CN103173444A - 一种准确区分辣椒与甜椒的功能标记及其检测引物组和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种准确区分辣椒与甜椒的功能标记及其检测引物组和检测方法。所述检测引物为F1：GCCATCAGTGTATGCTTT，F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC和R：CGTAAACTTCCGTTGTAAT。检测方法如下：1）提取植株基因组DNA；2）以植株基因组DNA为模板，利用3条功能标记引物进行PCR扩增；3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，观察扩增结果：如果PCR产物只有长1363bp的单一条带，则该植株为辣椒；如果只有长1171bp的单一条带，则该植株为甜椒；而如果同时具有这两条带，则该植株为辣椒与甜椒的杂合植株。本方法能够在植株生长的任何时期高效准确地检测出辣椒与甜椒构建的分离群体中单个植株基因型并预测其相应表型，提前对分离群体进行有目的选择，提高育种效率，并且，该方法还能用于种子纯度的检测。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种领域，涉及一种准确区分辣椒与甜椒的功能标记及其检测引物组和检测方法。
背景技术
辣椒属（Capsicum L.）是一种重要的蔬菜作物，广泛栽培于南北美洲、欧洲、亚洲、大洋洲等世界各地，根据形态学和细胞学特征分为5个栽培种，分别为Capsicum annuum、C. frutescens、C. chinense、C. baccatum 和 C. pubescens, 其中 C. annuum 是世界上栽培最广泛、类型最丰富的栽培种，迄今在世界范围内，辣椒育种主要在 C. annuum 这个栽培种上展开(Pickersgill，1997)。
辣椒因其独特的辣味而深受消费者的喜爱，不仅可以鲜食，还可以加工成辣椒酱、辣椒粉等，不仅如此，其果实中的辣椒素类物质在医药工业也具有广泛的应用价值。因此，国内外学者对辣椒辣味的产生进行了深入研究，结果表明，辣椒辣味是由单一显性基因Pun1（C基因）控制，它对所有其它辣味相关基因具有上位作用，当该基因为纯合隐性时，即辣味缺失(Boswell，1937； Webber，1912)。到目前为止，已鉴定出三个Pun1的自然突变等位基因，其中之一是来自C. annuum的等位基因Pun 1 1，与Pun 1相比，Pun 1 1基因组序列存在一段横跨启动子区和第一外显子区的约2.5kb的碱基缺失，导致该基因无法转录和翻译，以致辣味缺失(Stewart Jr et al，2005)。甜椒是辣椒的变种，携带Pun1的自然突变等位基因Pun 1 1。
在育种实践中，育种家需要充分利用辣椒与甜椒的优良基因，并将其进行整合，传统的育种方法是将两者进行杂交并在大田中进行后代分离群体的选择，这种传统的选择方法往往效率低且浪费大田资源，因此，建立一种高效准确的功能标记检测技术是解决这一问题的有效途径。
功能标记来源于控制表型的基因序列内部，是在鉴别基因序列的表型功能后，根据该基因的(复)等位基因序列多态性及其对应的表型效应，从而开发出能够区分和预测(复)等位基因及相对性状的DNA标记(Andersen and Lübberstedt，2003)。功能标记由于来源于基因内部而表现出与基因共分离，并与表型直接关联，因此，在分子育种运用中与其它分子标记相比具有诸多优势，主要表现在以下方面：一，准确可靠：由于与目标基因共分离，功能标记能够避免由于重组交换而产生的选择错误，在群体的目标基因检测时更加有效；二，普遍适用：可以在多种不同的遗传背景下应用，对人工育种群体和自然群体均有效；三，避免连锁累赘：由于是来源于基因内部，直接反映目标性状表现，因此利用回交转育进行优良性状的转移时，功能标记的应用可以更好的避免连锁累赘，减少供体不益基因向受体的导入。
辣椒（Capsicum L.）相对于其它几个模式植物而言其分子生物学研究起步较晚，精细定位和克隆的基因有限，因此，制约了功能标记的发展和运用，本发明在充分探明Pun1等位基因序列差异和表型效应的基础上发展功能标记，加速功能标记在蔬菜分子育种和基础研究中的运用进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确区分辣椒与甜椒的功能标记检测引物、试剂盒及检测方法。
本发明基于Pun1基因(GENBANK登录号为：AY819029.1)的等位基因序列差异发展功能标记，巧妙地设计了3条引物，引物F1位于第一外显子区，引物F2横跨约2.5kb的缺失序列，引物R为公用引物（图1）。当植株为辣椒时，只能是引物F1和R组合扩增出特异条带1；当植株为甜椒时，只能是引物F2和R组合扩增出特异条带2；当植株为辣椒与甜椒的杂合植株时，则2条特异带同时扩增。
本发明所采取的技术方案是：
一种准确区分辣椒与甜椒的功能标记，其位于辣椒Pun1基因（SEQ ID NO.1）上的第27 bp～2587 bp。
一种准确区分辣椒与甜椒的PCR引物组，包括如下3条引物：
F1：GCCATCAGTGTATGCTTT（SEQ ID NO.2）；
F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC（SEQ ID NO.3）；
R：CGTAAACTTCCGTTGTAAT（SEQ ID NO.4）。
一种准确区分辣椒与甜椒的PCR试剂盒，其含有上述的PCR引物组。
所述试剂盒中还含有10×PCR buffer，dNTPs和Taq酶。
一种准确区分辣椒与甜椒的方法，包括如下步骤：
1）提取植株基因组DNA；
2）以植株基因组DNA为模板，利用3条功能标记引物进行PCR扩增，3条引物分别为：
F1：GCCATCAGTGTATGCTTT（SEQ ID NO.2），
F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC（SEQ ID NO.3），
R：CGTAAACTTCCGTTGTAAT（SEQ ID NO.4）；
3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，观察扩增结果：如果PCR产物只有长1363bp的单一条带，则该植株为辣椒；如果只有长1171bp的单一条带，则该植株为甜椒；而如果同时具有这两条带，则该植株为辣椒与甜椒的杂合植株。
步骤1）是采用CTAB法提取植株叶片的基因组DNA。
步骤2）中PCR体系为20 μL，包括2 μL 10×PCR buffer，1.5 μL浓度为2.5 mM 的dNTPs，浓度为10 μM的引物F1、引物F2和引物R各1 μL，1 μL浓度为40 ng/μL的模板DNA，Taq酶1 U，加水定容到20 μL。
步骤2）中PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火1 min，72℃延伸90 s，5个循环； 94℃变性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸90 s，5个循环； 94℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸90 s，25个循环；72℃延伸10 min。
步骤3）所述电泳分离所用琼脂糖凝胶浓度为1%，电压为4-5V/cm，时间为1 h。
本发明的有益效果是：
（1）本发明是基于等位基因序列差异设计的功能标记，标记位于基因内部，不会因重组交换而导致选择错误，准确率极高。
（2）本发明是共显性标记，重复性好，不因反应条件的改变导致检测结果偏差。
（3）本发明基于PCR技术，操作简单（每天可检测300～500个样），可在苗期在实验室内对育种材料进行有目的的选择，节约育种成本并加快育种进程。
（4）本发明可对辣椒/甜椒单个植株在任何生长期进行检测并预测其表型，且不影响其正常生长。
附图说明
图1为本发明功能标记检测引物的设计原理图；
图2为10个F1单株的检测电泳图（泳道1～10为10个F1单株，泳道11、12分别为母本和父本，泳道13为5000 ladder）；
图3为15个F2单株的的检测电泳图（泳道1～15为15个F2单株，泳道16、17分别为母本和父本，泳道18为5000 ladder）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
甜椒雄性不育尤其是甜椒胞质雄性不育 ( CMS )很难找到恢复系而不能实现甜椒三系配套。为了加快甜椒 CMS的研究进程，育种实践过程中需要以辣椒恢复基因源进行甜椒恢复系的转育。
以携带恢复基因的辣椒12A为父本，该材料果实羊角形，食味辣；目标材料甜椒自交系15A为母本，该材料园艺性状好，配合力高，果实灯笼形，食味甜，两者杂交获得F1，对F1真假杂种进行验证，步骤如下：
1、引物设计
与辣椒Pun1基因（SEQ ID NO.1）相比，甜椒Pun 1 1基因上存在一段横跨启动子区和第一外显子区的约2.5kb的碱基缺失，本实施例根据这一等位基因序列差异，巧妙地设计了3条引物，引物F1位于第一外显子区，引物F2横跨约2.5kb的缺失序列，即位于缺失序列前14个碱基和缺失序列后8个碱基，共22个碱基，引物R为公用引物（图1）。当植株为辣椒时，只能是引物F1和R组合扩增出长1363bp的特异条带；当植株为甜椒时，只能是引物F2和R组合扩增出长1171bp的特异条带；当植株为辣椒与甜椒的杂合植株时，则2条特异带同时扩增。3条检测引物的序列如下所示：
F1：GCCATCAGTGTATGCTTT（SEQ ID NO.2）；
F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC（SEQ ID NO.3）；
R：CGTAAACTTCCGTTGTAAT（SEQ ID NO.4）。
2、PCR检测，步骤如下：
（1）单果收种后每个果播种6颗种子于育苗杯中，在25～30℃、相对湿度50～70%的温室进行栽培管理，待幼苗长到5～6片真叶时，每个单果选1个单株，每单株取1～2片嫩叶，以CTAB法提取植株基因组DNA。
（2）以上述DNA为模板，利用3条检测引物进行PCR扩增。
反应体系为20 μL：包括2 μL 10×PCR buffer，1.5 μL dNTPs（浓度为2.5 mM），引物F1、引物F2和引物R（浓度为10μM）各1 μL，1 μL模板DNA（浓度为40 ng/μL），Taq酶1 U，加水定容到20 μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5 min，（94℃变性30 s，57℃退火1 min，72℃延伸90 s）5个循环；（94℃变性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸90 s）5个循环；（94℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸90 s）25个循环；72℃延伸10 min。
（3）上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，所用琼脂糖凝胶浓度为1%，电压为4-5V/cm，时间为1 h，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统仪观察结果并拍照，结果表明10个单株均扩增出长1363bp和1171bp的两条特异带（图2），表明10个单果均为真杂种（图2中泳道1～10为10个F1单株，泳道11、12分别为母本和父本，泳道13为5000 ladder）。
（4）将杂种F1种植于大田，正常管理，开花前套袋自交获得F2种子。
对分离世代F2进行选择，步骤如下：
（1）播种200个单株于育苗杯中，在25～30℃、相对湿度50～70%的温室进行栽培管理，待幼苗长到5～6片真叶时，每单株取1～2片嫩叶，以CTAB法提取植株基因组DNA。
（2）重复上述步骤（2）和（3）对200个单株进行检测，结果表明F2群体出现分离，其中48株扩增出母本带型，55株扩增出父本带型，97株扩增出两条带型。图3为部分扩增结果，图中15个单株有7个均扩增出2条特异带，4个扩增出父本带型，4个扩增出母本带型（图3中泳道1～15为15个F2单株，泳道16、17分别为母本和父本，泳道18为5000 ladder）。
将200个单株移栽到大田，正常管理，待果实成熟后感官评定辣椒辣度，结果表明，扩增出母本带型的48个单株果实均不辣，其它152个单株果实均存在不同程度的辣味，与PCR检测结果相符，表明本发明的方法是能够准确区分甜椒与辣椒的。
（3）结合相关园艺性状对48株当选的甜椒植株进行选择，后自交2-3代获得甜椒恢复系，测交验证育性。
在实际育种实践中为了加快育种进程可以加大分离群体（如1000个单株的分离群体），利用该功能标记在苗期进行选择，淘汰辣椒植株，种植甜椒植株，再结合目的性状进行选择达到育种目标。
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所；广东科农蔬菜种业有限公司
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cccatatagc ccacttgcta caaacatctc tatcacaaac tctagtctct tactatcctt 2160
atgctggaaa gttgaaggac aatgctactg ttgactgtaa cgatatggga gctgagttct 2220
tgagtgttcg aataaaatgt tccatgtctg aaattcttga tcatcctcat gcatctcttg 2280
cagagagcat agttttgccc aaggatttgc cttgggcgaa taattgtgaa ggtggtaatt 2340
tgcttgtagt tcaagtaagt aagtttgatt gtgggggaat agccatcagt gtatgctttt 2400
cgcacaagat tggtgatggt tgctctctgc ttaatttcct taatgattgg tctagcgtta 2460
ctcgtgatca tacgacaaca actttagttc catctcctag atttgtagga gattcagtct 2520
tctctacaca aaaatatggt tctctcatta cgccacaaat tttgtccgat ctcaaccagt 2580
gcgtacagaa aagactcatt tttcctacag ataagttaga tgcacttcga gctaaggtaa 2640
tactaccatc gtccattatt gtttgtctta cggtattttt gaaaagaata atatttaata 2700
gtcttcttga gacatatttc acttaacaag cctaggctat ttagtctatt tgtagaagct 2760
actcttaaac gcctcactta gttaatagca ctccacttat tggtgtcaaa aactactctt 2820
ggacatgtca tttacttaat aacactccac ttaattatcg aacagtaaag tggaaaatat 2880
aaaagaatgc agtaataaat acttgtagtt tttccgaaat gaaaagtact gaataattat 2940
tttaaaataa atttagtttg gttgacatta atttgggatt gaaggtggca gaagaatcag 3000
gagtaaaaaa tccaacaagg gctgaagttg ttagcgctct tcttttcaaa tgtgcaacaa 3060
aggcatcatc atcaatgcta ccatcaaagt tggttcactt cttaaacata cgtactatga 3120
tcaaacctcg tctaccacga aatgccattg gaaatctctc gtctattttc tccatagaag 3180
caactaacat gcaggacatg gagttgccaa cgttggttcg taatttaagg aaggaagttg 3240
aggtggcata caagaaagac caagtcgaac aaaatgaact gatcctagaa gtagtagaat 3300
caatgagaga agggaaactg ccatttgaaa atatggatgg ctataagaat gtgtatactt 3360
gcagcaatct ttgcaaatat ccatactaca ctgtagattt tggatgggga agacctgaaa 3420
gggtgtgtct aggaaatggt ccctccaaga atgccttctt cttgaaagat tacaaagctg 3480
ggcaaggcgt ggaggcgcgg gtgatgttgc acaagcaaca aatgtctgaa tttgaacgca 3540
atgaggaact cgttgagttc attgcctaat taattccaag ttttggagta attggatgtc 3600
atttccaagt cttttgtggt gtttgattga agagagaggg attttacgaa ataaaggaat 3660
acttttgaaa cttacgaaac aaaggtagga atacttttgt aattgttgtg tgtttcatca 3720
acataattac aacggaagtt tacggtcaac aa 3752
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccatcagtg tatgcttt 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cataccgctc cacggaaaag ac 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtaaacttc cgttgtaat 19
Claims (9)
1.一种准确区分辣椒与甜椒的功能标记，其位于辣椒Pun1基因（SEQ ID NO.1）上的第27bp～2587bp。
2.一种准确区分辣椒与甜椒的PCR引物组，包括如下3条引物：
F1：GCCATCAGTGTATGCTTT（SEQ ID NO.2）；
F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC（SEQ ID NO.3）；
R：CGTAAACTTCCGTTGTAAT（SEQ ID NO.4）。
3.一种准确区分辣椒与甜椒的PCR试剂盒，其含有权利要求2所示的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有10×PCR buffer，dNTPs和Taq酶。
5.一种准确区分辣椒与甜椒的方法，包括如下步骤：
1）提取植株基因组DNA；
2）以植株基因组DNA为模板，利用3条功能标记引物进行PCR扩增，3条引物分别为：
F1：GCCATCAGTGTATGCTTT（SEQ ID NO.2），
F2：CATACCGCTCCACGGAAAAGAC（SEQ ID NO.3），
R：CGTAAACTTCCGTTGTAAT（SEQ ID NO.4）；
3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，观察扩增结果：如果PCR产物只有长1363bp的单一条带，则该植株为辣椒；如果只有长1171bp的单一条带，则该植株为甜椒；而如果同时具有这两条带，则该植株为辣椒与甜椒的杂合植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）是采用CTAB法提取植株叶片的基因组DNA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中PCR体系为20 μL，包括2 μL 10×PCR buffer，1.5 μL浓度为2.5 mM 的dNTPs，浓度为10 μM的引物F1、引物F2和引物R各1 μL，1 μL浓度为40 ng/μL的模板DNA，Taq酶1 U，加水定容到20 μL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火1 min，72℃延伸90 s，5个循环； 94℃变性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸90 s，5个循环； 94℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸90 s，25个循环；72℃延伸10 min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3）所述电泳分离所用琼脂糖凝胶浓度为1%，电压为4-5V/cm，时间为1 h。
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-
2013
- 2013-03-27 CN CN2013101022253A patent/CN103173444A/zh active Pending
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