CN103197083B

CN103197083B - D-二聚体质控品及其制备方法

Info

Publication number: CN103197083B
Application number: CN201310090638.4A
Authority: CN
Inventors: 谢永华
Original assignee: SHANGHAI SUN BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI SUN BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-03-20
Also published as: CN103197083A

Abstract

本发明涉及临床凝血检验项目质量控制领域，具体提供了一种制备D-二聚体质控品的方法。本发明提供的方法是将牛血浆复钙凝固后，加入可降解纤维蛋白的酶使纤维蛋白凝块溶解，用蛋白酶抑制剂终止反应，产生的D-二聚体母液用冻干保护液稀释，冷冻干燥，即得。本发明方法制备的D-二聚体质控品，对检测试剂变化敏感性好，且具有较好的稳定性，满足临床D-二聚体检验的质量控制要求。

Description

D-二聚体质控品及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床凝血检验项目质量控制领域，特别涉及一种采用牛血浆制备D-二聚体质控品的方法。

背景技术

纤维蛋白原是哺乳动物血浆中含量最高的蛋白，在不同的哺乳动物之间具有高度同源性，在动物体内当纤维蛋白原被激活后纤维蛋白凝结块形成，血液凝固。在血液凝固的同时激活了纤维蛋白溶解系统，它是人体最重要的血液抗凝系统：当纤维蛋白凝结，纤溶酶原激活剂激活纤溶酶原转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段，形成纤维蛋白降解产物（FDP），FDP由：X、Y、D-二聚体、中间片段E片段等组成。

D-二聚体是纤维蛋白降解产物中的最小片段，也是交联纤维蛋白的特异性降解产物，是反映凝血及纤溶活化的分子标志物，正常人血浆中D-二聚体含量甚微，但在伴有血栓和微血栓形成的许多疾病中都可导致D-二聚体的增高，所以它目前是反映体内高凝状态和继发纤溶亢进的重要敏感指标之一，也同样适用于监测血栓形成，纤溶增强及溶栓治疗。

随着D-二聚体检验项目不断拓展到疾病诊断和治疗中的各个领域，使用配套的D-二聚体质控品对D-二聚体检验进行室内质量控制也显得尤为重要。目前国内应用的D-二聚体测定室内质控品均为国外进口产品，价格昂贵。也有文献报道用实验检测后剩余血浆来制备D-二聚体质控品，但该方法使用的原料来源为人血浆，不易获得，不适用于商品化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种采用牛血浆制备D-二聚体质控品的方法及获得的D-二聚体质控品。本发明方法制备的D-二聚体质控品，对检测试剂变化敏感性好，且具有较好的稳定性，满足临床D-二聚体检验的质量控制要求。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种制备D-二聚体质控品的方法，取牛血浆与钙离子溶液混合，37℃水浴使血液凝固，再加入可降解纤维蛋白的酶，37℃水浴4～8小时使纤维蛋白凝块溶解，用抑制剂终止反应，获得D-二聚体母液，使用冻干保护液稀释母液，冷冻干燥，获得D-二聚体质控品。

在本发明提供的制备方法中，牛血浆的制备方法为用牛颈静脉采集的血液，将血液按与抗凝剂以体积比为9:1加入抗凝剂，离心30分钟，相对离心力为2000～2500g，小心分离吸取上层血浆，即得；抗凝剂为2～5%柠檬酸三钠。

在本发明提供的制备方法中，钙离子溶液为0.01～0.05mol/L氯化钙溶液，加入量为牛血浆体积的30%～70%。

在本发明提供的制备方法中，可降解纤维蛋白的酶为链激酶、纤溶酶中的任意一种。

作为优选，可降解纤维蛋白的酶为纤溶酶，加入反应体系后纤溶酶的终浓度为100～300U/mL。

作为优选，抑制剂为抑肽酶，加入反应体系后抑肽酶的终浓度为0.1～1.0μg/mL。

在本发明提供的制备方法中，冻干保护液包括3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸（TAPSO）1～3%（w/v）、氯化钠1～5%（w/v）、叠氮钠0.5～3g/L、甘露醇5～20g/L、牛血清白蛋白10～30g/L，抑肽酶10000～100000KIU/L。

本发明还提供了上述方法制备获得的D-二聚体质控品。

本发明采取以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明选用牛血浆为原料制备D-二聚体质控品，原料价格低、来源充足、易于获得，且本发明制备工艺简单，产品生产成本低。

2、本发明方法制备的质控品，对检测试剂变化敏感，且冻干品复溶后稳定性更好，可替代进口产品用于D-二聚体检测的质量控制，保存时间延长，节约使用试剂，降低检测成本，给工作带来方便。

附图说明

图1示本发明实施例1制备的D-二聚体质控品与市售D-二聚体开瓶稳定性检测结果；其中，曲线1示本发明实施例1制备获得的质控品；曲线2示对照组Siemens质控品。

具体实施方式

本发明公开了一种采用牛血浆制备D-二聚体质控品的方法及获得的D-二聚体质控品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的采用牛血浆制备D-二聚体质控品的方法及获得的D-二聚体质控品中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1D-二聚体质控品的制备

1、牛血浆：将从牛颈静脉采集的血液，加入3.8%柠檬酸三钠抗凝剂溶液，血液与抗凝剂的体积比为9:1。将加入抗凝剂的血液离心30分钟，相对离心力为2000g，小心分离吸取上层血浆。

2、冻干保护剂：TAPSO1.3%、氯化钠2%、叠氮钠1.0g/L、甘露醇10g/L、牛血清白蛋白20g/L，抑肽酶80000KIU/L。

3、D-二聚体质控品制备：

（1）将牛血浆分装到玻璃试管中，每管加入血浆量40%的0.025mol/L的氯化钙溶液，37℃水浴15分钟直至血浆凝固。

（2）向血浆中加入纤溶酶溶液使其终浓度为240U/mL，放置于37℃水浴箱6小时，其间每隔一小时用玻璃棒搅动一次，直至纤维蛋白凝块全部溶解。

（3）加入抑肽酶溶液使其终浓度为0.48μg/mL，终止反应，产生D-二聚体母液。

（4）将母液用冻干保护液以1:100比例进行稀释，按0.5ml/瓶分装，冷冻干燥，获得D-二聚体质控品，用胶乳免疫比浊法进行测定，定值为32.1μg/mL。

实施例2D-二聚体质控品对试剂变化灵敏度比较

1、将实施例1中制备的D-二聚体质控品和市售德国Siemens公司的D-二聚体质控品准确复溶重建。

2、使用德国Siemens公司的D-二聚体检测试剂盒进行D-二聚体检测，检测方法为胶乳免疫比浊法。将试剂盒中R₂试剂（免疫胶乳试剂）用蒸馏水进行系列稀释，得到R₂浓度为：100%、80%、60%、40%、20%、10%试剂。

3、在日本东亚CA1500全自动血凝仪上分别用系列稀释的R₂试剂与试剂盒中其它试剂，检测实施例1中制备的D-二聚体质控品和市售德国Siemens公司D-二聚体质控品，检测结果如表1所示。结果显示：检测试剂R₂浓度从100%到10%，本发明D-二聚体质控品检测结果变化范围更大，对试剂变化灵敏度更高，表明本发明质控品在对有缺陷试剂的监测具有更高的敏感度。

表1试剂变异灵敏度检测

实施例3D-二聚体质控品稳定性检测。

1、开瓶稳定性检测

将实施例1中制备的D-二聚体质控品和德国Siemens公司质控品分别准确复溶，在室温（15～25℃）条件下保存，每天定时取样一次检测D-二聚体质控品浓度。采用直线回归法分析质控物的稳定性，检验线性方程的斜率b与0有无显著性差异，如P＜0.05，说明分析物浓度随时间发生变化，如P＞0.05，说明分析物浓度在测定时间内基本稳定。检测结果如表2和图1所示。

表2开瓶稳定性检测结果

本发明质控品回归方程为：y=-0.0182x+31.882，对斜率b与0的显著性差异进行双侧t检验：查表可知α=0.05，ν=9，t_α(ν)=2.262；根据统计学计算，t_b=-0.124，P＞0.05，表明本发明制备的D-二聚体质控品复溶后在室温条件下储存10天基本是稳定的。Siemens质控品回归方程为：y=-0.5155x+32.586，t_b=-2.847，P＜0.05，表明市售质控品在室温条件下开瓶储存10天，D-二聚体浓度出现明显的变化，且由图1可以看出，从第8天开始D-二聚体浓度出现明显下降。

由此可见，本发明制备的D-二聚体与市售产品相比，具有更好的开瓶稳定性，对于医院临床检验科，特别是业务量较小的基层医院，在D-二聚体检测的质控工作中，质控品开瓶后保存更长时间，可以减少试剂浪费，降低检测成本，给工作带来方便。

2、长期稳定性检测

将实施例1中制备的D-二聚体质控品冻干品在+2～+8℃条件下保存，每3个月取出一瓶准确复溶，检测D-二聚体质控品浓度，检测结果如表3所示。

表3长期稳定性检测结果

通过直线回归法分析，本发明质控品回归方程为：y=-0.0288x+31.259，对斜率b与0的显著性差异进行双侧t检验：查表可知α=0.05，ν=10，t_α(ν)=2.228；根据统计学计算，t_b=-1.570，P＞0.05，表明本发明制备的D-二聚体质控品在+2～+8℃条件保存33个月基本稳定，长期稳定性较好，有利于商品化生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种制备D-二聚体质控品的方法，其特征在于，取牛血浆与钙离子溶液混合，37℃水浴使血液凝固，再加入可降解纤维蛋白的酶，37℃水浴4～8小时使纤维蛋白凝块溶解，用抑制剂终止反应，获得D-二聚体母液，使用冻干保护液稀释母液，冷冻干燥，获得D-二聚体质控品；其中，所述冻干保护液包括3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸1～3％(w/v)、氯化钠1～5％(w/v)、叠氮钠0.5～3g/L、甘露醇5～20g/L、牛血清白蛋白10～30g/L，抑肽酶10000～100000KIU/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛血浆的制备方法为用牛颈静脉采集的血液，将血液按与抗凝剂以体积比为9:1加入抗凝剂，离心30分钟，相对离心力为2000～2500g，小心分离吸取上层血浆，即得；所述抗凝剂为2～5％柠檬酸三钠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钙离子溶液为0.01～0.05mol/L氯化钙溶液，加入量为所述牛血浆体积的30％～70％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可降解纤维蛋白的酶为链激酶、纤溶酶中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述可降解纤维蛋白的酶为纤溶酶，加入反应体系后所述纤溶酶的终浓度为100～300U/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制剂为抑肽酶，加入反应体系后所述抑肽酶的终浓度为0.1～1.0μg/mL。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法制备获得的D-二聚体质控品。