CN103183732B

CN103183732B - 一种棉花Gh FPF1蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103183732B
Application number: CN201310136123.3A
Authority: CN
Inventors: 喻树迅; 王小艳; 范术丽; 宋美珍; 庞朝友; 魏恒玲
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2033-04-18
Also published as: CN103183732A

Abstract

本发明公开了一种棉花Gh FPF1蛋白及其编码基因与应用。该蛋白Gh FPF1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光合效率相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因可用来培育生育期短的棉花，为转基因植物的培育奠定了基础。

Description

一种棉花Gh FPF1蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种棉花蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

短季棉的推广是解决我国粮棉争地、保证粮食安全的重要途径。早熟型是棉花品种的重要性状之一，而花期是衡量棉花熟性的重要指标之一。

花是植物的次生器官，高等植物的地上部分来自茎端分生组织(shoot apical meristem，SAM)，即位于茎顶端的一群未分化的小细胞，茎端分生组织进而发育成茎、叶、花序分生组织及花分生组织。开花决定过程是植物生殖生长启动的第一个阶段，是花发端和花器官形成的基础，所以开花决定过程直接控制作物生育期的早晚。因此克隆棉花开花相关基因，对其进行表达分析和转基因功能验证，为短季棉育种提供优质的基因资源。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白，名称为Gh FPF1，来源于棉花(Gossypium spp)。

本发明所述蛋白是如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中SEQ ID №.2所示的氨基酸序列由109个氨基酸残基组成。

上述1)和2)中的Gh FPF1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述1)和2)中的Gh FPF1蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №.1的第8-334位核苷酸所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。

编码所述Gh FPF1蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

本发明的又一个目的是提供所述蛋白的编码基因。

所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1第8-334位的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95％以上；再具体的为96％以上；再具体的为97％以上；再具体的为98％以上；再具体的为99％以上。

上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由401个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第8-334位核苷酸，编码序列表中SEQ ID №：2所示的蛋白质，即本发明所述的Gh FPF1蛋白。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)-3)至少一种中的应用：

1)调节植物生育期；

2)调节植物开花时间；

3)调节植物莲座叶数量；

4)调节植物茎生叶数量。

所述调节植物生育期为使植物的生育期提前；

所述调节植物开花为促进植物开花；

所述调节植物莲座叶数量为减少植物莲座叶数量；

所述调节植物茎生叶数量为减少植物茎生叶数量；

所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

本发明的还一个目的是提供本发明所述的蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在培育在培育转基因植物中的应用。

具体的，所述转基因植物具有如下至少一种性状：1)生育期提前；2)开花时间提前；3)莲座叶数量减少；4)茎生叶数量减少。

具体的所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

本发明再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将本发明所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物。

所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状：1)生育期提前；2)开花时间提前；3)莲座叶数量减少；4)茎生叶数量减少。

具体的，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花。

本研究从陆地棉中克隆出棉花Gh FPF1基因，成功构建植物过表达载体，采用农杆菌介导的花序浸染法转化模式植物拟南芥，与对照相比，转基因拟南芥比非转基因拟南芥提前开花5.1天，同时莲座叶与茎生叶的总数比野生型拟南芥少2.7片，因此利用该基因可用来培育生育期短的棉花，为转基因植物的培育奠定了基础。

附图说明

图1为转Gh FPF1基因拟南芥在DNA分子水平上的鉴定图，其中编号1为空白对照、2为野生型拟南芥、3为阳性对照(重组质粒)、4-10分别为转基因拟南芥各个株系。

图2为T₃代转Gh FPF1基因拟南芥在RNA分子水平上的鉴定图，WT为野生型拟南芥对照，COL3、COL7、COL4分别为转基因拟南芥各个株系。

图3为野生型和转Gh FPF1基因T₃代拟南芥生长3周时的表型对比图，其中A代表野生型拟南芥，B代表转基因拟南芥。

图4为野生型和转Gh FPF1基因T₃代拟南芥生长4周时的表型对比图，其中A代表野生型拟南芥，B代表转基因拟南芥。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、棉花基因Gh FPF1的制备

1、RNA的提取

取中棉所36种子(购自中国农业科学院棉花研究所)浸泡一天后种于小花盆中，置于光照培养室中生长一周后，取整个幼苗置于液氮中速冻后存放于-70°冰箱中。提取上述材料的RNA。

2、cDNA的制备

将步骤1制备得到的RNA反转录为cDNA。

3、基因的扩增

引物序列为：

上游引物P1 5’-AGAGAAAATGAGCGGTCCTTG-3’

下游引物P2 5’-GCCCGAACATGGTGATTAAG-3’

以上述设计的引物和步骤2所制备得到的中棉所36cDNA为模板，进行PCR扩增。

将PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，上述PCR扩增得到具有序列表中SEQ ID№：1的核苷酸序列，共401bp，其中编码区长327bp，该编码区序列如序列表中SEQID №：1中第8-334位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸序列，共109个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID №：1中第8-334位的核苷酸序列的片段命名为Gh FPF1。

实施例2、棉花基因Gh FPF1的功能验证

(一)、表达载体的构建

(1)带有特定酶切位点的目的基因片段的获得

上游引物：5’-CTAGTCTAGAATGAGCGGTCCTTGGTGTTT-3’含酶切位点XbaI(T/CTAGA)

下游引物：5’-TCCCCCGGGCATCATTTATCCATAACCATGAAC-3’含酶切位点SmaI(CCC/GGG)

以上述设计的含有酶切位点的引物，以中棉所36的幼苗的cDNA为模板，进行PCR扩增。将扩增获得的带有酶切位点的目的片段连接至pGEM-T Easy克隆载体，转化DH5α感受态细胞，通过PCR及酶切验证和序列测定筛选出序列正确的重组载体。

(2)pBI121-Gh FPF1植物表达载体的构建

将步骤(1)制备的重组载体和pBI121质粒分别用SmaI和XbaI双酶切，电泳回收目的基因片段和pBI121载体的大片段产物；将目的基因片段和pBI121的酶切大片段产物用T4连接酶连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜；挑取单克隆摇菌，测序验证序列的正确性。所得质粒中插入的外源基因的序列为SEQ ID №：1第8-337位核苷酸，将该质粒命名为pBI121-Gh FPF1。

(二)、转Gh FPF1基因拟南芥的获得

1、重组农杆菌的获得

将质粒pBI121-Gh FPF1转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到重组菌。提取重组菌的质粒送去测序，将测序正确的含有质粒pBI121-Gh FPF1的重组菌命名为LBA4404/pBI121-Gh FPF1。

2、采用花序浸染法转化拟南芥

(1)将-20℃保存的重组农杆菌菌液20μl接种到1ml LB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜活化，取活化菌液200μl加入到20ml LB液体培养基28℃、180rpm振荡培养

(2)待菌液OD值约为1.2时，3000转/每分离心菌液收集菌体

(3)转化介质配方为：1/2MS(大量元素减半，其他不变)、5％蔗糖，0.01μg/ml苄氨基嘌呤(BAP)，0.03％silwetL-77，20mg/L乙酰丁香酮，KOH调pH值至5.7(Steven et al.1998)。

(4)用上述转化介质悬浮菌体，调OD至0.8开始浸染

(5)将拟南芥花序置于转化介质中30-50s，浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养一天后置于正常条件下培养。

3、转Gh FPF1基因拟南芥植株的鉴定

(1)转Gh FPF1基因拟南芥植株中Gh FPF1基因的检测

将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上(琼脂浓度0.6％)，后进行4℃春化3天，转移到培养室中培养10天左右，二阴性植株叶片变黄，不再生长，将生长正常的植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后，检测植株中是否转入棉花基因GhFPF1。待测植株中Gh FPF1基因的制备方法与实施例1相同，以ddH₂O为空白对照，非转基因拟南芥DNA为阴性对照，重组子质粒为阳性对照，PCR扩增时所用引物序列为：

上游引物：5’-GATGTGATATCTCCACTGACGT-3’

下游引物：5’-TCCCCCGGGCATCATTTATCCATAACCATGAAC-3’

其中，上游引物与表达载体相匹配，下游引物与基因相匹配。

将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测结果见图1，上述选取的生长正常的植株和阳性对照组中均可以检测到约450bp的条带(基因序列加上表达载体上的一小段序列共约450bp)，而空白对照和野生型拟南芥阴性对照组中均未检测到相应的DNA分子片段，说明Gh FPF1基因已整合到上述拟南芥基因组中。

(2)qRT-PCR检测

收获步骤(1)筛选出的7株阳性株的T₀代种子，将种子繁殖至T₃代，将T₃代种子和野生型拟南芥种子同等条件下种植，两周分别整株取样至-70℃保存。随机选取三个转基因株系COL3、COL4、COL7进行qRT-PCR检测。按照实施例1的方法分别提取转基因和野生型拟南芥RNA，并反转录为cDNA，以该cDNA为模板、以拟南芥基因UBQ5为内参，，进行qRT-PCR检测，扩增Gh FPF1基因和UBQ5内参基因使用的引物序列为：

Gh FPF1上游引物：5’-AAACTCAGGTTCGGACCAAAGG-3’

下游引物：5’-CCGTCGTATCTTTCCCAACCAA-3’

UBQ5上游引物：5’-TAACCCTTGAGGTTGAATCATC-3’

下游引物：5’-GTCGATTCCTTCTGGATGTTGT-3’

qRT-PCR检测结果见图2，结果表明，Gh FPF1基因在不同的转基因T₃代植株中均有不同(高)水平的转录，但在野生型拟南芥中没有检测到Gh FPF1基因的转录产物。qRT-PCR检测结果进一步证明了Gh FPF1基因已整合到转基因T3代拟南芥的基因组中并且成功转录为mRNA。

(三)、转Gh FPF1基因拟南芥植株的表型

1、将转基因T₃代拟南芥与野生型拟南芥同等条件下种植栽培，分别观察生长3周和4周时的表型，结果见图3、4。从图3可以看出，转基因拟南芥抽薹早于野生型拟南芥；从图4可以看出，转基因拟南芥的开花时间早于野生型拟南芥。该实验结果表明，转基因拟南芥的生育期比非转基因拟南芥明显提前。

2、选取7个转基因T3代株系与野生型和转空载体拟南芥同等条件下种植栽培，每个株系30棵，统计开花时间，并将莲座叶与茎生叶一并进行计数，结果见表1。表1中，WT为野生型拟南芥，COL1-COL7为选取的7个T3代转基因拟南芥株系。

表1

结果显示，转基因拟南芥比野生型拟南芥提前开花5.1天，莲座叶与茎生叶的总数比野生型拟南芥少2.7片；转基因拟南芥比转空载体拟南芥提前开花5.0天，莲座叶与茎生叶的总数比转空载体拟南芥少2.6片。表1的统计结果进一步说明棉花Gh FPF1基因在拟南芥中具有调控生育期的作用，具体体现为开花时间早、莲座叶和茎生叶数量减少。

Claims

1.一种蛋白，其由如序列表中的SEQ ID №.2所示的氨基酸序列组成。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID №：1第8-334位所示。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述的编码基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求2或3所述的编码基因的宿主菌。

9.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的转基因细胞系或权利要求8所述的宿主菌在如下1)-3)至少一种中的应用：

1)使拟南芥开花时间提前；

2)使拟南芥莲座叶数量减少；

3)使拟南芥茎生叶数量减少。

10.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的转基因细胞系或权利要求8所述的宿主菌在培育转基因拟南芥中的应用；所述转基因拟南芥具有如下至少一种性状：1)开花时间提前；2)莲座叶数量减少；3)茎生叶数量减少。

11.一种培育转基因拟南芥的方法，是将权利要求2-3任一所述的编码基因导入目的拟南芥，得到转基因拟南芥；所述转基因拟南芥与所述目的拟南芥相比，具有如下至少一种性状：1)开花时间提前；2)莲座叶数量减少；3)茎生叶数量减少。