为1:9的水与乙腈的混合液；（3）涡流震荡2min，超声30min，不时摇动；（4）取出，经10000r/min离心4min;(5)离心上清液经0.22μm微孔滤膜过滤得到待测液。

在100ng/g的添加水平下，测得奶粉样品中双氰胺的含量为189.0ng/g，即添加回收率为189%，因此，采用上述样品前处理方法，将会导致回收率偏高，测得结果不准确。

本发明所述的样品前处理方法，以有机提取液对样品进行双氰胺的提取后，以MgSO₄和NaCl对样品进行分层提取，利用水中盐浓度的增加，进一步降低双氰胺在水相中溶解度，进而增加其在有机相中的溶解浓度，使其通过液液分配而更多的进入有机相，最大化的增加双氰胺的提取效率；同时由于MgSO₄在水中的溶解度较小，并具有很强的吸水性，且在吸水的同时产生自发热，能够进一步增加双氰胺在有机相中的溶解度，从而提高提取效率；另外，借助于MgSO₄和NaCl的盐析作用，促进有机相与水相分层，提高分离效率；并通过对提取后溶液的吸附、分离、浓缩、复溶、过滤等步骤的处理，最大程度的将可能干扰检出结果的因素处理，进一步提升了检测准确性及检测灵敏度。

优选地，当称取奶粉样品的质量为1g时，所述MgSO₄的用量为1-3g，并优选2g，既避免了MgSO₄用量太少，导致吸水及放热效应比较弱，起不到提高提取效率的问题，也避免了MgSO₄用量太大，将会产生大颗粒状的结块，导致MgSO₄与样品基质分散不均匀，影响提取效率的问题；并且研究显示，在优选MgSO₄用量的条件下，分散的MgSO₄固体颗粒与奶粉基质形成混合体，并在涡旋过程中起到摩擦和放热作用，有效地提高了提取效率；所述NaCl的用量为0.5-1g，并优选0.5g，既解决了NaCl用量太少，导致盐析作用不明显，而用量过大，会有部分NaCl进入乙腈层，在后续吹干过程中会有部分盐析出，盐的浓度过高会抑制质谱响应信号的问题，既保证盐析效率又保证了后续的检测准确性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (12)

1.一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）将奶粉样品溶解得水溶液，并加入有机提取液对双氰胺进行提取；

（2）向提取后的混合液中加入MgSO₄和NaCl使所述有机提取液与水相分层，离心得第一上清液；

（3）在所述第一上清液中加入吸附剂进行净化，离心得第二上清液；

（4）将所述第二上清液经浓缩、复溶、过滤步骤，得到所需的待测样品。

2.根据权利要求1所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述MgSO₄的添加量与所述奶粉样品的质量比为1:1-3:1。

3.根据权利要求2所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述NaCl的添加量与所述奶粉样品的质量比为0.5:1-1:1。

4.根据权利要求1-3任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述有机提取液提取双氰胺的步骤是在超声条件下进行的。

5.根据权利要求1-4任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述有机提取液为乙腈、酸化乙腈、氨化乙腈、乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的一种或几种的混合物。

6.根据权利要求1-5任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述吸附剂为粒径40-60μm的C18吸附剂。

7.根据权利要求6所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述吸附剂的添加量与所述奶粉样品的质量比为0.15:1-0.3:1。

8.根据权利要求1-7任一所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述浓缩步骤采用以氮气吹干的方式进行。

9.根据权利要求8所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的样品前处理方法，其特征在于，所述复溶步骤是采用乙腈和0.1%的甲酸水溶液的混合液进行的，所述乙腈与所述甲酸溶液的体积比为3:7。

10.一种液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）按照权利要求1-9任一所述的方法对所述奶粉进行前处理，得到所需的待测样品；

（b）采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对奶粉中含有的双氰胺进行检测。

11.根据权利要求10所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其特征在于，所述步骤（b）中所述高效液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T32.1×150mm，1.8μm；

柱温：30℃；

流动相A：10mmol/LNH₄Ac水溶液，流动相B：乙腈；

流速：0.25mL/min；

进样量：10μL；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述三重四级杆质谱的检测条件为：

质量分析器：三重四级杆；

离子源：ESI⁺；

毛细管电压：4kV；

锥孔电压：25V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：400℃；

中心气体流速：50L/Hr；

脱溶剂气体流速：800L/Hr；

碰撞气流速：0.15mL/min。

12.根据权利要求11所述的液-质联用检测奶粉中双氰胺的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的梯度洗脱程序为：

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