CN103173421B - 用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，以兔肉为原料，通过裂解、离心的方法从所述的原料中提取醛缩酶（ALD）、磷酸丙糖异构酶（TIM）和甘油磷酸脱氢酶（GDH）复合物，所述的裂解为碱裂解，每1mL/g所述的原料中加入0.01-0.1M浓度范围的碱性溶液。通过采用本技术方案，能够有效提高固体酶复合物的最终产量、单位酶活力和批量生产的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法。
背景技术
果糖二磷酸钠含量测定方法主要有高效液相（HPLC）法、紫外（UV）吸收法、气相色谱（GC）法、多种化学比色法及酶法测定。其中酶法测定专属性强、准确迅速。但是涉及酶法测定的醛缩酶（ALD）、磷酸丙糖异构酶（TIM）和甘油磷酸脱氢酶（GDH）价格昂贵，造成测定成本很高。为解决此问题，现阶段已有专利200910091934.X，从动物肌肉中提取固体酶复合物替代以上三种酶，取得一定成果。但是此专利中提及的用水提取肌肉中酶的方法，必然造成细胞裂解不完全，提取效率低下，最终导致产量不足。纱布过滤方法很难最大程度滤过肉糜中的酶提取液，也会降低最终产量；且肉糜极粘稠，人工挤压纱布效率难于标准化，影响后续提取工序。硫酸铵沉淀法中未给出具体数据，不利于批量生产的稳定性；且沉淀条件不能有效提高单位酶活，硫酸铵饱和度达到70%以上后沉淀物多为杂蛋白。故原有技术方案生产效率低且成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，以兔肉为原料，通过裂解、离心的方法从所述的原料中提取醛缩酶（ALD）、磷酸丙糖异构酶（TIM）和甘油磷酸脱氢酶（GDH）复合物，所述的裂解为碱裂解，每1mL/g所述的原料中加入0.01-0.1M的碱性溶液。
优选地，所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，包括依次进行的如下步骤：
步骤1、将所述的原料打成肉泥；
步骤2、将所述的肉泥置于容器中，每1mL/g所述的原料中加入0.01-0.1M的所述的碱性溶液，搅拌10-20分钟；
步骤3、冷冻离心10-20分钟，将上清液转移至新的容器中；
步骤4、将离心后的沉淀物再用0.01-0.1M的所述的碱性溶液进行多次碱裂解、冷冻离心，将多次离心的上清液转移至所述的新的容器中；
步骤5、向所述的新的容器中缓慢加入质量含量在90-97%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌至最终的硫酸铵溶液的饱和度为30-40%，调节pH至5.0±0.5，放置20-40分钟；
步骤6、将步骤5所得的溶液冷冻离心10-20分钟，取上清液再加入质量含量在90-97%的饱和硫酸铵溶液至最终的硫酸铵溶液的饱和度为50-60％，调节pH至3.5±0.5，放置20-40分钟；
步骤7、将步骤6所得的溶液冷冻离心10-20分钟，将沉淀物于-20℃预冻，然后冻干得所述的固体酶复合物。
优选地，所述的步骤3中的离心时的转速为5500-7000rpm。
优选地，所述的步骤4中的离心时的转速为5500-7000rpm。
优选地，所述的步骤6中的离心时的转速为8000-10000rpm。
优选地，所述的步骤7中的离心时的转速为8000-10000rpm。
优选地，所述的碱性溶液为KOH溶液或NaOH溶液。
优选地，所述的固体酶复合物的制备过程在0-4℃下进行。
优选地，所述的原料为兔的背部肌肉或大腿部肌肉或两者的混合物。
本发明的有益效果在于:
通过采用本技术方案，能够有效提高固体酶复合物的最终产量、单位酶活力和批量生产的稳定性。
附图说明
附图1为不同饱和度梯度硫酸铵溶液对沉淀中单位酶活力的影响；
附图2为不同pH值对沉淀中单位酶活力的影响；
附图3为实施例1与对比例1的产量、单位酶活力的比较。
具体实施方式
下面对本发明作进一步阐述。
实施例1
取家免一只，固定，猝死后剥皮割取背部及大腿部肌肉，置于碎冰上，同时用剪刀剪碎。用在-20℃冰箱预冷的绞肉机将碎肉打成肉泥，称重。置于烧杯中，按照1mL/g碎肉的量加入0.05M的KOH溶液，均匀搅拌15分钟后于4℃冷冻离心机7000rpm离心10分钟。将上清转移至新的烧杯中，肉糜沉淀再用半量的0.05M KOH同样方法抽提并离心后，合并两次离心上清液，以上操作均于碎冰上或4℃环境下进行。缓慢加入饱和硫酸铵溶液（706g/L，4℃），边加边搅拌至最终40%的饱和度，调节pH至5.0，于碎冰上放置30分钟。之后4℃，8000rpm冷冻离心15分钟，取上清液再加入饱和硫酸铵溶液至最终60％的饱和度，调节pH至3.5，于碎冰上放置30分钟。最后，4℃，10000rpm冷冻离心20分钟，获得沉淀于-20℃预冻，冷冻干燥机过夜冻干。冻干粉末研细后分装，按照药典方法测定其单位酶活，以每1g固体酶复合物每分钟催化果糖二磷酸钠的量大于40μg为合格产品，-20℃保存，用于果糖二磷酸钠含量的测定。
实验结果见附图1和附图2，附图1为家兔肌肉在0.05M的KOH裂解后离心所得上清，用不同饱和度的硫酸铵溶液依次对其进行沉淀，沉淀冻干后测复合物中的单位酶活力。图中40-50%和50-60%饱和度梯度的硫酸铵溶液有利于沉淀中单位酶活力的提高；
附图2为家兔肌肉在0.05M的KOH裂解后离心所得上清，在40%饱和度的硫酸铵溶液条件下，调节不同pH值对其进行沉淀，沉淀冻干后测复合物中的单位酶活力。图中pH4条件下沉淀中单位酶活力大幅提高。
对比例1
取家免一只，固定，猝死后剥皮割取背部及大腿部肌肉，低温下用绞肉机绞成肉泥（500毫升），盛于1000毫升烧杯中，加入等体积水搅拌15分钟后用医用3-4层纱布挤压进行粗过滤，滤渣再用半量水二次抽提，合并两次滤液，加入标准试剂（含量在98%以上）固体硫酸铵到饱和（固体硫酸铵不溶解），边加边拌，加完后放冰箱冷藏（5℃左右）存放30分钟，存液冷冻离心30分钟，转速为4000转/分钟（转速过大时，大分子将被分离），取离心上清液再精细过滤《通过石棉滤板布氏漏斗》去除尚存的沉淀悬浮物。清液中再加入标准试剂（含量在98%以上）固体硫酸铵到80%的饱和度。然后将此液以7000转/分钟（此转速可将有效大分子分离）冷冻离心30分钟，沉淀为粉红色糊状物将其分装在培养皿中，冷冻干燥得粉红色固体。研细后分装，按照药典方法测定其单位酶活，以每1g固体酶复合物每分钟催化果糖二磷酸钠的量大于40μg为合格产品，-20℃保存，用于果糖二磷酸钠含量的测定。
实施例2
专用固体复合酶的活力测定方法：
国药典化发〔2009〕12号文件(果糖二磷酸钠及其制剂质量标准征求意见稿)中：果糖二磷酸钠(FDP)检测方法中的固体复合酶试剂。实验结果见附图3，分别采用两种方法提取家兔运动肌肉中的固体酶复合物，冻干后对其称重并测定单位酶活力。图中固体酶复合物采用实施例1制备后产量显著提高约2.0倍，单位酶活力也显著提高约1.9倍，* P<0.001。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1. 用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，以兔肉为原料，通过裂解、离心的方法从所述的原料中提取醛缩酶（ALD）、磷酸丙糖异构酶（TIM）和甘油磷酸脱氢酶（GDH）复合物，其特征在于：所述的裂解为碱裂解，每1g所述的原料中加入1ml 0.01-0.1M浓度范围的碱性溶液；包括依次进行的如下步骤：
步骤1、将所述的原料打成肉泥；
步骤2、将所述的肉泥置于容器中，每1mL/g所述的原料中加入0.01-0.1M浓度范围的所述的碱性溶液，搅拌10-20分钟；
步骤3、冷冻离心10-20分钟，将上清液转移至新的容器中；
步骤4、将离心后的沉淀物再用0.01-0.1M浓度范围的所述的碱性溶液进行多次碱裂解、冷冻离心，将多次离心的上清液转移至所述的新的容器中；
步骤5、向所述的新的容器中缓慢加入质量含量在90-97%的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌至最终的硫酸铵溶液的饱和度为30-40%，调节pH至5.0±0.5，放置20-40分钟；
步骤6、将步骤5所得的溶液冷冻离心10-20分钟，取上清液再加入质量含量在90-97%的饱和硫酸铵溶液至最终的硫酸铵溶液的饱和度为50-60％，调节pH至3.5±0.5，放置20-40分钟；
步骤7、将步骤6所得的溶液冷冻离心10-20分钟，将沉淀物于-20℃预冻，然后冻干得所述的固体酶复合物。
2. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中的离心时的转速为5500-7000rpm。
3. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中的离心时的转速为5500-7000rpm。
4. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤6中的离心时的转速为8000-10000rpm。
5. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤7中的离心时的转速为8000-10000rpm。
6. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的碱性溶液为KOH溶液或NaOH溶液。
7. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的固体酶复合物的制备过程在0-4℃下进行。
8. 根据权利要求1所述的用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法，其特征在于：所述的原料为兔的背部肌肉或大腿部肌肉或两者的混合物。
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