CN103180297A

CN103180297A - 使用gdnf家族配体(gfl)模拟剂或ret信号传导通路活化剂促进神经细胞存活的方法

Info

Publication number: CN103180297A
Application number: CN2010800637467A
Authority: CN
Inventors: M.萨尔玛; M.卡雷尔森; M.贝斯帕罗夫; M.皮尔夫
Original assignee: GeneCode AS
Current assignee: GeneCode AS
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2013-06-26
Also published as: CN104529945A; US8901129B2; BR112012014022A2; EP2509953B1; JP2013513588A; MX2012006580A; WO2011070177A3; US20130030180A1; AU2010329847A1; EP2509953A2; CA2783934A1; WO2011070177A2

Abstract

本发明涉及治疗神经和其它病症的化合物和方法，其通过给予有此需要的受试者有效量的具有GFRα受体分子的结合和/或调节特异性的化合物，所述化合物可为胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)家族配体(GFL)的模拟剂、GFRα/RET信号传导通路的激动剂，和/或直接的RET激动剂(活化剂)。

Description

使用GDNF家族配体(GFL)模拟剂或RET信号传导通路活化剂促进神经细胞存活的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年12月11日提交的美国临时专利申请61/285,858的优先权，将其公开内容以其整体引入本文作为参考。

发明背景

许多神经和所有神经变性疾病由神经元的死亡或神经元的神经炎丧失导致。目前，尚无神经保护或神经复原的药物。几种支持神经元存活的蛋白已经在动物模型和临床试验中显示出对抗神经和神经变性疾病的功效，例如，帕金森氏病和慢性疼痛中的GDNF配体家族(GLF)。然而，蛋白为药代动力学差的大分子，不能穿透血脑屏障。

神经元，作为不可分裂的细胞，需要来自附近细胞、来自细胞外基质(ECM)和来自环境的持续存活信号，以保持存活。“保持存活”信号通常由促进神经元存活的神经营养因子携带。在一些病理学情况下，例如帕金森(PD)和阿尔茨海默氏病的情况下，神经元逐渐退化。神经元失去突触接触，发生轴突变性并最终死亡。

目前对于神经变性疾病可用的治疗为对症治疗，尚不存在可以逆转或显著减缓神经变性的其它可用治疗。基于神经营养因子的治疗具有极大的前景，因为除了促进神经元存活外它们还诱导轴突再生、支持突触形成和刺激神经元的功能性。

胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)是转化生长因子β超家族的远距离成员(distant member)以及GDNF家族配体(GFL)的创始成员(foundingmember)。该家族由四个成员组成：GDNF、neurturin(NRTN)，artemin(ARTN)和persephin(PSPN)(图1)，所有这些均为有效的神经营养因子(Airaksinen和Saarma，2002)。自从1993年被发现，GDNF已经因其在这些神经元中支持多巴胺能神经元的存活、诱导轴突萌发以及调节功能性多巴胺代谢的能力而受到广泛关注，其在PD中降解(Lin等人，1993)。另外，GDNF是PD动物模型中少数不仅能保护而且能修复多巴胺神经元的生长因子之一(Bespalov和Saarma，2007；Lindholm等人，2007)。

尽管GDNF已经在许多帕金森氏病的动物模型中显示出保护性和神经复原性作用，并且在两项临床试验中证明了非常有希望的结果(Gill等人，2003；Slevin等人，2005)，但是近期的研究未能显示GDNF的清晰的临床益处(Lang等人，2006)。这一矛盾可能解释为临床建立、患者的疾病状态以及表达GDNF的大肠杆菌性质的差异所致。至今为止，尚未清楚地理解为何这些试验产生不同的结果。

GDNF还可能对肌萎缩侧索硬化(ALS)的治疗至关重要，因为GDNF支持运动神经元(Henderson等人，1994)。因为RET信号传导增加了脑中多巴胺的量，因此其用于抑郁症的治疗(Mijatovic等人，2007)。GDNF或其模拟剂还可以用作男性避孕药(Meng等人，2000)。

NRTN是非常有前景的分子，因为近期的大脑核内(intraputamenal)注射携带NRTN基因的腺病毒的II期临床试验证明了帕金森氏病患者中的显著改善(Ceregene Inc.报刊发布)。ARTN在Biogen Idec/NsGene进行的I期临床试验中用于测试神经病，因为其已经证明了在慢性疼痛的动物模型中有效(Gardell等人，2003)，并且对感觉神经元具有复原作用(Wang等人，2008)。认为PSPN可用于治疗中风和阿尔茨海默氏病(Golden等人，2003；Tomac等人，2002)。

虽然GFL-受体复合体被认为是适当的药物靶点，但是GFL多肽可能不是合适的药理学药剂。基于蛋白的治疗的一个障碍是生物利用度。GDNF是具有134个氨基酸的碱性蛋白，其不能穿透血脑屏障。因此，需要脑手术进行递送。另外，GDNF、NRTN和ARTN与硫酸肝素相互作用，而后者是细胞外基质(ECM)中的成分(Lin等人，1993)。该相互作用显著降低了GFL从其施用或产生区域的扩散。重组GDNF可能诱发炎症并形成抗-GDNF抗体(Lang等人，2006)，而且重组GDNF价格昂贵。大肠杆菌产生的重组GDNF的性质可能随批次变化，因为其首先作为无活性蛋白产生，然后得以体外复性。最后，GDNF是混杂的；GDNF不仅通过GFRα1(也不显著地通过GFRα2和GFRα3)活化RET，还完全活化不同的受体：神经细胞粘着分子NCAM和携带结合GDNF的硫酸肝素侧链的共结合聚糖糖蛋白(Bespalov等人，未发表)(Sariola和Saarma，2003)。这些多效性GDNF作用可以导致多重副作用。

由于哺乳动物细胞在严格质量控制下分泌活化的GDNF，基因和细胞治疗方式可能有助于克服与大肠杆菌产生的重组GDNF有关的免疫和炎症响应问题。病毒载体和包含聚合物包裹的遗传改良的分泌GDNF的细胞的可植入装置(Sautter等人，1998)可以用于治疗帕金森氏病。不幸的是，这些策略可能增加癌症的风险，因为通过失调地和持续地产生GDNF来持续活化RET可能产生恶性肿瘤。例如，GDNF-过度表达的转基因小鼠出现了睾丸癌(Meng等人，2001)。与基因或细胞治疗不同，小分子不能触发持久的RET活化，因为它们以确定的时间间隔递送而且它们在生物体内迅速降解。致癌风险还因为GDNF-模拟剂是部分激动剂的事实而得以降低。

发明概述

本发明涉及在需要其治疗的受试者中治疗可通过接触、活化或抑制GFRα/RET受体复合体进行治疗的病症的方法，包括给予所述受试者有效量的具有GFRα1受体分子结合和/或调节特异性的化合物，由此治疗所述病症。

本发明涉及给予受试者化合物或组合物或物质进行公开的本发明的所有方面，还应该理解为涉及化合物或组合物或物质在治疗所述受试者中的用途；或涉及制备(用于)治疗所述疾病(受试者需要治疗)的药物。

同样，本文所述的用于这些目的的所有化合物(或其盐、酯或前药)本身也是本发明的一个方面。相似地，包括一个或多个这些化合物以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂的组合物也是本发明的一个方面。相似地，一个或多个所述化合物的单位剂量制剂也是本发明的一个方面。此外，医疗装置(例如包含所述化合物或组合物的注射器)也是本发明的一个方面。

本发明靶向的病症包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、雷特综合征、癫痫、帕金森氏病、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病、外周神经病、神经移植并发症、运动神经元疾病、多发性硬化、HIV痴呆、外周神经损伤、失聪、抑郁症、肥胖症、代谢综合征、疼痛、癌症和涉及表达GFRα/RET的细胞的变性或功能障碍的其它病症。

本发明还涉及化合物或其盐或酯，其可以抑制和/或活化GFRα/RET受体复合体。

在禁止对以人体为实施对象的方法授予专利权的管辖地区，既定包括以下限制：(1)应理解，人受试者的选择被限定为基于测试之前已经从人体取出的生物样品和/或基于从医疗史、患者访视或其它未以人体为实施对象的活动获得的信息进行选择；以及(2)给予人受试者组合物应当限定为开出控制物质的处方，而人受试者将通过任一技术(例如，口服、吸入、局部施用、注射、插入等)自己服用；或处方专家之外的人应当向所述受试者给药。对于各管辖地区，最广泛的合理解释为既定符合规定可授权主题的法律或法规。在不禁止对以人体为实施对象的方法授予专利权的管辖地区，受试者的选择和组合物的给药同时包括以人体为实施对象的方法和前述活动。

标题“发明概述”不用于限制或约束。本发明还包括原始提交的说明书或附图中公开的所有方面。随附的原始权利要求还限定认为是本发明的方面，并引入该概述作为参考。

除前述内容外，本发明包括以任何方式比上文具体提及的变化范围更窄的本发明的所有实施方式作为其它方面。例如，尽管本发明的方面可能已经通过提及种类或大范围数值进行了公开以满足简洁的需要，但是应当理解所述种类的各成员和所述范围内的各值或小范围属于本发明的一个方面。同样，本发明的各个方面和特征可以组合，得到属于本发明的范围内的其它方面。尽管申请人发明了随附权利要求的所有范围，但是随附权利要求在其范围内无意包括别人的现有技术工作。因此，当专利局或其它单位或个人提醒申请人注意合法的现有技术包括在权利要求的范围内时，申请人保留依据可用的专利法进行修改的权利，以重新限定该权利要求的主题，以便从该权利要求的范围中明确排除该合法现有技术或其显而易见的变化。所修改的权利要求限定的本发明的变化也是本发明的一个方面。

附图说明

图1：GDNF家族配体(GFL)及其受体。GFL不能直接结合信号转导的受体RET，而是需要糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的GFRα。GDNF、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)均可以与GFRα/RET受体复合体相互作用并经其传导信号。TM：跨膜区。所有蛋白以带状实线表示。

图2：GFL信号传导模拟的验证，其使用基于细胞的萤光素酶-报道分子系统(自主知识产权)。筛选的几种化合物的结构如下所示：化合物243G7具有式(VIII)结构，如下所示；化合物299B5具有式(X)结构，如下所示；化合物290A11具有以下结构：

化合物319H6具有以下结构：

以及化合物375F4具有以下结构：

图3：使用RET-ELISA测试检测GFL-模拟剂。GFL-模拟剂通过GFRα1和GFRα3激活RET。化合物219902具有以下结构：

且化合物74609具有以下结构：

图4：选择的GFL-模拟剂可以通过GFRα有效地激活RET，如磷酸化测试所揭示。WB：蛋白印迹。IP：免疫沉淀。pY：抗-磷酸-酪氨酸抗体。星号表明诱导RET活化的GLF-模拟化合物。泳道编号和化合物如下所示：1)二甲基亚砜(DMSO)；2)无活性的化合物氯喹，其具有以下结构：

3)无活性的化合物13005，其具有以下结构：

4)有活性的化合物219902，其具有以下结构：

5)有活性的化合物143511，其具有以下结构：

6)无活性的化合物349051，其具有以下结构：

7)无活性的化合物108，其具有以下结构：

8)有活性的化合物292651，其具有以下结构：

9)GDNF；以及10)分子量标示(MW)。

图5显示施用至GFRα1/RET-表达细胞(上图)、GFRα3/RET-表达或RET-表达报道细胞系(下图)的化合物的剂量-响应。由GFRα/RET活化的信号级联导致MAPK的活化，其诱导萤光素酶报道分子。化合物BT13、BT16和BT17可以以剂量依赖方式诱导GFRα1/RET和GFRα3/RET-表达报道分子细胞系中的萤光素酶表达。在单独表达RET的细胞中未观察到显著作用。化合物BT18在GFRα1/RET-细胞系中活化。GFRα3/RET-表达细胞系(a3)：实线；RET-表达细胞系(Noa)：虚线。BT10的结构为：

BT13(或者本文称为N13)的结构为：

BT16(或者本文称为N16)的结构为：

BT17(或者本文称为N17)的结构为：

B18的结构为：

以及B19的结构为：

图6显示新的(BT)GDNF-/ARTN模拟剂诱导的RET磷酸化。BT10、13、16、17和19的结构如图5所示；且BT12的结构为：

图6A显示通过多种BT化合物激活GFRα1/RET(这些化合物的结构如上所示)：将MG87RET成纤维细胞用GFRα1结构转染，并用100μM浓度的BT测试化合物处理。上图表示含有用抗-磷酸酪氨酸抗体(WB：pY)作为探针的细胞溶解的免疫沉淀的RET抗体(IP：RET)的膜。化合物BT13和BT16通过GFRα1强烈激活RET。化合物BT17和BT18可能是较弱的GFRα1/RET激动剂。下图显示用抗-RET抗体(WB：RET)作为探针的相同的膜。二甲基亚砜(DMSO)用作阴性对照。GDNF(100ng/ml)用作阳性对照。

图6B显示通过BT化合物激活GFRα3/RET。将MG87RET成纤维细胞用GFRα3或GFP结构转染并用以100μM浓度的BT化合物处理，它们的结构如上所示。上图表示含有用抗-磷酸酪氨酸抗体(WB：pY)作为探针的细胞溶解的免疫沉淀的RET抗体(IP：抗-RET)的膜。化合物BT13通过GFRα3强烈激活RET。化合物BT16、BT17和BT18可能为较弱的GFRα3/RET激动剂。下图显示用抗-RET抗体(WB：抗-RET)作为探针的相同的膜。30μl的DMSO用作GFRα3-转染细胞中的阴性对照。ARTN(100ng/ml)用作GFRα3-转染细胞中的阳性对照。

图7显示以指定浓度(0.2-5μg)在苯丙胺-诱导的转动中纹状体内注射载体、GDNF(10μg)或GDNF模拟剂的作用。损伤3周后，在纹状体中接受载体、GDNF或BT GDNF模拟剂化合物(它们的结构如上所示)的大鼠通过纹状体内6-OHDA(28微克)诱导。苯丙胺-诱导的行为在损伤6周后测量。

图8显示在指定BT化合物的存在下，鼠类成纤维细胞的细胞生长。BT10、13、16、17、18和19的结构如上所示。结果表示为根据DMSO对照(假定其活力为100±5%)的活细胞的百分率。所有化合物在50μM浓度显示出中等的细胞生长抑制(除了BT10在高于2μM的浓度显示显著的毒性)。

图9显示在苯丙胺-诱导的转动中纹状体内注射载体或GDNF(10μg)或GDNF模拟剂(指定剂量)的作用。所述化合物的结构如上所示。

发明详述

本发明涉及在受试者中治疗病症(同时包括神经和非神经病症)的化合物和方法，包括给予所述受试者有效量的具有结合和/或调节GFRα受体分子或下游RET信号的特异性的化合物，其分别称为“RET信号活化的化合物”和“GDNF模拟剂化合物”。在本发明的一些变型中，所述化合物以组合物给药，该组合物还包括一种或多种药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

对于公开的目的，当达成任一以下治疗目标时认为治疗成功：所述疾病的症状改善、缓解或减小；疾病或疾病症状的进展减慢或停止；恶化或损害缓解、部分治愈或完全治愈；和/或当所述受试者获得部分或完全恢复；和/或减少或免除更昂贵、更难以给药或副作用更不可接受的其它监护标准治疗，同时达到相似的生活质量。

所述病症可为例如，阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、雷特综合征、癫痫、帕金森氏病、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病、外周神经病、神经移植并发症、运动神经元疾病、多发性硬化、HIV痴呆、外周神经损伤、失聪、抑郁症、肥胖症、代谢综合征、疼痛、癌症或涉及表达GFRα/RET的细胞的变性或功能障碍的其它病症。

所述受试者可为动物或人受试者。所述动物可为哺乳动物。

本发明还涉及促进神经细胞存活或促进神经功能的方法，包括用具有特异性结合和/或调节GFRα1受体分子的活性的化合物治疗神经细胞。此外，本发明涉及诱导下游RET信号传导的化合物。

所述化合物可为小分子。在一些实施方式中，GDNF模拟剂化合物具有式(I)结构，

其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基和亚烷基氨基；R3独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基，且R4选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、亚烯基芳基、羟基；或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，R1和R2独立地选自亚烷基氨基和氢，其中亚烷基氨基部分的氨基还可被一个或两个烷基或亚烷基芳基(例如，苄基)取代。在多个实施方式中，R3为氯或氨基烷基。在一个具体的实施方式中，R1为氢且R2为亚烷基氨基。

在一些实施方式中，所述GDNF模拟剂化合物具有式(II)结构

其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基和亚烷基氨基；R3、R4、R5和R6独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基；或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述GDNF模拟剂化合物具有式(III)结构

在一些实施方式中，所述GDNF模拟剂化合物具有式(IV)结构

其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、亚烷基氨基；R3、R4、R5和R6独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基；或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(V)结构

其中R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、亚烷基氨基；R3独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基；或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(VI)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(VII)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(VIII)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(IX)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(X)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(XI)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(XII)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有式(XIII)结构

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，所述RET信号传导活化的化合物具有以下任一通式的结构

或其药学上可接受的盐。

在多种情况下，所述RET信号传导活化的化合物具有式(XX)结构：

其中R1为环状或非环状氨基，或其药学上可接受的盐。R1基团的非限制性实例包括二烷基氨基、哌啶基、取代的哌啶基、哌嗪基；取代的哌嗪基；四氢异喹啉基；以及取代的四氢异喹啉基。

本文所用的术语“烷基”是指含有碳原子的直链和支链的碳氢化合物基团，通常为甲基，乙基和直链和支链的丙基和丁基。除非另外指明，否则所述碳氢化合物基团含有至多20个碳原子。术语“烷基”包括“桥状烷基”，即C₆-C₁₆双环或多环碳氢化合物基团，例如，降冰片基(norbornyl)、金刚烷基(adamantly)、双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或十氢萘基。烷基任选地被取代、例如、被羟基(OH)、卤素、氨基和磺酰基取代。“烷氧基”为具有氧取代基的烷基，例如，-O-烷基。

术语“烯基”是指含有碳原子和具有至少一个碳-碳双键的直链和支链的碳氢化合物基团。除非另外指明，所述碳氢化合物基团可含有至多20个碳原子。烯基任选地被取代，例如，被羟基(OH)、卤素、氨基和磺酰基取代。

本文所用的术语“亚烷基”是指具有另一个所定义取代基的烷基。例如术语“亚烷基芳基”是指被芳基取代的烷基，且“亚烷基氨基”是指被氨基取代的烷基。亚烷基氨基的氨基还可进一步被取代，例如，被烷基、亚烷基芳基、芳基或其组合取代。术语“亚烯基”是指具有另一个所定义取代基的烯基。

本文所用的术语“芳基”是指单环或多环芳香基团，优选单环或双环芳香基团，例如苯基或萘基。除非另外指明，否则芳基可为未被取代的或被一个或多个，尤其一个至四个独立地选自例如，卤素、烷基、烯基、OCF₃、NO₂、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO₂H、CO₂烷基、芳基和杂芳基的基团取代。示例性芳基包括但不限于，苯基、萘基、四氢萘基、氯苯基、甲基苯基、甲氧基苯基、三氟甲基苯基、硝基苯基、2,4-甲氧基氯苯基等。“芳基氧基”为具有氧取代基的芳基，例如-O-芳基。

本文所用的术语“酰基”是指羰基，例如C(O)。所述酰基还被例如氢、烷基、烯基、芳基、烯基芳基、烷氧基或氨基取代。酰基的具体实例包括但不限于，烷氧基羰基(例如，C(O)-O烷基)；芳基氧基羰基(例如，C(O)-O芳基)；亚烷基芳基氧基羰基(例如，C(O)-O亚烷基芳基)；氨基甲酰基(例如，C(O)-NH₂)；烷基氨基甲酰基(例如，C(O)-NH(烷基))或二烷基氨基甲酰基(例如，C(O)-NH(烷基)₂)。

本文所用的术语“氨基”是指含氮取代基，其可具有零、一或两个烷基、烯基、芳基、亚烷基芳基或酰基取代基。具有零个取代基的氨基为-NH₂。

本文所用的术语“卤”或“卤素”是指氟、溴、碘或氯。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激性、过敏反应等，且与合理的益处/风险比相当的那些盐。药学上可接受的盐是本领域已知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences，66：1-19(1977)中详细公开了药学上可接受的盐。这些盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或分别地通过将所述游离碱官能团与合适的有机酸或无机酸反应制备。药学上可接受的非毒性酸加成盐的实例包括但不限于，氨基与无机酸或与有机酸形成的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸例如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、乳糖酸或丙二酸形成的盐，或通过使用本领域所用的其它方法形成的盐，例如离子交换。其它药学上可接受的盐包括但不限于，己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等的盐。恰当时，其它药学上可接受的盐包括，无毒性铵盐、季铵盐和使用抗衡离子(例如卤离子、氢氧根离子、羧酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、硝酸根离子、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸根离子和芳基磺酸根离子)形成的胺阳离子。

制剂

本发明公开的化合物可以与其它分子，分子结构或化合物的混合物混合、装入胶囊、共轭或结合，例如，脂质体，载剂，稀释剂，受体-靶向分子，口服，直肠，局部或帮助摄取、分布和/或吸收的其它制剂。教导制备所述摄取、分布和/或吸收-帮助的制剂的代表性美国专利包括但不限于，U.S.：5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；以及5,595,756，将其每篇引入作为参考。

本发明还涉及药物组合物和制剂，其包括所公开的化合物。所述药物组合物可以以许多方式给药，取决于是否需要局部或全身治疗，并取决于待治疗的区域。给药可为局部(包括眼用和粘膜用，包括阴道和直肠给药)、肺部，例如，通过吸入或喷洒粉剂或气雾剂，包括借助喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮、口服或肠胃外。肠胃外给药包括静脉注射、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如，鞘内或心室内给药。用于局部给药的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、溶液剂和粉剂。常规的药用载剂，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可为必要或需要的。

所述药物制剂(其可方便地以单位剂型存在)，可以根据制药工业熟知的常规技术制备。该技术包括将活性成份与药用载剂或赋形剂结合起来的步骤。一般而言，所述制剂通过将活性成份与液体载剂或充分粉碎的固体载剂或两者均匀和密切结合制备，然后，必要时将所述产品塑型。

所述组合物可以配方为任一可能的剂型，例如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。所述组合物还可配方为在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液还可包含增加所述悬浮液的粘度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。所述悬浮液还可包含稳定剂。

药物组合物包括但不限于，溶液剂、乳剂、泡沫剂和含脂质体的制剂。本发明的药物组合物和制剂还包括一种或多种穿透促进剂、载剂、赋形剂、稀释剂或其它活性或非活性成份。

乳剂通常为一种液体以通常直径超过0.1μm的微滴的形式分散在另一种中的液体非均相系统。乳剂可以包含分散相和活性药物以外的其它成分，其作为溶液在水相、油相中存在，或其本身作为单独的相。包括微乳剂作为本发明的实施方式。乳剂及其用途为本领域所熟知并且进一步公开在美国专利6,287,860中，将其引入本文作为参考。

制剂可以包括脂质体制剂。本文所用的术语“脂质体”是指囊泡，其由排列形成球形双层或多个双层的两亲性脂质组成。脂质体为单层的或多层的囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和包含待递送组合物的水性内部。脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，本文所用的该术语是指包括一种或多种专门的脂质的脂质体，当所述脂质掺入脂质体时，产生比缺乏该专门脂质的脂质体更长的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例为以下脂质体：其中部分脂质体的形成囊泡的脂质部分包括一种或多种糖脂或用一种或多种亲水性聚合物衍生化，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂质体及其用途进一步公开在美国专利6,287,860中，将其全文引入作为参考。

本发明涉及的药物制剂和组合物还可包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳剂中的用途是本领域熟知的。表面活性剂及其用途进一步公开在美国专利6,287,860中，将其全文引入作为参考。

在一个实施方案中，本发明涉及包括一种或多种穿透促进剂的制剂，以实现有效递送本发明化合物的目的。除了帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜外，穿透促进剂还增强亲脂性药物的渗透性。穿透促进剂可以分为五大类，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂。穿透促进剂及其用途进一步公开在美国专利6,287,860中，将其全文引入作为参考。

本领域技术人员将认识到，制剂将根据它们的既定用途(即给药途径)进行常规设计。

优选的局部给药制剂包括以下制剂：其中本发明化合物与局部递送药物(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、甾族化合物、螯合剂和表面活性剂)混合。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二豆蔻酰磷酯酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷酯酰胆碱)、阴性的(例如二豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。

口服给药的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、微颗粒剂、纳米颗粒剂、水或非水介质中的悬浮液或溶液剂、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂也是需要的。优选的口服制剂为以下制剂：其中化合物与一种或多种穿透促进剂(表面活性剂、螯合剂)结合给药。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐，胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途进一步公开在美国专利6,287,860中，将其全文引入作为参考。还优选穿透促进剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。特别优选的组合为月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其它穿透促进剂包括聚氧乙烯基-9-月桂基醚、聚氧乙烯基-20-十六烷基醚。本发明化合物可以以颗粒形式口服递送(所述颗粒包括喷雾干燥的颗粒)，或络合形成微米或纳米颗粒。络合剂及其用途进一步公开在美国专利6,287,860中，将其全文引入作为参考。口服制剂及其制备详细公开在美国申请09/108,673、09/315,298和10/071,822中，将其每篇以其全文引入作为参考。

肠胃外、鞘内或心室内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，例如但不限于，穿透促进剂、载剂化合物和其它药学上可接受的载剂或赋形剂。

必要时，为了促进穿透血脑屏障(BBB)，所述活性化合物可以通过使用多种使得药物进入脑内的现有策略给药。本领域已知的用于增加穿过BBB运输、因而增强调节剂运输穿过BBB的策略可以适用于本发明化合物(该策略的综述请参见例如，Pardridge.Trends in Biotechnol.12：239-245(1994)；Van Bree等人，Pharm.World Sci.15：2-9(1993)；以及Pardridge等人，Pharmacol.Toxicol.71：3-10(1992))。在一种方式中，将所述化合物进行化学修饰，形成具有增强跨膜运输的前药。合适的化学修饰包括通过酰胺或酯连接基将脂肪酸与所述化合物共价连接(参见例如，美国专利4,933,324和PCT公开WO 89/07938；美国专利5,284,876；Toth等人，J.Drug Target.2：217-239(1994)；以及Shashoua等人，J.Med.Chem.27：659-664(1984))，以及将所述化合物糖基化(参见例如，美国专利5,260,308)。此外，N-酰基氨基酸衍生物可以用于调节剂，形成“脂质”前药(参见例如，美国专利5,112,863)。

在增加穿过BBB运输的另一方式中，将肽或拟肽化合物结合至第二个肽或蛋白，因此形成嵌合蛋白，其中所述第二个肽或蛋白发生吸收-介导的或受体-介导的胞吞作用穿过BBB。因此，通过将本发明涉及的化合物与该第二个肽或蛋白偶联，得到的嵌合蛋白被运输穿过BBB。第二个肽或蛋白可为脑毛细血管内皮细胞受体配体的配体。例如，优选的配体为特异性结合脑毛细血管内皮细胞上的转铁蛋白受体的单克隆抗体(参见例如，美国专利5,182,107和5,154,924以及PCT公开WO 93/10819和WO 95/02421)。其它可以介导穿过BBB运输的合适的肽或蛋白包括组蛋白(见例如，美国专利4,902,505)和配体，例如生物素、叶酸、烟酸、泛酸、核黄素、硫胺、吡哆醛和抗坏血酸(参见例如，美国专利5,416,016和5,108,921)。此外，已经报道葡萄糖转运蛋白GLUT-1运输糖肽([Met5]脑啡肽的L-丝氨酰-β-D-葡萄糖苷类似物)穿过BBB(Polt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7114-1778(1994))。因此，化合物可以偶联至该糖肽以将调节剂靶向于GLUT-1葡萄糖转运蛋白。例如，在游离胺用修饰基团Aic(3-(O-氨基乙基-异)-胆碱基(3-(O-aminoethyl-iso)-cholyl)，具有游离氨基的胆汁酸的衍生物)修饰的化合物可以通过标准方法经Aic的氨基偶合至糖肽。嵌合蛋白可以通过重组DNA方法形成(例如，通过形成编码融合蛋白的嵌合基因)或通过将调节剂与第二个肽或蛋白化学交联形成嵌合蛋白。本领域已知多种化学交联剂(例如，可市售获自Pierce，Rockford Ill)。可以选择允许以高产率将调节剂与第二个肽或蛋白偶合、并且随后裂解连接基释放生物活性调节剂的交联剂。例如，可以使用基于生物素-亲和素的连接基系统。

在增加穿过BBB运输的另一方式中，将所述化合物装入介导穿过BBB运输的载剂载体中。例如，所述化合物可以装入脂质体中，例如正电性单层脂质体(参见例如，PCT公开WO 88/07851和WO 88/07852)，或装入聚合物微球中(参见例如，美国专利5,413,797；美国专利5,271,961；以及美国专利5,019,400)。此外，所述载剂载体可被修饰，以使之运输穿过BBB。例如，所述载剂载体(例如，脂质体)可以用主动运输穿过BBB的分子或用脑内皮细胞受体的配体共价修饰，例如特异性结合至转铁蛋白受体的单克隆抗体(参见例如，PCT公开WO 91/04014和WO 94/02178)。

在增加穿过BBB运输的另一方式中，所述化合物可以与功能为穿透BBB的其它药物共同给药。该BBB“穿透剂”的实例包括缓激肽和缓激肽激动剂(参见例如，美国专利5,112,596)和美国专利5,268,164公开的肽化合物。

给药

例如通过剂量-响应、毒性和药代动力学研究，确定了制剂和给药的选择。给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，且疗程持续几天至几个月，或直至实现治愈，或达到所述疾病状态或疾病症状减小。给药可以不确定地连续用于可以达到减小而非治愈的慢性疾病状态或疾病。最佳给药方案可以根据测量药物在患者体内的蓄积进行计算。本领域技术人员可以容易地确定最优剂量、给药方法和重复率。最优剂量可以根据个别寡核苷酸的相对效力变化，并且通常可以根据体外和体内动物模型中有效的EC₅₀值估计。一般而言，剂量为0.01μg至100g/kg体重，并且可以每天一次或多次、每周、每月或每年，或甚至每2至20年一次给药。本领域技术人员可以根据测得的药物在体液或组织中的滞留时间和浓度容易地估计给药的重复率。治疗成功后，可能需要患者继续维持治疗以防止所述疾病状态复发，其中所述寡核苷酸以维持剂量给药，即0.01μg至100g/kg体重，每天一次或多次至每20年一次。

测试

本发明还涉及测试化合物(例如GDNF模拟剂)结合和/或调节GFRα受体分子或下游RET信号传导的方法。所述测试可以提供高通量的化合物分析。例如，将表达GFRα1的细胞与所研究化合物接触，将所述模拟剂测试的细胞生长与不使用化合物的背景对照实验比较，细胞生长的增加指出所述化合物是否是GDNF模拟剂。在一些情况下，所述细胞为表达萤光素酶以及GFRα1的细胞，且所述细胞生长的指示剂为萤光素酶。细胞生长的测量可以通过测量细胞-化合物混合物的发光进行。

本发明还包括其中细胞天然地或重组地表达其它感兴趣的受体(例如GFRα2、GFRα3、GFRα4)的测试。在本发明的一些变化中，选择对选自GFRα1、GFRα2、GFRα3和GFRα4的单一受体具有特异性的化合物。在其它情况下，选择调节两种、三种或所有四种这些受体的化合物。

本发明的测试还可以使用阳性对照实施，例如，感兴趣的受体的天然配体。以此方式，可以选择抑制配体-介导激活GFRα1、GFRα2、GFRα3和/或GFRα4的受体结合化合物。优选的配体受体组合描绘于图1中。所述图1还描绘了模拟或调节或干扰特异性配体/受体相互作用的化合物的示例性疾病适应症。

本发明涉及的其它方法包括双重抗体夹心ELISA测试，以评估化合物作为GDNF模拟剂，其在一些实施方式中可以提供所述模拟剂的活性的定量测量。将表达RET和GFRα1(或一种其它感兴趣的受体)的细胞与所研究化合物接触，然后首先与抗-RET抗体接触，然后与抗-pY抗体(例如小鼠抗-pY抗体)接触，形成双重抗体夹心，其中形成双重抗体夹心表明所述化合物为GDNF模拟剂。在一些情况下，检测所述夹心可以通过直接检测进行，例如，当所述抗-pY抗体为小鼠抗体时，将所述夹心与第二个抗-小鼠HRP-共轭的抗体以及化学发光试剂(例如ECL试剂)接触，并测量所得的发光。

实施例

已经包括以下实施例用于例示本发明公开的主题。根据本发明公开和本领域的一般技术水平，本领域技术人员将理解以下实施例仅仅旨在例示，而且可以在不背离本发明公开的主题的精神和范围内应用许多变化、修饰和改变。

方法

细胞系。用RET原癌基因稳定转染的MG87RET鼠类成纤维细胞(

等人，2004)。N18大鼠/小鼠胶质瘤/成神经细胞瘤细胞获自ATCC。

动物。颈上神经节分离自P0-P2Wistar大鼠。实验动物的使用获得赫尔辛基大学的动物实验委员会(Committee for Animal Experiments of theUniversity of Helsinki)的批准和省管理委员会(County Administrative Board)的首席兽医的许可(HY 55-06)。

蛋白。GDNF、ARTN获自PeproTech Ltd。NGF购自Promega。所有GFL的浓度由microBCA试剂盒(Pierce)使用BSA作为标准品进行检查。

质粒。亚克隆至pCDNA3(Invitrogen)的全长flag-标记的大鼠Gfrα1cDNA(

等人，2004)。亚克隆至pCDNA6(Invitrogen)的全长人GFRα1cDNA(Sidorova等人，未发表)。全长人GFRα3cDNA(Wang等人，2006)。亚克隆至pCR3.1(Invitrogen)的全长人RET(长亚型)(Runeberg-Roos等人，2007)。MAPK活性检测系统(Baloh等人，2000)和PathDetect Elk-1(Stratagene)均包括两种质粒。第一种质粒组成性地表达MAPK途径特异性融合反式作用子，其由Elk-1的活化结构域和酵母GAL4蛋白(Gal4-Elk1)的DNA-结合域组成。另一种质粒(Gal4-Luc)携带萤光素酶基因，其受到合成的含有酵母GAL4结合序列的启动子的控制。

稳定的细胞系的传代。将MG87RET鼠类成纤维细胞平铺在35mM培养皿中，并用4μg的G4-Luc、Gal4-Elk(Baloh等人，2000)和表达GFRα1的质粒(“αLUC”细胞)或用含有耐新霉素基因的空载体(“NOα″细胞)转染，其比例为4:1∶1，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用于DNA递送，如生产商所述。第二天，将细胞用胰蛋白酶消化并以低密度平铺在10-cm组织培养皿上。在500-750μg/ml遗传霉素(Invitrogen)的存在下选择稳定的转化株。将建立的细胞系保持在DMEM、10%胎牛血清(FBS)、100μg/ml Normocin(Invivogene)、2μg/ml嘌呤霉素、500μg/ml遗传霉素、15mM HEPES，pH 7.2中。将Pathdetect Elk-1系统和人GFRα1-表达质粒(“Strat-Luc”细胞)或空载体(对照细胞系“NOStratls”)细胞选择和保持在DMEM、10%FBS、100μg/mlNormocin(Invivogene)、2μg/ml嘌呤霉素、500μg/ml的G418、2μg/ml的杀稻瘟菌素S、15mM HEPES，pH 7.2中。

使用报道基因萤光素酶活性测试检测GDNF模拟剂

在测试的前一天，以20 000个细胞/孔的细胞密度将细胞平铺在96-空板中的DMEM、10%FBS、100μg/ml Normocin、2μg/ml嘌呤霉素、500μg/ml的G418、15mM HEPES，pH 7.2中。第二天，将在DMEM、10%FBS、100μg/ml Normocin中最终浓度为100ng/ml的神经营养因子添加至孔中。允许细胞生产萤光素酶共24小时，然后在20μl的1x细胞培养溶胞试剂(Promega)中溶解，并冷冻-解冻一次以确保完全溶解。然后，将5μl溶胞产物与20μl萤光素酶测试底物(Promega)在黑色的96-孔Isoplate(PerkinElmer)的孔中(在冰上)混合。在MicroBeta 2计数器(PerkinElmer)上记录两次发光。使用第二次运行的结果。为了优化平铺，在测试的前一天以2000-50000个细胞/孔的细胞密度接种；为了估计用GDNF刺激的细胞在溶液中的响应，将GDNF加入至细胞悬浮液中，然后平铺直至最终浓度为10-100ng/ml，然后以20 000个细胞/孔的细胞密度将细胞平铺在96-孔板中并放置24小时以产生萤光素酶；对于剂量-响应曲线，加入GFL至5-200ng/ml的最终浓度；为了确定产生萤光素酶所需的最优时间，将细胞放置在含有GDNF的培养基中4-48小时；为了研究短期MAPK活化，用100ng/ml的GDNF处理αLUC细胞0.5-60分钟，用生长培养基洗涤一次，并放置在新鲜部分的生长培养基中共24小时，以产生萤光素酶。数据表示为M±m，其中M表示4次重复的平均值且m为标准偏差。检测的结果在图2中给出。所研究的化合物包括以下：

化合物299B5

化合物290A11

化合物319H6

和化合物375F4

使用RET-ELISA测试检测GDNF模拟剂

一旦用GDNF或其模拟剂刺激后，将细胞溶解，然后将溶胞产物转移至具有预先吸收的抗-RET抗体的96-孔板中以进行固相免疫沉淀，随后进行磷酸酪氨酸检测。制备96-孔板(OptiPlate 96F HB，黑色，Wallac)用于磷酸-RET检测：将1μg/ml山羊抗-RET抗体(Santa Cruz)在PBS中稀释。将稀释的抗体以75μl/孔加入，密封板并在+4℃培养过夜。然后用PBS(200μl/孔)洗涤三次，用阻断溶液(5%BSA的TBS溶液)在室温阻断2小时，然后用溶胞缓冲液(每10ml所述缓冲液含TBS、1%TritonX100、1%NP-40、0.25%去氧胆酸、10%甘油、1mM Na₃VO₄、1mM EDTA、一片完全蛋白酶抑制剂(Roche))洗涤一次。抗原的结合和信号检测：然后将刺激的细胞(用感兴趣的配体处理5-15分钟)放置在冰上，用冰冷却的补充有1mM钒酸钠的PBS洗涤一次。移除PBS后，在冰上将细胞溶解于100-200μl溶胞缓冲液中，同时在+4℃搅拌至少20分钟。将溶胞产物以100μl/孔施加至涂有抗-RET包被的96-孔板中，密封板并在水平振荡器上在+4℃培养1.5-2小时。然后用清洗缓冲液(TBS、1%TritonX100、2%甘油，200μl/孔)洗涤三次。加入在结合缓冲液(TBS、1%TritonX100、2%甘油、2%BSA)中以1∶1000稀释的抗-pY抗体(克隆4G10，Upstate)(100μl/孔)，并在室温培养1-1.5小时。然后用清洗缓冲液(200μl/孔)洗涤三次。以100μl/孔加入在结合缓冲液中以1:3000稀释的第二个抗-小鼠HRP-结合的抗体(Dako)中。然后在室温培养30-40分钟，用200μl/孔的清洗缓冲液洗涤三至四次。最后，加入100μl/孔预混合的并预温热至室温的ECL试剂。在暗处(在发光计内)培养1-2分钟，并在MicroBeta发光计上计数。检测的结果示于图3。

化合物219902具有以下结构：

且化合物74609具有以下结构：

使用RET磷酸化测试通过免疫沉淀和蛋白印迹检测GDNF模拟剂

将αLUC和NOα细胞平铺在35mm组织培养皿中，在无血清的DMEM中饥饿4小时，并用500ng/ml的PSPN或100ng/ml的GDNF(阳性对照)刺激15分钟。然后，将细胞用冰冷却的含有1mM Na3VO4的PBS洗涤一次，并在冰上溶解于1ml/孔的RIPA-改良缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1%NP-40、1%TX-100、10%甘油、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mM Na3VO4、2.5mg/ml去氧胆酸钠、1mMPMSF)。用抗-RET C-20抗体(Santa-Cruz Biotechnology，Inc.)免疫沉淀RET。将沉淀的蛋白在7.5%SDS-PAGE上分离，然后转移至硝基纤维素膜上。将膜在室温用10%脱脂奶粉的TBS-T溶液阻断15分钟，并在室温用在含有3%脱脂奶粉的TBS-T中以1∶1000稀释的抗-磷酸酪氨酸抗体(clone 4G10，Upstate Biotechnology)探针检测2小时。将膜用TBS-T洗涤三次，每次5分钟，并在室温在1:3000的第二个抗-小鼠抗体的溶液中培养45分钟，所述抗体结合有HRP(DAKO)并在含有3%脱脂奶粉的TBS-T中稀释。将膜用TBS-T洗涤5x10分钟。用ECL试剂(Pierce)使用LAS3000成像程序显现染色带。(图4，上图)。为了确定等量的蛋白装载，剥离后将膜用抗-RET C-20抗体(1:500，Santa-Cruz Biotechnology，inc)探针检测。我们使用结合有HRP(1:1500，DAKO)的第二个抗-山羊抗体检测C-20。检测的结果示于图4，下图。

使用报道基因萤光素酶活性测试的新的(BT)GDNF-和ARTN-模拟剂的剂量-响应

在测试的前一天，以每孔20000(或5000，对于384-孔板)的细胞密度将细胞平铺于96-孔板(或384-孔板)中的DMEM、10%FBS、100μg/mlNormocin、2μg/ml嘌呤霉素、500μg/ml的G418、15mM HEPES，pH 7.2中。第二天，加入所述化合物至1-50μM的最终浓度。所述化合物的结构如上面的图5所示。允许细胞产生萤光素酶24小时，然后溶解在20μl的1x细胞培养溶解试剂(Promega)中，并冷冻-解冻一次以确保完全溶解。然后将5μl溶胞产物与20μl萤光素酶测试底物(Promega)在黑色Isoplate(PerkinElmer)的孔中(在冰上)混合。在MicroBeta 2计数器(PerkinElmer)上进行两次发光计数。数据表示为诱导倍数，其中相应浓度的DMSO用作参照。数据请参见图5。

通过免疫沉淀和蛋白印迹在RET磷酸化测试中测试新的(BT)GDNF-/ARTN-模拟剂的活性

在实验的前一天，将MG87RET细胞平铺在35mm组织培养皿中。将细胞用GFRα1、GFRα3或用编码GFP的载体转染。在实验当天，将细胞在无血清的DMEM中饥饿4小时，并用100μM浓度的本发明化合物(结构如上面的图6所示)或用100ng/ml的GDNF或ARTN(阳性对照)刺激15分钟。然后，将细胞用冰冷却的含有1mM Na₃VO₄的PBS洗涤一次，并在冰上溶解于1ml/孔的RIPA-改良缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、1%NP-40、1%TX-100、10%甘油、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche)、1mM Na3VO4、2.5mg/ml去氧胆酸钠、1mM PMSF)。通过抗-RET C-20抗体(Santa-Cruz Biotechnology，Inc.)免疫沉淀Ret。将沉淀的蛋白在7.5%SDS-PAGE上分离，然后转移至硝基纤维素膜上。将膜在室温用10%脱脂奶粉的TBS-T溶液阻断15分钟，并在室温用在含有3%脱脂奶粉的TBS-T中以1∶1000稀释的抗-磷酸酪氨酸抗体(clone 4G10，UpstateBiotechnology)探针检测2小时。将膜用TBS-T洗涤三次，每次5分钟，并在室温在1:3000的第二个抗-小鼠抗体的含有3%脱脂奶粉的TBS-T中的溶液中培养45分钟，所述抗体结合有HRP(DAKO)并在含有3%脱脂奶粉的TBS-T中稀释。将膜用TBS-T洗涤5x10分钟。用ECL试剂(Pierce)使用LAS3000成像程序显现染色带。为了确定等量的蛋白装载，剥离后将膜用抗-RET C-20抗体(1:500，Santa-Cruz Biotechnology，inc)探针检测。我们使用结合有HRP(1:1500，DAKO)的第二个抗-山羊抗体检测C-20。检测的结果示于图6。

帕金森氏病动物模型

将所有大鼠暴露于腹腔内注射的活性化合物(即GFL-模拟剂或RET-信号传导活化剂)和/或脑功能区定位的微输注两次；首先对大鼠给予载体(4μl)、活性化合物(1-100mg/kg)或GDNF(10μg)，并且6小时后，各动物在左背纹状体的相同部位接受6-0HDA(8μg)。根据Paxinos和Watson图集(Paxinos and Watson，1997，The rat brain in stereotaxic coordinates，Academicpress，San Diego)，左纹状体中相对于前囟点和硬脑膜的坐标为A/P+1.0，L/M+2.7，D/V-4。该研究由以下组组成：纹状体内PBS+6-OHDA、纹状体内GDNF+6-OHDA和纹状体内GFL-模拟剂+6-OHDA、纹状体内PBS+6-OHDA+腹腔内GFL-模拟剂。

转动行为：行为测试在损伤后2周和4周进行。使所述大鼠习惯于测试室30分钟，然后给药D-苯丙胺(University Pharmacy，Helsinki，Finland；2.5mg/kg腹腔内)。在2小时的时间内记录全方位(360°)同侧和对侧转动的次数。朝向损伤方向的净同侧转动通过用向右转动减去向左转动得以计算。

免疫组织化学：在损伤后4周，用过量的戊巴比妥钠(90mg/kg，腹腔内，Orion Pharma，Finland)麻醉大鼠并在贲门内灌注磷酸盐-缓冲的盐水(PBS)，然后灌注4%低聚甲醛的0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.4。取出大脑，后固定4小时并保存在4℃的含有20%蔗糖的磷酸钠缓冲液中。在滑动切片机上切下40μm的系列冠状冰冻切片。在冷冻保护剂溶液(0.5M PB，30%甘油和30%乙二醇)中收集6组切片，并在-20℃保存直至免疫组织化学处理。将自由漂浮的切片进行TH-免疫组织化学处理。在PBS中冲洗三次后，内源性过氧化物酶活性在3%H₂O₂/10%甲醇/PBS中终止5分钟。在PBS中冲洗三次后，将切片用标准马血清(NHS)/0.3%Triton X-l00的PBS溶液预培养，以便阻止非特异性染色。此后，将切片在室温用1:2000稀释的生物素化的小鼠-抗-TH(Chemic on，Temecula，Calif.)培养过夜。然后，将切片用1:200稀释的生物素化的马-抗-小鼠(Vector，BA2001)培养，并在亲和素-生物素过氧化物酶复合物中使用Elite ABC Vectastain试剂盒(Vector Laboratories)培养。使用DAB作为色原体使反应可见。

形态分析/SN细胞计数：在黑质致密部(SNpc)通过使用光学分馏器方法与剥离器原理以及无偏性规则的组合，使用无偏性体视学细胞计数操作(unbiased stereological cell counting procedure)计数TH-阳性细胞(West等人，1991，Anat.Rec.231，482-497；Mouton等人，2002，Brain Res.956，30-35)。用连接至Olympus BX51显微镜的Stereo Investigator平台(MicroBrightField，Germany)分析整个SNpc。选择来自每只动物的SNpc中央部分的3个切片(其中存在内侧终核(MTN)(水平A/P-5.3)进行定量分析。优化光学分馏器评估方法，得到低于x%/个别大脑样品的误差系数。在较低倍数(4x)给出各参考空间的轮廓图并使用高放大倍数(60x，油浸法)物镜计数细胞。

在雄性Wistar大鼠中，将活性化合物单次注射至纹状体和/或腹腔内，防止了6-羟基多巴胺(6-OHDA，8μg)诱导的黑质纹状体束的多巴胺能神经的变性。在麻醉下，将大鼠暴露至脑功能区定位的微注射两次。首先，给予每只动物载体(PBS，4μl，对照组)或活性化合物，并在6小时后给予它们6-OHDA(8μg)至左背纹状体的相同位置。根据Paxinos和Watson图集(Paxinos and Watson，1997，The rat brain in stereotaxic coordinates，Academicpress，San Diego)，左纹状体中相对于前囟点和硬脑膜的坐标为A/P+1.0，L/M+2.7，D/V-4。

在所有大鼠中进行了两次行为测试。损伤后2周和4周，给予每只大鼠D-苯丙胺(2.5mg/kg，腹腔内)，以便诱导同侧(与损伤相同侧)转动行为，记录2小时。在损伤后2周，预期苯丙胺(2.5mg/kg，腹腔内)在对照组中诱导明显的同侧转动。相反，预期在治疗组(在6OHDA前用活性化合物治疗)观察到最少的同侧转动或观察到同侧转动没有增加。在损伤后4周，预期活性化合物能够显著逆转苯丙胺诱导的同侧转动，且免疫组织化学分析显示通过神经营养因子显著保护DAergic细胞。

TH-免疫组织化学。在损伤后4周，在第二次行为实验之后，用过量的戊巴比妥钠(90mg/kg)麻醉大鼠，并在贲门内灌注磷酸盐-缓冲盐水(PBS)，然后灌注4%低聚甲醛的0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.4。将自由漂浮的切片进行TH-免疫组织化学测试。在黑质致密部(SNpc)通过使用光学分馏器方法与剥离器原理以及无偏性规则的组合，使用无偏性体视学细胞计数操作计数TH-阳性细胞(West等人，1991，Anat.Rec.231，482-497；Mouton等人，2002，Brain Res.956，30-35)。用连接至Olympus BX51显微镜的Stereo Investigator平台(MicroBrightField，Germany)分析整个SNpc。预期对照组和治疗组的黑质致密部中TH阳性细胞的损失分别为大约30%和大约4%。

另一项帕金森氏病研究

该研究的目的在于，调查在帕金森氏病的大鼠模型6-OHDA中纹状体内(i.s.)给药小分子GDNF模拟剂(化合物13、16、319H6和292651，它们的结构见上图)的效果。在用于该研究的亚急性损伤模型中，通过将6-OHDA注射至纹状体中的多巴胺能末梢的近端创造经历数周缓慢进展的黑质(SNc)的损伤(Kirik-D 1998，Exp.Neurol.152：259-277)。在该模型中，黑质纹状体突出的部分保留完整，其可以用作对生长促进剂和神经保护剂响应的再生和功能恢复的底物。

在暴露于神经毒素6-OHDA 3周后，将GDNF模拟剂化合物、GDNF或载体给药至纹状体。在注射6-OHDA 12周后，分别用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学和HPLC评价在SNc中的多巴胺能神经元的选择性伤害，以及多巴胺及其代谢产物的纹状体水平。另外，通过前肢不对称试验(圆柱体试验)、苯丙胺诱导的转动不对称试验以及刻板型自发转动缺陷的Y-迷宫试验评估大鼠的行为损害。

动物：根据国立卫生研究院(National Institute of Health，NIH)对于实验动物的看护和使用指导方针并得到芬兰南部的州办公室(State ProvincialOffice of Southern Finland)的批准，对所有的动物进行实验。总计108只雄性Wistar大鼠(购自Charles River，Germany，重量为220-275g)用于本实验。将动物在标准温度(22±1℃)和在光线控制的环境(7am至8pm开灯)中圈养，且可自由获取食物和水。将动物如下分组：

组1：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用载体(0mg/kg，纹状体内)处理

组2：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT13(5μg/大鼠，即0.4mg/kg，纹状体内)处理

组3：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT13(1μg/大鼠，即0.1mg/kg，纹状体内)处理

组4：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT13(0.2μg/大鼠，即0.2mg/kg，纹状体内)处理

组5：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT16(0.5μg/大鼠，即0.2mg/kg，纹状体内)处理

组6：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT292651(5μg/大鼠，即0.4mg/kg，纹状体内)处理

组7：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT292651(1μg/大鼠，即0.1mg/kg，纹状体内)处理

组8：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用BT18(1μg/大鼠，即0.2mg/kg，纹状体内)处理

组9：12只大鼠，在6-OHDA输注后3周用GDNF(R&D Systems，Ltd.；10μg/大鼠或大约40μg/kg，纹状体内)处理

为了在SNc中产生部分退行性变性，根据Sauer和Oertel用修饰进行6-OHDA损伤(Sauer和Oertel，1994)。用5%异氟烷(在70%N₂O和30%O₂中；流速300ml/分钟)麻醉雄性Wistar大鼠，并放置在立体定位框架上。在手术期间，麻醉剂的浓度降低至1-1.5%。用恒温毯系统将直肠温度维持在37.0±1.0℃。经过对头骨的小型颅骨切除术暴露右脑半球。用精细镊小心地取出硬脑膜并在脑功能区定位注射6-OHDA(4μg/μl)至右纹状体。以0.5μl/分钟的速度总共输注7μl的6-OHDA，并等量分布至以下坐标的4个位置之间：AP+1.0，ML+2.8，DV-6.0，-5.5，-5.0和-4.4mm。将插管留在原处另外5分钟，然后取出。随后用修补材料填充头骨中的洞并缝合和消毒皮肤。允许大鼠从麻醉中恢复，并小心地监测可能的术后并发症。将动物放回可自由获取食物和水的鼠笼。

在第21天，用5%异氟烷(在70%N₂O和30%O₂中；流速300ml/分钟)再次麻醉大鼠，并放置在立体定位框架上。在手术期间，麻醉剂的浓度降低至1-1.5%。用恒温毯系统将直肠温度维持在37.0±1.0℃。经过对头骨的小型颅骨切除术暴露右脑半球。在脑功能区定位注射所测试化合物、GDNF或载体至右纹状体。各种给药溶液以1μl/分钟的速度输注，并等量分布至以下坐标的4个位置之间：AP+1.0，ML+2.8，DV-6.0，-5.5，-5.0和-4.4mm。将插管留在原处另外5分钟，然后取出。随后用修补材料填充头骨中的洞并缝合和消毒皮肤。允许大鼠从麻醉中恢复，并小心地监测可能的术后并发症。将动物放回可自由获取食物和水的鼠笼。

行为测试：在自发后腿站立中的前肢使用和偏好(Forelimb Use andPreference in Spontaneous Rearing)–圆柱体试验：使用圆柱体试验(改良自Schallert and Tillerson in Innovative models of CNS disease：from molecule totherapy.Clifton，NJ，Humana，1999)定量测定对鼠笼壁的自发后腿站立的前肢使用。该试验在6-OHDA注射后的第14、35、56和77天进行。当大鼠在鼠笼中自由活动时监测它们。由对治疗遮盲的观察员地后腿站立时各前爪与笼壁的接触进行评分。每只动物总计记录20次接触，并且计算损伤的非-损伤的前肢的接触次数，表示为总接触次数的百分比。

自发转动偏好和活动性的Y-迷宫试验

用漆成黑色的塑料制作Y-迷宫。Y-迷宫的各条臂长35cm、高25cm和宽10cm，并以相等角度放置。在6-OHDA损伤后的14、35、56和77天，将各大鼠放在一条臂的端部并允许在迷宫内自由移动8分钟。手动记录进入臂的顺序。用单向性6-OHDA损伤的大鼠趋向于避免更高多巴胺活性侧(未损伤的，左侧)，因此显示右转的偏好。由数据集确定右转偏好的百分比，表示为右转占总转动次数的百分比((右/左+右)x 100%)。除了右转偏好评分，还测量进入臂的总次数。

苯丙胺诱导的转动不对称

在6-OHDA注射后42和84天测试动物的苯丙胺-诱导的转动行为。在注射苯丙胺(5mg/kg腹腔内)后，在自动转动球(TSE Systems，Germany)中监测运动不对称共45分钟。通过朝向损伤的同侧转动减去对侧转动计算净同相转动不对称得分(net ipsiversive rotation asymmetry score)。

一般健康状况和人道终点

由实验室工作人员每天监测动物。当动物的一般健康状况显著恶化时，通过过量的CO₂以及断头处死动物。可接受的终点的定义包括：24小时的观察期内无自发运动并且不能饮水或进食、大出血、自发炎症、肢体不全(missing anatomy)、肿胀或肿瘤大于20mm，以及不能在30秒内恢复常态(right itself)。

6-OHDA暴露85天后，在动物的贲门内灌注肝素化的(肝素2.5IU/ml)盐水，以除去脑内的血液。之后取出大脑并在冰上切开。

整个切下同侧和对侧纹状体，称重，干冰急冻并保存在-80℃用于多巴胺及其代谢产物的HPLC分析。所有的同侧纹状体样品进行HPLC分析。对侧样品不进行HPLC分析。

通过浸入4%低聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液(PB)达24小时来固定含有SNc的后脑区域。在30%蔗糖的0.1M PB中冷冻保护2-3天后，在液氮中冷冻所述区域，用低温恒温器制备20-μm厚的冰冻切片。在一片Superfrost^TM载玻片(切片相距100μm)上放置来自每只大鼠的4片切片，并用于TH免疫组织化学(还收集另外4片各含4片切片的载玻片并保存在-80℃作为备用样品)。首先将切片重新水化，然后用含有0.5%Tween-20的PBS渗透化处理。在5%山羊血清的PBST溶液(含有0.05%Tween 20的PBS)中阻断切片，然后用1:1500的家兔抗-TH(Novus Biologicals，目录号NB300-109)多克隆抗体在室温培养过夜。之后将切片洗涤，并用结合山羊抗-家兔IgG二抗的AlexaFluor

594(Molecular Probes，目录号A11012)在室温培养2小时。最后，冲洗切片，脱水，盖上盖玻片并用Olympus AX-70荧光显微镜检查。对经过SNc(4片切片/动物)的TH-免疫荧光神经元的数量进行计数。

同侧纹状体进行HPLC。通过具有电化学检测的高效液相色谱(HPLC)方法确定多巴胺(DA)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)在纹状体组织样品中的浓度。

在冰上解冻后，将组织样品在0.1M高氯酸中用MSE Soniprep 150超声波粉碎器(MSE Scientific Instruments，Crawley，UK)匀浆化(1∶10，w/v)。将组织匀浆在15000g在4℃离心15分钟。经过聚丙烯膜(GHPAcrodisc 13 0.45μm，Pall Corporation，Ann Arbor，MI，USA)过滤上清液，并用0.1M高氯酸稀释(1:1)。将样品转移至塑料瓶中并立即分析。

所述ESA HPLC系统(ESA Inc.，Chelmsford，MA，USA)由以下组成：582溶剂递送系统，DG-1210真空脱气器，542自动取样器，880恒温室，装配有2通道5014B微透析单元的8通道CoulArray

5600电化学阵列检测器，以及Windows数据采集模块(1.00版)CoulArray应用电压为-175mV(通道1)，+225mV(通道2)，+350mV(通道3)和+450mV(通道4)。DA和DOPAC在通道2检测且HVA在通道3检测。进样量为10μl。

分析物在Zorbax SB-Aq反相色谱(2.1x100mm，3.5μm，AgilentTechnologies Inc.，Little Falls，Wilmington，DE，USA)上分离，使用ZorbaxSB-Aq预装柱(2.1x12.5mm，5μm)以等梯度运行。将柱维持在35℃。流动相为100mM磷酸二氢钠，其含有4.75mM柠檬酸单水合物、7mM的1-辛烷磺酸和50μM EDTA二钠-乙腈的混合物(98:2，v/v)。将流动相的pH用o-磷酸调节至2.2。流速为0.3ml/分钟。DA、DOPAC和HVA的浓度表示为nmol/g组织湿重。

所有值均表示为平均值±标准差(SD)或平均值的标准误差(SEM)，认为当P<0.05时差异具有统计学显著性。使用StatsDirect分析软件进行统计学分析。平均值间的差异通过使用单侧-ANOVA然后用Dunnet检验(与对照组(=载体处理的大鼠)比较)进行分析。非-参数数据用Kruskal-Wallis ANOVA分析。

结果：追踪调查动物12周，并且注射至6-OHDA-治疗的大鼠的纹状体的GDNF模拟剂化合物没有产生副作用。在行为测试中，也有证据表明化合物BT13、BT16、BT18和BT292651在纹状体内注射时没有导致毒性作用。

在苯丙胺诱导的转动测试(其在6-OHDA注射6周后以及在化合物BT13(或13)、BT16(或16)、BT18(或18)和BT292651(或292651)纹状体内注射3周后进行)中，BT13在一个浓度(0.2μg)时，化合物BT16、BT18和化合物BT292651也在一个浓度(1μg)时减少了苯丙胺-诱导的同侧转动。见图7。

当注射6-OHDA神经毒素至纹状体3周后，GDNF模拟剂化合物BT13、BT16、BT18和BT292651在损伤大鼠中显著减少苯丙胺-诱导的同侧转动。因此，化合物BT13、BT16、BT18和BT292651在体内帕金森氏病大鼠模型中显著减少病理性运动动作。

多巴胺能神经元存活

大鼠多巴胺能神经元根据Schinelli等人，1988所述进行培养。简言之，通过颈椎脱臼处死孕期15天的怀孕雌性大鼠(Wistar大鼠；Janvier)，并将胎儿从子宫中取出。除去胚胎的中脑并将其放入冰冷却的含有1%青霉素-链霉素(PS；Invitrogen)和1%牛血清白蛋白(BSA；Sigma)的Leibovitz培养基(L15；Invitrogen)。仅将中脑曲的腹侧部分用于细胞制备，因为这是发育大脑富含多巴胺能神经元的区域。

通过在37℃在不含钙和镁的PBS中稀释的胰蛋白酶(10%胰蛋白酶EDTA 10X；Invitrogen)消化20分钟分解中脑。通过加入含有DNAase I gradeII(0.1mg/ml；Roche Diagnostic)和10%胎牛血清(FCS；Invitrogen)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Invitrogen)终止反应。然后通过10ml移液管机械分解细胞三次。然后在L15培养基中的BSA层(3.5%)上将细胞在室温在180x g离心10分钟。弃去上清液并将细胞沉淀物再悬浮于由以下组成的确定的培养基：补充有B27(2%；Invitrogen)的Neurobasal(Invitrogen)、L-谷氨酰胺(0.2mM；Invitrogen)和1%的PS溶液。在Neubauer细胞计数器中使用锥虫蓝不相容试验计数活细胞。

将细胞以69000个细胞/孔接种在96孔-板(各孔用聚-L-赖氨酸(10μg/ml；Sigma)预包被)中并在37℃在增湿的空气(95%)/CO₂(5%)气氛中培养。每2天用新鲜培养基更换一半培养基。在这些条件下，培养5天后，星形细胞出现在培养基中并释放允许神经元分化的生长因子。3%至5%的神经元细胞群为多巴胺能神经元。

在第6天，除去培养基并加入含有或不含16μM的MPP⁺以及含有或不含测试物质的新鲜培养基。毒化(培养的第8天)48小时后，用PFA 4%固定细胞。多巴胺能神经元通过单克隆抗-酪氨酸羟化酶(TH)抗体(Sigma)标记。该抗体标记多巴胺能神经元的神经突和细胞体。该抗体用Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG(Molecular probe)显示，并且所述细胞的细胞核通过荧光标记物(Hoechst solution，SIGMA)标记。对于各种条件，使用InCell AnalyzerTM1000(Amersham Biosciences)使用10x放大倍数对各孔拍摄2x10照片。在相同条件下拍摄所有图片。

使用InCell AnalyzerTM 1000 3.2工作站软件分析神经突长度和具有或不具MPP+中毒的标记有抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体的神经元的数量。在10张照片(培养条件的12次分析)上计数多巴胺能神经元和神经突总长度。

下表中的数据证明了化合物319H6的细胞保护作用。这些结果清楚地证明所述化合物的神经保护作用与天然的脑-衍生的神经营养因子(BDNF)相似。

表

^*BDNF浓度以ng/mL计

GDNF=/ARTN-模拟剂对细胞活力的评估

使用Echo acoustic dispenser(Labcyte Inc.)以2.5–125nl体积将所述测试化合物转移至384-孔培养板中。在以指定浓度溶解于DMSO的各种化合物的存在下，将胰蛋白酶消化的MG87RET鼠类成纤维细胞以20000细胞/ml(500细胞/孔)接种。在水平混合器中简单混合后，将板离心并转移至培养器中。将细胞加入化合物2天(48小时)后，使用CelTiterGlo试剂(Promega)评估细胞的活力。结果如图8所示。

苯丙胺-诱导的转动

损伤3周后在纹状体中接受载体、GDNF或GDNF模拟剂的大鼠受纹状体内6-OHDA诱导。在损伤后42和84天测量苯丙胺-诱导的行为。注射苯丙胺(5mg/kg，腹腔内)后，在自动转动球(TSE Systems，Germany)中监测运动不对称性共45分钟。通过从朝向损伤的同侧转动减去对侧转动计算各项试验的净同侧转动不对称得分。数据如下面的图9所示。

其它相关疾病模型

与上述的帕金森氏病的实验相似，设计并进行了相关疾病模型实验：ALS(例如SOD1G93A大鼠模型)、脑缺血(例如中央大脑动脉结扎啮齿类模型)、阿尔茨海默氏病(例如，Aβ-过度表达的转基因小鼠模型)、慢性疼痛(例如脊柱神经结扎大鼠模型)以及其它。

参考文献

本文引用的文献均整体引入并作参考。此外，当文献以具体测试或试剂的指导作用而引用时，这些具体的教导也被引入并作参考。

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Claims

1.具有式(I)结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中

R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基和亚烷基氨基；

R3独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基；和

R4选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、羟基。

2.权利要求1的化合物，其中R1和R2独立地选自亚烷基氨基和氢。

3.具有式(II)结构的化合物或其药学上可接受的盐

其中

R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基和亚烷基氨基；和

R3、R4、R5和R6独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基。

4.具有式(III)结构的化合物或其药学上可接受的盐

其中

5.具有式(IV)结构的化合物或其药学上可接受的盐

其中

R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、亚烷基氨基；和

6.具有式(V)结构的化合物或其药学上可接受的盐

其中

R3独立地选自H、氟、氯、溴、碘、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基。

7.具有式(XX)结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中R1为环状或非环状氨基。

8.权利要求7的化合物，其中R1选自二烷基氨基、哌啶基、取代的哌啶基、哌嗪基；取代的哌嗪基；四氢异喹啉基；和取代的四氢异喹啉基。

9.化合物，具有以下结构：

或其药学上可接受的盐。

10.组合物，其包括权利要求1-9中任一项的一种或多种化合物以及药学上可接受的稀释剂、佐剂或载剂。

11.权利要求10的组合物，其以单位剂量制剂形式，或包装在给药用无菌容器中。

12.医疗装置，优选注射器，其含有权利要求1-11中任一项的化合物或组合物。

13.调节神经元、神经细胞、神经元前体细胞、神经元祖细胞或神经组织的生长的方法，所述方法包括将所述细胞或组织与权利要求1-11中任一项的化合物或组合物接触。

14.权利要求13的方法，其中所述接触在体外进行。

15.权利要求1-9中任一项的化合物，其中所述化合物具有一种或多种选自以下的活性：GFRα/RET受体复合体活化剂、GFRα/RET受体复合体抑制剂、一种或多种胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)家族配体(GFL)的模拟剂，以及RET活化剂。

16.权利要求1-12和15中任一项的化合物、组合物或医疗装置，其用于治疗患者的病症。

17.权利要求16的化合物、组合物或医疗装置，其中所述病症通过调节GFRα/RET受体复合体得以治疗。

18.权利要求16或17的化合物、组合物或医疗装置，其中所述病症选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、雷特综合征、癫痫、帕金森氏病、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病、外周神经病、神经移植并发症、运动神经元疾病、多发性硬化、HIV痴呆、外周神经损伤、失聪、抑郁症、肥胖症、代谢综合征、疼痛、癌症和涉及表达GFRα/RET的细胞的变性或功能障碍的其它病症。

19.权利要求16-18中任一项的化合物、组合物或医疗装置，其中所述受试者为哺乳动物受试者。

20.权利要求19的化合物、组合物或医疗装置，其中所述受试者为人。

21.在需要其治疗的受试者中治疗可通过接触、活化或抑制GFRα/RET受体复合体进行治疗的病症的方法，其包括给予受试者有效量的具有GFRα1受体分子结合和/或调节特异性的化合物。

22.具有GFRα1受体分子结合和/或调节特异性的化合物在需要其治疗的受试者中治疗可通过接触、活化或抑制GFRα/RET受体复合体进行治疗的病症的用途。

23.用于结合和/或调节GFRα1受体分子的化合物，其用于在需要其治疗的受试者中治疗可通过接触、活化或抑制GFRα/RET受体复合体进行治疗的病症。

24.权利要求21-23中任一项的方法、用途或化合物，其中所述病症选自阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、雷特综合征、癫痫、帕金森氏病、脊髓损伤、中风、缺氧、缺血、脑损伤、糖尿病性神经病、外周神经病、神经移植并发症、运动神经元疾病、多发性硬化、HIV痴呆、外周神经损伤、失聪、抑郁症、肥胖症、代谢综合征、疼痛、癌症和涉及表达GFRα/RET的细胞的变性或功能障碍的其它病症。

25.权利要求21-24中任一项的方法、用途或化合物，其中所述受试者为哺乳动物受试者。

26.权利要求25的方法、用途或化合物，其中所述受试者为人受试者。

27.权利要求21-26中任一项的方法、用途或化合物，其中所述化合物为一种或多种胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)家族配体(GFL)的模拟剂。

28.纯化的化合物，其具有作为一种或多种胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)家族配体(GFL)的模拟剂的活性。

29.组合物，其包括权利要求28的纯化的化合物，还包括药学上可接受的稀释剂或载剂。

30.权利要求28的纯化的化合物或权利要求29的组合物，其以单位剂量制剂形式，或包装在给药用无菌容器中。

31.医疗装置，优选注射器，其含有权利要求28-30中任一项的纯化的化合物或组合物。

32.权利要求21-30中任一项的方法、用途、化合物或组合物，其中所述化合物为小分子。

33.权利要求21-32中任一项的方法、用途、化合物或组合物，其中所述化合物具有式(I)结构或为其药学上可接受的盐：

其中

R4选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、亚烯基芳基、羟基。

34.权利要求21-32中任一项的方法、用途、化合物或组合物，其中所述化合物具有式(II)结构或为其药学上可接受的盐：

其中

R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基和亚烷基氨基；和

35.权利要求21-32中任一项的方法、用途、化合物或组合物，其中所述化合物具有式(III)结构或为其药学上可接受的盐：

其中

36.权利要求21-32中任一项的方法、用途、化合物或组合物，其中所述化合物具有式(IV)结构或为其药学上可接受的盐：

其中

37.权利要求21-32中任一项的方法、用途、化合物或组合物，其中所述化合物包括母体化合物的衍生物，所述母体化合物具有一种或多种GFRα受体分子的结合和/或调节特异性，其中所述衍生物还具有一种或多种GFRα受体的结合和/或调节特异性。

38.权利要求37的方法、用途、化合物或组合物，其中与母体化合物相比，所述衍生物在至少一种选自以下的特征中展示增强作用：效力、选择性、亲水性、亲脂性、两亲性、溶解性、生物利用度和对肝脏降解的抵抗性。

39.在受试者中治疗可通过下游活化RET进行治疗的病症的方法，其包括给予所述受试者活化RET的化合物。

40.活化RET的化合物在需要该治疗的受试者中治疗可通过下游活化RET进行治疗的病症的用途。

41.权利要求39或40的方法或用途，其中所述化合物为小分子。

42.纯化的活化RET的化合物。

43.组合物，其包括权利要求42的化合物以及药学上可接受的稀释剂或载剂。

44.权利要求42或43的纯化的化合物或组合物，其以单位剂量制剂形式，或包装在给药用无菌容器中。

45.医疗装置，优选注射器，其含有权利要求42-44中任一项的纯化的化合物或组合物。

46.权利要求39-45中任一项的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中所述化合物具有式(V)结构或为其药学上可接受的盐：

其中

R1和R2独立地选自H、烷基、芳基、亚烷基芳基、酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、亚烷基芳基氧基羰基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基和二烷基氨基甲酰基和亚烷基氨基；

47.权利要求39-45中任一项的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中所述化合物具有式(VI)结构：

或为其药学上可接受的盐。

48.权利要求39-45中任一项的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中所述化合物具有式(VII)结构：

或为其药学上可接受的盐。

49.权利要求39-45中任一项的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中所述化合物具有式(VIII)结构：

或为其药学上可接受的盐。

50.权利要求39-45中任一项的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中所述化合物具有式(IX)结构：

或为其药学上可接受的盐。

51.权利要求39-45中任一项的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中所述化合物具有式(XX)结构：

其中R1为环状或非环状氨基，

或为其药学上可接受的盐。

52.权利要求51的方法、用途、化合物、组合物或装置，其中R1选自二烷基氨基、哌啶基、取代的哌啶基、哌嗪基；取代的哌嗪基；四氢异喹啉基；和取代的四氢异喹啉基。

53.鉴定GDNF模拟剂的方法，其包括将所研究化合物与表达GFRα1的细胞接触并测量细胞生长，其中细胞生长相比于背景细胞生长的增加表明所述化合物为GDNF模拟剂。

54.权利要求53的方法，其中将所研究化合物存在时的细胞生长与所研究化合物不存在时的细胞生长比较，以鉴定细胞生长的增加。

55.权利要求53或54的方法，其中所述细胞重组地表达GFRα1。

56.权利要求53-55中任一项的方法，其中所述细胞还表达报道蛋白，其中报道蛋白或报道蛋白活性的测量鉴定细胞生长。

57.权利要求56的方法，其中所述报道蛋白为萤光素酶。

58.权利要求57的方法，其中所述细胞生长的测量包括测量萤光素酶活性。

59.鉴定GDNF模拟剂的方法，其包括将化合物与表达RET和GFRα1的细胞接触，并检测RET的磷酸化，其中RET的磷酸化相比于背景的增加表明所述化合物为GDNF模拟剂。

60.权利要求59的方法，其中将所述细胞溶解，并将细胞溶胞产物与结合RET的抗体接触。

61.权利要求59或60的方法，其还包括通过将RET与结合磷酸化酪氨酸的抗体(抗-pY抗体)接触测量RET的磷酸化，并测量所述结合RET的抗体的量。