CN103163260B

CN103163260B - 一种药物的指纹图谱测定方法

Info

Publication number: CN103163260B
Application number: CN201110422716.7A
Authority: CN
Inventors: 邬智刚; 朱小兰; 柯潇
Original assignee: KANGHONG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Current assignee: KANGHONG PHARMACEUTICAL CO Ltd CHENGDU
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: CN103163260A

Abstract

本发明涉及一种药物指纹图谱的测定方法，具体涉及大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物和上述三种药物组成的药物制剂的指纹图谱的测定方法，本发明中供试品溶液的制备：取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加乙醇溶解、定容、过滤即得供试品；色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸和20mM醋酸铵水溶液；检测波长为254nm；(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明获得指纹图谱检测方法可重复性高、物质检测全面，且能直接与质谱仪联用，具有很好的药物监控效果。

Description

一种药物的指纹图谱测定方法

技术领域

本发明涉及质量标准测定方法，具体涉及一种药物的指纹图谱及其测定方法。

背景技术

一清胶囊是由汉代医学名著《金匮要略》中的“泻心汤”发展而来，其配方由大黄、黄芩、黄连组成，功用为泻火解毒、燥湿泄热，主治邪火内炽，迫血妄行，吐血，衄血，便秘溲赤；三焦积热，眼目赤肿，口舌生疮，外证疮疡，心胸烦闷，大便秘绪；湿热黄疸，胸中烦热痞满，舌苔黄腻，脉数实者。一清胶囊和颗粒是由根据该汉代处方发展而来，其中一清胶囊的功能主治：清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所致的身热烦躁、目赤口疮、咽喉牙龈肿痛、大便秘结、吐血、咯血、衄血、痔血；咽炎、扁桃体炎、牙龈炎见上述症候者。《中华人民共和国药典》(2005版)第一部401-402页记载了一清胶囊和颗粒的处方及制备工艺。其中一清胶囊的处方为：黄连660g、大黄2000g、黄芩1000g；制法为：以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。含量测定为：本品每粒含黄芩以黄芩苷(C₂₁H₁₈O₁₁)计，不得少于30.0mg；含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)和大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)的总量计，不得少于0.70mg。

《中国药典》2010年版规定黄芩药材含黄芩苷(C₂₁H₁₈O₁₁)不得少于9.0％，黄芩饮片不得少于8.0％；大黄药材含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的总量不得少于1.5％(按《中国药典》2010年版含量测定项目方法，检测多批大黄药材结果大黄素和大黄酚约占上述5种成分总量的50％，即大黄含大黄素和大黄酚的总量不得少于0.75％)。按此计算，一清胶囊黄芩中有效成分黄芩苷的提取率只有40％左右，大黄中有效成分大黄素和大黄酚的提取率仅有5％左右。

目前市场上存在一清产品由一清胶囊、一清颗粒以及一清软胶囊等等，制剂形式多样；而随着目前中药材的价格升高，使得降低药材量的一清新处方和工艺变为研究重点，如CN102178753A通过改变提取工艺，降低50％-95％的药材用量，来获得新组成的一清；同时由于野生药材资源的匮乏，人工大规模的种植大黄、黄芩和黄连也变为开发重点。鉴于目前市场上目前一清制剂形式的多样，配方的不同、提取方法不同以及药材本身的种植模式的改变，治疗效果也会存在一定的差异，因此，一清制剂的质量监控方法变得十分重要。目前，药典以及其他文献给出的一清质量监控方法，多采用薄层色谱法鉴别内容物，而对于含量多是以大黄中的大黄素和大黄酚，黄芩中的黄芩苷作为含量鉴定的标准。但是一清中大黄、黄芩和黄连中的每单个成分中均含有大量的其他成分，如大黄中主要的化学成分为蒽醌衍生物、苯基丁酮吡喃葡萄糖，二苯乙烯、丹宁酸和萘衍生物等[W.Jin，Y.F.Wang，R.L.Ge，H.M.Shi，C.Q.Jia，P.F.Tu.Simultaneous analysis of multiple bioactive constituents in Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.by high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21(14)：2351-2360.]；黄芩的主要化学成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类物质，目前已报道的黄酮有60多种，主要以葡萄糖苷的形式存在[温华珍，肖盛元，王义明，罗国安.黄芩化学成分及炮制学研究，天然产物研究与开发，2004，16：575-580；J.Han，M.Ye，M.Xu，J.H.Sun，B.R.Wang，D.Guo.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry，Journal of Chromatography B，2007，848：355-362；G.Z.Liu，J.Y.Ma，Y.Z.Chen，Q.Q.Tian，Y.Shen，X.S.Wang，B.Chen，S.Z.Yao.Investigation of flavonoid profile of Scutellaria baicalensis Georgi by high performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ion trap mass spectrometry，Journal of Chromatography A，2009，1216(23)：4809-4814.]；黄连的主要活性成分为原小蘖碱、吲哚类生物碱和喹啉酮生物碱等[X.B.Luo，B.Chen，S.Z.Yao.Simultaneous analysis of protoberberine，indolequinoline and quinolone alkaloids in coptis-evodia herb couple and the Chinese herbal preparations by high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry，Talanta，2005，66(1)：103-110]。因此如何更精确的监控一清制剂的质量标准成为了新的研究热点。

随着中药现代化、国际化的不断发展，现代分析技术如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱、X光衍射法、毛细管电泳、分子生物技术以及其他分析方法不断在中药鉴定中药质控等方面的应用，建立了一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法即指纹图谱。目前，美国FDA，英国和印度草药典，德国药用植物学会，加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法；2000年第4季度我国下发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》率先要求中药注射剂推行指纹图谱的质控办法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。其次，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。而一清制剂是由大黄、黄芩和黄连组成，属于汉代古方，通过改进后的制剂如胶囊、颗粒和软胶囊等的治疗效果也已经得到临床上充分印证，但是是否能保证药物的质量以及有效成分的含量，仅靠简单的大黄中大黄素和大黄酚和黄芩中黄芩苷的质控是不够的，要控制其疗效，必须对它的活性物质群进行控制，因此，现代手段指纹图谱的引入质控标准变得尤为重要。

Juan Chen等[Juan Chen，Yang Yang and Yan-Ping Shi，Simultaneous quantification of twelve active components in Yiqing granule by ultra-performance liquid chromatography：application to quality control study，biomedical chromatography，2011，25(9)：1045-4053]公开一种利用超高效液相色谱(UPLC)和光电二极管阵列(PDA)检测器来检测一清胶囊中的活性成分，共获得12种活性物质，其分别为小檗碱、巴马汀、药根碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、黄芩、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素。Haibin Qu等[Haibin Qu，Yanhong Ma，KeYu，Yiyu Cheng，Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，43：66-72]公开一种反相高效液相层析和二极管阵列(DAD)检测器来检测一清胶囊中的活性成分，共检测到8种活性物质，分别为黄连、芦荟、大黄素、大黄酸、大黄素、大黄、黄芩、黄芩素和汉黄芩素。但是以上检测方法获得指纹图谱，物质检测不全，难以全面的反映一清制剂中的物质成分，因此在质控过程中存在一定的缺陷。如何更好获得较全面的一清制剂的指纹图谱，以期更好的监控一清制剂的质量，从而获得质量可控、安全有效的药物变得十分重要。

发明内容

针对目前市场上黄芩提取物、大黄提取物和黄连提取物因来源、产地等不同从而造成一清制剂的质量难以监控的问题，本发明通过大量的实验研究，获得一种可以有效监控药物质量，从而保证药物安全有效的指纹图谱的检测方法。

本发明一方面提供了一种药物指纹图谱的测定方法，该方法包括

(a)供试品溶液的制备：取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加75％乙醇溶解、定容、过滤即得供试品；

(b)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸和20mM醋酸铵水溶液，检测波长为254nm。

(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；

其中所述的药物为大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物或上述三种提取物组成的中药制剂。

上述指纹图谱的检测方法中供试品溶液的制备优选为精密称量药物置于50ml量瓶中，加入75％乙醇约40ml，超声40min，加75％乙醇至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得供试品；其中所述药物为黄连提取物0.09g、大黄提取物0.27g、黄芩提取物0.14g或中药制剂0.5g的一种。

本发明涉及的中药制剂主要有大黄提取物、黄连提取物和黄芩提取物组成。该中药制剂的制备方法优选为黄连660g、大黄2000g、黄芩1000g；制法为：以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

本发明还提供了一种将上述指纹图谱的检测方法与质谱仪联用的方法，具体为将由高效液相色谱仪的紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪进行物质测定；其中所述质谱仪检测条件优选为如下条件：电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；全扫描质量范围：100-1000amu；二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响度强度最高的2个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev；其中所述正离子模式检测条件更优选为如下条件：喷雾电压4.5kV：鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为25V；所述负离子模式检测条件更优选为如下条件：喷雾电压4.5kV：鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为25V。

上述药物指纹图谱的测定方法中所用的色谱柱优选为安捷伦(Agilent)的Eclipse PlusC18。

上述检测方法中所述梯度洗脱的程序优选如下程序：

其中下述比例为体积比

0min时，流动相A∶流动相B＝5∶95

5min时，流动相A∶流动相B＝14∶86

25min时，流动相A∶流动相B＝20∶80

50min时，流动相A∶流动相B＝25∶75

80min时，流动相A∶流动相B＝60∶40

85min时，流动相A∶流动相B＝80∶20

91min时，流动相A∶流动相B＝80∶20

92min时，流动相A∶流动相B＝5∶95

100min时，流动相A∶流动相B＝5∶95；

其中柱温为25-30℃，流速为1.0ml/min。

本发明还进一步提供了大黄提取物的指纹图谱，其含有11个特征峰，分别为：

1号峰为没食子酸4-O-β-D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟

2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟

23号峰为大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为51.00分钟

24号峰为大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.58分钟

25号峰为大黄酚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为53.65分钟

26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟

28号峰为大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为60.71分钟

31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟

39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟

40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟

41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟。

本发明还提供了黄连提取物得指纹图谱，其含有9个特征峰，分别为：

3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟

8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟

15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟

16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟

17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟

18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟

21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟

22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟

27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟。

本发明还提供了黄芩提取物的指纹图谱，其含有21个特征峰，分别为：

4号峰为高黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为15.04分钟

5号峰为白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷平均保留时间为20.13分钟

6号峰为白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖平均保留时间为22.98分钟

7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟

9号峰为异鼠李素-7-O-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟

10号峰为5，6-二羟基-7-O-葡萄糖苷酸黄烷酮平均保留时间为29.61分钟

11号峰为去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为31.34分钟

12号峰为黄芩素-6-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为33.08分钟

13号峰为5，7，3-三羟基-4-甲氧基黄酮平均保留时间为33.72分钟

14号峰为木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为34.03分钟

19号峰为5，6，7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为37.17分钟

20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟

29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟

30号峰为黄芩素平均保留时间为62.5分钟

32号峰为黄芩新素I 平均保留时间为70.64分钟

33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟

34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟

35号峰为5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮平均保留时间为71.63分钟

36号峰为黄芩新素II 平均保留时间为72.31分钟

37号峰为木蝴蝶素A 平均保留时间为72.68分钟

38号峰为5，2’-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮平均保留时间为74.76分钟。

本发明还进一步提供了由大黄提取物、黄连提取物和黄芩提取物组成的中药制剂得指纹图谱，其含有41个特征峰，分别为：

1号峰为没食子酸4-O-β-D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟

2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟

3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟

4号峰为高黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为15.04分钟

7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟

8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟

9号峰为异鼠李素-7-O-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟

12号峰为黄芩素-6-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为33.08分钟

14号峰为木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖苷酸平均保留时间为34.03分钟

15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟

16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟

17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟

18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟

20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟

21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟

22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟

23号峰为大黄酚-1-O--D-吡喃葡萄糖苷平均保留时间为51.00分钟

26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟

27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟

29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟

30号峰为黄芩素平均保留时间为62.50分钟

31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟

32号峰为黄芩新素I 平均保留时间为70.64分钟

33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟

34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟

36号峰为黄芩新素II 平均保留时间为72.31分钟

37号峰为木蝴蝶素A 平均保留时间为72.68分钟

38号峰为5，2’-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮平均保留时间为74.76分钟

39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟

40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟

41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟

本发明通过液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析方法鉴定一清胶囊中的化学成分，通过将色谱峰的保留时间和质谱图，与对照品或文献进行对比，对41个色谱峰进行了归属和鉴定，其中有8个化合物通过与对照品保留时间进行对照，结构得到确证，被鉴定的化合物结构如下。

上述化合物主要来自于黄连；

上述化合物主要来自于黄芩；

上述化合物主要来自于大黄；

其中上述化合物：1、没食子酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Gallic acid 4-O-β-D-glucopyranoside)；2、没食子酸(Gallic acid)；3、木兰花碱(Magnoflorine)；4、高黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸(Scutellarein-7-O-glucuronide)；5、白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖(Chrysin-6-C-ara-8-C-glu)；6、白杨素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖(Chrysin-6-C-glu-8-C-ara)；7、黄芩苷(Baicalin)；8、羟(基)小檗碱(Berberastine)；9、异鼠李素-7-O-鼠李糖-葡萄糖(Isorhamnetin-7-O-rha-glu)；10、5，6-二羟基-7-O-葡萄糖苷酸黄烷酮(5，6-Dihydroxy-7-O-glu acid flavanone)；11、去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸(norwogonion-7-O-glucuronide)；12、汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷(Wogonin-7-O-glucoside)；13、5，7，3-三羟基-4’-甲氧基黄酮(5，7，3-Trihydroxy-4’-methoxyflavone)；14、木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖酸(Oroxylin A-7-O-glu acid)；15、非洲防己碱(columbamine)；16、表小檗碱(epiberberine)；17、药根碱(Jatrorrhizine)；18、黄连碱(Coptisine)；19、5，6，7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖苷酸(5，6，7-Trihydroxy-8-methoxy flavone-7-O-glucuronide)；20、汉黄芩苷(Wogonoside)；21、巴马汀(Palmatine)；22、小檗碱(Berberine)；23、大黄酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Chrysophanol-1-O-β-D-glucopyranoside)；24、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside)；25、大黄酚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside)；26、芦荟大黄素(Aloe-emodin)；27、13-甲基小檗碱(13-Methylberberine)；28、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Physcion-8-O-β-D-glucopyranoside)；29、去甲汉黄芩素(5，7，8-Trihydroxy flavone(Norwogonin))；30、黄芩素Baicalein；31、大黄酸(Rhein)；32、黄芩新素I(5，2’-Dihydroxy-7，8，6’-trimethoxy flavone(Skullcapflavone I))；33、汉黄芩素(Wogonin)；34、白杨素(5，7-Dihydroxy flavone(Chrysin))；35、5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮 (5，7-Dihydroxy-6，8-dimethoxy flavone)；36、黄芩新素II(Skullcapflavone II)；37、木蝴蝶素(oroxylin-A)；38、5，2’-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮(5，2’-Dihydroxy-6，7，8-trimethoxyflavone)；39、大黄素(Emodin)；40、大黄酚(Chrysophanol)；41、大黄素甲醚(Physcion)。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明能够有效的检测黄连提取物、黄芩提取物及大黄提取物的指纹图谱，并能有效确定相关峰所对应的物质结构，比现有技术更能有效的监控上述三种中药提取物的质量。

2、本发明获得指纹图谱比较全面，能够很好的的监控由黄连提取物、黄芩提取物及大黄提取物组成一清制剂的质量，从而获得质量可控、安全有效的药物。

3、本发明指纹图谱测定方法可重复性好，稳定好。

4、本发明的HPLC检测条件避免了磷酸及其盐的使用，能够在经高效液相色谱检测后直接与质谱仪联用，有效确定相关物质的结构，能更好的监控相关药物的质量。

说明书附图

图1、对照品HPLC色谱图

图2-1、一清胶囊HPLC色谱图全图(0-100min)

图2-2、一清胶囊HPLC色谱图(0-24min局部放大图)

图2-3、一清胶囊HPLC色谱图(24-40min局部放大图)

图2-4、一清胶囊HPLC色谱图(45-67min局部放大图)

图2-5、一清胶囊HPLC色谱图(67-89min局部放大图)

图3、空白基线HPLC色谱图

图4、黄芩提取物HPLC色谱图

图5、黄连提取物HPLC色谱图

图6、大黄提取物HPLC色谱图

图7、批号为20090906的一清胶囊HPLC色谱图

图8、批号为20090916的一清胶囊HPLC色谱图

图9、批号为20100814的一清胶囊HPLC色谱图

具体实施方式

1.样品和试剂

1.1样品一清胶囊、大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物由成都康弘制药有限公司提供，

按照以下工艺制备：

一清胶囊的制备工艺：黄连660g、大黄2000g、黄芩1000g；制法为：以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

大黄提取物的制备：取大黄2000g，加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉

黄连提取物的制备：取黄连660g，加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉

黄芩提取物的制备：取黄芩1000g，加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉。

对照品黄芩苷(110715-200815)、黄芩素(111595-200905)、盐酸小檗碱(110713-200910)、大黄酸(0757-2008206)、大黄素(110756-200110)、大黄酚(110796-200310)、大黄素甲醚(110758-200610)和芦荟大黄素(110795-200806)，购自中国药品生物制品检定所。

1.2试剂

乙腈(HPLC，Sigma aldrich Company Inc.USA)

乙醇、甲酸、醋酸铵为分析纯(Sigma aldrich Company Inc.USA)

纯净水经Milli-Q纯水系统自制(Millipore Bedford，MA，USA)

2.一清胶囊供试品溶液制备

取本品胶囊内容物0.5g于50ml量瓶中，加入75％乙醇约40ml，超声40min，加75％乙醇至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得。

3.提取物供试品溶液制备

提取物按照一清胶囊处方配比称取样品，按“一清胶囊供试品溶液制备”方式进行制备。黄连提取物称样量为0.09g，大黄提取物称样量为0.27g，黄芩提取物的称样量为0.14g。

4.对照品溶液的制备

称取适量的对照品，置25ml容量瓶，加入甲醇超声溶解，定容，即得。对照品溶液中各成分的浓度为：黄芩苷0.0716mg/ml、黄芩素0.0716mg/ml、盐酸小檗碱0.0820mg/ml、大黄酸0.0512mg/ml、大黄素0.0784mg/ml、大黄酚0.0872mg/ml、大黄素甲醚0.1164mg/ml和芦荟大黄素0.0716mg/ml

5、液相色谱条件

仪器：Agilent infinity 1290液相色谱仪(Agilent，USA)

以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱：Eclipse plus C18(250mm×4.6mm，5um)(Agilent，USA)

流动相：流动相A：乙腈(ACN)；流动相B：0.1％甲酸和20mM醋酸铵水溶液(0.1％HCOOH， 20mMNH4Ac)，按梯度洗脱，洗脱程序如表1：

表1梯度洗脱程序表

柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；进样体积：5ul

6、质谱条件

仪器：Finnigan LTQ离子肼质谱(电喷雾电离源)(San Jose，CA，USA)。

从紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪的流速为0.2ml/min。电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气。正离子模式下：喷雾电压4.5kV-鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为25V。负离子模式下：喷雾电压4.5kV：鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为25V。全扫描质量范围：100-1000amu。二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响度强度最高的2个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。

7、结构鉴定

根据对照品峰的保留时间和样品峰的保留时间进行比对，可以鉴定样品中的8个成分，根据样品中色谱峰的化合物质谱图与文献[1-9]进行比较，41个化合物得到鉴定。峰的归属见表2。

表2.一清胶囊化合物鉴定表

注：“/”表示该化合物在相应的离子模式下没响应，“a”表示化合物通过与对照品对比确定结构。

分析结论

本发明测定指纹图谱的方法，能够很好获得大黄提取物、黄芩提取物、黄连提取物以及一清胶囊的指纹图谱，并能通过质谱有效的确定主要特征峰代表的化合物，其中大黄提取物的指纹图谱(附图6)中含有11个化合物结构可确定的特征峰、黄连提取物的指纹图谱(附图5)中含有9个化合物结构可确定的特征峰、黄芩提取物的指纹图谱(附图4)中含有21个化合物结构可确定的特征峰，而通过本发明测定指纹图谱的方法，在一清胶囊的指纹图谱(附图2-1、2-2、2-3、2-4、2-5)中能够完整的呈现上述41个可确定的结构的特征峰，说明本发明指纹图谱的测定方法，更能体现一清胶囊中主要的物质结构，从而能够有效的监控一清胶囊的质量、确保相关药物的安全、有效。

同时通过不同批次(如批号为20090906、20090916、20100814)的一清胶囊检测得到的指纹图谱(附图7、8、9)可知，本发明检测方法具有很好的可重复性。

文献：

[1]W.Jin，Y.F.Wang，R.L.Ge，H.M.Shi，C.Q.Jia，P.F.Tu.Simultaneous analysis of multiple bioactive constituents in Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.by high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21(14)：2351-2360.]；

[2]J.Han，M.Ye，M.Xu，J.H.Sun，B.R.Wang，D.Guo.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry，Journal of Chromatography B，2007，848：355-362；

[3]G.Z.Liu，J.Y.Ma，Y.Z.Chen，Q.Q.Tian，Y.Shen，X.S.Wang，B.Chen，S.Z.Yao.Investigation of flavonoid profile of Scutellaria baicalensis Georgi by high performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ion trap mass spectrometry，Journal of Chromatography A，2009，1216(23)：4809-4814.]；

[4]X.B.Luo，B.Chen，S.Z.Yao.Simultaneous analysis of protoberberine，indolequinoline and qumolone alkaloids in coptis-evodia herb couple and the Chinese herbal preparations by high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry，Talanta，2005，66(1)：103-110]。

[5]J.B.Wang，Y.Qin，W.J.Kong，Z.W.Wang，L.N.Zeng，F.Fang，C.Jin，Y.L.Zhao，X.H.Xiao.Identification of the antidiarrhoeal components in official rhubarb using liquid chromatography-tandem mass spectrometry Food Chemistry 129(2011)1737-1743。

[6]J.H.Chen，F.M.Wang，J.Liu，F.S.C.Lee，X.R.Wang，H.H Yang.Analysis of alkaloids in Coptis chinensis Franch by accelerated solvent extraction combined with ultra performance liquid chromatographic analysis with photodiode array and tandem mass spectrometry detectiohs，Ahalytica ChimicaActa，2008，613(2)：184-195.

[7]W.C.Chuang，D.S.Young，L.L.K.L.，S.J.Sheu.Liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric analysis of Coptidis Rhizoma，Journal of Chromatography A，1996，755(1)：19-26.

[8]D.W.Wang，Z.Q Liu，M.Q.Guo，S.Y.Liu，Structural elucidation and identification of alkaloids inRhizoma Coptidis by electrospray ionization tandem mass spectrometry，Journal of Mass Spectrometry，2004，39：1356-1365.

[9]M.Ye，J.Han，H.B.Chen，J.H.Zheng，D.A.Guo，Analysis of Phenolic Compounds in Rhubarbs Using Liquid Chromatography Coupled with Electrospray Ionization Mass Spectrometry，Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2007，18：82-91。

Claims

1.一种药物指纹图谱的测定方法，其特征在于包含

(a)供试品溶液的制备：取中药提取物，精密称量，置于容量瓶中，加乙醇溶解、定容、过滤即得供试品；

(b)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸和20mM醋酸铵水溶液；检测波长为254nm；

(c)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；其中所述的药物为大黄提取物、黄连提取物、黄芩提取物或上述三种提取物组成的中药制剂；所述梯度洗脱的程序如下：其中下述比例为体积比

0min时，流动相A∶流动相B＝5∶95

5min时，流动相A∶流动相B＝14∶86

25min时，流动相A∶流动相B＝20∶80

50min时，流动相A∶流动相B＝25∶75

80min时，流动相A∶流动相B＝60∶40

85min时，流动相A∶流动相B＝80∶20

91min时，流动相A∶流动相B＝80∶20

92min时，流动相A∶流动相B＝5∶95

100min时，流动相A∶流动相B＝5∶95；

其中柱温为25-30℃，流速为1.0ml/min。

2.根据权利要求1所述药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述供试品溶液的制备方法如下：精密称量药物置于50ml量瓶中，加入75％乙醇约40ml，超声40min，加75％乙醇至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45um滤膜，取续滤液，即得供试品；其中所述药物为黄连提取物0.09g、大黄提取物0.27g、黄芩提取物0.14g或中药制剂0.5g的一种。

3.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述中药制剂的制备方法为黄连660g、大黄2000g、黄芩1000g；制法为：以上三味药材，分别加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄、黄连的混合浸膏粉；两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

4.根据权利要求1-3中任一项所述药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱仪的紫外检测器出来的溶液经过分流，进入质谱仪进行物质测定。

5.根据权利要求4所述药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述质谱仪检测条件如下：电喷雾电离，正离子模式和负离子模式检测，氮气作为鞘气、辅助气和吹扫气；全扫描质量范围：100-1000amu；二级质谱用数据依赖模式采集，全扫描图谱中响度强度最高的2个峰用于二级质谱分析，高纯氦气用作碰撞气，碰撞能量为35ev。

6.根据权利要求5所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述正离子模式检测条件：喷雾电压4.5kV：鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为25V；所述负离子模式检测条件：喷雾电压4.5kV：鞘气为20arb，辅助气为5arb，吹扫气为2arb；毛细管温度：275℃，毛细管电压为25V。

7.根据权利要求1所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述的色谱柱为安捷伦的Eclipse PlusC18。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为大黄提取物时，其指纹图谱中含有11个特征峰，分别为：

1号峰为没食子酸4-O-β-D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟

2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟

26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟

31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟

39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟

40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟

41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为黄连提取物时，其指纹图谱中含有9个特征峰，分别为：

3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟

8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟

15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟

16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟

17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟

18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟

21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟

22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟

27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为黄芩提取物时，其指纹图谱中含有21个特征峰，分别为：

4号峰为高黄芩素-7-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为15.04分钟

7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟

9号峰为异鼠李素-7-O-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟

10号峰为5，6-二羟基-7-O-葡萄糖酸黄烷酮平均保留时间为29.61分钟

11号峰为去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸甙平均保留时间为31.34分钟

12号峰为黄芩素-6-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为33.08分钟

14号峰为木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为34.03分钟

19号峰为5，6，7-三羟基-8-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为37.17分钟

20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟

29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟

30号峰为黄芩素平均保留时间为62.5分钟

32号峰为黄芩新素I 平均保留时间为70.64分钟

33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟

34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟

36号峰为黄芩新素II 平均保留时间为72.31分钟

37号峰为木蝴蝶素A 平均保留时间为72.68分钟

11.根据权利要求1-3中任一项所述的药物指纹图谱的测定方法，其特征在于所述药物为由大黄提取物、黄连提取物和黄芩提取物组成的中药制剂时，其指纹图谱中含有41个特征峰，分别为：

1号峰为没食子酸4-O-β-D-葡萄糖苷平均保留时间为3.25分钟

2号峰为没食子酸平均保留时间为4.83分钟

3号峰为木兰花碱平均保留时间为13.07分钟

4号峰为高黄芩素-7-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为15.04分钟

7号峰为黄芩苷平均保留时间为25.7分钟

8号峰为羟(基)小檗碱平均保留时间为26.62分钟

9号峰为异鼠李素-7-O-鼠李糖-葡萄糖平均保留时间为26.62分钟

12号峰为黄芩素-6-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为33.08分钟

14号峰为木蝴蝶素A-7-O-葡萄糖酸苷平均保留时间为34.03分钟

15号峰为非洲防己碱平均保留时间为34.88分钟

16号峰为表小檗碱平均保留时间为35.52分钟

17号峰为药根碱平均保留时间为36.35分钟

18号峰为黄连碱平均保留时间为36.47分钟

20号峰为汉黄芩苷平均保留时间为37.91分钟

21号峰为巴马汀平均保留时间为47.21分钟

22号峰为小檗碱平均保留时间为49.20分钟

26号峰为芦荟大黄素平均保留时间为56.16分钟

27号峰为13-甲基小檗碱平均保留时间为56.53分钟

29号峰为去甲汉黄芩素平均保留时间为61.28分钟

30号峰为黄芩素平均保留时间为62.5分钟

31号峰为大黄酸平均保留时间为68.09分钟

32号峰为黄芩新素I 平均保留时间为70.64分钟

33号峰为汉黄芩素平均保留时间为71.03分钟

34号峰为白杨素平均保留时间为71.39分钟

36号峰为黄芩新素II 平均保留时间为72.31分钟

37号峰为木蝴蝶素A 平均保留时间为72.68分钟

39号峰为大黄素平均保留时间为79.52分钟

40号峰为大黄酚平均保留时间为86.22分钟

41号峰为大黄素甲醚平均保留时间为88.20分钟。