CN103172601B

CN103172601B - 一种分离提取丹酚酸b的方法

Info

Publication number: CN103172601B
Application number: CN201310065798.3A
Authority: CN
Inventors: 王骊丽; 贺娜; 王文鹏; 屈倩
Original assignee: NORTHWEST UNIVERSITY
Current assignee: NORTHWEST UNIVERSITY
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-03-04
Also published as: CN103172601A

Abstract

本发明公开了一种从中药材丹参中分离制备丹酚酸B的方法。丹参药材经纯水提取后采用一种高效疏水相互作用色谱填料的色谱柱，以盐-水为洗脱体系，分离纯化水溶性成分丹酚酸B，并用高效反相液相色谱法和液-质联用技术对其进行质量监测，获得的丹酚酸B纯度可达到95%以上，质量回收率大于90%。本发明可以避免使用高浓度的有机溶剂带来的环境污染，且易于实现大规模制备丹酚酸B。

Description

一种分离提取丹酚酸B的方法

技术领域

本发明涉及一种用高效疏水相互作用色谱（HPHIC）固定相对丹参药材中有效成分丹酚酸B的分离制备方法，用反相液相色谱法对丹酚酸B进行质量监测，属于天然有效成分的分离与提取技术领域。

背景技术

丹参（Radix Salvia miltiorrhiza）为唇形科植物干燥的根及根茎，已发现丹参的有效活性成分有70余种，被广泛用于治疗血液循环疾病、心血管疾病以及月经失调等。其中从丹参植物的水提取物中可以分离得到多种水溶性有效成分，以酚酸类为主的丹酚酸B（Salvianolia acid B）是丹参水溶性成分中重要的活性物质，其含量约占丹参药材的5%，总丹酚酸类的70%。研究发现，丹酚酸B具有很强的生物活性，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显的保护作用，有抗血小板聚集和抗血栓的作用，同时对肾功能不全和肝损伤均有一定保护作用等。丹酚酸B是由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而形成一个四聚咖啡酸类，从化学结构可以看出其化学性质不是很稳定。

目前，分离制备丹酚酸B的方法有溶剂分离法、萃取法、大孔树脂吸附法以及高效反相液相色谱、高速逆流色谱法。但是这些分离制备方法的缺点是使大部分有效成分损失，色谱法则采用高浓度的有机溶剂(如甲醇/乙腈)作为流动相，在制备过程中气味较大，毒性较强，易挥发、易引起环境污染等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全、绿色、高效、稳定、可控的丹酚酸B的分离制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种分离提取丹酚酸B的方法，包括以下步骤：

（1）丹参切片加入丹参重量5～20倍的水提取并过滤得到丹参粗提液；

（2）丹参粗提液使用结构式（I）所示的高效疏水相互作用色谱介质分离，收集色谱馏分，冷冻干燥得到丹酚酸B；

（I）

其中R为，或，或，n=10-25；

是孔径为80～90?，粒径为5～10μm的硅胶微球；

色谱条件：流动相A液为0.5～3 mol/L (NH₄)₂SO₄，0～50 mmol/L KH₂PO₄，pH 5～8；流动相B液为0～50 mmol/L KH₂PO₄，pH 5～8；流速为0.5-2.0 mL/min；采用0-100% B液线性梯度洗脱30 min，延长100% B液10 min；检测波长280-290 nm。

上述步骤（1）中，丹参切片加入重量为5～20倍的纯水浸泡1～36 h后50～70℃炮制0.5～3h，1000～20000 rpm离心5～15 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤或真空抽滤得到丹参粗提液。

上述步骤（2）中，最优的固定相中结构式（I）中R为;空白基质是孔径为90?；粒径为5μm高纯硅胶微球；色谱条件：流动相A液为3 mol/L (NH₄)₂SO₄，pH 7.4；流动相B液为纯净水，pH 7.4；流速为1.0 mL/min；采用0-100% B线性梯度洗脱30 min，延长100%B液10 min；检测波长286 nm。

采用上述分离方法提取得到的丹酚酸B的质量监控方法：丹酚酸B用50%～100%乙醇溶解，采用高效反相液相色谱和液-质联用技术进行定性和定量分析，所述的高效反相液相色谱采用C18填料等度洗脱方式，流动相采用水：乙腈体积比为70:30～80:20，流速为0.5～1.0 mL/min。

上述结构式（I）所述的HPHIC固定相的制备方法为：以空白基质为原材料，空白基质可以是高纯小孔硅胶微球或聚合物基质微球，经过活化反应，活化方法为环氧氯丙烷法，烯丙基溴法或γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷法，然后以聚乙二醇600～1000（即PEG600～1000），苯甲醇，四氢糠醇作为配基分子，经过偶联反应即得本发明的色谱固定相。

本发明的优点在于：（1）利用HPHIC来分离丹参制备丹酚酸B，可以达到很好的分离效果，且制备得到的丹酚酸B纯度大于95%；（2）流动相采用盐-水体系，实现了对环境无污染的要求；（3）操作简单成熟，易于控制和放大。

附图说明

图1是本发明中以苯基为配体的HPHIC固定相对丹参分离的色谱图(*丹酚酸B)。图中横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处紫外吸收值（mAU）；

图2是本发明中以四氢糠醇为配体的HPHIC固定相对丹参分离的色谱图(*丹酚酸B) 。图中横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处紫外吸收值（mAU）；

图3是本发明中以PEG600为配体的HPHIC固定相对丹参分离的色谱图(*丹酚酸B)。图中横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处紫外吸收值（mAU）；

图4为本发明以苯基为配基的分析型色谱柱优化色谱条件后对丹参分离色谱图(*丹酚酸B)。图中横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处紫外吸收值（mAU）；

图5为本发明以苯基为配基的制备型色谱柱色优化谱条件后对丹参分离的色谱图(*丹酚酸B)。图中横坐标为保留时间（time），纵坐标为波长286nm处紫外吸收值（mAU）；

图6是丹酚酸B的液相色谱-质谱联用（LC-MS）图。图(A)为液相色谱图：其中“1”为样品，“2”为标准品;图（B）为样品和标准品质谱图（二者一致）：横坐标为质核比（m/z），纵坐标为分子离子峰的强度(Intens)；

图7是高效反相液相色谱对丹酚酸B质量监测的色谱图。图中：“1”为丹酚酸B标准品，“2”为丹参粗提液，“3”为HPHIC分离制备的丹酚酸B，“*”为目标物丹酚酸B峰。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。

实施例1

（1）HPHIC固定相制备与色谱柱

以高纯小孔硅胶(孔径为90?；粒径为5μm)作为空白基质，首先进行酸处理，将硅胶用1：1的盐酸120℃回流3～4 h，冷却，然后用蒸馏水反复洗涤，直到溶液显中性，真空干燥过夜。将酸处理好的硅胶用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（TM-560）进行活化，在90℃条件下缓慢滴加TM-560适量，与硅胶反应8h，然后依次用水、甲醇、水洗涤干净，真空干燥，即得环氧基硅胶。在1000 mL的三颈瓶中加入100g环氧基硅胶，再加入300 mL二氧六环、300 mL48%的三氟化硼乙醚及200 mL苯甲醇，超声5min，常温搅拌7h，产物用丙酮、甲醇、水洗涤干净，烘干即得苯基型的HPHIC填料。通过元素分析、红外、XPS对苯基型的HPHIC填料进行表征，确认了其结构如结构式（I）所述。

（2）苯基为配基固定相分离制备丹酚酸Ｂ

称取药材丹参切片10.0 g，加入10倍的纯水浸泡24 h后70℃炮制2 h，静置，全部转移至50 mL离心管，于10 000rpm，离心10min，残渣用适量纯水洗涤3次，静置、离心，合并上清液于100mL容量瓶中，用纯水稀释至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤得到丹参粗提液。

使用上述所制备的苯基型固定相自行装填分析型色谱柱，对丹参粗提液进行HPHIC分离制备。色谱条件：流动相A液为3 mol/L (NH₄)₂SO₄，50 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.0；流动相B液为50 mmol/L KH₂PO₄， pH7.0；流速为1.0 mL/min；采用0-100% B线性梯度洗脱，30 min，延长100% B液10 min；检测波长286 nm；进样量为50μL。色谱图见图1，可以得到基本的基线分离。

实施例2

与实施例1类似，不同的是步骤（1）将苯甲醇更换为四氢糠醇作为固定相配基，四氢糠醇取100mL与步骤（1）进行相同反应处理，得到四氢糠醇型HPHIC填料。通过元素分析、红外、XPS对苯基型的HPHIC填料进行表征，确认了其结构如结构式（I）所述。

与实施例1类似，不同的是步骤（2）用四氢糠醇型固定相对丹参粗提液进行高效疏水相互作用色谱分离制备。色谱图见图2，可以得到基本分离。

实施例3

与实施例1类似，不同的是步骤（1）将苯甲醇更换为PEG 600-1000作为固定相配基，聚乙二醇1000，600，400，200各取330 mL, 200mL, 140mL, 70mL与步骤（1）相同反应处理，得到PEG 600-1000型HPHIC填料。通过元素分析、红外、XPS对苯基型的HPHIC填料进行表征，确认了其结构如结构式（I）所述。

与实施例1类似，不同的是步骤（2）用聚乙二醇系列PEG 600固定相对丹参粗提液进行高效疏水相互作用色谱分离制备。色谱图见图3，可以得到基本分离。

实施例4

与实施例1类似，不同的是步骤（2）使用上述所制备的苯基型填料自行装填分析型色谱柱，对丹参粗提液进行高效疏水相互作用色谱分离制备。色谱条件：流动相A液为3 mol/L (NH₄)₂SO₄，pH 7.0；流动相B液为H₂O，pH7.0；流速为1.0 mL/min；采用0-100% B线性梯度洗脱，30 min，延长100% B液10 min；检测波长286 nm；进样量为100 μL。色谱图见图4，可以得到基本的基线分离。

实施例5

与实施例1类似，不同的是步骤（2）使用上述所制备的苯基型填料自行装填制备型色谱柱，对丹参粗提液进行高效疏水相互作用色谱分离制备。色谱条件：流动相A液为3 mol/L (NH₄)₂SO₄，10 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.0；流动相B液为10 mmol/L KH₂PO₄，pH7.0；流速为1.0 mL/min；采用0-100% B线性梯度洗脱，30 min，延长100% B液10 min；检测波长286 nm；进样量为1000μL。该固定相效果最佳，色谱条件优化后的分离效果见图5。

实施例6 HP-RPLC法对分离制备的丹酚酸B定性、定量监测

对苯基型HPHIC柱收集的丹酚酸B馏分于-80℃冰箱中冷冻后，放置于冷冻干燥仪进行冷冻干燥，获得白色粉末状丹酚酸B固体。用75%乙醇溶解，取上清液，用高效反相液相色谱（C₁₈柱）对其进行定性和定量分析。色谱条件：流动相A液为水+0.1%TFA；流动相B液为乙腈+0.1%TFA；流速为1.0 mL/min；A、B液浓度比为77:23的等度洗脱；检测波长286nm；进样量为20μL。液-质鉴定图谱见图6，色谱分析见图7。由峰面积计算得到制备的丹酚酸B的纯度大于95%，质量回收率达90%以上。

Claims

1.一种分离提取丹酚酸B的方法，其特征在于包括以下步骤：

（I）

其中R为，或，或，n=10-25；

空白基质是孔径为80～90?，粒径为5～10μm的硅胶微球；

色谱条件：流动相A液为0.5～3 mol/L (NH₄)₂SO₄，0～50 mmol/L KH₂PO₄，pH 5～8；流动相B液为0～50 mmol/L KH₂PO₄，pH 5～8；流速为0.5-2.0 mL/min；采用0-100% B液线性梯度洗脱；检测波长280～290 nm。

2.根据权利要求1所述的分离提取丹酚酸B的方法，其特征在于：步骤（1）中，丹参切片加入重量为5～20倍的纯水浸泡1～36 h后50～70℃炮制0.5～3h，1000～20000 rpm离心后用0.45 μm微孔滤膜过滤或真空抽滤得到丹参粗提液。

3.根据权利要求1所述的分离提取丹酚酸B的方法，其特征在于：步骤（2）中结构式（I）中R为；

空白基质是孔径为90?，粒径为5μm硅胶微球；

色谱条件：流动相A液为3 mol/L (NH₄)₂SO₄，pH 7.4；流动相B液为纯净水，pH 7.4；流速为1.0 mL/min；采用0-100% B线性梯度洗脱30 min，延长100%B液10 min；检测波长286 nm。