CN103191120B

CN103191120B - 一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途

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Publication number: CN103191120B
Application number: CN201210593628.8A
Authority: CN
Inventors: 刘强; 龙梓洁; 鲁桂; 郑飞猛; 罗羽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103191120A

Abstract

本发明公开了一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途。该嘧啶衍生物包括具有结构式（I）的嘧啶化合物、其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、前药，或者含有嘧啶化合物的组合物，结构式（I）如下：在本发明中通过在嘧啶环的2,4,6-位，分别进行不同的C-N偶联，引入不同的药效团，形成新的具有Aurora激酶抑制活性的嘧啶衍生物，这种嘧啶衍生物可制备成能够预防和/或治疗和/或辅助治疗癌症的药物。

Description

一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

Aurora激酶是一类在细胞生长周期中具有重要调控作用的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节纺锤体形成、中心体成熟、染色体分化和胞质分裂过程，对维持基因组的稳定性具有关键作用。研究发现，Aurora激酶的过度表达易导致细胞有丝分裂异常，与肿瘤的形成密切相关。Aurora激酶在许多癌细胞（如肺癌、乳腺癌、直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌）中过度表达，抑制Aurora激酶的活性可以导致肿瘤细胞多倍体的聚集、促进细胞凋亡、阻断细胞增殖。以Aurora激酶为靶点进行抗肿瘤药物的研究开发也越来越受到人们的重视。Aurora激酶抑制剂属于靶向抗肿瘤药物，与其它非特异性细胞毒药物相比，将具有更大的优势。

根据氨基酸序列的不同，人类Aurora激酶分为AuroraA、AuroraB和AuroraC三种亚型。这三种亚型具有非常保守的C-端催化区和N-端可变区，即具有高度同源的ATP结合位点（C-端催化区），但在N-末端的氨基酸长度和序列上有较大差异。

其中AuroraA位于复制的中心体和有丝分裂的纺锤体两端，调节中心体的成熟、纺锤体的组装以及有丝分裂的启动过程。AuroraA可以磷酸化细胞周期蛋白B1-Cdk1的调节因子Cdc25b，活化Cdc25b后调节细胞有丝分裂的启动过程。AuroraA还通过参与调节三种中心体蛋白，即中心体蛋白（centrosomin，CNN）、转化酸性卷曲螺旋蛋白（trans-formingacidiccoiled-coilprotein，TACC）和纺锤体缺陷型蛋白（spindledefective-2，SPD-2）来保证有丝分裂过程中中心体的成熟。

自1998年科学家证实肿瘤的发生与Aurora激酶的过度表达有密切关系后，引发了学术界和制药工业界将Aurora激酶作为抗肿瘤药物作用靶点的研究热潮。随着Aurora激酶晶体结构研究的深入和计算机模拟技术的应用，人们发现大多数合成的Aurora激酶抑制剂属于ATP（三磷酸腺苷）竞争性激酶抑制剂，竞争结合激酶的ATP结合位点，切断激酶直接的能量来源，从而抑制其活性。

研究发现，ATP结构中的嘌呤环可结合于Aurora激酶结构的疏水口袋，并与连接区的氨基酸残基形成氢键。ATP结合口袋由以下几个区域组成：激酶铰链区、疏水口袋结合区、磷酸盐沟埋区、溶剂可及区以及核糖部分。

Aurora激酶家族ATP结合位点具有很高的同源性，这使得激酶抑制剂的选择性成为一个很大的挑战。许多报道的Aurora激酶抑制剂仍能体现出良好的选择性，其中一个重要原因是抑制剂除了通过ATP结合位点与激酶相互作用外，还作用于ATP结合口袋附近的区域，包括激酶后部的疏水口袋，所有这些作用区域氨基酸残基的不同共同决定了激酶抑制剂选择性的差异。已报道的激酶抑制剂的基本结构特点是：具有一个平面的杂环体系以竞争结合激酶的ATP口袋并模拟腺嘌呤与激酶的相互作用；抑制剂与激酶铰链区之间还可通过氢键作用形成“供体-受体-供体”作用模式；抑制剂的官能团往往能够进入激酶磷酸盐结合区域或者选择性结合口袋。从结构上看，目前合成的Aurora激酶抑制剂主要为嘧啶环类、吡咯并吡唑类、吲哚类、喹唑啉类、苯并氮□并嘧啶类以及其它结构类化合物。

嘧啶类化合物是最早报道的Aurora激酶抑制剂，美国威泰克斯（Vertex）公司（US7361492B2，WO03092607A2）2003年首次报道了AuroraA激酶与嘧啶化合物N-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-2-苯基喹唑啉-4-胺复合物晶体结构。专利中指出，该复合物吡唑环上的两个N原子与激酶的铰链区形成氢键作用，在激酶的甘氨酸富集区域，激酶与该复合物的苯环之间有π-π相互作用。Vertex公司的研究成果为后续合理设计Aurora激酶抑制剂打下了良好的基础。专利WO03092607A2中化合物结构式如下：

Vertex公司与默克（Merck）公司联合开发了第一个Aurora激酶抑制剂VX-680（又名MK-0457）(WO2004000833A1)。该分子结构呈Y状，中心的嘧啶环位于激酶的疏水区，与激酶氨基酸残基之间有疏水作用；含氨基吡唑的胳膊伸入激酶的铰链区域，吡唑环的氮原子与铰链区氨基酸残基有氢键作用；含苯基的胳膊伸入激酶活性位点口袋中，苯基末端的环丙基与AuroraA激酶的F275残基有疏水作用；哌嗪侧链则由酶的活性区域伸展到酶的溶剂可及区。研究发现，VX-680对AuroraA、B、和C都具有很好的抑制作用，IC₅₀值分别为0.6、18和4.6nM，能够抑制结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、颈部肿瘤、白血病等众多肿瘤细胞的增殖。2006年，VX-680进入了临床II期研究，主要用于治疗顽固的慢性骨髓性白血病和急性淋巴性白血病。研究发现该药物可引起病人的QTc延长风险（QTc为心电图上校正的T波与Q波之间的时间差，QTc延长容易导致心律失常），2007年11月默克终止了VX-680的II期临床试验（ExpertOpin.InvestingDrugs.2009,18,379）。

现有技术中虽然存在一些类似于VX-680的对Aurora激酶具有抑制作用的化合物，但依然需要进一步研究更多具有Aurora激酶抑制作用的化合物，以便于制作出更多适于预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物的需要。

发明内容

本发明目的在于提供一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途，以便将一种具有新结构的嘧啶衍生物制成用于预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。

为此，在本发明的一个方面，提供了一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途，该嘧啶衍生物包括具有结构式（I）的嘧啶化合物、其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、前药，或者含有嘧啶化合物的组合物，结构式（I）如下：

优选地，在上述用途中，合成具有结构式（I）的嘧啶化合物的方法包括以下步骤：将具有结构式（1）的化合物A与1-甲基哌嗪按照摩尔比1：8～12溶解到1,4-二氧六环中，160～200℃，微波反应30～60分钟，反应所得混合物旋干溶剂，即得具有结构式（I）的嘧啶化合物，其中，式（1）中X为卤素。

优选地，在上述用途中，合成具有结构式（I）的嘧啶化合物的方法中旋干溶剂处理后进一步包括用硅胶柱纯化的步骤，用硅胶柱纯化的步骤为用体积比为100：1～60：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂进行洗脱，收集纯化的具有结构式（I）的嘧啶化合物。

优选地，在上述用途中，合成化合物A的方法如下：将具有结构式（2）的化合物B与对硝基苯胺、对甲苯磺酸按照摩尔比1：1～1.2：0.8～1溶于正丁醇中，130～150℃下回流反应12～16h，反应后冷却至室温，加入饱和NaHCO₃溶液调节pH至7～8，使用乙酸乙酯萃取3～5次，有机层用饱和食盐水洗涤3～5次，再用无水Na₂SO₄干燥，旋干溶剂即得化合物A，其中，式（2）中X为卤素。

优选地，在上述用途中，合成化合物A的方法中旋干溶剂处理后进一步包括用甲醇研磨，抽滤后即得化合物A。

优选地，在上述用途中，合成化合物B的方法如下：将2,4,6-三卤代嘧啶和3-氨基-5-甲基吡唑按照摩尔比1：1～2溶于无水乙醇中，加入三乙胺，0℃搅拌反应8～16h，反应停止后，往反应体系中加入水，析出白色固体后抽滤，依次采用冰水和冰甲醇洗涤，干燥后得到化合物B。

优选地，在上述用途中，合成具有结构式（2）的化合物B的方法中2,4,6-三卤代嘧啶为2,4,6-三氯嘧啶。

优选地，在上述用途中，肿瘤为因Aurora激酶的异常表达引起的肿瘤。

优选地，在上述用途中，肿瘤为鼻咽癌、乳腺癌、以及血液肿瘤。

同时，本发明还提供了一种嘧啶衍生物体外抑制肿瘤细胞生长的用途，嘧啶衍生物包括具有结构式（I）的嘧啶化合物、其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、前药，或者含有嘧啶化合物的组合物。

在本发明中通过在嘧啶环的2,4,6-位，分别进行不同的C-N偶联，引入不同的药效团，形成新的具有Aurora激酶抑制活性的嘧啶衍生物，这种嘧啶衍生物可制成能够预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

附图构成本说明书的一部分、用于进一步理解本发明，附图示出了本发明的优选实施例，并与说明书一起用来说明本发明的原理。图中：

图1示出了根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物的核磁共振氢谱谱图；

图2示出了根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物的核磁共振碳谱谱图；

图3a示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞SUM149中AuroraA激酶抑制试验结果图；

图3b示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞BT549中AuroraA激酶抑制试验结果图；

图4a示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对白血病细胞HL-60的药物剂量效应图；

图4b示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞BT549的药物剂量效应图；

图4c示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞MCF-7的药物剂量效应图；

图4d示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对表柔比星耐药的乳腺癌MCF-7细胞（MCF-7-Epi）的药物剂量效应图；

图4e示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞MDA-MB-231的药物剂量效应图；

图4f示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞MDA-MB-453的药物剂量效应图；

图4g示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞MDA-MB-468的药物剂量效应图；

图4h示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞Sk-br-3的药物剂量效应图；

图4i示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞SUM149的药物剂量效应图；

图5a示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对白血病细胞HL-60的周期阻滞结果图；

图5b示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞SUM149的周期阻滞结果图；

图5c示出了不同浓度的根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对乳腺癌细胞BT549的周期阻滞结果图；

图6示出了根据本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）抑制乳腺癌细胞BT549和SUM149克隆形成的结果图；

图7a示出了乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌细胞MCF-7-Epi在表柔比星作用下的细胞生存率对比图；

图7b示出了乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌细胞MCF-7-Epi经流式细胞仪检测CD24-CD44+表达的差异图；

图7c示出了经本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）处理后的乳腺癌细胞MCF-7-Epi中CD24-CD44+表达变化的结果图；以及

图7d示出了本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物处理后的乳腺癌细胞MCF-7-Epi中CD24-CD44+表达变化的统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的实施例中的技术方案进行详细的说明，但如下实施例以及附图仅是用以理解本发明，而不能限制本发明，本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

在本发明的一种实施方式中，提供了一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途，该嘧啶衍生物包括具有结构式（I）的嘧啶化合物、其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、前药，或者含有所述嘧啶化合物的组合物，所述结构式（I）如下：

本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物为N⁴-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)-N²-(4-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺，其化学式为C₁₉H₂₃N₉O₂，相对分子量为409.2g/mol，该化合物是通过在嘧啶环的2,4,6-位，分别进行不同的C-N偶联，引入不同的药效团，形成新的具有Aurora激酶抑制活性的嘧啶衍生物，这种嘧啶衍生物可制成能够预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物。

在本发明的一种实施方式中，提供了一种合成上述具有结构式（I）的嘧啶化合物的方法包括以下步骤：将具有结构式（1）的化合物A与1-甲基哌嗪按照摩尔比1：8～12溶解到1,4-二氧六环中，160～200℃，微波反应30～60分钟，反应所得混合物旋干溶剂，即得所述具有结构式（I）的嘧啶化合物，其中，式（1）中X为卤素。

优选地，合成上述具有结构式（I）的嘧啶化合物的方法中旋干溶剂处理后进一步包括用硅胶柱纯化的步骤，用硅胶柱纯化的步骤为用体积比为100：1～60：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂进行洗脱，收集纯化的所述具有结构式（I）的嘧啶化合物。在该方法中增加了用硅胶柱纯化的步骤，该步骤的增加有利于提高所合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物的纯度，有利于后期制药用途。

在本发明的一种实施方式中，合成所述具有结构式（1）中的化合物A的方法包括将具有结构式（2）的化合物B与对硝基苯胺、对甲苯磺酸按照摩尔比1：1～1.2：0.8～1溶于正丁醇中，130～150℃下回流反应12～16h，反应后冷却至室温，加入饱和NaHCO₃溶液调节pH至7～8，使用乙酸乙酯萃取3～5次，有机层用饱和食盐水洗涤3～5次，再用无水Na₂SO₄干燥，旋干溶剂即得具有结构式（1）的化合物A，其中，式（2）中X为卤素。

优选地，合成具有结构式（1）的化合物A的方法中旋干溶剂处理后进一步包括用甲醇研磨，抽滤后即得所述具有结构式（1）的化合物A。在该方法中增加了甲醇研磨的步骤，该步骤的增加有利于得到纯度较高的化合物A，进而有利于减少后续合成具有结构式（I）的嘧啶化合物时的副产物，进而提高具有结构式（I）的嘧啶化合物的纯度，有利于后期制药用途。

在本发明的一种实施方式中，合成所述具有结构式（2）的化合物B的方法包括将2,4,6-三卤代嘧啶和3-氨基-5-甲基吡唑按照摩尔比1：1～2溶于无水乙醇中，加入三乙胺，0℃搅拌反应8～16h，反应停止后，往反应体系中加入水，析出白色固体后抽滤，依次采用冰水和冰甲醇洗涤，干燥后得到具有结构式（2）的化合物B。其中，2,4,6-三卤代嘧啶优选为2,4,6-三氯嘧啶。

本发明的一种实施方式中肿瘤为因Aurora激酶的过度引起的肿瘤。优选为鼻咽癌、乳腺癌、以及血液肿瘤。

同时，在本发明的一种实施方式中，提供了一种嘧啶衍生物体外抑制肿瘤细胞生长的用途，该嘧啶衍生物包括具有上述结构式（I）的嘧啶化合物、其药学上可以接受的盐、溶剂化物、多晶型物、互变异构体、前药，或者含有所述嘧啶化合物的组合物。

下面将详细描述本发明的示例性实施方案。然而，这些实施方案仅为说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

如本文所使用的，如果为提供具体的限定，本发明的术语具有下述含义。

“卤素”包括氟，氯，溴和碘。

“治疗有效量”指的是在给予需要这样的治疗的哺乳动物时，足以有效治疗的通式化合物的量。治疗有效量将依赖于所用的治疗药剂的特定活性、患者的年龄、生理状况、其它疾病状态的存在、和营养状况而变化。此外，患者可能正接受的其它药物治疗将影响要给予的治疗药剂的治疗有效量的确定。

本发明的化合物还包括所有同位素的原子，无论是在中间体或最后的化合物。同位素的原子包括具有相同的原子数，但不同质量数。例如，氢的同位素包括氚和氘。

本发明的化合物还包括药学上可接受的盐。药学上可接受的盐是指把母体化合物中的碱性基团转换成盐的形式。药学上可接受的盐包括，但不仅限于，碱性基团例如胺（氨）基的无机或有机酸盐类。本发明药学上可接受的盐可以由母体化合物合成，即母体化合物中的碱性基团与1-4当量的酸在一个溶剂系统中反应。合适的盐列举在Remington’sPharmaceuticalSciences,17thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,1985,p.1418和JournalofPharmaceuticalScience,66,2(1977)中。

药学上可接受的酸加成盐可以由无机和有机酸制备。由衍生酸加成盐的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。由衍生酸加成盐的有机酸包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苯磺酸等。衍生酸加成盐的无机酸和有机酸尤其选自盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、高氯酸、氢溴酸、乙酸、苯甲酸、和对甲苯磺酸。

如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌药剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药学活性物质在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，其在治疗组合物中的应用是可预期的。补充的活性成分也可以并入组合物中。

该组合物优选被配制成单位剂型。术语“单位剂型”指的是适于用作给予人类受试者和其他哺乳动物的单一剂量的物理离散单位，每一单位含有计算出用以产生所需要的治疗有效的活性物质的预定的量以及相关的合适的药用赋形剂（如片剂、胶囊、安瓿）。通式（I）的化合物在广泛的剂量范围内是有效的并且通常给予有效药物量。优选地，对于口服给药，每个剂量单位包含10mg至2g的通式（I）化合物，更优选为10至700mg，而对于肠胃外给药，优选为10至700mg的通式（I）化合物，更优选约50至200mg。然而，应当明了，实际给予的通式（I）化合物的量将由医师根据有关的情况来确定，包括要治疗的病症，选择的给药途径，给予的实际化合物以及其相对活性，各个患者的年龄、体重、以及反应，患者症状的严重性等。

为了制备固体组合物如片剂，将主要的活性组分与药物赋形剂（或载体）进行混合以形成固体预配制组合物，其包含本发明的化合物的均匀混合物。当称这些预配制组合物为均匀的时候，它是指活性组分被均匀分散在整个组合物中，以致组合物可以容易地被细分成相同有效的单位剂型如片剂、丸剂以及胶囊剂。

本发明的片剂或丸剂可以被涂布或用其它方式被复合以提供一种具有延长作用优点的剂型，或保护片剂或丸剂免受胃中酸性条件的作用。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量成分，后者具有在前者之上的外皮的形式。可以用肠溶层来分隔两种成分，其中肠溶层用来阻止在胃中的崩解以及允许内成分完整进入十二指肠或被延迟释放。各种材料可以用于这样的肠溶层或涂层，上述材料包括许多高分子酸以及高分子酸与这样的材料如虫胶、十六烷醇、以及醋酸纤维素的混合物。

用于吸入法或吹入法的组合物包括在药学上可接受的含水溶剂或有机溶剂、或其混合物中的溶液和悬浮液，以及散剂。液体或固体组合物可以包含如上文所述的适宜的药用赋形剂。优选地，通过口服或鼻呼吸途径给予这些组合物以获得局部或全身效应。可以通过使用惰性气体来雾化在优选的药学可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置吸入雾化溶液，或雾化装置可以连接于面罩帐状物、或间歇正压呼吸机。可以由以适当方式递送剂型的装置，优选口服或鼻途径，给予溶液、混悬剂、或散剂组合物。

本发明的化合物和药学上可接受的盐还包括溶剂化物或水合物的形式。一般来说，溶剂化物或水合物的形式与非溶剂化的或非水合的形式等同，并涵盖在本发明的范围内。本发明中的某些化合物有可能存在多晶体或无定形的形式。总的来说，所有的物理形式具有同等的用途，并且涵盖在本发明的范围内。

本发明还包括所述化合物的前药。前药是一个药理物质(药物)，由母体药物衍生而来。一旦进入体内，前药就被代谢转变成母体药物。前药可通过对母体药物的一个或多个官能团进行取代而制备，其取代基团在体内将被降解而释放出母体化合物来。前药的制备和使用可以在T.HiguchiandV.Stella,“Pro-drugsasNovelDeliverySystems,”Vol.14oftheA.C.S.SymposiumSeries,和BioreversibleCarriersinDrugDesign,ed.EdwardB.Roche,AmericanPharmaceuticalAssociationandPergamonPress,1987中找到。

本发明还提供包括通式（I）化合物或其药学可接受的盐或其前药以及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物可口服，针剂注射，喷雾吸入，皮外用，直肠用，鼻腔用，阴道用，腹腔用，或通过植入储液囊或透皮贴剂等途径而使用。

以下将结合具体的实施例进一步证明本发明的有益效果。

实施例1

合成化合物B：

称取2,4,6-三氯嘧啶（1.83g,10mmol），3-氨基-5-甲基吡唑（0.97g,10mmol）溶于100mL无水乙醇中，加入1.4mL三乙胺，0℃下搅拌反应12h。停止反应后，往反应溶液中加入150mL水，立即析出大量的白色固体，抽滤，并依次用50mL冰水和20mL冰甲醇洗涤，干燥后得到白色固体B（1.82g,75%）。

产物分析：所得到的白色固体B的核磁数据为¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：12.21(s,1H),10.63(s,1H),7.74and6.76(m,1H),6.38,5.78(m,1H),2.21(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ：161.1,159.7,158.4,147.1,139.0,102.6,95.2,10.4ppm。由此可见所得到的白色固体B具有结构式（2）中结构。

合成化合物A：

称取化合物B（244mg,1.0mmol），对硝基苯胺（166mg,1.2mmol），一水合对甲苯磺酸（152mg,0.8mmol），溶于10mL正丁醇中，140℃下回流反应12h。冷却至室温后加入2.5mL饱和NaHCO₃溶液，中和至pH=7-8，使用二氯甲烷萃取（20mL×3），有机层用无水Na₂SO₄干燥后，旋干溶剂，用甲醇研磨，抽滤得黄色固体A（130mg,36.8%）。

产物分析：所得到的黄色固体A的核磁数据为¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：11.86(s,1H),10.26(s,2H),8.16(d,2H),8.04(s,2H),6.26(s,2H),2.22(t,3H)。由此可见所得到的黄色固体A具有结构式（2）中结构。

合成具有结构式（I）的嘧啶化合物：

称取化合物A（100mg,0.29mmol），1-甲基哌嗪（0.32mL,2.9mmol）溶于2mL的1,4-二氧六环中，180℃下微波反应45分钟，旋干溶剂，使用硅胶柱纯化（CH₂Cl₂:MeOH=100:1-60:1），得到黄色固体（57mg,48%）。

产物分析：所得到的黄色固体的核磁数据为¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ：11.88(s,1H),9.55(s,1H),9.04(s,1H),8.11(s,2H),8.04(s,2H),6.24(s,1H),6.07(s,1H),3.50(s,4H),2.39(s,4H),2.21(s,6H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ：163.2,160.5,157.9,148.2,139.4,124.8,117.2,95.0,78.2,54.1,45.6,43.7,10.7ppm.所得到的黄色固体高分辨质谱数据为HRMS(ESI-TOF):m/zcalcdforC₁₉H₂₃N₉O₂,[M+H]⁺:410.2047,found:410.2050。由此可见所得到具有结构式（Ⅰ）的嘧啶化合物。

实施例2

合成化合物B：

称取2,4,6-三氯嘧啶（1.83g,10mmol），3-氨基-5-甲基吡唑（1.94g,20mmol）溶于100mL无水乙醇中，加入1.4mL三乙胺，0℃下搅拌反应16h。停止反应后，往反应溶液中加入150mL水，立即析出大量的白色固体，抽滤，并依次用50mL冰水和20mL冰甲醇洗涤，干燥后得到白色固体B（1.82g,70%）。

合成化合物A：

称取化合物B（244mg,1.0mmol），对硝基苯胺（138mg,1mmol），一水合对甲苯磺酸（190mg,1mmol），溶于10mL正丁醇中，150℃下回流反应10h。冷却至室温后加入2.5mL饱和NaHCO₃溶液，中和至pH=7-8，使用二氯甲烷萃取（20mL×3），有机层用无水Na₂SO₄干燥后，旋干溶剂，用甲醇研磨，抽滤得黄色固体A（117mg,33%）。

合成具有结构式（I）的嘧啶化合物

称取化合物A（100mg,0.29mmol），1-甲基哌嗪（0.348mL,3.48mmol）溶于2mL的1,4-二氧六环中，160℃下微波反应60分钟，旋干溶剂，使用硅胶柱纯化（CH₂Cl₂：MeOH=100：1-60：1），得到黄色固体（53mg,45%）。该黄色固体经核磁检测分析为具有结构式（I）的嘧啶化合物。

通过实施例1和实施例2中方法都能够得到本申请具有结构式（I）的嘧啶化合物，其中采用实施例1中方法所获得的具有结构式（I）的嘧啶化合物的产率更高些。

一、实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对细胞中Aurora-A激酶的抑制活性实验。

实验客体：乳腺癌细胞SUM149和BT549。

实验方法：将实施例合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物溶于DMSO（100mM）作为存储液，实验时用PBS进行稀释，加于培养液中。采用不同浓度的具有结构式（I）的嘧啶化合物溶液对乳腺癌细胞进行处理，48小时后收集细胞裂解物，采用Westernblot法检测细胞裂解物中磷酸化Aurora-A的表达（T288），以GAPDH作为内参，结果如图3a和图3b所示。

实验结果：在乳腺癌细胞SUM149和BT549中，具有结构式（I）的嘧啶化合物能剂量依赖性的降低Aurora-A激酶活性（T288位点），表明该抑制剂的靶向特异性。

图3a为具有结构式（I）的嘧啶化合物对乳腺癌细胞SUM149中磷酸化Aurora-A的抑制作用图。由图3a可知具有结构式（I）的嘧啶化合物可抑制乳腺癌细胞SUM149中AuroraA激酶的活性。

如图3b为具有结构式（I）的嘧啶化合物对乳腺癌细胞BT549中Aurora-A的抑制作用图。由图3b可知具有结构式（I）的嘧啶化合物可抑制乳腺癌细胞BT549中AuroraA激酶的活性。

二、实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对细胞中抑制肿瘤细胞的生长实验。

实验客体：白血病细胞HL-60，乳腺癌细胞BT549、MCF-7、及表柔比星耐药的MCF-7（MCF-7-Epi）、MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、Sk-br-3及SUM149。

实验方法：将白血病细胞HL-60及各乳腺癌细胞及表柔比星耐药的MCF-7-EPi分别培养于96孔板中，分别采用不同浓度的实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物处理各肿瘤细胞24或48小时后加入MTT，37°C培养4小时，用490nm检测OD值，结果如图4a至4i所示，各图中横坐标为化合物的浓度，纵坐标为细胞相对生存率。

实验结果：

如图4a所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM）对HL-60细胞的生长具有剂量及时间依赖性的抑制作用；

如图4b所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对BT549细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4c所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对MCF-7细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4d所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对MCF-7-Epi细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4e所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对MDA-MB-231细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4f所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对MDA-MB-453细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4g所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对MDA-MB-468细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4h所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对Sk-br-3细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用；

如图4i所示，具有结构式（I）的嘧啶化合物（浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM）对SUM149细胞的生长具有剂量依赖性的抑制作用。

三、实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对细胞周期阻滞作用实验。

实验客体：白血病细胞HL-60，乳腺癌细胞BT549及SUM149。

试验方法：分别取浓度为0、0.1、0.5和5μM的具有结构式（I）的嘧啶化合物对白血病细胞HL-60进行处理，24小时后收集细胞，或浓度为0、0.3125、0.625、1.25、2.5和5μM的具有结构式（I）的嘧啶化合物对乳腺癌细胞BT549及SUM149进行处理，48小时后收集细胞，70%乙醇固定后用50μg/mlPI染色，采用流式细胞仪进行细胞周期及凋亡（sub-G1）检测，检测结果如图5a、5b、5c所示。

实验结果：

如图5a、5b、5c所示，在白血病细胞HL-60及乳腺癌细胞SUM149、BT549中，所合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物在所示浓度范围内均能明显引起G2/M细胞周期阻滞，并出现多倍体现象，表明具有结构式（I）的嘧啶化合物通过抑制Aurora-A进而对细胞周期产生影响。

如图5a、5b、5c所示，在白血病细胞HL-60及乳腺癌细胞SUM149、BT549中，所合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物在所示浓度范围内可促进细胞凋亡，表现为Sub-G1峰比例的增加。该化合物在浓度5μM时均能在上述细胞中引起明显的凋亡现象。

四、实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）对细胞中抑制肿瘤细胞的克隆形成的实验。

实验客体：乳腺癌细胞BT549及SUM149。

试验方法：将各乳腺癌细胞BT549及SUM149以103/孔的密度培养于6孔板，细胞贴壁后分别以浓度为0μM、0.625μM、1.25μM的实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物处理各肿瘤细胞，6天后用结晶紫染色观察克隆的个数，观测结果如图6所示。

实验结果：如图6所示，在乳腺癌细胞SUM149及BT549中，不同浓度的具有结构式（Ⅰ）的嘧啶化合物能剂量依赖的抑制肿瘤细胞的克隆形成能力，结果进一步表明该化合物具有抑制肿瘤生长的作用。

五、实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物（AKI603）处理后的细胞的流式细胞仪检测CD24-CD44+表达的变化。

实验客体：乳腺癌细胞MCF-7及MCF-7-Epi。

试验方法：

以浓度为0μM、0.049μM、0.097μM、0.195μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的表柔比星对各乳腺癌细胞进行处理，48小时后加入MTT，37°C培养4小时，用490nm检测OD值，测试结果如图7a所示；

收集各乳腺癌细胞，用CD24及CD44抗体染色，采用流式细胞仪检测的CD24-CD44+表达的变化，测试结果如图7b所示；

采用浓度为0.625μM的实施例1合成的具有结构式（I）的嘧啶化合物处理乳腺癌细胞MCF-7-EPi，分别0天、6天及9天收集细胞，用CD24及CD44抗体染色，采用流式细胞仪检测的CD24-CD44+表达的变化，测试结果如图7c所示；该经本发明具有结构式（I）的嘧啶化合物处理后的乳腺癌细胞MCF-7-Epi的CD24-CD44+表达变化的统计结果如图7d所示，7d中L1为对比统计线，L2为具有结构式（I）的嘧啶化合物统计线。

实验结果：如7a所示，乳腺癌细胞MCF-7-Epi表现为明显的表柔比星耐药，如图7b所示，CD24-CD44+乳腺癌干细胞比例明显上升。如图7c和7d采用具有结构式（I）的嘧啶化合物作用以后，分别在0天、6天及9天观察乳腺癌干细胞的比例，结果发现具有结构式（I）的嘧啶化合物明显抑制CD24-CD44+乳腺癌干细胞的比例，说明该化合物既能靶向杀伤肿瘤细胞，也能靶向杀伤肿瘤干细胞，比传统的化疗药物具有优越性。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种嘧啶衍生物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途，其特征在于，所述嘧啶衍生物为具有结构式(I)的嘧啶化合物或其药学上可以接受的盐，

所述结构式(I)如下：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，合成所述具有结构式(I)的嘧啶化合物的方法包括以下步骤：

将具有结构式(1)的化合物A与1-甲基哌嗪按照摩尔比1：8～12溶解到1,4-二氧六环中，160～200℃，微波反应30～60分钟，反应所得混合物旋干溶剂，即得所述具有结构式(I)的嘧啶化合物，

其中，式(1)中X为卤素。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，合成所述具有结构式(I)的嘧啶化合物的方法中旋干溶剂处理后进一步包括用硅胶柱纯化的步骤，用硅胶柱纯化的步骤为用体积比为100：1～60：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂进行洗脱，收集纯化的所述具有结构式(I)的嘧啶化合物。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，合成所述化合物A的方法如下：

将具有结构式(2)的化合物B与对硝基苯胺，对甲苯磺酸按照摩尔比1：1～1.2：0.8～1溶于正丁醇中，130～150℃下回流反应12～16h，反应后冷却至室温，加入饱和NaHCO₃溶液调节pH至7～8，使用乙酸乙酯萃取3～5次，有机层用饱和食盐水洗涤3～5次，再用无水Na₂SO₄干燥，旋干溶剂即得化合物A，

其中，式(2)中X为卤素。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，合成所述化合物A的方法中旋干溶剂处理后进一步包括用甲醇研磨，抽滤后即得所述化合物A。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，合成所述化合物B的方法如下：

将2,4,6-三卤代嘧啶和3-氨基-5-甲基吡唑按照摩尔比1：1～2溶于无水乙醇中，加入三乙胺，0℃搅拌反应8～16h，反应停止后，往反应体系中加入水，析出白色固体后抽滤，依次采用冰水和冰甲醇洗涤，干燥后得到所述化合物B。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，合成所述具有结构式(2)的化合物B的方法中所述2,4,6-三卤代嘧啶为2,4,6-三氯嘧啶。

8.根据权利要求1至7中任一项中所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为因Aurora激酶的异常表达引起的肿瘤。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为鼻咽癌、乳腺癌、以及血液肿瘤。

10.一种嘧啶衍生物体外抑制肿瘤细胞生长的用途，其特征在于，所述嘧啶衍生物为具有结构式(I)的嘧啶化合物或其药学上可以接受的盐，

所述结构式(I)如下：