CN103169752A

CN103169752A - 一种木鳖子提取物及其制备方法和用途

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Publication number: CN103169752A
Application number: CN2011104424930A
Authority: CN
Inventors: 郁韵秋; 刘洪瑞; 林志燕
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: CN103169752B

Abstract

本发明属医学检验领域，涉及一种木鳖子提取物及其制备方法和抗肿瘤的用途。本发明对待测提取样品冷浸过后，以高效液相色谱为手段进行分离和纯化得到相应组分，制得具抗肿瘤活性的木鳖子提取物，经体外药理实验，实验结果表明，木鳖子提取物通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞生长周期显著抑制癌细胞的增殖，对于人胃癌细胞及其他肿瘤细胞有明显的抑制作用，可作为活性成分制备治疗实体肿瘤的药物，尤其是治疗人胃癌、人前列腺癌或结肠癌的药物。本发明制备方法简单，方便且成本低；产率高，提取物组分纯度高、重现性高。

Description

一种木鳖子提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属医学检验领域，涉及中药材中的活性物质，具体涉及一种木鳖子提取物及其制备方法和抗肿瘤的用途。

背景技术

据统计报道，恶性肿瘤已成为严重威胁人类生命的疑难疾病，是仅次于心脏病的第二杀手。目前，临床实践常用的对恶性肿瘤的药物治疗方法大多首选化疗，然而，化疗时会带来极其严重的副作用。现有技术研究报道若干中草药在治疗疑难杂症、恶性肿瘤等方面具有独到之处。因此，从天然资源中寻找和筛选抗肿瘤的活性成分，以进一步开发有效低毒的治疗恶性肿瘤的药物，已经引起医药研究者的广泛关注。

木鳖子为葫芦科植物木鳖(Momordica cochinchinensis(Lour.)Spreng)的干燥成熟种子，主产于广西、四川、湖北、河南、安徽、浙江、福建、广东、贵州、云南等地。据《现代中药大辞典》记载，木鳖子性味苦、微甘，有毒，入肝、脾、胃经，具散结消肿，攻毒疗疮功效，常用于疮疡肿毒，乳痈，瘰疬，痔漏，干癣，秃疮。

有研究将中药材木鳖子运用在抗肿瘤复方中，与其它中药成分起协同作用，但中药复方尚达不到国家促进中药产业化、国际化以及对中药标准水平的要求。有关研究者期望，从天然中药材木鳖子中筛选抗肿瘤的活性成分以进一步开发有效低毒的治疗恶性肿瘤的药物。

迄今，尚未见有关木鳖子提取物其独特的并通过体外药理实验证明的抗肿瘤活性的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种木鳖子提取物及其制备方法。

本发明的进一步目的是提供该木鳖子提取物的抗肿瘤活性，尤其是对人胃癌、人前列腺癌和结肠癌抑制作用。

本发明对中药材木鳖子进行，从中提取得到一种活性提取物，通过体外药理实验证明该提取物对人胃癌细胞SGC7901、人前列腺癌细胞PC-3和小鼠结肠癌细胞CT-26具有抑制其生长作用，进一步可作为活性成分制备治疗人胃癌、人前列腺癌和结肠癌的药物，为中药材木鳖子提供了新的广阔的应用前景。

本发明提供了制备木鳖子中活性提取物的方法，其包括步骤：

1)样品制备

木鳖子中粉，用乙酸钠溶液20mM，pH 5.0在冰箱中4℃冷藏提取过夜，离心后滤液冻干得提取物F；

2)样品分离与纯化

采用半制备型的液相色谱柱，其填料为十八烷基键合相硅胶，高效液相系统采用半制备型的紫外检测器以及高压泵，流动相采用A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水(含0.045％甲酸)，梯度洗脱，依照出峰情况和保留时间收集，得有效部位。

更具体的，本发明的木鳖子中活性提取物通过下述方法制备：

将木鳖子中药材粉碎得到木鳖子中粉，取木鳖子中粉100g，用500ml乙酸钠溶液(20mM，pH 5.0)在冰箱中4℃冷藏提取过夜，离心后滤液冻干得提取物，于-20℃冰箱中保存备用。将提取得到的木鳖子提取物冻干粉用水溶解后，离心过滤除去少量不溶杂质，用色谱法进行进一步的分离(如图1所示)，色谱条件是：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150×10mm，5μm)；柱温：室温；流动相：A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水(含0.045％甲酸)；流速：2ml/min；进样量：1000μL；检测器：紫外可变波长检测器(VWD)，检测波长254nm。

洗脱方式：梯度洗脱(如表1所示)，收集26-40min馏分，合并收集液冻干后于-20℃冰箱中保存备用。

表1木鳖子提取物梯度洗脱时间表

本发明对提取得到活性提取物，进行了体外药理实验，通过细胞培养实验，检测了木鳖子提取物在体外对人胃癌细胞SGC7901、人前列腺癌细胞PC-3和小鼠结肠癌细胞CT-26的作用及机制，实验结果表明，木鳖子提取物通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞生长周期而显著抑制癌细胞的增殖，对于人胃癌细胞SGC7901的抑制作用F3＞F＞F1＞F2，其中F和F3对其他肿瘤细胞也有明显的抑制作用(如图2、表2所示)。

表2木鳖子提取物F及F3抑制人胃癌细胞SGC7901、人前列腺癌细胞PC-3和小鼠结肠癌细胞CT-26细胞增殖的IC₅₀值。

表3是采用PI染色和流式细胞仪检测木鳖子提取物对人胃癌细胞SGC7901生长周期的影响，结果显示了不同浓度木鳖子提取物处理SGC7901细胞48h，其中A.Control；B.0.1mg/L；C.0.2mg/L，D.0.4mg/L。

表2

表3

本发明的木鳖子提取物可作为活性成分制备治疗实体肿瘤的药物，尤其是治疗人胃癌、人前列腺癌或结肠癌的药物。

本发明的木鳖子提取物及其制备方法具有如下优点：

(1)制备简单，采用冷浸提取法，不仅方便且成本低；

(2)提取物组分纯度高，用半制备高效液相色谱法进行分离和纯化得到相应的组分，重现性还且纯度高。

附图说明

图1木鳖子提取物色谱分离图。

图2木鳖子提取物(F，F1，F2，F3)抑制人胃癌细胞SGC7901增殖的作用，不同浓度木鳖子提取物(F，F1，F2，F3)处理时间为72h，与空白对照组相比，*p＜0.05，#p＜0.01。

图3采用Hoechst 33258染色和PI/Annexin V双染检测木鳖子提取物对SGC7901细胞凋亡的作用。不同浓度木鳖子提取物处理SGC7901细胞48h，A.Hoechst 33258染色；B.PI/Annexin V双染。

具体实施方式

实施例1.制备木鳖子提取物

将木鳖子中药材粉碎得到木鳖子中粉，取木鳖子中粉100g，用500ml乙酸钠溶液(20mM，pH 5.0)在冰箱中4℃冷藏提取过夜，离心后滤液冻干得提取物(F)，于-20℃冰箱中保存备用，将提取得到的木鳖子提取物冻干粉(F)用水溶解后，离心过滤除去少量不溶杂质，用色谱法进行进一步的分离(色谱图如图1所示)，收集26-40min馏分，合并收集液冻干后于-20℃冰箱中保存备用。

色谱条件如下：

色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150×10mm，5μm)

柱温：室温

流动相：A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水(含0.045％甲酸)

流速：2ml/min

进样量：1000μL

检测器：紫外可变波长检测器(VWD)，检测波长254nm

洗脱方式：梯度洗脱(表1)。

表1木鳖子提取物梯度洗脱时间表

实施例2.木鳖子提取物体外抗肿瘤作用试验

将对数生长期的SGC7901细胞接种于96孔板中，分为空白对照组、卡铂对照组和木鳖子提取物处理组(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml)，37℃培养72h后进行MTT检测，计算细胞增殖抑制率。结果显示，随着剂量增加，木鳖子提取物显著抑制SGC7901细胞增殖(如图2所示)。

实施例3.木鳖子提取物F及F3对不同肿瘤细胞的IC₅₀值

将对数生长期的人胃癌细胞SGC7901、人前列腺癌细胞PC-3和小鼠结肠癌细胞CT-26分别接种于96孔板中，分为空白对照组、卡铂对照组和木鳖子提取物处理组(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml)，37℃培养48h、72h、96h后进行MTT检测，计算细胞增殖抑制率。结果显示，随着剂量增加，木鳖子提取物显著抑制各种癌细胞增殖(如表2所示)。

实施例4.木鳖子提取物抑制SGC7901细胞生长周期的作用

将对数生长期的SGC7901细胞接种于96孔板内，加入木鳖子提取物处理48h后，离心收集细胞，PBS洗2次，加入预冷的70％乙醇固定过夜。离心收集细胞，PBS洗1次，加入溴化乙锭(PI)避光孵育30分钟，用流式细胞仪检测，结果用ModFit软件分析。结果显示，随着剂量增加，木鳖子提取物将SGC7901细胞阻滞于S期(如表3所示)。

实施例4.木鳖子提取物诱导SGC7901细胞生长凋亡的作用

将SGC7901将细胞接种于24孔板，加入木鳖子提取物处理48h后，加入终浓度为5μg/ml的Hoechst33342溶液，室温避光放置5分钟。弃培养基，4％甲醛固定10min，吸弃，PBS洗涤1-2次，加入1ml PBS。荧光显微镜下观察凋亡细胞大小、形态。另外，离心收集SGC7901细胞，用预冷PBS漂洗1次，加入Annexin V-FITC混合均匀，室温避光温育10min。PBS洗1次，加入适量PI，用流式细胞仪进行细胞凋亡定量检测。结果显示，木鳖子提取物具有明显诱导SGC7901细胞凋亡的作用(如图3所示)。

Claims

1.一种木鳖子提取物，其特征在于，该木鳖子提取物通过下述方法制备：

1)样品制备

2)样品分离与纯化

采用半制备型的液相色谱柱，其填料为十八烷基键合相硅胶，高效液相系统采用半制备型的紫外检测器以及高压泵，流动相采用A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水，其中含0.045％甲酸，梯度洗脱，依照出峰情况和保留时间收集，得有效部位。

2.按权利要求1所述的木鳖子提取物，其特征在于，所述的木鳖子提取物制备中，色谱条件是：色谱柱：YMC-Pack ODS-A 150×10mm，5μm；柱温：室温；流动相：A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水，其中含0.045％甲酸；流速：2ml/min；进样量：1000μL；检测器：紫外可变波长检测器，检测波长254nm；

洗脱方式：梯度洗脱，收集26-40min馏分，合并收集液冻干后于-20℃冰箱保存备用。

3.权利要求1木鳖子提取物在制备治疗实体肿瘤药物中的用途。

4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的实体肿瘤是人胃癌、人前列腺癌或结肠癌。