CN103194479A - 苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用”属于生物技术领域。本发明通过比较苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）四种不同转录机制的cry基因启动子（Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E）的转录活性，筛选出一个强启动子Pcry8E，构建了一个高效表达载体pHT315-8E21b。利用该载体可以正确表达Cry蛋白，并具有生物学活性，其表达效率高于被广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY422b载体，具有广泛的应用前景。

Description

苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用

该申请为申请号为2012101193981，发明名称为“苏云金芽胞杆菌高效表达载体、构建方法及应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建方法及应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种广泛存在于土壤中的细菌，其可以在生长稳定期形成芽胞，且芽胞内含有晶体，晶体主要组成成份是杀虫晶体蛋白（亦称为δ-内毒素）由cry和cyt基因编码，具有特异的杀虫活性[Sanahuja,G.,R.Banakar,R.M.Twyman,et al.,2011.Bacillus thuringiensis:acentury of research,development and commercial applications.Plant Biotechnol J.9(3):p.283-300]。多种Bt产品被应用于农业害虫和卫生害虫蚊子的防治[Bravo,A.,S.Likitvivatanavong,S.S.Gill,et al.,2011.Bacillusthuringiensis:A story of a successful bioinsecticide.Insect Biochem Mol Biol.41(7):p.423-31]。根据cry基因表达调控的特点可以将其分为两类，芽胞依赖型cry基因如cry1A、cry2A、cry4A、cry4B和cry11A等，和不依赖芽胞形成的cry基因，如cry3A[Ibrahim,M.A.,N.Griko,M.Junker,et al.,2010.Bacillus thuringiensis:agenomics and proteomics perspective.Bioeng Bugs.1(1):p.31-50.Bravo,A.,H.Agaisse,S.Salamitou,et al.,1996.Analysis of cryIAa expression in sigE and sigK mutants of Bacillus thuringiensis.Mol Gen Genet.250(6):p.734-41.Agaisse,H.and D.Lereclus,1994.Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis cryIIIAtoxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spo0A mutant.J Bacteriol.176(15):p.4734-41.]。而不同机制的启动子需要不同的转录因子，如cry1Ac启动子为重叠的双启动子BtⅠ和BtⅡ，二者分别由σ^E和σ^K调控[Sedlak,M.,T.Walter,and A.Aronson,2000.Regulation by overlappingpromoters of the rate of synthesis and deposition into crystalline inclusions of Bacillus thuringiensisdelta-endotoxins.J Bacteriol.182(3):p.734-41]；cry4A为非重叠双启动子p1和p2，在过渡期受到σ^H的调控有较弱表达[Yoshisue,H.,T.Fukada,K.Yoshida,et al.,1993.Transcriptional regulation of Bacillusthuringiensis subsp.israelensis mosquito larvicidal crystal protein gene cryIVA.J Bacteriol.175(9):p.2750-3]；cry8E基因与其上游orf1基因以操纵子形式进行转录，操纵子中的两个启动子受到σ^H和σ^E调控（未发表资料）；cry3A从营养期即开始表达，受到σ^A的调控[Agaisse,H.and D.Lereclus,1994.Expression in Bacillussubtilis of the Bacillus thuringiensis cryIIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factorand is increased in a spo0A mutant.J Bacteriol.176(15):p.4734-41]，而sigK基因功能的丧失有利于cry3A启动子在产胞后期的转录。

cry基因启动子转录机制的不同决定了其相应的转录特点，研究人员根据这些特点构建出表达载体用于实验和生产。目前已报道的Bt表达载体主要有pBMB1A、pEMB0557、pSXY-422b和pSTK-3A。pBMB1A是以低拷贝载体pHT304为基础，cry1Ac启动子指导的穿梭表达载体，可用于快速克隆表达不同类别的Cry蛋白[郑文,叶伟星,彭东海,等.2012.基于cry1Ac表达调控元件的苏云金芽孢杆菌表达载体构建.湖北农业科学,,51(2):400-405]；pEMB0557可以容纳至少70kb的DNA片段，可用于克隆或表达较大的基因或基因簇[Liu,X.,D.Peng,Y.Luo,et al.,2009.Construction of an Escherichia coli to Bacillus thuringiensis shuttlevector for large DNA fragments.Appl Microbiol Biotechnol.82(4):p.765-72];pSXY-422b和pSTK-3A均是以高拷贝载体pHT315为基础，cry3A启动子指导的穿梭表达载体，只有抗性不同，Wang等将携带cry3Aa7基因的pSTK-3A转化到对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株G03中，得到对鞘翅目和鳞翅目害虫都有很高毒力的工程菌G033A[Wang,G.,J.Zhang,F.Song,et al.,2006.Engineered Bacillus thuringiensis GO33A withbroad insecticidal activity against lepidopteran and coleopteran pests.Appl Microbiol Biotechnol.72(5):p.924-30]。Yan等将携带cry3Aa7基因的pSTK-3A转化到对蛴螬高毒力的野生菌株HBF-1中，得到工程菌株3A-HBF，其不仅对蛴螬表现出较高毒力，而且还获得对叶甲科害虫的杀虫活性[Yan,G.,F.Song,C.Shu,et al.,2009.An engineered Bacillus thuringiensis strain with insecticidal activity against Scarabaeidae(Anomalacorpulenta)and Chrysomelidae(Leptinotarsa decemlineata and Colaphellus bowringi).Biotechnol Lett.31(5):p.697-703]。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体的形成是蛋白积累的结果，而利用一个强启动子表达相应基因，可提高蛋白的产量，从而提高单位重量发酵液的活性。因此筛选一个强启动子并构建一个高效表达载体，为今后研制更为高效广谱的苏云金芽胞杆菌工程菌奠定基础，对提高Bt制剂的活性有非常广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是构建一种分析载体，用于比较四种不同转录机制的cry基因启动子（Pcry1A，Pcry3A，Pcry4A和Pcry8E）的活性，筛选出一个强启动子，指导cry基因的表达。

目的之二是应用筛选出的强启动子，构建一个高效表达载体并对其效率进行评估，以用于研制更为高效广谱的苏云金芽胞杆菌工程菌。

一种分析载体，其结构特征为：将报告基因lacZ插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

所述分析载体为pHTlac，其序列如SEQ ID NO所示。

上述分析载体在构建分析转录活性菌株中的用途。

一种表达载体，其结构特征为：将cry8E基因启动子与大肠杆菌表达载体pET-21b的非启动子表达区的重叠片段插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

所述表达载体为pHT315-8E21b，其序列如SEQ IDNO所示。

表达载体pHT315-8E21b的构建方法，包括如下步骤：

(1)获得cry8E基因启动子和pET-21b的非启动子表达区的重叠片段8E-21b，

(2)插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

所述步骤（1）的方法为：以Bt185菌株基因组DNA为模板，用引物对8E-up/8E-down（SEQ ID NO11/12）扩增cry8E基因的启动子序列，大小为1352bp；以大肠杆菌表达载体pET-21b质粒为模板，用引物对21b-up/21b-down（SEQ ID NO13/14）扩增得到无启动子的pET-21b表达区片段，大小为213bp，其中包括多克隆位点；回收两个PCR产物，以此为模板，用引物8E-up和21b-down进行重叠PCR，获得cry8E基因启动子和pET-21b表达区的重叠片段8E-21b，大小为1565bp，所述骨架载体的pHT315经EcoRI/HindIII双酶切。

一种重组表达载体，在上述表达载体的多克隆位点之间插入目的基因。

所述重组表达载体为pHT-8E-1Ac，其序列如SEQ ID NO所示。

一种工程菌HD-8E1Ac菌株，其特征是含有重组表达载体pHT-8E-1Ac。

上述表达载体在表达Cry蛋白中的应用。

所述蛋白为Cry1Ac。

本发明的技术方案如下：

构建四种不同转录机制的cry基因启动子（Pcry1A，Pcry3A，Pcry4A和Pcry8E）与报告基因lacZ融合表达载体，并导入Bt无晶体突变株HD-73-中，通过β-半乳糖苷酶活性测定，比较四种启动子的活性，筛选出具有高转录活性的启动子。

将强启动子与表达载体pET-21b的非启动子表达区重叠，连接到基础穿梭载体pHT315中，获得高效表达载体pHT315-8E21b，并对该载体进行蛋白定量，杀虫活性等效率评估。

以下详述本发明的方案过程：

1大肠杆菌JM110热击感受态的制备

为了获得含有外源基因的大肠杆菌转化子，制备大肠杆菌的热击转化感受态细胞[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.,Cold SpringHarbour,NY)]。采用热击转化的方法转化大肠杆菌受体态细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。

2高拷贝转录活性分析载体pHTlac的构建

以高拷贝载体pHT315为基础载体，将质粒pHT304-18Z中lacZ基因片段经PCR扩增、限制性内切酶消化，连接到pHT315的多克隆位点，获得高拷贝转录活性分析载体pHTlac（图1）。经PCR、酶切及测序鉴定，验证质粒的正确性（图2）。

3Bt电击感受态的制备

为了提高Bt的转化效率，制备Bt的电击转化感受态细胞[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.,Cold Spring Harbour,NY)]，采用电击转化的方法转化Bt受体菌细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。

4Pcry1A，Pcry3A，Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合表达载体构建

分别以含有cry1A、cry3A、cry4A和cry8E基因的Bt菌株总DNA为模板，用相应的特异性引物进行PCR扩增，得到Pcry1A，Pcry3A，Pcry4A和Pcry8E四个启动子片段，用限制性内切酶消化后与pHTlac载体连接，得到的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定，验证质粒的正确性（图4）。将正确的重组质粒导入Bt无晶体突变株HD-73^-，获得菌株HDLPcry1Ac、HDLPcry3A、HDLPcry4A、HDLPcry8E和HDpHTlac。

5四种启动子转录活性比较

将分别含有四种启动子的HDLPcry1Ac、HDLPcry3A、HDLPcry4A和HDLPcry8E菌株接种于SSM培养基[Schaeffer,P.,J.Millet,and J.P.Aubert,1965.Catabolic repression of bacterial sporulation.Proc Natl Acad SciU S A.54(3):p.704-11]，按固定的时间间隔取样，测定样品的β-半乳糖苷酶活性，比较四种启动子的活性，筛选出具有高转录活性的启动子（图5）。

6强启动子指导的高效表达载体的构建

将强启动子与大肠杆菌表达载体pET-21b的非启动子表达区重叠，连接到基础穿梭载体pHT315中，获得高效表达载体pHT315-8E21b（图6），经酶切及测序验证重组质粒的正确性（图7）。

7高效表达载体的效率评估

PCR扩增cry1Ac基因，经限制性内切酶消化后，导入高效表达载体pHT315-8E21b中，得到重组质粒pHT-8E-1Ac，经酶切及测序鉴定正确（图8），导入HD-73^-无晶体突变株，获得HD-8E1Ac菌株；同样方法，将cry1Ac基因导入广泛应用的含有cry3A基因启动子的表达载体pSXY-422b中，得到重组质粒pSXY-422b-1Ac，鉴定正确后，导入HD-73^-无晶体突变株，获得HD-422-1Ac菌株。

晶体形态观察：将HD-8E1Ac菌株接种于SSM培养基，至细胞大部分裂解，用扫描电子显微镜观察晶体形态（图9）。检测高效表达载体pHT315-8E21b可正确表达外源Cry蛋白。

蛋白产量测定：以无晶体突变株HD73^-为对照，利用SSM培养基培养HD-422-1Ac和HD-8E1Ac菌株至细胞完全裂解，采用

660nm protein Assay Kit分别对三者上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量（图10）。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南（第二版）(金冬雁等).北京:科学出版社,1992]。

杀虫活性测定：将HD-422-1Ac和HD-8E1Ac菌株制成粉剂，对粉剂中蛋白进行定量，然后稀释成不同的浓度，分别混入饲料拌匀，测定对小菜蛾（Plutella xylostella）的活性。结果表明，HD-8E-1Ac菌株产生的Cry1Ac蛋白对小菜蛾有活性，LC₅₀为0.05561，约为HD-422-1Ac LC₅₀的五分之一，证明菌株HD-8E1Ac的生物活性比菌株HD-422-1Ac的活性高，所以从生物活性的角度说明pHT315-8E21b载体对Cry蛋白的表达效率高于pSXY-422b。

附图说明

图1：pHTlac载体构建示意图，

图2：pHTlac载体PCR和酶切鉴定，

1：λ/Eco130I Marker，2：Pst I单酶切产物，3：Hind III+Pst I双酶切产物，4：PCR产物，

图3：Pcry1A，Pcry3A，Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合表达载体构建示意图，

图4：重组质粒pHTlacPcry1Ac、pHTlacPcry3A、pHTlacPcry4A和pHTlacLPcry8E酶切和PCR鉴定，

1：λ/Eco130I Marker，2：pHTlacPcry1Ac/Xba I单酶切产物，3：pHTlacPcry1Ac/Kpn I+Xba I双酶切产物，

4：Pcry1Ac PCR产物，5：pHTlacPcry3A/Xba I单酶切产物，6：pHTlacPcry3A/Kpn I+Xba I双酶切产物，

7：Pcry3A PCR产物，8：pHTlacPcry4A/Xba I单酶切产物，9：pHTlacPcry4A/Kpn I+Xba I双酶切产物，

10：Pcry4APCR产物，11：pHTlacLPcry8E/Xba I单酶切产物，12：pHTlacLPcry8E/Kpn I+Xba I双酶切产物，13：LPcry8E PCR产物，14：DL2000Marker，

图5：不同cry基因启动子转录活性比较，

图6：pHT315-8E21b载体构建图谱，

图7：pHT315-8E21b单酶切鉴定，

1：Wide range Marker，2：BamH I单酶切产物，3：Sal I单酶切产物，4：EcoR I单酶切产物，5：Sac I单酶切产物，6：Hind III单酶切产物，7：Xho I单酶切产物，

图8：重组质粒pHT-8E-1Ac双酶切鉴定，

1：1kb DNA Ladder，2：BamH I+Sal I双酶切产物，

图9：菌株HD73^-和HD-8E1Ac的扫描电镜观察结果，

图10：HD-422-1Ac、HD-8E-1Ac菌株Cry1Ac蛋白的SDS-PAGE分析，

1：HD-73^-菌株，2：HD-422-1Ac菌株，3：HD-8E1Ac菌株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下面所用载体和菌株均为市售产品。本申请人的实验室均有保藏，可以对外公开发放。

实施例1 大肠杆菌JM110热击感受态的制备及转化

挑取单菌落于5ml LB液体培养基，37℃震荡培养过夜；按1%接种量接种于100ml LB液体培养基中，37℃，220rpm培养2-2.5hr，（OD₆₀₀=0.5-0.6）；4℃，4000rpm离心10min；弃上清，向沉淀中加入50ml预冷的0.1M CaCl₂悬浮细胞,置于冰上30min；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，分装成200μL/0.5mL离心管中，于4℃保存，一周内用完。将200μL感受态细胞与质粒混匀，冰浴30min，42°C热击1.5min，冰浴3min，加入800μL LB培养基，37°C培养60min，取200μL涂板，37°C培养。

实施例2 高拷贝转录活性分析载体pHTlac的构建

以质粒pHT304-18Z为模板，用引物对LacZ5'/LacZ3'（SEQ ID NO1/2）扩增获得lacZ基因片段（3115bp），经过限制性内切酶HindⅢ和Pst I双酶切后，插入高拷贝载体pHT315中相应位点，获得重组质粒pHTlac（图1），对重组质粒进行PCR和酶切鉴定，结果表明（图2），PCR扩增得到3115bp的特异性条带，用Pst I对载体进行酶切，获得大约9.5kb大小的条带，用Hind III、Pst I对载体进行双酶切鉴定，获得6.5kb和3.0kb的条带，证明重组质粒构建正确。序列见（SEQ ID NO17）。

实施例3 Bt电击感受态的制备

挑取单菌落于5ml LB液体培养基，30℃震荡培养过夜。按1%接种量接种于100ml BH液体培养基中，37℃，220rpm培养3-4hr（OD₆₀₀=3.0）。4℃，4000rpm离心10min。弃上清，加入预冷的超纯水悬浮细胞，4℃，4000rpm离心10min，重复两次，弃上清，向沉淀中加入1ml40%PEG重悬细胞，分装，-70℃保存备用。

实施例4 Pcry1A，Pcry3A，Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合表达载体构建

分别以HD-73菌株总DNA为模板用引物对LP1Ac5'/LP1Ac3'（SEQ ID NO3/4）扩增cry1Ac基因ATG上游382bp的启动子序列；以Bt22菌株总DNA为模板，LP3A5'/LP3A3'（SEQ ID NO5/6）为引物扩增cry3A基因ATG上游570bp的启动子序列；以Bti菌株总DNA为模板，LP4A5'/LP4A3'（SEQID NO7/8）为引物扩增cry4A基因ATG上游826bp的启动子序列；以Bt185菌株总DNA为模板，LPorf15'/LP8E3'（SEQ ID NO9/10）为引物扩增cry8E基因ATG上游1352bp的启动子序列。以上启动子片段分别经限制性内切酶Kpn I和Xba I双酶切后，插入质粒pHTlac的相应位点，转化大肠杆菌JM110菌株,获得重组质粒pHTlacPcry1Ac、pHTlacPcry3A、pHTlacPcry4A和pHTlacLPcry8E，图3为重组质粒构建示意图。四个重组质粒经PCR扩增、双酶切及测序鉴定，证明构建正确（图4）。将鉴定正确的质粒和对照载体pHTlac导入无晶体突变株HD-73^-，分别获得含有不同启动子的菌株HDLPcry1Ac、HDLPcry3A、HDLPcry4A、HDLPcry8E和HDpHTlac。

实施例5 四种启动子转录活性比较

将过夜活化的菌株HDLPcry1Ac、HDLPcry3A、HDLPcry4A和HDLPcry8E接入含有红霉素的SSM培养基中，30℃，220rpm振荡培养，从T₀（菌体对数生长期将要结束即将进入稳定期的时间点）取样至T₁₂（T₀后12小时），每小时取样一次，每次取样2ml，12000×g离心弃上清，沉淀迅速置于-20℃保存。β-半乳糖苷酶活性测定：向沉淀中加入500μL Buffer Z（0.06M Na₂HPO₄·2H₂O，0.04M NaH₂PO₄·H₂O，0.01M KCl，0.001M MgSO₄·7H₂O）和0.2g钢珠,破碎细胞1min；4℃，12000×g离心5min，取20μl上清用于测定蛋白浓度，读取OD595值；取100μl上清与700μl Buffer Z混合，加入200μl ONPG（4mg/ml），混匀，37℃反应，计时直到反应液呈现黄色，加入500μl，1M Na₂CO₃，读取OD420值。根据公式计算Miller Units[Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics.New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,352-355]。每组数据进行三次独立重复试验，取平均值。结果表明（图5），在SSM培养基中，Pcry1A和Pcry4A启动子从T₂开始有活性，Pcry1A从T₂到T₉活性持续升高，Pcry4A在T₈时活性达到最高；Pcry8E和Pcry3A从T₀开始有活性，T₀到T₁之间，Pcry3A活性略高于Pcry8E，T₁后Pcry8E活性开始高于Pcry3A，进入芽胞期后，Pcry8E、Pcry1A与Pcry4A活性均有较大幅度的提高，而Pcry3A变化较为平缓。空载体pHTlac的转录活性很低。以上结果说明启动子转录活性由高到低依次为Pcry8E>Pcry1A>Pcry4A>Pcry3A，证明Pcry8E为一个强启动子。

实施例6 强启动子指导的高效表达载体的构建

通过启动子转录活性分析，发现芽胞期时cry8E基因的启动子活性最强，因此选取该启动子构建穿梭表达载体。以Bt185菌株基因组DNA为模板，用引物对8E-up/8E-down（SEQ ID NO11/12）扩增cry8E基因的启动子序列，大小为1352bp；以大肠杆菌表达载体pET-21b质粒为模板，用引物对21b-up/21b-down（SEQ ID NO13/14）扩增得到无启动子的pET-21b表达区片段，大小为213bp，其中包括多克隆位点；回收上述PCR产物，以此为模板，用引物8E-up和21b-down进行重叠PCR，获得cry8E基因启动子和pET-21b表达区的重叠片段8E-21b，大小为1565bp。8E-21b经SmaI酶切，插入穿梭载体pHT315经EcoRI/HindIII双酶切并补平后的位点，得到重组质粒pHT315-8E21b。该质粒含有cry8E基因启动子、多克隆位点及T7终止子，物理图谱如图6。重组质粒经多种限制性内切酶单酶切及测序鉴定，证明构建正确图7，序列见（SEQ ID NO18）。

实施例7 高效表达载体的效率评估

以HD-73菌株基因组DNA为模板，引物1Ac-up和1Ac-down（SEQ ID NO15/16）配对扩增大小为3537bp的cry1Ac基因，经BamHI和SalI双酶切后，导入pHT315-8E21b的BamHI和SalI位点之间，转化大肠杆菌JM110菌株，得到重组质粒pHT-8E-1Ac，经双酶切及测序鉴定（图8），证明构建正确，序列见（SEQ ID NO19）。将重组质粒导入HD-73^-无晶体突变株，获得菌株HD-8E1Ac。同样方法，将cry1Ac基因导入广泛应用的含有cry3A基因启动子的表达载体pSXY-422b中，得到重组质粒pSXY-422b-1Ac，去甲基化后，导入HD-73-无晶体突变株，获得菌株HD-422-1Ac。

晶体形态观察：将HD-8E1Ac菌株和对照菌株HD-73^-无晶体突变株接种于SSM培养基，至细胞大部分裂解，离心，弃上清，将沉淀重悬于无菌水中；同时将盖玻片粘在载物台上，然后将胞晶混合物涂在盖玻片上，用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金；扫描电子显微镜下观察晶体的形态。结果证明（图9），HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体，而HD-73^-菌株中未观察到菱形晶体的存在，说明pHT315-8E21b载体可以正确表达cry1Ac基因。

蛋白产量测定：以无晶体突变株HD73^-为对照，利用SSM培养基培养HD-422-1Ac和HD-8E1Ac菌株至细胞完全裂解，HD-422-1Ac菌株需24h完全裂解，而HD-8E1Ac需要30h。采用660nm proteinAssay Kit分别对三者上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量（图10）。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南（第二版）(金冬雁等).北京:科学出版社,1992]。由图10可知菌株HD-422-1Ac和HD-8E1Ac均可产生约130KDa的Cry1Ac蛋白，而总蛋白含量一致的情况下，通过Quantity One软件定量得知，HD-8E1Ac菌株所表达的Cry1Ac蛋白约为HD-422-1Ac的4倍，说明pHT315-8E21b载体对Cry蛋白的表达效率明显高于pSXY-422b。

杀虫活性测定：利用SSM培养基培养HD-422-1Ac和HD-8E1Ac菌株至细胞完全裂解，将菌株制成粉剂，对粉剂中蛋白进行定量，然后稀释成不同的浓度，分别混入饲料拌匀，测定对小菜蛾（Plutellaxylostella）的活性。结果表明（表1），HD-8E-1Ac菌株产生的Cry1Ac蛋白对小菜蛾有活性，LC₅₀为0.05561，约为HD-422-1Ac LC₅₀的五分之一，证明菌株HD-8E1Ac的生物活性比菌株HD-422-1Ac的活性高，所以从生物活性的角度说明pHT315-8E21b载体对Cry蛋白的表达效率高于pSXY-422b。

表1菌株HD-422-1Ac和HD-8E1Ac对小菜蛾的毒力测定

Claims (9)

1.一种表达载体，其结构特征为：将cry8E基因启动子与大肠杆菌表达载体pET-21b的非启动子表达区的重叠片段插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

2.根据权利要求1所述表达载体为pHT315-8E21b，其序列如SEQ ID NO18所示。

3.权利要求1或2所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)获得cry8E基因启动子和pET-21b的非启动子表达区的重叠片段8E-21b，

(2)插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。

4.权利要求3所述的构建方法，所述步骤（1）的方法为：以Bt185菌株基因组DNA为模板，用引物对8E-up/8E-down（SEQ ID NO11/12）扩增cry8E基因的启动子序列，大小为1352bp；以大肠杆菌表达载体pET-21b质粒为模板，用引物对21b-up/21b-down（SEQ ID NO13/14）扩增得到无启动子的pET-21b表达区片段，大小为213bp，其中包括多克隆位点；回收两个PCR产物，以此为模板，用引物8E-up和21b-down进行重叠PCR，获得cry8E基因启动子和pET-21b表达区的重叠片段8E-21b，大小为1565bp，所述骨架载体的pHT315经EcoRI/HindIII双酶切，

所述8E-up序列如SEQ ID NO11所示，所述8E-down序列如SEQ ID NO12所示，

所述21b-up序列如SEQ ID NO13所示，所述21b-down序列如SEQ ID NO14所示。

5.一种重组表达载体，在权利要求1或2所述表达载体的多克隆位点之间插入目的基因。

6.根据权利要求5所述重组表达载体为pHT-8E-1Ac，其序列如SEQ ID NO19所示。

7.菌株HD-8E1Ac，其特征是含有权利要求6所述的重组表达载体pHT-8E-1Ac。

8.权利要求5或6所述表达载体在表达Cry蛋白中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述蛋白为Cry1Ac。

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