CN103215335B - 霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甾体激素类药物霉菌发酵合成制备霉菌氧化物的工艺及所需新型氮源，配合新型氮源，在27±3℃搅拌反应，并在生物发酵过程中进行通气，经24-72h氧化反应，再经板框压滤脱水、吹干，将底物沃氏氧化物转化为含有霉菌氧化物的菌丝体，再经丙酮提取得到霉菌氧化物粗品，经甲苯、氯仿混合溶剂精制得到霉菌氧化物精品，新型氮源的配方更加适合生物发酵工艺要求，收率可达92%以上，产品质量稳定，产量高、转化率、收率相关指标高，经济效益可观，适合于产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及甾体激素类药物霉菌发酵领域，具体为一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的方法。
背景技术
环氧黄体酮呈白色结晶粉末状，无臭，溶于甲醇，甲苯等有机溶剂。由天然甾体薯蓣皂素经过开环、乙酰化、氧化、水解、消除、环氧化、氧化等反应制得，廉价易得，是我国用量最大的一类非常重要的甾体药物中间体，广泛应用于肾上腺皮质激素药物的合成，是氢化可的松、可的松、强的松，地塞米松和肤轻松等甾体激素类药物的主要原料。
1952年，美国普强制药公司的Murray等首次利用黑根霉将黄体酮转化为11a一羟基黄体酮，解决了皮质激素合成中的关键问题，且转化率有90%以上，反应专一性强，是化学方法无法比拟的，使得人们开始认识到微生物转化在甾体药物生产中的重要性。随后，研究者又相继发现了细菌、放线菌、酵母和霉菌的某些菌种可使甾体化合物的特定部位发生有价值的转化，许多化学方法难以进行的反应，利用微生物转化可以轻而易举地实现，从而促使了生物催化和生物转化这一新领域的兴起，也促进了甾体药物工业的迅速发展。
黑根霉微生物转化，是指利用黑根霉细胞(酶)对沃氏氧化物C11位(基团)进行特定的羟化反应，使其转化成结构上相类似的更有价值的新化合物霉菌氧化物。其转化的最终产物不是黑根霉细胞对营养物质的代谢产物，而是黑根霉细胞酶系对底物的C11位进行催化反应后的产物。由于采用微生物转化法能够减少合成步骤，缩短生产周期，提高收率，减少副反应，而且反应迅速、专一，条件温和，有立体选择性和区域选择性，因此利用微生物转化具有重要的现实意义。目前，微生物转化技术，如羟化反应已成为许多甾体激素药物或其中间体合成路线中不可或缺的关键技术。
甾体微生物转化过程中一个重要的技术难点是如何提高转化效率，该过程存在氮源中蛋白质含量偏低，氨基酸组合配伍不够合理，尤其是铁离子含量低及存在可溶性磷离子等诸多缺陷，虽多年来工艺不断改进，各项指标有所提高，但其转化率、收率、指标并无大的突破。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的方法，它是针对现有技术不足的一种改进，它是采用氮源II弥补蛋白质含量偏低，氨基酸配比不够合理等缺陷的生物发酵工艺；它在保证现有产品质量的前提下，大幅度提高产品转化率、收率指标的重大突破，这是多年来各种改进所不能达到的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺，它包括以下步骤：
（1）菌丝制备：
A、将碳源：葡萄糖60～85kg；氮源I：玉米浆40～57kg；蚕蛹粉10～20kg；硫酸铵5～10kg；氮源II，氮源II各组分在培养基中的终浓度设置为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%；消沫剂：聚醚1000～2000mL一次投入到一级发酵罐内，加入1～4吨水，调整pH值至2～5，蒸汽灭菌，降温至27±3℃时，接入黑根霉的孢子悬浮液3～50升，孢子悬浮液浓度为10～300万/mL,通入空气，所说的通入空气和反应液的体积比为0.21～0.28倍体积/min，搅拌12～36h,后移入二级发酵罐；
B、按与一级发酵罐同样的物料配比投5～10倍物料，经灭菌，降温至27±3℃，移入A步骤所制全部液体，通入空气，所说的通入空气和反应液的体积比为0.21～0.28倍体积/min，搅拌18～36h，投入340kg底物沃氏氧化物，于25～30℃进行生物氧化，氧化反应时间为24～72小时，取样镜检，及色谱测试，底物转化比例达到50～60%后，提高温度至30～60℃，下口罐放料；
C、将菌丝液体压入板框压混机，滤掉发酵液，将菌转体空气吹干，再将菌转体粉碎；
（2）霉菌氧化物粗品的制备：将粉碎后的菌丝体投入提取罐内，加入菌丝体重量5～10倍丙酮，提取2～8次，将提取液浓缩结晶，得霉菌氧化物粗品；
（3）霉菌氧化物精制：将霉菌氧化物粗品投入精制罐内，加入霉菌氧化物粗品重量10～15倍体积的甲苯、氯仿混合溶媒，全溶浓缩，所说的甲苯、氯仿体积比为：1∶2～2∶1，反复精制3～9次，取样测试，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、滤干，精品入烤箱干燥，取样送检，霉菌氧化物含量大于97%为霉菌氧化物。
本发明的反应方程式是：
沃氏氧化物 霉菌氧化物
霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺所需氮源II，包含有如下组分：
蛋白胨，酵母浸膏，(NH4)2SO4，FeSO4·7H2O，NaCl，KH2PO4，MgSO4·7H2O，吐温80。
所述氮源II各组分在配制培养基时的终浓度设置为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%。
本发明的有益效果是：
本研究采用氮源II，既包含无机氮源（硫酸铵）和有机氮源（蛋白胨、酵母浸膏），也包含黑根霉发酵转化各阶段所需的速效氮源（酵母浸膏、硫酸铵）和迟效氮源（蛋白胨），增强黑根霉转化的关键酶P450酶活性，提高转化率。
速效氮源（如无机氮源等）能缩短种子培养阶段的时间，而迟效氮源（如蛋白胨等）能保证发酵阶段氮源的供应充足，本发明根据黑根霉转化沃氏的前期、中期和后期的需要将速效氮源和迟效氮源按照科学的配比（ 3:10 ）进行配制，既充分保证黑根霉在发酵转化中菌体快速生长，缩短种子培养时间，又能保证发酵后期氮源的合理供应，从而保证黑根霉的酶活始终维持在最大水平。
本发明氮源II是根据黑根霉生长以及转化沃氏氧化物需要，经过多年的分析研究，按照科学的配比，直接将其中的必需氨基酸成分，以及细胞色素P450氧化酶不可或缺的Fe离子，其生长转化所必需的生长因子和维生素有机组合在一起，能够更有效的诱导氨基酸残基肽段的细胞色素P450羟化酶系的表达；在此基础上，根据黑根霉生长周期的需要，加入迟效氮源，提供黑根霉生长和转化所必需的氮源。
此外由于该复合氮源是由多种不同价格的氮源通过不同比较复配而成，有利于降低成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。
通过上述工艺所制备的霉菌氧化物精品，其霉菌氧化物精品质量稳定，含量高，总收率由现行水平的80%提高到92%，产率高，经济效益可观，适用于产业化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：
实施例1：
一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺，它包括以下步骤：
1、菌丝制备：
（1）将葡萄糖60kg、玉米浆40kg；氮源II（氮源II各组分培养基中的终浓度为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%）；蚕蛹粉10kg；硫酸铵5kg；聚醚1000mL一次投入到一级发酵罐内，加入1.5吨水，调整pH值至2，蒸汽灭菌，降温至27±3℃时，接入黑根霉的孢子悬浮液3升，孢子悬浮液浓度为10万/mL,通入0.21倍体积/min空气，搅拌培养24h,镜检，发现菌丝成长成熟后，移入二级发酵罐；
（2）将葡萄糖600kg、玉米浆400kg；氮源II（氮源II各组分培养基中的终浓度为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%）；蚕蛹粉100kg；硫酸铵50kg、聚醚10000mL配比将物料投入二级发酵罐内，经灭菌，降温至27±3℃，移入（1）步骤所制全部液体，通入0.21倍体积/min空气、搅拌、培养24h,镜检，菌丝成长成熟后，投入340公斤沃氏氧化物，于26℃进行生物氧化至30h,取样镜检，及色谱测试，底物转化比例达到50%后，提高温度30℃，得到菌丝为1600公斤，霉菌氧化物转化率62%，下罐放料；
（3）将菌丝液体压入板框压混机，滤掉发酵液，将菌转体空气吹干，再将菌丝体粉碎；
2、霉菌氧化物粗品的提取制备：将粉碎后的菌丝体投入提取罐内，加入菌丝重量5倍丙酮，提取5次，将提取液浓缩结晶，滤液压入浓缩罐浓缩，得霉菌氧化物粗品，粗品率96.9%；
3、霉菌氧化物精制：将霉菌氧化物粗品投入精制罐内，加入霉菌氧化物粗品重量10倍甲苯、氯仿混合溶媒，甲苯、氯仿体积比:1∶1,搅拌溶清，全溶浓缩，反复精制5次，取样测试，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、滤干，精品入烤箱干燥，取样送检，霉菌氧化物含量大于97%为霉菌氧化物精品，精制率97.8%。
实施例2：
一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺，它包括以下步骤：
1、菌丝培养：
（1）将葡萄糖85kg、玉米浆57kg；氮源II（氮源II各组分培养基中的终浓度为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%）；蚕蛹粉20kg；硫酸铵10kg；聚醚2000mL一次投入到一级发酵罐内，加入一吨水，调整pH值至3.5，蒸汽灭菌，降温至27±3℃时，接入黑根霉的孢子悬浮液28升，孢子悬浮液浓度为150万/mL,通入0.24倍体积/min空气，搅拌培养36h,镜检，发现菌丝成长成熟后，移入二级发酵罐；
（2）将葡萄糖680kg、玉米浆454kg；氮源II（氮源II各组分培养基中的终浓度为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%）；蚕蛹粉160kg；硫酸铵80kg；聚醚160000mL一次投入二级发酵罐内，经灭菌，降温至27±3℃时，移入（1）步骤所制全部液体，通入0.24倍体积/min空气、搅拌、培养24h,镜检，发现菌丝成长成熟后，投入340公斤底物沃氏氧化物，于30℃进行生物氧化至72h，取样镜检，及色谱测试，底物转化比例达到55%后，提高温度45℃，得到菌丝为1700公斤，霉菌氧化物转化率63%，下罐口放料；
（3）将菌丝液体压入板框压混机，滤掉发酵液，将菌转体空气吹干，再将菌转体粉碎；
2、霉菌氧化物粗品的制备：将粉碎后的菌丝体投入提取罐内，加入菌丝重量8倍丙酮，提取8次，将提取液浓缩结晶，滤液压入浓缩罐浓缩，得霉菌氧化物粗品，粗品率97.3%；
3、霉菌氧化物精制：将霉菌氧化物粗品投入精制罐内，加入霉菌氧化物粗品重量10倍甲苯、氯仿混合溶媒，甲苯、氯仿体积比:2∶1,搅拌溶清，全溶浓缩，反复精制3次，取样测试，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、滤干，精品入烤箱干燥，取样送检，霉菌氧化物含量大于97%为霉菌氧化物精品，精制率97.9%
实施例3：
一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺，它包括以下步骤：
1、菌丝培养：
（1）将葡萄糖75kg、玉米浆50kg；氮源II（氮源II各组分培养基中的终浓度为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%）；蚕蛹粉15kg；硫酸铵8kg；聚醚1500mL一次投入到一级发酵罐内，加入一吨水，调整pH值至5，蒸汽灭菌，降温至27±3℃时，接入菌种库购进的黑根霉的孢子悬浮（中国药品生物制品鉴定所菌种库购进）液50升，孢子悬浮液浓度为300万/mL,通入0.28倍体积/min空气，搅拌培养24h,镜检，发现菌丝成长成熟后，移入二级发酵罐；
（2）将葡萄糖675kg、玉米浆450kg；氮源II（氮源II各组分培养基中的终浓度为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%）；蚕蛹粉135kg；硫酸铵72kg；聚醚13500mL配比物料投入二级发酵罐内，经灭菌，降温至27±3℃时，移入（1）步骤所制全部液体，通入0.28倍体积/min空气、搅拌、培养24h,镜检，发现菌丝成长成熟后，投入340公斤底物沃氏氧化物，于34℃进行生物氧化至48h，取样镜检，及色谱测试，底物转化比例达到60%后，提高温度60℃，得到菌丝为1700公斤，霉菌氧化物转化率64%，下罐口放料；
(3)将菌丝液体压入板框压混机，滤掉发酵液，将菌转体空气吹干，再将菌转体粉碎；
2、霉菌氧化物粗品的制备：将粉碎后的菌丝体投入提取罐内，加入菌丝重量8倍丙酮，提取6次，将提取液浓缩结晶，滤液压入浓缩罐浓缩，得霉菌氧化物粗品，粗品率96.8%；
3、霉菌氧化物精制：将霉菌氧化物粗品投入精制罐内，加入霉菌氧化物粗品重量12倍甲苯、氯仿混合溶媒，甲苯、氯仿体积比:1∶2,搅拌溶清，全溶浓缩，反复精制5次，取样测试，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、滤干，精品入烤箱干燥，取样送检，霉菌氧化物含量大于97%为霉菌氧化物精品，精制率97.8%。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
（1）菌丝制备：
A、将碳源：葡萄糖60～85kg；氮源I：玉米浆40～57kg；蚕蛹粉10～20kg；硫酸铵5～10kg；氮源II，氮源II各组分在培养基中的终浓度设置为：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4 ：0.5‰，FeSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4 ：1‰，MgSO4·7H2O： 0.2‰，吐温80 1%；消沫剂：聚醚1000～2000mL一次投入到一级发酵罐内，加入1～4吨水，调整pH值至2～5，蒸汽灭菌，降温至27±3℃时，接入黑根霉的孢子悬浮液3～50升，孢子悬浮液浓度为10～300万/mL,通入空气，所说的通入空气和反应液的体积比为0.21～0.28倍体积/min，搅拌12～36h,后移入二级发酵罐；
B、按与一级发酵罐同样的物料配比投5～10倍物料，经灭菌，降温至27±3℃，移入A步骤所制全部液体，通入空气，所说的通入空气和反应液的体积比为0.21～0.28倍体积/min，搅拌18～36h，投入340kg底物沃氏氧化物，于25～30℃进行生物氧化，氧化反应时间为24～72小时，取样镜检，及色谱测试，底物转化比例达到50～60%后，提高温度至30～60℃，下口罐放料；
C、将菌丝液体压入板框压混机，滤掉发酵液，将菌丝体空气吹干，再将菌丝体粉碎；
（2）霉菌氧化物粗品的制备：将粉碎后的菌丝体投入提取罐内，加入菌丝体重量5～10倍丙酮，提取2～8次，将提取液浓缩结晶，得霉菌氧化物粗品；
（3）霉菌氧化物精制：将霉菌氧化物粗品投入精制罐内，加入霉菌氧化物粗品重量10～15倍体积的甲苯、氯仿混合溶媒，全溶浓缩，所说的甲苯、氯仿体积比为：1∶2～2∶1，反复精制3～9次，取样测试，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、滤干，精品入烤箱干燥，取样送检，霉菌氧化物含量大于97%为霉菌氧化物。
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