CN103211764A

CN103211764A - 与pyy类似物结合的脂质体及其制备方法

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Publication number: CN103211764A
Application number: CN2013101632907A
Authority: CN
Inventors: 曹亮
Original assignee: Shanghai Advanced Vehicle Technology Ltd Co
Current assignee: Shanghai Advanced Vehicle Technology Ltd Co
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明属于与PYY类似物结合的脂质体及其制备方法。该发明是在脂质末端的一部分被巯基化的脂质体上通过二硫键结合了PYY类似物而得到的脂质体，相对于包含在脂质体中的1摩尔巯基化脂质，所述PYY类似物的结合量为0.5-10mol％。该脂质体在保留了PYY多肽生物活性的同时，增加了PYY类似物在血液中的稳定性，延长了PYY类似物在体内的半衰期。

Description

与PYY类似物结合的脂质体及其制备方法

技术领域：

本发明涉及脂质体。具体涉及与PYY类似物结合的、具有优良的血中稳定性和治疗效果的脂质体，及其制备技术。

背景技术：

多肽、蛋白类药物与传统药物相比，不仅具有用药剂量小、疗效好、毒副作用低等突出优点，而且还具有不同于传统药物的一些特性：1)蛋白质分子的化学结构决定其活性，影响活性的结构因素主要为氨基酸及其排序、末端基团、肽链和二硫键位置等。此外，药物的空间结构即二维、三维结构也同样影响生物活性。2)蛋白质药物体内外不稳定性。蛋白质药物在体内外环境可能经受多种复杂的化学降解和物理变化而失活，如凝聚、沉淀、消旋化、水解、脱酰氨基等。3)蛋白质药物半衰期短、清除率高、分子量大、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、非注射给药生物利用度低，一般都仅为百分之几。因此，如何设计出安全、有效和稳定的转运多肽、蛋白类药物的新型给药系统是当今制剂工作者和制药业面临的一个重大难题。

多肽、蛋白类药物脂质体的研究是当前一个十分活跃的领域。脂质体用做多肽、蛋白类药物载体具有众多优点和用途：(1)根据脂质体类似生物膜的结构，脂质体可以用来测定多肽、蛋白类药物通过膜的渗透性能及药物在膜和水相之间的分配性能等；(2)根据脂质体具有细胞亲和性，适合体内降解、无毒性和无免疫原性的特点，脂质体被广泛制药和化妆品中的多肽、蛋白类药物载体；(3)脂质体做为药物载体可控制药物的释放和具有器官靶向性，可用于药物的可控释放和体内的靶向给药；(4)利用脂质体可与细胞融合的特性，脂质体还可用作将目的基因和其它多肽、蛋白类物质向细胞内传递的工具，介导转染作用。

作为向特定部位输送大量药剂的手段，提出了将药剂封入脂质体，使抗体结合到脂质体表面的方法。特别是在癌的治疗领域，有许多关于其中封入了抗肿瘤药、与抗体结合的脂质体的有效性的报道(Konno等，Cancer Tes.，47，4471，1987；特开昭58-134032号公报。进而，作为对脂质体存在的问题，即封入物的漏出、脂质体的凝集以及在网状内皮器官中的捕获等的改善方法，提出了向脂质体上结合聚乙二醇的方法(特开平1-249717号公报、特开平2-149512号公报、Klibanovet，A.L等，FEBS Lett.，268，235，1990)。

在特开平4-346918号公报中，公开了与蛋白质结合的含有药剂的脂质体，其特征在于具有蛋白质和包含聚乙二醇部分的化合物残基，所述蛋白质和化合物残基分别通过各自的硫羚基与内含药剂的脂质体表面的马来酸亚胺基结合.这种脂质体是使结合在杭体上的硫巯基和结合在含聚乙二醇部分的化合物上的硫巯基与脂质体表面的马来酸亚胺基反应来制备的，它的特征在于如通过历来的脂质体所观察到的那样，在肝脏、脾脏等网状内皮系统中的非特异性摄入得到抑制，实现了靶向性的化学疗法。

PYY是最初从胰肠分离的36个残基肽酰胺，并位于胃肠道和胰腺的内分泌细胞中(Tatemoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.79：2514，1982)。肽YY具有N-端和C-端酪氨酸酰胺；因此，这两个酪氨酸给予PYY其名字(Y表示肽命名中的氨基酸酪氨酸)。此外，PYY共享其最初从猪脑分离出来的同源肽神经肽Y(NPY)的多个中枢和外周调节作用(Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.79：5485，1982)。与PYY的细胞定位相反，NPY存在于粘膜下和肠肌层神经元中，其各自神经支配粘膜和平滑肌层(Ekblad等，Neuroscience20：169，1987)。认为PYY和NPY都能抑制肠运动性和血流(Laburthe，Trends Endocrinol.Metab.1：168，1990)，还认为它们在大鼠中减弱基础的(Cox等，Br.J.Pharmacol.101：247，1990)和促分泌素诱导的肠分泌(Lundberg等， Proc.Natl.Acad.Sci USA79：4471，1982)，以及刺激净吸收(MacFadyen等，Neuropeptides7：219，1986)。总之，这些观察表明进餐后PYY和NPY释放至循环中(Adrian等，Gastroenterology89：1070，1985；Balasubramaniam等，Neuropeptides14：209，1989)，因此在调节肠分泌和吸收中起着生理作用。

PYY由回肠L细胞分泌，与摄入的热量呈正相关，在循环中以PYY(3-36)形式存在，其分子结构和生物活性均与胰多肽(PP)、神经肽Y(NPY)相似，三者同属肽类家族。近年来研究表明，PYY除在胃肠道功能的调节中发挥重要作用外，还在机体摄食的短期调节中起着重要作用，可能参与肥胖的发生。PYY受神经内分泌系统(大脑-肠道轴)的调节，其由肠道内分泌细胞分泌后，通过G蛋白偶联，作用于传入神经或直接作用于下丘脑弓状核神经元，还可通过负反馈作用阻断饮食摄入刺激所引起的NPY和豚鼠相关蛋白的表达和释放，从而阻断兴奋下丘脑腹外侧核引起的摄食。因而，PYY的水平下降或作用发生异常可能导致肥胖。

研究发现，PYY(3-36)能迅速抑制小鼠的食物摄入，且抑制率高达45％。通过外周PYY输注可以减少雌性肥胖小鼠的体重增加而不影响其摄食总量；在饮食诱导的雄性肥胖小鼠模型中，PYY-3-36的输注可减少其摄食总量，减轻体重和脂肪堆积，还可阻止饮食过量导致的糖化血红蛋白A1c的升高，但对血糖水平无明显影响。

以上研究使开发PYY(3-36)作为一种肥胖治疗药物具有广阔的前景。然而，天然的PYY生物半衰期短，在体内很快被血液中的酶降解，同时，在肾脏被肾小球滤过，被肾小管上的酶代谢。半衰期短的问题是限制该类药物临床应用的主要原因，本发明重点解决这一缺陷。

到目前为止，在肥胖领域，脂质体制剂应用于多肽药物PYY类似物，目的延长PYY类似物的血浆稳定性的研究鲜有报道。

发明详述

本发明提供将半胱氨酸修饰的PYY(3-36)类似物通过二硫键结合到脂质末端的一部分被巯基化的脂质体上而得到的脂质体，相对于包含在全脂中的1mol巯基化脂质，所述PYY类似物的结合量为85％-98％；相对于全脂中，所述PYY类似物的结合量为0.5-10mol％。

构成本发明脂质体的脂质的例子包括但不限于下述物质：天然卵磷脂(例如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱((DMPC)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱((DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)等磷脂，鞘糖脂、甘油糖脂等糖脂、脂肪酸、两亲性二烷基二甲铵、聚甘油烷基醚、聚氧乙烯烷基醚等。可以单独使用这些脂质，或是将两种或两种以上结合使用，也可以与胆固醇等非极性物质、胆甾醇衍生物结合使用。

在本发明的脂质体中，为了结合多肽衍生物，使用例如巯基化磷脂酰乙醇胺等被巯基化的脂质(在本说明书中称为“巯基化脂质”)作为脂质体重要组成部分。

用巯基化磷脂酰乙醇胺的例子来进行说明，这种化合物是由具有与氨基的反应性的含巯基乙酸酯的化合物与磷脂酰乙醇胺(PE)的氨基反应得到的。所述含巯基的化合物可以含己酰基、苯甲酰基、苯基丁酰基等残基。可以使用的PE有二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE)等磷脂酰乙醇胺类，但优选DPPE。

构成本发明磷脂/胆甾醇/巯基化磷脂摩尔比为10-30/10/0.1-1；更为优选的比例是磷脂/胆甾醇/巯基化磷脂摩尔比为10-30/10/0.1-1；最为优选的比例是磷脂/胆甾醇/巯基化磷脂18/10/0.5.

巯基化脂质相对于全脂质的比例通常约为0.5-10％。

构成本发明的多肽脂质体具有较好的控制饮食的功效，具有良好的血浆稳定性。

此外，提供作为肥胖治疗药的上述脂质体；以及使用所述脂质体的肥胖治疗方法。

具体实施方式：

以下通过实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明的范围不限于以下的实施例。

实施例1

(1)载体脂质体的制备

向由二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)/胆甾醇/巯基己酰基二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)摩尔比为18/10/0.5)组成的脂质体混合物(4.8g)中加入48mL0.3M的柠檬酰缓冲液(pH4.0)，水合之后，用液氮和60℃的温浴冷冻和解冻3次，制成多层脂质体.进一步用挤出法将其颗粒大小调整为0.1微米。

脂质体混合物配比：

二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)/胆甾醇/巯基己酰基二月桂酰磷脂酰乙醇胺(HS-DLPE)摩尔比为18/10/0.5；

二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)/胆甾醇/巯基己酰基二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(HS-DMPE)摩尔比为18/10/0.5；

二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)/胆甾醇/巯基己酰基二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(HS-DSPE)摩尔比为18/10/0.5；

二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)/胆甾醇/巯基己酰基二油酰磷脂酰乙醇胺(HS-DOPE)摩尔比为18/10/0.5；

二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)/胆甾醇/巯基己酰基二芥酰磷脂酰乙醇胺(HS-DEPE)摩尔比为18/10/0.5；

天然蛋黄卵磷脂/胆甾醇/巯基己酰基二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE18/10/0.5)；

天然大豆黄卵磷脂/胆甾醇/巯基己酰基二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)18/10/0.5；

二棕榈酰磷脂酸(DPPA)/胆甾醇/巯基己酰基二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)18/10/0.5；

二棕榈酰磷脂酸甘油(DPPG)/胆甾醇/巯基己酰基二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(HS-DPPE)18/10/0.5。

(2)含有半胱氨酸(Cys)残基的PYY(3-36)类似物的合成

使用微波辅助固相多肽合成仪合成末端和中间位置含有半胱氨酸的PYY(3-36)类似物；

AKPEACGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂；

AKPEAPCEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂；

AKPECPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂；

AKPCAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂；

AKCEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂；

ACPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂；

CAKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH₂.

(3)结合了PYY(3-36)类似物脂质体的制作

用缓冲液1mM EDTA的0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)后，溶解(2)中制备的PYY(3-36)类似物。加入(1)中所述的脂质，使其在25℃通入空气，反应12小时，使多肽结合到脂质体上。制成结合了GLP-1类似物的脂质体。

(4)结合PYY类似物量的定量

将脂质体溶液作为最终浓度为2％的SDS溶液在60℃加温30分钟，使脂质体可以完全溶解。使用GPC柱(3000SWXL)，用pH7.0的缓冲液(25mM NaH₂PO₄，200mM Na₂SO₄，0.1％SDS)进行洗脱，分离GLP-1类似物，用在214nm检出的多肽PYY类似物峰的面积值来对多肽进行定量。

(5)脂质体的定量

用HPLC法对脂质(DPPC和胆固醇的总量)进行定量。向L-柱ODS4.6mm X250mm中装入脂质体，用四氢呋喃(THF)/乙睛/水(2∶1∶1，v/v/v，0.1％三氟乙酸进行洗脱。由DPPC的峰面积和胆固醇的峰面积来进行定量。向1体积的脂质体试样中加入9体积的上述洗脱液来制备脂质体定量用试样。

实施例2

(1)血浆稳定性试验

所制备的化合物与人血浆在三乙醇胺-HCl(pH7.8，肽终浓度2～20nM)37℃条件下孵育1-24小时。最后加入10％(V/V)三氟醋酸/水终止酶促反应。酶解产物用C-18反相HPLC分析鉴定，214nm下测定紫外吸收。

(2)小鼠急性喂养试验

雄性清洁级小鼠14-16g，随机分组，20只为一组。适应性喂养一周，控制食物摄入量，让小鼠一周后体重在22-24g。饲养期间，皮下给生理盐水0.20ml，使小鼠适应。第七天晚上小鼠禁食不禁水，次日皮下给药。剂量为5.6umol/kg，PYY(3-36)作为阳性对照药。给药30min后，给食物。测量1，2，4，8，12，24，36小时的食物重量。

血浆稳定性试验结果：

小鼠急性喂养试验结果如附图1所示：

该实验结果表明，在血浆稳定性试验中，360min中后多肽衍生化的脂质体相对于阳性对照药PYY(3-36)，仍然具有较高的血药浓度；在小鼠急性喂养实验中，24hr后仍具有较好的控制饮食的功效。说明本发明公开的多肽衍生化的脂质体具有较好的血浆稳定性，和较长的体内半衰期。

产业利用性：

本发明的脂质体的特征在于：具有优良的血浆稳定性，和较好的减少进食的功能。由于脂质体本身的性质，PYY脂质体在体内部分器官非特异性吸收，实现了靶向治疗的目的。在肥胖医药领域具有较好的应用前景。

Claims

1.一种脂质体，所述脂质体是将半胱氨酸修饰的PYY(3-36)类似物通过二硫键结合到脂质末端的一部分被巯基化的脂质体上而得到的脂质体，相对于包含在全脂中的1mol巯基化脂质，所述PYY类似物的结合量为85％-98％。

2.权利要求1的脂质体，其中所述化合物的结合量相对于全脂为0.5-10mol％。

3.权利要求1或2的脂质体，所述脂质体选自天然卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸等磷脂，以及鞘糖脂、甘油糖脂等糖脂、脂肪酸、两亲性二烷基二甲铵、聚甘油烷基醚、聚氧乙烯烷基醚等。

4.权利要求1-3中任一项的脂质体，其中所述化合物结合在所述脂质体的表面。

5.权利要求1-4中任一项的脂质体，其中所述聚亚烷基二醇为聚乙二醇。

6.权利要求5的脂质体，其中所述化合物为具有2个聚乙二醇基的化合物。

7.权利要求6的脂质体，其中所述聚乙二醇的分子量为2,000-7,000道尔顿。

8.权利要求6的脂质体，其中所述聚乙二醇的分子量为约5,000道尔顿。

9.权利要求1-8中任一项的脂质体，其中所述脂质体的表面进一步结合了抗体。

10.权利要求1-9中任一项的脂质体，所述脂质体可用于制备治疗肥胖的药物。