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CN103154246B - 用于治疗白血病的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗白血病的组合物和方法 Download PDF

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CN103154246B CN201180033581.3A CN201180033581A CN103154246B CN 103154246 B CN103154246 B CN 103154246B CN 201180033581 A CN201180033581 A CN 201180033581A CN 103154246 B CN103154246 B CN 103154246B
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Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中的急性髓性白血病的组合物、方法和试剂盒。

Description

用于治疗白血病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年5月14日提交的美国临时申请号61/334,991；2010年8月4日提交的美国临时申请号61/370,745；2010年8月22日提交的美国临时申请号61/375,863；2011年3月24日提交的美国临时申请号61/467,376以及2011年3月24日提交的美国临时申请号61/467,342的权益。通过引用以其全文将这些申请的内容结合在此。
在联邦资助研究下做出本发明的权利陈述
本工作由来自美国国立卫生研究院的以下拨款支持，拨款号：K08CA128972。在本发明中政府具有一定的权利。
发明背景
急性髓性白血病(AML)代表一个范例，用于理解协作的遗传和表观遗传变化的复杂模式如何导致肿瘤发生。虽然这种复杂性对靶标疗法的发展提出了挑战，但是不同的AML基因突变普遍功能上地集中于解除对类似的核心细胞过程的调节。在AML起始中的一个关键事件是细胞命运程序的恶化，从而产生白血病干细胞(LSC)，白血病干细胞异常地自我更新并且由此维持疾病的蔓延。虽然不完全了解，已经将这个过程与调节性染色质修饰的改变联系起来，其对基因表达的影响得以良好表征。因此，在AML中常见的癌基因，如AML1-ETO以及MLL融合蛋白，至少部分地通过表观遗传通路的重编程诱导自我更新程序。一些表观遗传调节子是体细胞突变的靶标。由于通过致瘤刺激诱导的表观遗传的改变是有可能可逆的，因此正在探索作为候选药物靶标的染色质调节子。
发明概述
本发明提供了用于检测并治疗白血病以及相关的失调(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(ChronicLymphocydicLeukemia)(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征)的组合物、方法和试剂盒。
在一个方面中，本发明总体上提供了一种用于治疗受试者中的白血病或相关的失调(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征)的方法，该方法包括向该受试者给予一种有效量的抑制Brd4的试剂(例如，一种标向Brd4的限制性核酸JQ1)或其衍生物。
在另一个方面中，本发明提供了一种减少白血病细胞的生长、增殖或存活的方法，该方法包括使该细胞接触一种有效量的抑制Brd4的试剂或其衍生物，由此减少白血病细胞的生长、增殖或存活。
在又另一个方面中，本发明提供了一种诱导白血病细胞的细胞死亡或终末分化的方法，该方法包括使该细胞接触一种有效量的抑制Brd4的试剂或其衍生物，由此诱导白血病细胞的细胞死亡或终末分化。
在又另一个方面中，本发明提供了一种治疗受试者中的急性髓性白血病的方法，该方法包括给予需要它的受试者一种有效量的抑制Brd4的试剂，由此治疗受试者的急性髓性白血病。
在又另一个方面中，本发明提供了一种药用组合物，该药用组合物在一种药用有效的赋形剂中包含治疗有效量的抑制Brd4的试剂或其衍生物。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗白血病的试剂盒，该试剂盒包含一种治疗有效量的抑制Brd4的试剂，以及用于在权利要求8中的方法中使用的化合物的给药的书面说明书。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于检测白血病细胞的临床反应性的方法，该方法包括使白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测该细胞中的巨噬细胞特异性分化标记的表达，其中该巨噬细胞特异性分化标记表达的提高表明该细胞响应于该试剂。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于选择针对经鉴别患有白血病的受试者的治疗方案的方法，该方法包括使该受试者的白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测该细胞中的巨噬细胞特异性分化标记的表达，其中该巨噬细胞特异性分化标记表达的提高表明包含该试剂的治疗方案应该被选择用于该受试者。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于检测白血病细胞的临床反应性的方法，该方法包括使白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测该细胞中的myc的表达，其中myc表达的减少表明该细胞响应于该试剂。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于选择针对受试者的治疗方案的方法，该方法包括使白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测myc的表达，其中myc表达的减少表明包含该试剂的治疗方案应该被选择用于该受试者。
在此描绘的本发明的任何上述方面或任何其他方面的不同实施方案中，该试剂是小化合物(例如，JQ1或其衍生物)或抑制性核酸分子(例如，siRNA、shRNA或反义核酸分子)。在上述方面的其他实施方案中，该受试者是哺乳动物(例如，人类病人)。在其他实施方案中，该受试者是成年哺乳动物(例如，成年人类病人)。在其他实施方案中，该受试者是幼年哺乳动物(例如，儿童人类病人)。在上述方面的其他实施方案中，该方法减少了受试者中的白血病细胞的生长、增殖或存活。在任何上述方面的不同实施方案中，该试剂是具有化学式I-XXII中任一的或具有在此所述的任何其他化学式的化合物。在上述方面的具体实施方案中，该细胞是在受试者中。在上述方面的其他实施方案中，该白血病是急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生异常或骨髓增生障碍。在上述方面的其他实施方案中，该白血病细胞衍生自急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生异常或骨髓增生障碍。在另一个方面中，本发明总体上提供了一种用于治疗受试者中的白血病或相关的失调(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征)的方法，该方法包括向该受试者给予一种有效量的抑制Brd4的试剂(例如，一种标向Brd4的限制性核酸JQ1)或其衍生物。
在另一个方面中，本发明提供了一种减少白血病细胞的生长、增殖或存活的方法，该方法包括使该细胞接触一种有效量的抑制Brd4的试剂或其衍生物，由此减少白血病细胞的生长、增殖或存活。
在又另一个方面中，本发明提供了一种诱导白血病细胞的细胞死亡或终末分化的方法，该方法包括使该细胞接触一种有效量的抑制Brd4的试剂或其衍生物，由此诱导该白血病细胞的细胞死亡或终末分化。
在又另一个方面中，本发明提供了一种治疗受试者的急性髓性白血病的方法，该方法包括给予需要它的受试者一种有效量的抑制Brd4的试剂，由此治疗受试者的急性髓性白血病。
在又另一个方面中，本发明提供了一种药用组合物，该药用组合物在一种药用有效的赋形剂中包含治疗有效量的抑制Brd4的试剂或其衍生物。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗白血病的试剂盒，该试剂盒包含一种治疗有效量的抑制Brd4的试剂以及用于在权利要求8中的方法中使用的化合物的给药的书面说明书。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于检测白血病细胞的临床反应性的方法，该方法包括使白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测该细胞中的巨噬细胞特异性分化标记的表达，其中该巨噬细胞特异性分化标记表达的提高表明该细胞响应于该试剂。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于选择针对经鉴别患有白血病的受试者的治疗方案的方法，该方法包括使该受试者的白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测该细胞中的巨噬细胞特异性分化标记的表达，其中该巨噬细胞特异性分化标记表达的提高表明包含该试剂的治疗方案应该被选择用于该受试者。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于检测白血病细胞的临床反应性的方法，该方法包括使白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测该细胞中的myc的表达，其中myc表达的减少表明该细胞响应于该试剂。
在又另一个方面中，本发明提供了一种用于选择针对受试者的治疗方案的方法，该方法包括使白血病细胞接触一种Brd4抑制剂或其衍生物，并且检测myc的表达，其中myc表达的减少表明包含该试剂的治疗方案应该被选择用于该受试者。
在此描绘的本发明的任何上述方面或任何其他方面的不同实施方案中，该试剂是小化合物(例如，JQ1或其衍生物)或抑制性核酸分子(例如，siRNA、shRNA或反义核酸分子)。在上述方面的其他实施方案中，该受试者是哺乳动物(例如，人类病人)。在上述方面的其他实施方案中，该方法减少了受试者中的白血病细胞的生长、增殖或存活。在任何上述方面的不同实施方案中，该试剂是具有化学式I-XXII中任一的或具有在此所述的任何其他化学式的化合物。在上述方面的具体实施方案中，该细胞是在受试者中。在上述方面的其他实施方案中，该白血病是急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生异常或骨髓增生障碍。在上述方面的其他实施方案中，该白血病细胞衍生自急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生异常或骨髓增生障碍。
在结合附图考虑时，从下面的本发明的各种非限制性实施方案的详细描述中，本发明的其他优点和新颖特征将变得显而易见。在本说明书以及通过引用结合的文献包括冲突和/或不一致的披露的情况下，本说明书将控制。
联系下面提供的实例来分离或制造本发明定义的组合物和物品。从详细的说明中，以及从权利要求中，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
附图简要说明
附图1A和1B显示染色质调节子对Brd4抑制敏感。附图1A包含一个显示参与染色质修饰的基因的分布的饼图以及一个显示MLL-AF9/NrasG12D白血病中池化的负选择筛选的图表，该图表描绘了在十四天的培养期间，1072种信息性的shRNA的表现度(representation)的变化(附图1B)。数字表明在每个分类中的基因的数目。针对每一基因，使用BIOPREDsi算法(Huesken等人，(Huesken)，《自然生物技术》(NatBiotech)，2005；23：995-1001)设计六种shRNA，并使其适于miR30情况。使用大型芯片上的寡核苷酸合成，随后通过池化PCR克隆和单个克隆的序列验证来构建该文库，得出总共1095种shRNA(每个基因三至六种)。附图1B包含一个图，显示了在14天的培养期间，1072种信息性的shRNA表现度的变化。在MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞上进行池化的负选择筛选，shRNA的丰度比如下计算：给予强力霉素十四天之后的读数数目(T14)除以给予强力霉素之前的读数(T0)。将这些结果作为两次重复的平均值以升序排列绘图。将完全消耗的shRNA(在T14处读数为零，n＝71)按10-5的比例绘制；在这个组中突出显示的shRNA按字母顺序用相等的间隔表明。将正评分的shRNA(在两个重复中都具有高于二十倍的消耗，n＝177)标记为深灰色。阳性对照包括靶向Rpa1、Rpa3、Pcna或Polr2b的shRNA。阴性对照shRNA靶向海肾荧光素酶(Ren)或Braf。
附图2A-2D显示在Tet-On感受态AML模型中的RNAi筛选。附图2A是一个示意图，描述了RNAi筛选策略。在一个Tet-On感受态急性髓性白血病(AML)模型中进行该筛选，该模型是通过将编码rtTA3-IRES-MLL-AF9和荧光素酶-IRES-NrasG12D的载体经逆转录病毒共转导入造血干细胞以及祖细胞(HSPC)产生。将从晚期病鼠上重获的白血病细胞放置在培养基中并且用于筛选。将靶向染色质调节基因的自定义shRNA文库使用芯片上寡核苷酸合成来进行合成，并且以池化形式(pooledformat)进行克隆。将1095种序列验证的shRNA的文库池亚克隆到TRMPV-Neo(Zuber等人，《自然生物技术》(NatBiotechnol)，2011；29：79-83)中，并且转导到白血病细胞中，随后进行G418选择。然后将细胞用强力霉素处理十四天(相当于十二次细胞传代)，随后进行荧光激活细胞分选(FACS)，从而分离dsRed-阳性/shRNA-表达的细胞。基因组DNA从分选的(T14)以及预处理的(T0)白血病细胞制备，并且被用作用于shRNA引导链的PCR扩增的模板，使该模版经受深度测序从而量化该文库中的每种shRNA的相对丰度。将该筛选中的靠前符合定义为这样的基因，对其而言至少两种shRNA显示出高于二十倍消耗。三十八种基因满足这些标准并且经受了使用不同的MLL-AF9/NrasG12D诱导的AML细胞系和组成型shRNA表达载体(LMN)的逐一验证。附图2B是一个散点图，说明了质粒池与药物选择之后经文库转导的白血病细胞(T0)的两个重复之间的每一shRNA的归一化读数的相互关系。该相互关系证实该文库表现度(libraryrepresentation)在很大程度上未受逆转录病毒和药物选择影响。附图2C是在一个试验中与T14相比较的T0中的每一shRNA的归一化读数的散点图。低相互关系表明shRNA表现度(shRNArepresentation)的实质性地改变。附图2D是一个散点图，说明了在两个独立重复中的T14处的每一shRNA的归一化读数的相互关系。高相互关系表明shRNA丰度的改变是由于特异性影响。r，皮尔逊相关系数。
附图3A和3B验证了该筛选策略。附图3A是一个示意图，描述了RNAi筛选验证策略。将在初始池化筛选(标准：在两独立重复中，至少两种shRNA消耗高于二十倍)中正评分的每一基因经受逐一验证。将设计为靶向那一基因的shRNA亚克隆到该LMN载体中，该载体在组成型LTR启动子的控制下表达miR30-shRNA，并且其特征是GFP和NeoR的报告子。将LMN-shRNA转导入一个独立衍生的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞系中，该转导具有20％的平均感染效率。通过流式细胞计数法经十天监控GFP％的相对变化并且用作细胞生长抑制的示值读数，将其绘制为消耗倍数[GFP％(d2)除以GFP％(d12)]。附图3B是一个直方图，显示了所有靶向这三十八种经鉴别的符合对象的LMN-shRNA在初始筛选中的消耗倍数。所有靶向这三十八种经鉴别的符合对象的LMN-shRNA在初始筛选中的消耗倍数。一些基因未能验证，这可能是由于(i)在初始筛选中的真实的假阳性，(ii)在独立的白血病系中的变量影响，或(iii)shRNA表达系统之间的差别。基于经鉴别的显示出最高消耗(二十五倍)的shRNA的总数目，Brd4被鉴别为该筛选中的最前符合。
附图4A-4E展示了在白血病、MEF以及G1E细胞中的Brd4-shRNA效果的比较。在每一个所示的实验中，将TtTMPV载体中的强力霉素可诱导的shRNA转导进入Tet-On感受态细胞，随后进行G418选择。附图4A包含多个图，显示了48小时的强力霉素(dox)处理后的Brd4mRNA水平的RT-qPCR的结果。(n＝4)。附图4B包含多个图，显示了竞争性增殖测定的结果。将选择的细胞与未经转导的细胞以8∶1比率进行混合，并且随后用强力霉素进行培养。在标明的时间点确定Venus-阳性/TurboRFP-阳性(即，shRNA表达)细胞的相对百分数并且将变化用于读出生长抑制效果(n＝3)。误差棒表示平均数标准误差(s.e.m.)。附图4C包含给予强力霉素五天之后的流式细胞计量术图，这些图来自在附图4B中测定的细胞的细胞周期分析(BrdU/7-AAD双重染色)。附图4D包含的图显示了给予强力霉素五天之后，使用在附图4A中测定的细胞的膜联蛋白V(AnnexinV)/DAPI双重染色而进行的凋亡测量。首先对活细胞(FSC/SSC)应用设门，随后是RFP+/shRNA+细胞设门。这解释了累积的死亡(膜联蛋白V+/DAPI+)细胞的缺乏。附图4E包含多个表，显示了如在附图3A中描述的、在G1E中进行的LMN-shRNA的GFP消耗的程度(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。
附图5A-5D显示了BRD4的shRNA敲低足以抑制人类AML细胞系THP-1和MOLM-13的生长。靶向人类BRD4的shRNA被克隆到TRMPV-Neo载体中，随后是Eco-受体+/Tet-On感受态人类AML细胞系THP-1和MOLM-13的逆转录病毒转导。用G418选择细胞，持续一周。附图5A包含一个图，显示了条件性RNAi抑制时的BRD4敲低效率。48小时的强力霉素(dox)处理后，对TRMPV-MOLM-13系进行RT-qPCR(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。附图5B和5C包含多个图表，显示了MOLM-13和THP-1的竞争性增殖测定的结果。将经选择的细胞与未经转导的细胞混合并且随后在强力霉素(dox)上培养。在标明的时间点确定dsRed+/shRNA+细胞的相对百分数并且将变化用于测量生长抑制效果。结果是两独立实验的平均值。将所有的结果归一化为对照shRNA(shRen.713)。误差棒表示s.e.m.。附图5D包括流式细胞计量术，该流式细胞计量术来自5天的强力霉素(dox)处理之后对附图5B和5C的细胞的细胞周期分析(BrdU/DAPI双重染色)。在dsRed+/shRNA+细胞上对各事件进行设门。
附图6A-6E显示了AML生长对Brd4抑制敏感。附图6A(上组)包含一个代表性的全细胞裂解物的蛋白质印迹，该细胞裂解物制备自鼠类胚胎纤维母细胞(MEF)培养系，该培养系经过用标明的TtTMPV-shRNA进行转导并且用强力霉素诱导五天。附图6A(下组)展示了用LMN-shRNA转导MLL-AF9/NrasG12D白血病培养系之后，GFP％的相对改变。附图6B-6E展示了在用JQ1进行处理时鼠类(附图6B和6D)和人类(附图6C和6E)的细胞增殖的抑制。附图6B和6C包含多个图表，显示了经JQ1处理的细胞的增殖率。曲线是通过测量培养三周之后有活力的细胞数目的增加并且将数据拟合成指数生长曲线来产生的。相对于对照细胞的增殖率(设定为1(n＝3))来对结果进行绘图。将结果归一化为经载体/DMSO处理的细胞的增值率，设定为1(n＝3)。术语CML-BC是指慢性髓性白血病急变期。术语T-ALL是指T细胞急性成淋巴细胞白血病。附图6D和6E包含的图显示了在标明的浓度，经JQ1处理持续四十八小时之后，定量化的S-相(BrdU-阳性)百分数(n＝3)。在所示的所有实验中，将BrdU脉冲三十分钟。所有的误差棒表示s.e.m.。附图7A和7B显示，JQ1在不同的人类白血病细胞系中展示出广谱抗白血病活性。附图7A和7B包括显示JQ1处理的细胞系的增殖率的图。曲线是这样产生的：进行培养3天后测量有活力细胞数目的增加并且将数据拟合为指数生长曲线。相对于对照细胞(经DMSO处理)的增殖率(设置为1)对结果进行绘图。(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。大部分人类髓细胞性白血病细胞系显示出IC50＜500nM。
附图8A-8D显示了病人衍生的成人AML样品的JQ1敏感性。附图8A包括一张表，显示有关所分析的AML样本的临床与病理学信息。附图8B包括一张表，总结了JQ1对增殖(3H-胸苷-吸收)、凋亡(吉姆萨染色(Giemsastain))以及细胞成熟(莱特-吉姆萨染色(Wright-Giemsastaining))的影响。由于该增殖测定与附图7中利用的那些不同，所以HL-60以及MOLM-13被包括以保证IC50测量与其他研究结果相一致。附图8C包括的图显示了在细胞因子存在下，经JQ1处理的AML样本的增殖曲线。(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。附图8D包括AML样品#4的莱特-吉姆萨染色细胞离心涂片的图像，显示了巨噬细胞分化的形态学特征。
附图9A-9C显示了病人衍生的小儿白血病样品的JQ1敏感性。附图9A包括一张表，总结了来自这些JQ1实验的病人白血病样品信息以及敏感性数据。该MV4-11细胞系被包括作为一种对照以确保使用WST1测定进行的增殖测量与附图7中显示的结果是可比较的。用JQ1处理样品持续72小时，接着用WST-1试剂进行分析或用膜联蛋白V染色进行分析。对使用250nMJQ1处理了48小时的样本进行细胞离心涂片的莱特-吉姆萨染色。附图9B包括一个显示增殖曲线的图。结果被归一化为经DMSO处理的对照细胞。(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。附图9C包括样品PED025的莱特-吉姆萨染色细胞离心涂片的图像，显示了淋巴分化的特征。
附图10A-10C显示JQ1处理导致白血病细胞的凋亡。附图10A和10B包括显示鼠细胞(附图10A)以及人细胞(附图10B)的细胞死亡定量的图。细胞用250nMJQ1处理四十八小时，接着用碘化丙啶(PI)进行染色。通过FACS对PI染色呈阳性的细胞进行定量；n＝3。所有误差棒表示s.e.m.。附图10C包括的图显示了对用JQ1处理了四十八小时的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的凋亡测量。(n＝3)。显示了代表性实验的结果。
附图11A-11F显示无性繁殖的TRMPV-Neo白血病系在强力霉素诱导shRNA表达时显示出强健的疾病抑制。通过进行限制性连续稀释来产生TRMPV-Neo克隆。附图11A包括一个图示，描述了这些体内RNAi以及JQ1实验。将Tet-On感受态白血病细胞用TRMPV-Neo-shRNA进行转导，接着进行G418选择，并且随后移植进入经亚致死剂量照射的受体小鼠中。疾病起始时(典型的是在五或六天后通过生物发光成像来确定)，通过在饮水与食物中补充强力霉素来诱导shRNA表达。利用生物发光成像、总存活数以及dsRed阳性细胞定量来对动物疾病负荷进行评估。附图11B包括经强力霉素处理的白血病克隆的FACS图。这些结果证实了这些细胞群体中高百分数的Venus+/dsRed+细胞。经鉴别的克隆是＞99.9％阳性，尽管TRMPV-Neo池典型地是～85％Venus+/dsRed+(参见附图12)。附图11C包括白血病负荷的生物发光图像。在疾病起始后(移植后第5-6天)给予强力霉素。附图11D包括一个图，显示了强力霉素处理之后的生物发光成像响应的定量。标明了每一处理方式中的小鼠的数目并且误差棒表示s.e.m.。附图11E包括一个图，显示了用标明的TRMPV-shRNA白血病克隆进行了移植的受体小鼠的卡普兰-迈耶存活曲
(Kaplan-Meiersurvivalcurve)。强力霉素处理的间隔通过箭头标明。克隆的shBrd4疾病的总存活得益是9-10天，而非克隆的池的存活中值是4天。附图11F包括晚期病变的经强力霉素处理的小鼠中的供体衍生(CD45.2+)骨髓细胞的流式细胞计量术图。显示的门(gate)包括dsRed+/shRNA+细胞。
附图12A-12I显示Brd4对于体内白血病进展是需要的。附图12A包括在疾病起始(即，移植后六天)时给予强力霉素的小鼠的生物发光图像。第零天是给予强力霉素的第一天。附图12B包括一个图，显示了强力霉素给予之后的生物发光成像响应的定量。所显示的是四个重复小鼠的平均值。附图12C包括一个图，显示了用标明的TRMPV-shRNA白血病细胞系进行了移植的受体小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。强力霉素给予的周期通过箭头标明。利用时序检验()计算相对于靶向海肾荧光素酶的shRNA(shRen)的统计显著性；*p＝0.0001，**p＜0.0001。附图12D包括晚期病变的给予强力霉素的小鼠中供体衍生的(CD45.2阳性)骨髓细胞的流式细胞计量术。显示的门(gate)包括dsRed阳性/shRNA阳性细胞。附图12E包括一个图，显示了CD45.2阳性晚期白血病负荷中的dsRed阳性/shRNA阳性百分数的定量。附图12F包括用JQ1(50mg/kg/d)或DMSO载体处理的MLL-AF9/NrasG12D白血病受体小鼠的生物发光图像。附图12G包括一个图，显示了对JQ1处理响应的生物发光成像的定量。所显示的是6只经DMSO处理的以及7只经JQ1处理的小鼠的平均值。利用双尾学生氏配对t检验(two-tailedStudent’spairedt-test)计算p值。附图12H包括一个图，显示了对照以及JQ1处理小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。利用时序检验计算统计显著性。在12F、12G以及12H中，JQ1处理在移植50,000白血病细胞之后的第1天开始。附图12I包括一个图，显示了在已建立疾病中对JQ1处理响应的生物发光成像的定量。用500,000白血病细胞对小鼠进行移植，接着在移植后6天开始处理，此时可以对疾病进行首次成像。所显示的是6只经DMSO处理的以及7只经JQ1处理的小鼠的平均值。利用双尾学生氏配对t检验计算p值。显示的所有误差棒表示s.e.m.。
附图13A-13E显示，在已建立的MLL-AF9/NrasG12D白血病中100mg/kg/d以及50mg/kg/d的JQ1处理展现单药(singleagent)活性。附图13A包括用100mg/kg/dJQ1处理的白血病小鼠的生物发光图像。用1百万白血病细胞对小鼠进行移植，接着在第4天开始处理(此时通过成像疾病变得可见)。附图13B包括的图显示了生物发光图像的定量。(每一组中n＝8)。误差棒表示s.e.m.。附图13C包括一个图，显示了对照以及JQ1处理小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。在移植后第4天开始处理(由水平线标明)。利用时序检验计算统计显著性。附图13D包括用50mg/kg/dJQ1处理的白血病小鼠的生物发光图像。用500,000白血病细胞对小鼠进行移植，接着在第6天开始处理(此时通过成像疾病变得可见)。定量显示于附图12I中。附图13E包括一个图，显示了对照以及附图13D中所示的JQ1处理小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。在移植后第6天开始处理(由水平线标明)。利用时序检验计算统计显著性。
附图14A-14C显示，JQ1在AML1-ETO9a/NrasG12D/p53-/-AML小鼠模型中展示出单药抗白血病活性。附图14A是一个显示了实验策略的图示。将p53-/-HSPC与AML1-ETO9a以及萤光素酶IRES-NrasG12D构建体进行共转导，接着将细胞移植进入经亚致死剂量辐射的受体小鼠中。如已经在前所述，小鼠高外显率地死于AML(Dick，J.E.，《血液》(Blood)2008；112：4793-807)。将从垂死小鼠得来的脾脏白血病材料移植进入次级受体动物中。在5天的发病(通过生物发光成像来确定)后，开始50mg/kg/dJQ1处理。附图14B包括在标明的时间点处的白血病小鼠的生物发光图像。附图14C包括一个图，显示了对JQ1处理响应的生物发光成像的定量。所显示的是每一处理组中8只小鼠的平均值，误差棒表示利用双尾学生氏配对t检验计算p值。
附图15包括的图显示了JQ1处理对外周造血细胞计数的影响。用JQ1(50或100mg/kg/d)或DMSO载体(400ul/d)对健康C57Bl/6小鼠进行处理，两者都是通过腹膜内注射进行给予持续20天。通过下颌下出血来收集外周血液并且利用Hemavet950分析器(DrewScientific公司)进行分析。各值表示3只重复小鼠的平均值；误差棒表示s.e.m.。
附图16包括细胞染色，显示了20天的JQ1给予对正常骨髓造血作用具有最小影响。在骨髓分析之前，对健康C57BL/6小鼠进行处理，每天腹腔内注射50mg/kg或100mg/kgJQ1，持续20天。经载体或JQ1处理的小鼠的胸骨髓的H&E染色组织病理学显示出正常的细胞性以及正常的混合造血作用。每个处理组n＝3-5只小鼠。显示了代表性图像。
附图17A以及17B显示每日的JQ1给予对正常造血作用具有最小影响。在骨髓FACS分析之前，对健康C57BL/6小鼠进行处理，每天注射50mg/kg或100mg/kgJQ1，持续20天。附图17A包括骨髓细胞的代表性FACS图，显示了用于区分Lin-、ckit+细胞(LK祖细胞)以及Lin-Sca1+ckit+(LSK干细胞)并且对它们的百分数进行定量的设门。附图17B包括的图显示了总共的针对标明的抗体进行了染色的骨髓细胞的百分数。(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。
附图18A-18I显示Brd4抑制导致骨髓分化以及白血病干细胞消耗。附图18A以及18B包括光学显微镜图像，显示了2天的强力霉素诱导的shRNA表达或2天的100nMJQ1处理之后的梅格二氏(May-Grunwald)/吉姆萨染色的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞。shRNA表达是在经TRMPV转导的白血病细胞里进行诱导。利用40X物镜进行成像。附图18C以及18D包括4天的shRNA表达或2天的100nMJQ1处理之后，Mac-1以及c-kit表面表达的FACS图。附图18E-18H包括基因集合富集分析(GSEA)图，评估了Brd4抑制时巨噬细胞以及LSC基因标志的变化。在附图18E以及18G中，在2天的强力霉素诱导之后，从分选的dsRed+/shRNA+细胞(Renvs三种不同的Brd4shRNA)获得用于表达阵列的RNA。在附图18F以及18H中，从用DMSO或100nMJQ1处理2天的白血病细胞获得微阵列数据。NES＝归一化的富集分数。FDRq-val＝假发现率q值，它是具有给定NES的基因集合表示假阳性结果的概率。附图18I包括显示RT-qPCR结果的图。进行RT-qPCR来分析在2天的强力霉素诱导的shRNA表达或2天的100nMJQ1处理之后参与巨噬细胞功能的基因。shRNA表达是利用TRMPV载体来进行诱导。对于shRNA实验而言，将dsRed+/shRNA+进行了FACS分选以制备RNA。显示的Brd4shRNA数据是Brd4.552、1448以及2097shRNA样品的平均值。将信号归一化为GAPDH，对照样品设置为1。(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。
附图19包括GSEA图，显示了JQ1在THP-1人类AML细胞中引发与在鼠MLL-AF9/NrasG12DAML模型中类似的基因表达变化模式。在收集RNA之前，用250nMJQ1处理THP-1细胞持续48小时。利用Affymetrix人类基因ST1.0阵列进行表达阵列。进行GSEA以评估Brd4抑制时巨噬细胞、LSC以及Myc基因标志的变化，如所示。
附图20A-20H显示JQ1在白血病细胞中抑制Myc通路。附图20A和20B包括的图显示在利用JQ1处理48小时之后，小鼠(附图20A)或人(附图20B)中的相对MycRNA水平的RT-qPCR结果。将结果归一化为GAPDH，将未处理细胞中的RNA水平设置为1(n＝3)。附图20C包括全细胞裂解物的蛋白质印迹，该全细胞裂解物是从用DMSO或250nMJQ1处理了48小时的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞而制备。附图20D包括显示RT-qPCR结果的图。在用250nMJQ1处理MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞之后，在标明的时间点进行RT-qPCR。将结果归一化为GAPDH，将未处理细胞中的mRNA水平设置在1(n＝3)。附图20E包括显示ChIP-qPCR结果的图。用标明的抗体以及引物位置在MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中进行ChIP-qPCR(就DMSO而言，n＝6；就JQ1处理而言，n＝4)。TSS＝转录起始位点。附图20F包括全细胞裂解物的蛋白质印迹，该全细胞裂解物是从用空载体或包含MyccDNA的MSCV逆转录病毒进行了转导的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞而制备。将细胞用DMSO或250nMJQ1处理48小时。附图20G包括一个图，显示了在用空载体或Myc-cDNA进行了转导的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中，在30分钟脉冲之后BrdU掺入的定量。以标明的浓度将细胞用JQ1处理5天。(n＝3)。附图20H包括梅格二氏/吉姆萨染色的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的光学显微镜图像，这些细胞用空载体或包含MyccDNA的载体进行了转导。将细胞用50nMJQ1处理5天。显示了在40X物镜获取的代表性图像。显示的所有误差棒表示s.e.m.。
附图21A-21D显示经由shRNA的Brd4敲低导致Myc水平的下调以及Myc靶标基因表达的下调。附图21A和21B包括的图显示了Brd4(附图21A)以及Myc(附图21B)mRNA水平的RT-qPCR分析结果，这些mRNA从经分选的用标明的TtTMPV-shRNA构建体进行了转导的TurboRFP+(shRNA表达)白血病细胞制备而来。将细胞用强力霉素处理3天。结果归一化至GAPDH。附图21C包括从Brd4-shRNA表达细胞制备的提取物的蛋白质印迹。使用经TRMPV转导的MLL-AF9/Nras白血病克隆。将细胞用强力霉素处理3天。附图21D包括GSEA图，评估了Myc下游靶标基因表达的变化。微阵列数据获自在附图21A中描述的RNA样品。Myc靶标基因集合已经在先前得以描述(Kim等人，《细胞》(Cell)2010；143：313-24；以及Schuhmacher等人，《核酸研究》(NucleicAcidsRes)2001；29：397-406)。
附图22显示JQ1引发Myc靶标基因表达的下调。附图22包括GSEA图，评估了JQ1诱导的Myc下游基因标志的变化。从用DMSO或100nMJQ1处理48小时的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞获得微阵列数据。
附图23A和23B显示，48小时的JQ1处理在白血病细胞中选择性地抑制Myc表达。附图23A和23B包括显示RT-qPCR结果的图。进行RT-qPCR以确定小鼠(附图23A)或人类(附图23B)细胞系中的MycRNA水平。将结果归一化为GAPDH，将未处理细胞中的RNA水平设置在1(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。
附图24A-24D显示了逆转录病毒的Myc过表达对白血病细胞JQ1敏感性的影响。附图24A包括用于Myc过表达的逆转录病毒载体的图示。附图24B包括显示RT-qPCR结果的图。进行RT-qPCR以对用JQ1处理白血病细胞5天时的巨噬细胞相关基因进行评估，这些白血病细胞过表达Myc或空载体对照。n＝3。误差棒表示s.e.m.。附图24C包括一个图，显示了在50nMJQ1或DMSO载体对照的存在下，对照以及Myc转导的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中的累积细胞数目。附图24D包括一个图，显示了在第4天的经JQ1处理的细胞的细胞死亡定量。通过FACS对PI+细胞进行定量(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。
附图25A-25D显示Myc过表达阻止Brd4shRNA诱导的细胞周期停滞以及巨噬细胞分化。附图25A包括代表性流式细胞计量术图，显示了MLL-AF9/NrasG12D白血病培养细胞的细胞周期(BrdU/DAPI双染色)分析，这些培养细胞是用MSCV-Myc或空载体连同TtTMPV条件型shRNA载体一起进行了共转导并且随后用嘌呤霉素以及G418进行了选择。将细胞用强力霉素处理3天以诱导shRNA表达。在dsRed+/shRNA+细胞上对各事件设门。附图25B包括的图显示了shRNA+/dsRed+群体中BrdU掺入的定量。n＝3。误差棒表示s.e.m.。附图25C包括梅格二氏/吉姆萨染色的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的光学显微镜图像。给予强力霉素处理持续2天。用40X物镜获取图像。附图24D包括显示RT-qPCR结果的图。进行RT-qPCR以评估用MSCV-Myc或空MSCV载体转导的Tet-On感受态白血病细胞中在2.5天的强力霉素诱导的Brd4-shRNA表达之后与巨噬细胞相关的基因。使用TtTMPV载体来表达shRNA。n＝3。误差棒表示s.e.m.。
附图26A-26C显示大部分的经JQ1诱导的基因表达变化是Myc抑制的次级效应。将经MSCV-Myc或空载体对照转导的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞用100nMJQ1处理48小时，接着收集RNA用于表达微阵列分析。附图26A包括mRNA的相对丰度的行归一化(row-normalized)的热度图(heatmap)表示，这些mRNA对根据其在JQ1处理后的空载体对照白血病细胞中是上调(左)还是下调(右)2倍而选择的基因进行编码。在此利用的适度水平的Myc过表达在JQ1处理之前影响基因表达。附图26B包括热度图表示，显示了Myc过表达对标明的基因集合的基因表达变化的影响。附图26A以及26B中的色度指示行归一化的表达值。附图26C包括的图显示了JQ1诱导的基于与Myc表达关系的基因表达变化的分类。如果在对照细胞的JQ1处理之后表达改变2倍的基因仍能够在用MSCV-Myc转导的白血病细胞中表达改变2倍，则将它们归类为Myc独立性的。如果基因在JQ1处理的MSCV-Myc细胞中未能表达改变2倍，则将它们分类为Myc依赖性的。
附图27A-27D显示，Myc的shRNA敲低抑制MLL-AF9/NrasG12D白血病发展并且引发终末骨髓分化。附图27A包括一个图，显示了当将LMN-shRNA转导进入MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞系时的细胞生长抑制。将GFP％的相对改变通过流式细胞计量术经6天进行监测并且用作对细胞生长抑制的测量。附图27B包括FACS图，显示了在转染后第4天，经LMN转导的白血病细胞的c-kit以及Mac-1的表面表达。在dsRed+/shRNA+细胞上对所有事件设门。附图27C包括2天的强力霉素诱导的TRMPV-shRNA表达之后，梅格二氏/吉姆萨染色的克隆的MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的光学显微镜图像。附图28D包括显示RT-qPCR结果的图。进行RT-qPCR来分析在2天的强力霉素诱导的shRNA表达之后参与巨噬细胞功能的基因。shRNA表达是利用TRMPV载体来进行诱导。将信号归一化为GAPDH，对照样品设置为1。(n＝3)。误差棒表示s.e.m.。
附图28A以及28B显示相对于其他细胞类型，Brd4并没有在AML中一致性地过表达。附图28A和28B包括显示RT-qPCR结果的图。对标明的小鼠(附图28A)或人类(附图28B)细胞系进行RT-qPCR。结果归一化至GAPDH。n＝3。误差棒表示s.e.m.。
附图29A和29B显示在小鼠中(+)-JQ1的药物代谢动力学研究结果。附图29A包括药物代谢动力学数据以及测量参数的表。在单次腹膜内注射(+)-JQ1(50mg/kg)进入成年C1雄性小鼠中以后，在预先规定的时间点，如所示，通过三重的四极LCMS-MS(API-2000)来测量血浆药物浓度。以这一剂量给予(+)-JQ1产生极好的峰血浆浓度(Cmax＞20uM)以及总药物接触(AUC＞20,000h*ng/mL)。BQL表示其中(+)-JQ1超出该药物代谢动力学检测测定的可定量极限(1.00ng/mL)的样品。附图29B包括一个图，显示了使用附图29A中列出的数据得到的(+)-JQ1的血浆浓度-时间曲线。数据表示平均测量并且误差棒表示标准差，两者都来自一式三份的独立测量。体外观察到的生物活性浓度(100nM；水平红线)以上的药物血浆浓度通过外推法观察了10小时以上。
附图30A-30C显示抑制Brd4、Myb以及MLL-AF9(伴随这三个因子抑制时Myc的下调)时引起的广泛重叠的转录效应。附图30A包括GSEA图，评估了MLL-AF9以及Myb下游的转录标志。基于Tet-Off介导的MLL-AF9下调或MybshRNA敲低时的倍数变化，利用RMA分别将MLL-AF9_500以及Myb500定义为前500下调的基因。该500基因截取相应于Log2倍数变化，对Myb而言是-1.17并且对MLL-AF9而言是-1.77。附图30B包括标明的微阵列重复中Myc表达的热度图表示。利用Limma算法，补充地利用Bioconductor，来计算Log2倍数变化以及adj.P.Val。附图30C包括显示RT-qPCR结果的图。进行RT-qPCR来验证JQ1处理不影响Hoxa7、Hoxa9以及Meis1的表达，它们是经良好确立的MLL-AF9的直接靶标。这表示Brd4抑制不抵消MLL-AF9的总体功能，但是却抑制一大子集的其他下游靶标，例如Myc。n＝3。误差棒表示s.e.m.。
定义
所谓“试剂(agent)”意味着任何小分子的化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽、或其片段。
如在此所使用的，术语“烷基(alkyl)”意味着饱和的直链或支链非环烃，该烃典型地具有1-10个碳原子。代表性的饱和的直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基以及正癸基；而饱和的支链烷基包括异丙基、仲-丁基、异丁基、叔-丁基、异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基丁基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基戊基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2，2-二乙基戊基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基、3，3-二乙基己基等。包括在本发明的化合物中的烷基基团可以是未经取代的、或可任选地经一个或多个取代基取代，诸如氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳基氨基、烷氧基、烷硫基、氧基、卤素、酰基、硝基、羟基、氰基、芳基、杂芳基、烷芳基、烷基杂芳基、芳氧基、杂芳氧基、芳硫基、杂芳硫基、芳氨基、杂芳氨基、碳环基、碳环氧基、碳环硫基、碳环氨基、杂环基、杂环氧基、杂环氨基、杂环硫基等。对于本发明的化合物而言典型地优选低级烷基。
所谓“改变(alteration)”意味着通过标准技术已知的方法(如在此描述的方法)检测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如在此所使用的，改变包括表达水平的10％变化，优选是表达水平的25％的变化、更优选是40％的变化、以及最优选是50％或更大的变化。
所谓“改善(ameliorate)”是指减少、抑制、减弱、减小、阻滞、或稳定疾病的发展或进展。
所述的“类似物(analog)”意味着不是相同的但是具有类似的功能或者结构特征的分子。例如，多肽类似物保留了对应的天然存在的多肽的至少一些生物活性，同时相对于天然存在的多肽具有增强其功能的某些生物化学修饰。这样的生物化学修饰可以增加其蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变，例如，配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。
如在此所使用的，术语“芳族环(aromaticring)”或“芳基(aryl)”意味着单环或多环的芳族环或者包括碳和氢原子的环基团。适合的芳基基团的实例包括，但并不局限于，苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、薁基、和萘基、以及苯稠合的碳环部分，如5，6，7，8-四氢萘基。芳基基团可以是未经取代的或可任选地经一个或多个取代基取代，例如，在此所描述的用于芳基基团的取代基(包括但并不局限于烷基(优选是低级烷基或者经一个或多个卤素取代的烷基)、羟基、烷氧基(优选是低级烷氧基)、烷硫基、氰基、卤素、氨基、硼酸(-B(OH)2)、以及硝基)。在某些实施方案中，芳基基团是单环，其中该环包括6个碳原子。
所谓“溴基结构域(bromodomain)”意味着识别乙酰化的赖氨酸残基的多肽的一部分。在一个实施方案中，BET家族成员多肽的溴基结构域包括大约110个氨基酸并且共享一种保守的折叠，该折叠包括被不同的环区连接的四个α螺旋的一种左旋束，这些环区与染色质相互作用。
所谓“BET家族多肽(BETfamilypolypeptide)”意味着包括两个溴基结构域和一种额外末端(ET)结构域的多肽或其片段，其具有转录调控活性或乙酰化的赖氨酸结合活性。示例性的BET家族成员包括BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT。
所谓“BRD2多肽(BRD2polypeptide)“意味着与能够结合染色质或者调控转录的NP_005095具有至少85％同一性的蛋白质或其片段。
一个示例性的BRD2多肽的序列如下：
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所谓“BRD2核酸分子(BRD2nucleicacidmolecule)”意味着对BRD2多肽或其片段进行编码的多核苷酸。
所谓“BRD3多肽(BRD3polypeptide)”意味着与能够结合染色质或者调控转录的NP_031397.1具有至少85％同一性的蛋白质或其片段。
一个示例性的BRD3多肽的序列如下：
1mstattvapagipatpgpvnppppevsnpskpgrktnqlqymqnvvvktlwkhqfawpfy
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所谓“Brd3核酸分子(Brd3nucleicacidmolecule)”意味着对BRD3多肽进行编码的多核苷酸。
所谓“BRD4多肽(BRD4polypeptide)”意味着与能够结合染色质或者调控转录的NP_055114具有至少85％同一性的蛋白质或其片段。
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所谓“Brd4核酸分子(Brd4nucleicacidmolecule)”意味着对BRD4多肽进行编码的多核苷酸。
所谓“BRDT多肽(BRDTpolypeptide)”意味着与能够结合染色质或者调控转录的NP_001717具有至少85％同一性的蛋白质或其片段。
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所谓“BRDT核酸分子(BRDTnucleicacidmolecule)”意味着对BRDT多肽进行编码的多核苷酸。
关于手性中心的命名，术语“d”以及“l”构型正如国际理论与应用化学联合会(IUPAC)所定义的。关于术语非对映异构体、消旋体、差向异构体以及对映异构体，这些将在它们通常的语境中使用以便描述制品的立体化学。
所谓“化合物(compound)”意味着任何小分子的化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽、或其片段。
在本公开中，“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”以及“具有(having)”等具有美国专利法指定的意义并且意味着“包括(includes、including)”等；“基本上由...组成(consistingessentiallyof或consistsessentially)”同样具有美国专利法指定的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施方案。
所谓“计算机建模(computermodeling)”意味着应用计算程序确定以下一项或多项：配体对于结合部分的定位和结合邻近，被结合配体占用的空间，结合部分与配体之间的互补接触表面的量，给定配体对结合部分进行结合的变形能，以及配体与结合部分之间的氢键能、范德华相互作用、疏水性相互作用、和/或静电相互作用能的一些估算。计算机建模还可以提供模型系统与候选化合物的特征比较。例如，计算机建模实验可以比较本发明的一个药效团模型与一个候选化合物，以便评估该候选化合物与该模型的适宜性。
所谓“计算机可读媒介(computerreadablemedia)”意味着可以被计算机直接读取并且存取例如从而使得该媒质适合于在以上提到的计算机系统中使用的任何媒质。该媒质包括，但并不局限于，磁存储媒质如软磁盘、硬磁盘存储媒质以及磁带；光存储媒质如光盘或只读光盘(CD-ROM)；电存储媒质如RAM和只读存储器(ROM)；以及这些分类的混合体如磁/光存储媒质。
所谓“计算机系统(computersystem)”意味着用于分析原子坐标数据的硬件装置、软件装置以及数据存储装置。本发明的基于计算机的最小硬件装置包括中央处理器(CPU)、输入装置、输出装置以及数据存储装置。理想的是，提供一个监视器对结构数据进行可视化。该数据存储装置可以是随机存取存储器(RAM)或者对本发明的计算机可读媒质进行存取的装置。这样的系统的实例是从SiliconGraphicsIncorporated公司以及SunMicrosystems公司可得到的运行基于Unix的，WindowsNT或IBMOS/2的操作系统的微型计算机工作站。
“检测(detect)”指的是识别有待检测的分析物的存在、缺乏或者量。
所谓“可检测的标记物(detectablelabel)”意味着一种组合物，当把该组合物连接到一个感兴趣的分子时，使后者变成通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、或化学的手段可检测的。例如，有用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶粒、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，如通常在酶联免疫吸附试验(ELISA)中所使用的)、生物素、异羟基洋地黄毒甙元、或半抗原。
术语“非对映异构体(diastereomers)”指的是具有两个或更多个不对称中心并且其分子不是彼此镜像的立体异构体。
所谓“疾病(disease)”意味着损害或妨碍细胞、组织、或器官正常功能的任何违和或失调。易于用在此描述的化合物进行治疗的疾病的实例包括白血病以及相关的失调(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征)。
所谓“有效量(effectiveamount)”意味着相对于未治疗的病人，改善疾病的症状所需的药剂的量。用于实施本发明以治疗性地处理疾病的一种或多种活性化合物的有效量随给药方式，受试者的年龄、体重以及总体健康状况而变化。最终地，主治医生或者兽医会决定适当的量以及给药方案。这样的量被指为“有效(effective)”量。
术语“对映异构体(enantiomers)”是指一种化合物的两种互为不能重叠的镜像的立体异构体。两种对映异构体的等摩尔混合物称为“消旋混合物”或者“消旋体”。
所谓“适宜性(fitting)”意味着通过自动、或半自动的手段确定试剂分子的一个或多个原子与BET家族成员的一个或多个原子或结合位点(例如，BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT的溴基结构域)的相互作用，并且确定这种相互作用稳定的程度。用于适宜性的不同的基于计算机的方法在此进一步地描述。
所谓“片段(fragment)”意味着多肽或者核酸分子的一部分。这一部分包含，优选地，参考核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。一个片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90，或100、200、300、400、500、600、700、800、900，或1000个核苷酸或氨基酸。
术语“卤烷基(haloalkyl)”旨在包括以上定义的，经卤素单、双或多取代的烷基基团，例如氟甲基以及三氟甲基。
术语“卤素(halogen)”是指-F、-Cl、-Br或-I。
术语“杂芳基(heteroaryl)”指的是芳族的5-8元单环、8-12元双环、或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-4个环杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N、或S，并且剩余环原子是碳。杂芳基基团可以可任选地经一个或多个如在此描述的用于芳基基团的取代基取代。杂芳基基团的实例包括，但并不局限于，吡啶基、呋喃基、苯并二氧杂环戊烯基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、喹啉基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、三唑基、噻二唑基、异喹啉基、吲唑基、苯丙噁唑基、苯并呋喃基、吲嗪基、咪唑并吡啶基、四唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、以及吲哚基。
如在此所使用的术语“杂原子(heteroatom)”是指除了碳或氢之外的任何元素的原子。优选杂原子是氮、氧、硫以及磷。术语“同分异构体(isomers)”或者“立体异构体(stereoisomers)”指的是具有相同的化学构成，但是原子或基团的空间安排不同的化合物。
如在此所使用的术语“杂环的(heterocyclic)”指的是在一个环状结构内包含除了碳之外的至少一个原子(例如，S、O、N)的有机化合物。这些有机化合物中的该环状结构可以是芳族的或者，在某些实施方案中，是非芳族的。杂环部分的一些实例包括，但并不局限于，吡啶、嘧啶、吡咯烷、呋喃、四氢呋喃、四氢噻吩、以及二噁烷。
“杂交(hybridization)”意味着互补核碱基之间的氢键合，该氢键合可以为沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏(reversedHoogsteen)氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成进行配对的互补核碱基。
术语“羟基(hydroxyl)”意味着-OH。
所谓“抑制性核酸”意味着一种双链RNA、siRNA、shRNA、或反义RNA、或其部分、或其模拟物，当将其给予哺乳动物细胞时，导致靶基因表达的下降(例如，下降10％、25％、50％、75％、或者甚至90-100％)。典型地，核酸抑制剂包含靶标核酸分子的至少一部分或其直向同源物，或者包含靶标核酸分子的互补链的至少一部分。例如，一条抑制性核酸分子包括在此描绘的任何或所有核酸的至少一部分。
所谓“分离的多核苷酸(isolatedpolynucleotide)”意味着脱离了基因的核酸(例如，DNA)，该基因在衍生出本发明的核酸分子的有机体的天然存在的基因组中。因此该术语包括，例如，重组DNA，该重组DNA合并进入载体、自主复制质粒或病毒、或原核生物或真核生物的基因组DNA，或者该重组DNA作为不依赖于其他序列的分离的分子存在(例如，通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA或者基因组的或cDNA的片段。此外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及是对另外的多肽序列进行编码的杂合基因的一部分的重组DNA。
所谓“分离的多肽(isolatedpolypeptide)”意味着本发明的从天然伴随它的组分中分离的多肽。典型地，当该多肽以重量计为至少60％时，将它从它天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子中分离。优选地，制品是以重量计至少75％、更优选是至少90％、并且最优选是至少99％的本发明的多肽。本发明的分离的多肽可以，例如，通过从天然源提取、对这样的多肽进行编码的重组核酸的表达、或化学合成蛋白质而得到。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或高效液相色谱(HPLC)分析。
术语“同分异构体(isomers)”或者“立体异构体(stereoisomers)”指的是具有相同的化学构成，但是原子或基团的空间安排不同的化合物。
术语“同位素衍生物(isotopicderivatives)”包括化合物的衍生物，其中这些化合物中的一个或多个原子被这些原子的相应的同位素替换。例如，含有碳原子(C12)的化合物的同位素衍生物可以是其中该化合物的该碳原子被C13同位素替换的同位素衍生物。
所谓“白血病细胞”意味着衍生自白血病的细胞。
所谓“标记(marker)”意味着在与疾病或失调相关联的表达水平或活性方面具有改变的任何蛋白质或多核苷酸。
措辞“抑制癌细胞生长(inhibitingthegrowthofacancercell)”包括放慢、中断、阻滞或停止其生长和转移并且不是必须地表明该生长的完全消除。
在本发明的方法中有用的核酸分子包括对本发明的多肽或其片段进行编码的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列具有100％的同一性，但是将典型地表现出基本的同一性。与内源性序列具有“基本同一性(substantialidentity)”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。在本发明的方法中有用的核酸分子包括对本发明的多肽或其片段进行编码的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列具有100％的同一性，但是将典型地表现出基本的同一性。与内源性序列具有“基本同一性(substantialidentity)”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交(hybridize)”意味着在不同的严格条件下进行配对以便在互补的多核苷酸序列(例如，在此描述的基因)、或其部分之间形成双链分子。(例如，参见Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987)《酶学方法》(MethodsEnzymol.)152：399)，Kimmel，A.R.(1987)《酶学方法》(MethodsEnzymol.)152：507)。
如在此所使用的术语“光学异构体(opticalisomers)”包括互为不能重叠的镜像的分子，也被称为手性分子。
在此使用的短语“肠胃外给药(parenteraladministration和administeredparenterally)”意味着除了肠内以及局部给药之外的给药方式，通常是通过注射，并且包括但并不局限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内以及胸骨内注射以及输注。
术语“多环基(polycyclyl)”或者“多环的基团(polycyclicradical)”指的是两个或更多个环的环基团(例如，环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个碳被两个邻接的环共用，例如，这些环是“稠环”。通过非相邻的原子连接的环称为“桥”环。多环的每个环可以经以上描述的取代基取代，例如，卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧基、烷基羰基、烷氧基羰基、氨羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸根、膦酸基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷氨基、二烷氨基、芳氨基、二芳氨基、以及烷基芳氨基)、酰胺基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基以及脲基)、脒基、亚胺基、硫氢基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基、烷基芳基、或芳族的或杂芳族的部分。
如在此所使用的术语“多晶型(polymorph)”指的是本发明的化合物或其络合物的固体晶型。相同化合物的不同多晶型表现出不同的物理、化学和/或光谱特性。不同的物理特性包括，但并不局限于，稳定性(例如，对热或光)、可压缩性以及密度(在配制和产品制造方面重要)、以及溶解速率(能够影响生物可利用率)。稳定性的不同可由化学反应性(例如，差分氧化，一种剂型当包括一种多晶型时比包括另一种多晶型褪色更快)或力学特征(例如，存储时破碎为动力学上有利的多晶型的片剂转化成热力学上更稳定的多晶型)或两者(例如，具有一种多晶型的片剂在高湿度时更容易断裂)的变化引起。多晶型的不同的物理特性可以影响它们的加工。
术语“药物前体(prodrug)”包括具有可在体内代谢的部分的化合物。通常，药物前体在体内通过酯酶或者其他机制代谢为活性药物。药物前体的实例以及它们的应用在本领域是众所周知的(参见，例如，Berge等人(1977)“药物盐(PharmaceuticalSalts)”《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci)66：1-19)可以在化合物的最终分离和纯化时原位制备这些药物前体，或通过将经纯化的化合物以自由酸形式或羟基分开地与适合的酯化剂进行反应。通过用羧酸进行处理，可以将羟基基团转化成酯类。药物前体部分的实例包括经取代的和未经取代的、支链或无支链的低级烷基酯部分(例如，丙酸酯类)，低级烯基酯类，二-低级烷基-氨基低级烷基酯类(例如，二甲基氨基乙基酯)，酰氨基低级烷基酯类(例如，乙酰氧基甲基酯)，酰氧基低级烷基酯类(例如，新戊酰氧基甲基酯)，芳基酯类(苯基酯)，芳基-低级烷基酯类(例如，苯甲基酯)，经取代的(例如，用甲基、卤素、或甲氧基取代基)芳基和芳基-低级烷基酯类，酰胺类，低级烷基酰胺类，二-低级烷基酰胺类，以及羟基酰胺类。优选的药物前体部分是丙酸酯类和酰基酯类。也包括在体内通过其他机制转化成活性形式的药物前体。
此外，横跨碳-碳双键的立体化学的表示也与通常的化学领域相反：“Z”指的是经常被称为“顺式(cis)”(相同侧)的构象而“E”指的是经常被称为“反式(trans)”(相反侧)的构象。本发明的化合物包括这两种构型，顺式/反式和/或Z/E。
所谓“减少(reduces)”或“增加(increases)”意味着相对于参考，分别地至少大约10％、25％、50％、75％、或100％的负的或正的改变。
所谓“减少细胞存活(reducingcellsurvival)”意味着相对于参考细胞，抑制细胞的生存力或诱导细胞死亡。
所谓“参考(reference)”意味着标准或对照状况。
“参考序列(referencesequence)”是定义的作为序列比较的基础的序列。参考序列可以是规定序列的子集或者整体，例如全长cDNA或基因序列的区段、或者该完整的cDNA或基因序列。对多肽而言，参考多肽序列的长度将通常是至少大约16个氨基酸，优选地是至少大约20个氨基酸，更优选地是至少大约25个氨基酸，并且甚至更优选地是大约35个氨基酸、大约50个氨基酸、或大约100个氨基酸。对核酸而言，参考核酸序列的长度将通常是至少大约50个核苷酸、优选地是至少大约60个核苷酸、更优选地是至少大约75个核苷酸、并且甚至更优选地是大约100个核苷酸或大约300个核苷酸或它们附近的或者它们之间的任一整数。
所谓“均方根偏差(rootmeansquaredeviation)”是指离均差的平方的算术平均数的平方根。
使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(麦迪逊大学道1710，威斯康星州53705(1710UniversityAvenue，Madison，Wis.53705))遗传计算组的序列分析软件包，BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)典型地测量序列同一性。这种软件通过将同源性程度分配给不同的取代、缺失、和/或其他修饰进行相同或相似序列的匹配。保守取代典型地包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e-3到e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
所谓“siRNA”意味着一种双链RNA。最佳的，一条siRNA是在长度上18、19、20、21、22、23或24个核苷酸并且在它的3’末端具有2个碱基突出。这些dsRNA可以被引入单个细胞或整个动物中；例如，它们可以经由血流被全身性地引入。此类siRNA用于下调mRNA水平或者启动子活性。
所谓“特异性结合(specificallybinds)”意味着一种化合物或抗体识别并且结合本发明的多肽，但是基本上并不识别并且结合天然地包括本发明的多肽的试样(例如，生物试样)中的其他分子。
所谓“受试者(subject)”意味着哺乳动物，包括但并不局限于，人或非人类的哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊、或猫。
所谓“基本上同一的(substantiallyidentical)”意味着相对于参考氨基酸序列(例如，在此描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，在此描述的任一核酸序列)，一种多肽或核酸分子表现出至少85％的同一性。优选地，相对于用于比较的序列，这样的序列在氨基酸水平或核酸上为至少85％、90％、95％、99％或甚至100％的同一。
术语“巯基(sulfhydryl或thiol)”意味着-SH。
如在此所使用的，术语“互变异构体(tautomers)”指的是通过互变异构化容易地进行相互转化的有机分子的同分异构体，其中氢原子或质子在该反应中迁移，在一些场合伴随着单键与相邻双键的转换。
本发明提供了多个对于开发高特异性药物是有用的靶标以便治疗以在此描述的方法为特征的失调。此外，本发明的方法提供了一种容易的手段以便识别安全用于受试者的疗法。此外，本发明的方法提供了以高体积通量、高灵敏度以及低复杂度实际上地分析任何数量的用于作用于在此描述的疾病的化合物的通路。
如在此所使用的术语，“预防(prevent、preventing、prevention)”、“预防性治疗(prophylactictreatment)”等指的是减少失调或违和在受试者中的发展的可能性，该受试者没有失调或违和，但是有发展失调或违和的风险或者容易发展失调或违和。
“有效量(effectiveamount)”指的是对经治疗的受试者产生治疗作用的化合物的量。这种治疗效果可以是客观的(即通过一些测试或标记是可测量的)或主观的(即受试者给出了作用的指征或感觉到了作用)。在此描述的化合物的有效量可以在每千克体重大约1mg到大约5000mg的范围内。有效剂量还会根据给药通路，以及与其他药剂共同使用的可能性而改变。
将在此提供的范围理解为该范围内的所有值的简略表达。例如，将1至50的范围理解为包括下组的任一数、数的组合、或者下组的子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。
如在此所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”指的是减少或改善失调和/或与其相关联的症状。所谓“改善(ameliorate)”是指减少、抑制、减弱、减小、阻滞、或稳定疾病的发展或进展。将被理解的是，尽管不能排除，治疗失调或违和并不要求完全地消除该失调、违和或与其相关联的症状。
除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或(or)”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“一个、一种(a、an)”、和“该(the)”被理解为单一的或复数的。
除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“大约(about)”被理解为在本领域的正常容差范围内，例如，在平均数的2标准差之内。大约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语大约修饰。
在此的变量的任何定义中的一系列化学基团的陈述包括该变量作为任何单个基团或所列出基团的组合的定义。在此针对变量或方面的实施方案的陈述包括该实施方案作为任何单个的实施方案或与任何其他实施方案或其部分的组合。
在此提供的任何组合物或方法可以与在此提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。
发明的详细说明
本发明特征是有用于治疗白血病以及相关的失调(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征)的组合物和方法。
本发明至少部分基于抑制Brd4的试剂的发现，这些试剂有用于抑制急性髓性白血病的发展或进展。该抑制可以包括抑制Myc的活性。这些发现还突出了RNAi筛选作为发现平台用于揭示癌症中用于直接药理学介入的表观遗传缺陷的功用。
如在下文详细报告的，使用无偏性的方法对急性髓性白血病(AML)(一种与异常染色质相关联的、攻击性的造血系统恶性肿瘤)中的表观遗传缺陷进行探测，从而得到了Brd4的抑制对治疗白血病有用的发现。通过筛选专门的靶向在遗传上定义的白血病中已知的染色质调节子的shRNA文库，包含溴基结构域的蛋白Brd4被鉴别为一种对AML疾病维持而言的关键性需求。使用shRNA或小分子抑制剂JQ1对Brd4的抑制导致体外和体内的强健的抗-白血病效应，伴随着终末髓细胞样分化和白血病干细胞(LSC)的消除。这些效应归因于在维持Myc基因表达和促进异常自我更新中需要Brd4。
含有溴基结构域的蛋白质
基因调控基本上被可逆的、非共价的大分子组装控制。至RNA聚合酶的信号转导要求更高级的蛋白质复合体，该复合体被能够解释染色质的翻译后修饰状态的组装因子在空间上调控。表观遗传读出物是结构上不同的蛋白质，各自具有一个或多个进化上保守的效应物模块，该效应物模块识别组蛋白或DNA的共价修饰。组蛋白尾上的赖氨酸残基的ε-N-乙酰化(Kac)与开放的染色质构造以及转录激活相关联(Marushige等人，《美国科学院院刊》(ProcNatlAcadSciUSA)，73，3937-3941，(1976))。乙酰基-赖氨酸的背景特异的分子识别主要由溴基结构域介导。
作为转录因子复合体(TAF1、PCAF、Gcn5以及CBP)的组分以及表观遗传记忆的决定子，含有溴基结构域的蛋白质有重要的生物学意义(Dey等人，《分子生物细胞学》(MolBiolCell)，20，4899-4909，(2009))。有含有总共57种不同的溴基结构域的41种人类蛋白质。尽管大量序列不同，但所有的溴基结构域共享一种保守的折叠，该折叠包括由确定底物特异性的不同环区(ZA与BC环)连接的四个α螺旋(αZ、αA、αB、αC)的一种左旋束。具有肽底物的共晶体结构表明乙酰基-赖氨酸被一种中心疏水腔识别并且通过与存在于大多数溴基结构域中的天冬酰胺残基的氢键得以锚定(Owen，D.J.等人，通过组蛋白乙酰转移酶gcn5p的溴基结构域识别乙酰化的组蛋白H4的结构基础，《欧洲分子生物学组织杂志》(EmboJ)，19，6141-6149，(2000))。溴基结构域和额外末端(BET)家族(BRD2、BRD3、BRD4以及BRDT)共享一种共同结构域构造以及一种更趋异的C端募集结构域，该共同结构域构造包括表现高水平的序列保守性的两个N端溴基结构域(Zeng等人，《欧洲生物化学学会联盟通讯》(FEBSLett)，513，124-128，(2002))。
本发明特征在于用于抑制人类溴基结构域蛋白质的组合物和方法。
本发明的化合物
本发明提供了多种化合物(例如，JQ1和具有在此描述的化学式的化合物)，这些化合物结合在BET家族成员(例如BRD2、BRD3、BRD4)的第一溴基结构域的apo晶体结构的结合袋中。不希望受理论的约束，这些化合物可以特别有效地抑制白血病，包括但不局限于急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征。在一种方法中，使用分子对接程序对有用于治疗白血病以及相关的失调的化合物进行选择，以鉴别预期结合到溴基结构域结构结合袋的化合物。在某些实施方案中，本发明的化合物可以阻止、抑制、或破坏、或减少BET家族成员(例如，BRD2、BRD3、BRD4、BRDT)的至少10％、25％、50％、75％、或100％的生物活性，和/或例如通过结合到溴基结构域apo结合袋内的结合位点破坏这类蛋白质的亚细胞定位。
在某些实施方案中，本发明的化合物是小分子，其分子量小于大约1000道尔顿、小于800、小于600、小于500、小于400、或小于大约300道尔顿。本发明的化合物的实例包括JQ1和其他化合物，这些化合物结合到BET家族成员(例如，BRD4(下文指BRD4(1)；PDBID2OSS))的第一溴基结构域的apo晶体结构的结合袋。JQ1是一种新型的噻吩并-三唑并-1，4-二氮杂环庚烷。本发明进一步提供了这些化合物的药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明的化合物是小分子，其分子量小于大约1000道尔顿、小于800、小于600、小于500、小于400、或小于大约300道尔顿。本发明的化合物的实例包括JQ1和其他化合物，这些化合物结合到BET家族成员(例如，BRD4(下文指BRD4(1)；PDBID2OSS))的第一溴基结构域的apo晶体结构的结合袋。JQ1是一种新型的噻吩并-三唑并-1，4-二氮杂环庚烷。本发明进一步提供了这些化合物的药学上可接受的盐。
在一个方面，该化合物是具有化学式I的化合物：
其中
X是N或CR5；
R5是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
RB是H、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基、或-COO-R3，其中的每一个可任选地经取代；
环A是芳基或杂芳基；
每一个RA独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或者任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个融合的芳基或杂芳基基团；
R是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基；其中的每一个可任选地经取代；
R1是-(CH2)n-L，其中n是0-3并且并且L是H、-COO-R3、-CO-R3、-CO-N(R3R4)、-S(O)2-R3、-S(O)2-N(R3R4)、N(R3R4)、N(R4)C(O)R3、可任选地经取代的芳基、或可任选地经取代的杂芳基；
R2是H、D、卤素、或可任选地经取代的烷基；
每一个R3独立地选自下组，该组由以下各项组成：
(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基、或经取代的杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；
(iii)-C1-C8烷基、-C2-C8链烯基或-C2-C8炔基，每一个包含0、1、2、或3个选自O、S、或N的杂原子；-C3-C12环烷基、经取代的-C3-C12环烷基、-C3-C12环烯基、或经取代的-C3-C12环烯基，其中的每一个可以可任选地经取代；以及
(iv)NH2，N＝CR4R6；
每一个R4独立地是H、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
或将R3和R4与它们附接的氮原子一起以形成一个4-10元环；
R6是烷基、链烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或将R4和R6与它们附接的碳原子一起以形成一个4-10元环；
m是0、1、2、或3；
假设
(a)如果环A是噻吩基，X是N，R是苯基或经取代的苯基，R2是H，RB是甲基，并且R1是-(CH2)n-L，其中n是1并且L是-CO-N(R3R4)，那么不将R3和R4与它们附接的氮原子一起形成一个吗啉代环；
(b)如果环A是噻吩基，X是N，R是经取代的苯基，R2是H，RB是甲基，并且R1是-(CH2)n-L，其中n是1并且L是-CO-N(R3R4)，并且R3和R4之一是H，那么R3和R4中的另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代的苯基、吡啶基或经取代的吡啶基；并且
(c)如果环A是噻吩基，X是N，R是经取代的苯基，R2是H，RB是甲基，并且R1是-(CH2)n-L，其中n是1并且L是-COO-R3，那么R3不是甲基或乙基；
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，R是芳基或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代。
在某些实施方案中，L是H、-COO-R3、-CO-N(R3R4)、-S(O)2-R3、-S(O)2-N(R3R4)、N(R3R4)、N(R4)C(O)R3或可任选地经取代的芳基。在某些实施方案中，每一个R3独立地选自下组，该组由以下各项组成：H，包含选自O、S、或N的0、1、2或3个杂原子的-C1-C8烷基；或NH2，N＝CR4R6。
在某些实施方案中，R2是H、D、卤素或甲基。
在某些实施方案中，RB是烷基、羟烷基、卤烷基、或烷氧基；其中的每一个可任选地经取代
在某些实施方案中，RB是甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、或COOCH2OC(O)CH3。
在某些实施方案中，环A是5或6元芳基或杂芳基。在某些实施方案中，环A是硫代呋喃基、苯基、萘基、联苯基、四氢萘基、茚满基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、或5，6，7，8-四氢异喹啉基。
在某些实施方案中，环A是苯基或噻吩基。
在某些实施方案中，m是1或2，并且至少一次出现的RA是甲基
在某些实施方案中，每一个RA独立地是H、一个可任选地经取代的烷基，或任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个芳基。
在另一个方面，该化合物是具有化学式II的化合物：
其中
X是N或CR5；
R5是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
RB是H、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基、或-COO-R3，其中的每一个可任选地经取代；
每一个RA独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或者任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个融合的芳基或杂芳基基团；
R是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
R’1是H、-COO-R3、-CO-R3、可任选地经取代的芳基、或可任选地经取代的杂芳基；
每一个R3独立地选自下组，该组由以下各项组成：
(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基、经取代的杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；
(iii)-C1-C8烷基、-C2-C8链烯基或-C2-C8炔基，每一个包含0、1、2、或3个选自O、S、或N的杂原子；-C3-C12环烷基、经取代的-C3-C12环烷基；-C3-C12环烯基、或经取代的-C3-C12环烯基；其中的每一个可以可任选地经取代；
m是0、1、2、或3；
其条件是如果R’1是-COO-R3，X是N，R是经取代的苯基，并且RB是甲基，那么R3不是甲基或乙基；
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，R是芳基或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代。在某些实施方案中，R是苯基或吡啶基，其中的每一个可任选地经取代。在某些实施方案中，R是对-Cl-苯基、邻-Cl-苯基、间-Cl-苯基、对-F-苯基、邻-F-苯基、间-F-苯基或吡啶基。
在某些实施方案中，R’1是-COO-R3、可任选地经取代的芳基、或可任选地经取代的杂芳基；并且R3是-C1-C8烷基，它包含0、1、2、或3个选自O、S、或N的杂原子，并且它可以可任选地经取代。在某些实施方案中，R’1是-COO-R3，并且R3是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、或叔丁基；或R’1是H或可任选地经取代的苯基。
在某些实施方案中，RB是甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH2OC(O)CH3。
在某些实施方案中，RB是甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、或COOCH2OC(O)CH3。
在某些实施方案中，每一个RA独立地是一个可任选地经取代的烷基，或任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个融合的芳基。
在某些实施方案中，每一个RA是甲基。
在另一个方面，该化合物是具有化学式III的化合物：
其中
X是N或CR5；
R5是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
RB是H、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基、或-COO-R3，其中的每一个可任选地经取代；
环A是芳基或杂芳基；
每一个RA独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或者任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个融合的芳基或杂芳基基团；
R是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
每一个R3独立地选自下组，该组由以下各项组成：
(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基、或经取代的杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；
(iii)-C1-C8烷基、-C2-C8链烯基或-C2-C8炔基，每一个包含0、1、2、或3个选自O、S、或N的杂原子；-C3-C12环烷基、经取代的-C3-C12环烷基、-C3-C12环烯基、或经取代的-C3-C12环烯基，其中的每一个可以可任选地经取代；以及
(iv)NH2，N＝CR4R6；
每一个R4独立地是H、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
或将R3和R4与它们附接的氮原子一起以形成一个4-10元环；
R6是烷基、链烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或将R4和R6与它们附接的碳原子一起以形成一个4-10元环；
m是0、1、2、或3；
假设：
(a)如果环A是噻吩基，X是N，R是苯基或经取代的苯基，RB是甲基，那么不将R3和R4与它们附接的氮原子一起形成一个吗啉代环；并且
(b)如果A是噻吩基，X是N，R是经取代的苯基，R2是H，RB是甲基，并且R3和R4之一是H，那么R3和R4中的另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代的苯基、吡啶基或经取代的吡啶基；以及
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，R是芳基或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代。在某些实施方案中，R是苯基或吡啶基，其中的每一个可任选地经取代。
在某些实施方案中，R是对-Cl-苯基、邻-Cl-苯基、间-Cl-苯基、对-F-苯基、邻-F-苯基、间-F-苯基或吡啶基。在某些实施方案中，R3是H、NH2、或N＝CR4R6。
在某些实施方案中，每一个R4独立地是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；其中的每一个可任选地经取代。
在某些实施方案中，R6是烷基、链烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代。
在另一个方面，该化合物是具有化学式IV的化合物：
其中
X是N或CR5；
R5是H、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
RB是H、烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、卤烷基、羟基、烷氧基、或-COO-R3，其中的每一个可任选地经取代；
环A是芳基或杂芳基；
每一个RA独立地是烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或者任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个融合的芳基或杂芳基基团；
R1是-(CH2)n-L，其中n是0-3并且L是H、-COO-R3、-CO-R3、-CO-N(R3R4)、-S(O)2-R3、-S(O)2-N(R3R4)、N(R3R4)、N(R4)C(O)R3、可任选地经取代的芳基、或可任选地经取代的杂芳基；
R2是H、D、卤素、或可任选地经取代的烷基；
每一个R3独立地选自下组，该组由以下各项组成：
(i)H、芳基、经取代的芳基、杂芳基、或经取代的杂芳基；
(ii)杂环烷基或经取代的杂环烷基；
(iii)-C1-C8烷基、-C2-C8链烯基或-C2-C8炔基，每一个包含0、1、2、或3个选自O、S、或N的杂原子；-C3-C12环烷基、经取代的-C3-C12环烷基、-C3-C12环烯基、或经取代的-C3-C12环烯基，其中的每一个可以可任选地经取代；以及
(iv)NH2，N＝CR4R6；
每一个R4独立地是H、烷基、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；
或将R3和R4与它们附接的氮原子一起以形成一个4-10元环；
R6是烷基、链烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、或杂芳基，其中的每一个可任选地经取代；或将R4和R6与它们附接的碳原子一起以形成一个4-10元环；
m是0、1、2、或3；
假设
(a)如果环A是噻吩基，X是N，R2是H，RB是甲基，并且R1是-(CH2)n-L，其中n是0并且L是-CO-N(R3R4)，那么不将R3和R4与它们附接的氮原子一起形成一个吗啉代环；
(b)如果环A是噻吩基，X是N，R2是H，RB是甲基，并且R1是-(CH2)n-L，其中n是0并且L是-CO-N(R3R4)，并且R3和R4之一是H，那么R3和R4中的另一个不是甲基、羟乙基、烷氧基、苯基、经取代的苯基、吡啶基或经取代的吡啶基；并且
(c)如果环A是噻吩基，X是N，R2是H，RB是甲基，并且R1是-(CH2)n-L，其中n是0并且L是-COO-R3，那么R3不是甲基或乙基；或者
其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，R1是-(CH2)n-L，其中n是0-3并且L是-COO-R3、可任选地经取代的芳基、或可任选地经取代的杂芳基；并且R3是-C1-C8烷基，它包含0、1、2、或3个选自O、S、或N的杂原子，并且它可以可任选地经取代。在某些实施方案中，n是1或2并且L是烷基或-COO-R3，并且R3是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、或叔丁基；或n是1或2并且L是H或可任选地经取代的苯基。
在某些实施方案中，R2是H或甲基。
在某些实施方案中，RB是甲基、乙基、羟甲基、甲氧基甲基、三氟甲基、COOH、COOMe、COOEt、COOCH2OC(O)CH3。
在某些实施方案中，环A是苯基、萘基、联苯基、四氢萘基、茚满基、吡啶基、呋喃基、吲哚基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、噻吩基、噻唑基、三唑基、异噁唑基、喹啉基、吡咯基、吡唑基、或5，6，7，8-四氢异喹啉基。
在某些实施方案中，每一个RA独立地是一个可任选地经取代的烷基，或任何两个RA与各自附接的多个原子一起可以形成一个芳基。
本发明的方法还涉及具有化学式V-XXII的化合物，并且涉及在此所述的任何化合物。
在另一个方面，该化合物是由以下化学式表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，该化合物是(+)-JQ1：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个方面，该化合物是由以下化学式表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个方面，该化合物是由以下化学式表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个方面中，该化合物是由以下化学式中任一个表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个方面中，该化合物是由以下化学式中任一个表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个方面中，该化合物是由以下结构中任一个表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，本发明的一种化合物可由以下结构之一表示：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在一个实施方案中，该化合物由以下结构表示：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个实施方案中，该化合物由以下结构表示：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在另一个实施方案中，该化合物由以下结构表示：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，本发明的化合物可以具有与在此列出的任何化合物相反的手性。
在某些实施方案中，该化合物是由化学式(V)、(VI)、或(VII)表示的化合物：
其中，R、R1、以及R2和RB具有如在化学式(I)中相同的意义；Y是O、N、S、或CR5，其中R5具有如在化学式(I)中相同的意义；n是0或1；并且化学式(VII)中的虚线圈表示芳族的或者非芳族的环；或其一种盐、溶解物或水合物。
在化学式I-IV和VI(或在此的任何化学式)中任一的某些实施方案中，R6表示下面表A中列出的醛的非羰基部分(即，对具有化学式R6CHO的醛而言，R6是该醛的非羰基部分)在某些实施方案中，R4和R6一起表示表A中列出的酮的非羰基部分(即，对化学式R6C(O)R4的酮而言，R4和R6是该酮的非羰基部分)
表A：
在一个实施方案中，该化合物是由以下化学式表示的化合物：
或其一种盐、溶解物或水合物。
在某些实施方案中，该化合物是(消旋的)JQ1；在某些实施方案中，这种化合物是(+)-JQ1。在某些实施方案中，该化合物是选自下组，该组由以下各项组成：
和
或其一种盐、溶解物或水合物。
化合物的另外的实例包括根据以下化学式中任一所述的化合物：
在化学式IX-XXII中，R和R’可以是，例如，H、芳基、经取代的芳基、杂芳基、杂芳基、杂环烷基、-C1-C8烷基、-C2-C8链烯基、-C2-C8炔基、-C3-C12环烷基、经取代的-C3-C12环烷基、-C3-C12环烯基、或经取代的-C3-C12环烯基，其中的每一个可以可任选地经取代。在化学式XIV中，X可以是用于如在此所描述的芳基基团的任何取代基。
可以通过多种方法制备本发明的化合物，其中一些方法在本领域是已知的。例如，下文提供的化学实例提供了用于制备化合物JQ1(作为消旋体)以及对映异构体(+)-JQ1和(-)-JQ1的合成方案(见方案S1和S2)。可以替换适当的起始材料通过类似的的方法制备具有化学式(I)-(VIII)的化合物。
例如，从JQ1起始，类似的胺可以按照下面所示的方案1制备。
如方案1中所示，JQ1的叔丁基酯的水解提供羧酸，用二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)处理该羧酸并使其经历克尔蒂斯(Curtius)重排条件以提供苄氧羰基(Cbz)保护的胺，然后脱保护产生该胺。该胺基团的后续加工，例如通过还原氨化，产生仲胺，这种仲胺可以被进一步地烷基化以提供叔胺。
方案2列出了本发明的化合物的另外的实例的合成，例如具有化学式I的化合物，其中稠环核心被修饰(例如，通过如化学式I中环A的不同的芳基环的取代)。使用具有适当官能度的氨基二芳基酮(例如，替换以下方案S1中的氨基二芳基酮S2)提供了具有多种稠环核心和/或芳基基团附属物(相应于化学式I中的基团R)的新颖化合物。这样的氨基二芳基酮是可商购的或者可以通过多种方法制备，其中一些方法在本领域是已知的。
方案3提供了用于制备本发明的另外的化合物的其他示例性合成方案。
如方案3所示，用R部分(DAM＝二甲氨基亚甲基保护基团)对稠合的二环前体(参见以下用于合成这种化合物的方案S1)进行官能化，并且然后通过与酰肼进行反应对其进行加工以形成三环的稠合核心。通过选择合适的酰肼可以改变取代基Rx。
本发明的化合物的其他实例(可以通过在此描述的方法制备)包括：
酰胺类：
可以通过例如以下的步骤制备酰胺类：制备相应的羧酸或酯，随后用适当的胺在标准条件下对其进行酰胺化。在某些实施方案中，酰胺提供了具有含有末端氮的环(例如，吡啶基、哌啶基、哌嗪基、咪唑基(包括N-甲基-咪唑基)、吗啉基等)的二碳“连接子”。示例性的酰胺结构包含：
优选使用酰胺部分与含有末端氮的环之间的二碳链接子。
“反向酰胺类”：
仲胺类：
硼酸类：
在某些实施方案中，具有至少一个手性中心的化合物以消旋形式存在。在某些实施方案中，具有至少一个手性中心的化合物是在对映异构体意义上富集的，即，具有至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的对映异构体过量(e.e.)。在某些实施方案中，化合物与在此描述的化合物(+)-JQ1((S)-2-(4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂环庚-6-基)乙酸叔丁酯)具有相同的绝对构型。
在于此披露的任一化学式的某些实施方案中，该化合物不由以下结构表示：
其中：
R’1是C1-C4烷基；
R’2是氢、卤素、或可任选地经卤素原子或羟基基团取代的C1-C4烷基；
R’3是卤素原子、可任选地经卤素原子取代的苯基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、或氰基；-NR5-(CH2)m-R6，其中R5是卤素原子或C1-C4烷基，m是0-4的整数，并且R6是可任选地经卤素原子取代的苯基或吡啶基；或-NR7-CO-(CH2)n-R8，其中R7是卤素原子或C1-C4烷基，n是0-2的整数，并且R8是可任选地经卤素原子取代的苯基或吡啶基；并且
R’4是-(CH2)a-CO-NH-R9，其中a是1-4的整数，并且R9是C1-C4烷基；C1-C4羟烷基；C1-C4烷氧基；或可任选地经C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氨基或羟基基团取代的苯基或吡啶基，或-(CH2)b-COOR10，其中b是1-4的整数，并且R10是C1-C4烷基。
术语“药学上可接受的盐(pharmaceuticallyacceptablesalt)”还指的是由在此披露的化合物(例如，JQ1，具有化学式I-XXII的化合物)或在此描述的任何其他化合物制备的盐，这种盐具有酸性官能团，如羧酸官能团，以及药学上可接受的无机或有机碱。适合的碱包括，但并不局限于，碱金属，如钠、钾、以及锂，的氢氧化物；碱土金属，如钙和镁，的氢氧化物；其他金属，如铝和锌，的氢氧化物；氨、和有机胺类，如未经取代的或经羟基取代的单-、二-、或三烷基胺；二环己胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基-N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-羟基-低级烷基胺类)，如单-、双-、或三-(2-羟基乙基)胺、2-羟基-叔丁胺、或三-(羟基甲基)甲胺，N，N-二-低级烷基-N-(羟基低级烷基)-胺，如N，N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺，或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸类，如精氨酸、赖氨酸等。术语“药学上可接受的盐(pharmaceuticallyacceptablesalt)”还指的是由在此披露的化合物，或在此描述的任何其他化合物制备的盐，这种盐具有碱性官能团，如氨基官能团，以及药学上可接受的无机或有机酸。适合的酸包括，但并不局限于，硫酸氢盐、柠檬酸、乙酸、草酸、盐酸、溴化氢、碘化氢、硝酸、磷酸、异烟酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、琥珀酸、马来酸、苯磺酸(besylicacid)、富马酸、葡糖酸、glucaronicacid、糖二酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸(benzenesulfonicacid)、以及对甲苯磺酸。
除抑制Brd4的小化合物以外，本发明进一步提供了抑制Brd4表达或生物活性的其他试剂。
抑制性核酸
本发明进一步提供了抑制Brd4的表达或活性的抑制性核酸分子，以及这些试剂用于治疗白血病(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常)的用途。此类寡核苷酸包括结合编码Brd4的核酸分子(例如，反义分子、siRNA、shRNA)的单链以及双链的核酸分子(例如，DNA、RNA及其类似物)以及直接结合到Brd4上从而调节其生物活性的核酸分子(例如，适体)。
核糖核酸酶
可以使用包含本发明的反义Brd4序列的催化性RNA分子或核糖核酸酶来抑制体内Brd4核酸分子的表达。核糖核酸酶序列包含在反义RNA中赋予对它们RNA-切割活性，由此增加这些构建体的活性。靶向RNA特异性核酶的设计和用途描述于Haseloff等人，《自然》(Nature)1988；334：585-591，以及美国专利申请公开号2003/0003469A1中，将它们各自通过引用结合在此。
因此，本发明的特点还有在结合臂包括具有八至十九个之间的连续核碱基的反义RNA的催化性RNA分子。在本发明的一个优选实施方案中，该催化性核酸分子在锤头(hammerhead)或发夹基序中形成。此类锤头基序的实例由Rossi等人，《艾滋病研究和人体逆转录酶病毒》(AidsResearchandHumanRetroviruses)1992；8：183所描述。发卡基序的实例由Hampel等人，1989年9月20日提交的“用于切割特定的RNA序列的RNA催化剂”(RNACatalystforCleavingSpecificRNASequences)(1988年9月20日提交的美国序列号07/247,100的部分继续)；Hampel和Tritz，《生物化学》(Biochemistry)1989；28：4929以及Hampel等人，《核酸研究》(NucleicAcidsResearch)1990；18：299描述。这些特定的基序不局限在本发明中，并且本领域的普通技术人员将认识到在本发明的酶性核酸分子中有重要作用的全部都如以下：它具有特异性底物结合部位，该部位与一个或多个靶基因RNA区互补，并且它在该底物结合部位内或周围具有核苷酸序列，这些序列赋予该分子RNA切割活性。
小发卡RNA由具有可任选的3′UU-突出的茎-环结构组成。同时可以有变化，茎的范围可以从21至31bp(理想地是25至29bp)，并且环的范围可以从4至30bp(理想地是4至23bp)。就shRNA在细胞中的表达而言，可以使用包含聚合酶IIIH1-RNA或U6启动子，一种用于茎-环的RNA插入的克隆位点以及4-5-胸苷转录终止信号的质粒载体。该聚合酶III启动子通常具有明确定义的起始与终止位点并且它们的转录本无聚腺苷酸尾巴。用于这些启动子的终止信号由聚胸苷段(polythymidinetract)确定并且在第二个尿苷之后，该转录本典型地被切割。在表达的shRNA中，这个位置处的切割产生一种与合成的siRNA的3′突出类似的3′UU突出。用于在哺乳动物细胞中表达shRNA的此外的方法描述于上文引用的参考文献中。
siRNA
短的二十一至二十五个核苷酸双链RNA在下调基因表达上是有效的(Zamore等人，《细胞》(Cell)101：25-33；Elbashir等人，《自然》(Nature)2001；411：494-498，通过引用结合在此)。McCaffrey等人(《自然》(Nature)2002；418：38-39)已经体内证实了sirNA方法在哺乳动物中的疗效。
给出靶基因的序列，可以设计出siRNA来使该基因失活。例如，可以将此类siRNA直接给药于受影响组织，或全身性地给药。可以使用Brd4基因的核酸序列来设计小干扰RNA(siRNA)。这些21至25个核苷酸的siRNA可以用作，例如，治疗剂以治疗血管疾病或失调。
可以采用本发明的抑制性核酸分子作为用于RNA干扰(RNAi)介导的BET表达敲低的双链RNA。在一个实施方案中，造血细胞或白血病细胞中Brd4表达被降低。RNAi是一种用于减少感兴趣的特异性蛋白的细胞内表达的方法(综述于Tuschl，《化学生物化学》(Chembiochem)2001；2：239-245；Sharp，《基因&发育》(Genes&Devel.)2000；15：485-490；Hutvagner和Zamore，《遗传发育新见》(Curr.Opin.Genet.Devel.)2002；12：225-232；以及Hannon，《自然》(Nature)2002；418：244-251)。越来越多地使用siRNAs引入细胞(通过dsRNA的转染或使用基于质粒的表达系统的siRNA表达)来在哺乳动物细胞中创造功能缺失的表型。
在本发明的一个实施方案中，双链RNA(dsRNA)分子被制成包含本发明的核碱基低聚物的八至十九个之间的连续核碱基。该dsRNA可以是两种不同的RNA链，它们具有双链的RNA链或单一的自身双链化的RNA链(短发卡(sh)RNA)。典型地，dsRNA有大约21或22个碱基对，但是如果希望的话，可以更短或更长(多达大约29个核碱基)。可以使用标准技术(例如，化学合成或体外转录)制备dsRNA。例如，可向Ambion公司(德克萨斯州，奥斯丁(Austin，Tex))以及Epicentre公司(威斯康辛州，麦迪逊(Madison，Wis))购买试剂盒。用于在哺乳动物细胞中表达dsRNA的方法描述于Brummelkamp等人，《科学》(Science)2002；296：550-553；Paddison等人，《基因&发育》(Genes&Devel.)2002；16：948-958；Paul等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnol.)2002；20：505-508；Sui等人，《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2002；99：5515-5520；Yu等人，《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2002；99：6047-6052；Miyagishi等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnol.)2002；20：497-500；以及Lee等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnol.)2002；20：500-505，将它们各自通过引用结合在此。
小发夹RNA(shRNA)包含一种具有茎-环结构的RNA序列。“茎-环结构”是指具有二级结构的核酸，该二级结构包含一个核苷酸区，该核苷酸区是已知的或预测为可形成双链或双链体(茎部分)，该双链体的一端通过主要是单链核苷酸(环部分)的区域连接。术语“发卡”在此还用来指茎-环结构。此类结构在本领域中是已知的并且该术语的使用与它在本领域中的含义一致。如在本领域中已知的，该二级结构不需要额外的配对碱基。因此，该茎可以包含一个或多个碱基错配或膨胀部。可替代地，该配对碱基可以是精确的，即，不包含任何错配。多重的茎-环结构可以通过一种接头彼此连接，例如，像一种核酸接头、miRNA侧翼序列、其他分子或其组合。
在此使用的，术语“小发卡RNA”包括常规的形成miRNA前体(前-miRNA)的茎-环shRNA。尽管在范围上可能有一些变化，一个常规的茎-环shRNA可包含范围从19至29bp的茎以及范围从4至30bp的环。“shRNA”还包括微小RNA嵌入的shRNA(基于miRNA的shRNA)，其中该miRNA双链体的引导链和过客链是合并到一个现存的(或天然的)miRNA中或者是合并到一个经修饰的或合成的(设计的)miRNA中。在一些情况下，该前体miRNA分子可以包含不止一个茎-环结构。微小RNA内源性地编码大约22个核苷酸长的RNA分子，并且通常以高等组织特异或发育阶段特异的方式来表达，并且这些微小RNA转录后地调节靶基因。已经在植物和动物中鉴别了超过200个的不同的miRNA。这些小的调节性RNA被认为通过以下两种主要的作用方式来起重要的生物学功能：(1)通过阻抑靶mRNA的翻译，以及(2)通过RNA干扰(RNAi)，即，mRNA的酶切与降解。在后者的案例中，miRNA功能类似于小干扰RNA(siRNA)。因此，可以基于现存的miRNA基因的特点设计并表达人工miRNA。
在此方面，可以将短发卡RNA设计为模仿内源性的miRNA。许多miRNA中间体可以被用作shRNA或shRNAmir的模型，包括但不限于包含miR-15a、-16、-19b、-20、-23a、-27b、-29a、-30b、-30c、-104、-132s、-181、-191、-223的主链设计的miRNA(见，美国公开号2005/0075492)。在一些实施方案中，shRNA分子是基于人miR-30序列而设计，通过用不相关的配对碱基序列取代pri-miR-30的茎序列来进行重新设计以允许人工shRNA的表达(Siolas等人，2005，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)23：227-231；Silva等人，2005，《自然遗传学》(Nat.Genet.)37：1281-1288；Zeng等人(2002)，《分子细胞》(Molec.Cell)9：1327-1333)。该miR-30的自然茎序列可以由长度上从大约16至大约29个核苷酸，特别是长度上从大约19至29个核苷酸的茎序列代替。可以改变环序列使得长度从大约4至大约23个核苷酸。在一个实施方案中，该shRNA分子的茎是长度上大约22个核苷酸。在另一个实施方案中，该茎是长度上大约29个核苷酸。因此，使用合成生产的shRNA，以及在自然界中发现的并且可以将其改型以作为合成的沉默短发卡RNA起功能的微小RNA(miRNA)分子来实施本发明。
shRNA可以从DNA载体中表达以提供持续的沉默并且高产率递送进入几乎任何细胞类型。在一些实施方案中，该载体是一种病毒载体。示例性的病毒载体包括逆转录病毒载体，其包括慢病毒的、腺病毒的、杆状病毒的以及鸟类病毒的载体，并且包括允许稳定的、单拷贝基因组整合的此类载体。逆转录病毒质粒载体可以从其衍生的逆转录病毒包括但不局限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白细胞增生病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。逆转录病毒质粒载体可以用于转导包装细胞系(packagingcellline)，从而形成生产者细胞系(producercellline)。可以被转染的包装细胞的实例包括但不局限于，PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12以及DAN细胞系，如在Miller，《人类基因治疗》(HumanGeneTherapy)1：5-14(1990)中所述的，通过引用以其全文结合于此。载体可以经由本领域中已知的任何方法转导这些包装细胞。生产者细胞系产生有传染性的逆转录病毒载体颗粒，这些逆转录病毒载体颗粒诱导对DNA复制蛋白进行编码的多核苷酸。然后可以采用此类逆转录病毒载体颗粒来体外或体内地转导真核细胞。这些经转导的真核细胞将表达DNA复制蛋白。
本质上可以使用任何用于将核酸构建体引入细胞内的方法。引入核酸的物理方法包括注射含有该构建体的溶液，用被该构建体覆盖的粒子轰击，将细胞、组织样品或有机体浸泡在该核酸的溶液中，或者在该构建体存在下电穿孔细胞膜。可以使用包装进入病毒颗粒中病毒构建体来完成表达型构建体有效地引入细胞中以及被编码的shRNA的有效转录。可以使用其他本领域中已知的、用于将核酸引入细胞的方法，如，脂类介导的载体转运，化学品介导的转运如磷酸钙，等等。因此，可以将编码shRNA的核酸构建体与执行一种或多种以下活动的组分一起引入：增强细胞摄入RNA，促进双链体链的退火，使退火链稳定或者否则增加靶基因的抑制。
对于细胞内表达而言，可以使用DNA载体，例如包含RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的质粒载体。内源性miRNA的表达由RNA聚合酶II(PolII)启动子控制，并且在一些情况下，与RNA聚合酶III启动子相比较，shRNA由PolII启动子驱动最有效(Dickins等人，2005，《自然遗传学》(Nat.Genet.)39：914-921)。在一些实施方案中，可以通过可诱导型启动子或条件型表达系统(包括但不限于，RNA聚合酶类型II启动子)来控制shRNA的表达。在本发明的上下文中有用的启动子的实例是四环素诱导型启动子(包括TRE-紧(TRE-tight))、IPTG-诱导型启动子、四环素反式激活蛋白系统以及反向的四环素反式激活蛋白(rtTA)系统。还可以使用组成型启动子，以及细胞或组织特异性的启动子。许多启动子是普遍存在的，这样使得它们在所有的细胞和组织类型中表达。某一实施方案使用四环素应答性启动子(tetracycline-responsivepromoter)，它是体外和体内研究中最有效的条件型基因表达系统之一。针对可诱导型shRNA的描述见国际专利申请PCT/US2003/030901(公开号WO2004-029219A2)以及Fewell等人，2006，《今日药物发现》(DrugDiscoveryToday)11：975-982。
小发夹RNA(shRNA)包含一种具有茎-环结构的RNA序列。“茎-环结构”是指具有二级结构的核酸，该二级结构包含一个核苷酸区，该核苷酸区是已知的或预测为可形成双链或双链体(茎部分)，该双链体的一端通过主要是单链核苷酸(环部分)的区域连接。术语“发卡”在此还用来指茎-环结构。此类结构在本领域中是已知的并且该术语的使用与它在本领域中的含义一致。如在本领域中已知的，该二级结构不需要额外的配对碱基。因此，该茎可以包含一个或多个碱基错配或膨胀部。可替代地，该配对碱基可以是精确的，即，不包含任何错配。多重的茎-环结构可以通过一种接头彼此连接，例如，像一种核酸接头、miRNA侧翼序列、其他分子或其组合。
在此使用的，术语“小发卡RNA”包括常规的形成miRNA前体(前-miRNA)的茎-环shRNA。尽管在范围上可能有一些变化，一个常规的茎-环shRNA可包含范围从19至29bp的茎以及范围从4至30bp的环。“shRNA”还包括微小RNA嵌入的shRNAs(基于miRNA的shRNAs)，其中该miRNA双链体的引导链和过客链是合并到一个现存的(或天然的)miRNA中或者是合并到一个经修饰的或合成的(设计的)miRNA中。在一些情况下，该前体miRNA分子可以包含不止一个茎-环结构。微小RNA内源性地编码大约22个核苷酸长的RNA分子，并且通常以高等组织特异或发育阶段特异的方式来表达，并且这些微小RNA转录后地调节靶基因。已经在植物和动物中鉴别了超过200个的不同的miRNA。这些小的调节性RNA被认为通过以下两种主要的作用方式来起重要的生物学功能：(1)通过阻抑靶mRNA的翻译，以及(2)通过RNA干扰(RNAi)，即，mRNA的酶切与降解。在后者的案例中，miRNA功能类似于小干扰RNA(siRNA)。因此，可以基于现存的miRNA基因的特点设计并表达人工miRNA。
在此方面，可以将短发卡RNA设计为模仿内源性的miRNA。许多miRNA中间体可以被用作shRNA或shRNAmir的模型，包括但不限于包含miR-15a、-16、-19b、-20、-23a、-27b、-29a、-30b、-30c、-104、-132s、-181、-191、-223的主链设计的miRNA(见，美国公开号2005/0075492)。在一些实施方案中，shRNA分子是基于人miR-30序列而设计，通过用不相关的配对碱基序列取代pri-miR-30的茎序列来进行重新设计以允许人工shRNA的表达(Siolas等人，2005，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)23：227-231；Silva等人，2005，《自然遗传学》(Nat.Genet.)37：1281-1288；Zeng等人(2002)，《分子细胞》(Molec.Cell)9：1327-1333)。该miR-30的自然茎序列可以由长度上从大约16至大约29个核苷酸，特别是长度上从大约19至29个核苷酸的茎序列代替。可以改变环序列使得长度从大约4至大约23个核苷酸。在一个实施方案中，该shRNA分子的茎是长度上大约22个核苷酸。在另一个实施方案中，该茎是长度上大约29个核苷酸。因此，使用合成生产的shRNA，以及在自然界中发现的并且可以将其改型以作为合成的沉默短发卡RNA起功能的微小RNA(miRNA)分子来实施本发明。
shRNA可以从DNA载体中表达以提供持续的沉默并且高产率递送进入几乎任何细胞类型。在一些实施方案中，该载体是一种病毒载体。示例性的病毒载体包括逆转录病毒载体，其包括慢病毒的、腺病毒的、杆状病毒的以及鸟类病毒的载体，并且包括允许稳定的、单拷贝基因组整合的此类载体。逆转录病毒质粒载体可以从其衍生的逆转录病毒包括但不局限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白细胞增生病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。逆转录病毒质粒载体可以用于转导包装细胞系，从而形成生产者细胞系。可以被转染的包装细胞的实例包括但不局限于，PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12以及DAN细胞系，如在Miller，《人类基因治疗》(HumanGeneTherapy)1：5-14(1990)中所述的，通过引用以其全文结合于此。载体可以经由本领域中已知的任何方法转导这些包装细胞。生产者细胞系产生有传染性的逆转录病毒载体颗粒，这些逆转录病毒载体颗粒诱导对DNA复制蛋白进行编码的多核苷酸。然后可以采用此类逆转录病毒载体颗粒来体外或体内地转导真核细胞。这些经转导的真核细胞将表达DNA复制蛋白。
本质上可以使用任何用于诱导细胞内核酸构建体的方法。引入核酸的物理方法包括注射含有该构建体的溶液，用被该构建体覆盖的粒子轰击，将细胞、组织样品或有机体浸泡在该核酸的溶液中，或者在该构建体存在下电穿孔细胞膜。可以使用包装进入病毒颗粒中病毒构建体来完成表达型构建体有效地引入细胞中以及被编码的shRNA的有效转录。可以使用其他本领域中已知的、用于将核酸引入细胞的方法，如，脂类介导的载体转运，化学品介导的转运如磷酸钙，等等。因此，可以将编码shRNA的核酸构建体与执行一种或多种以下活动的组分一起引入：增强细胞摄入RNA，促进双链体链的退火，使退火链稳定或者否则增加靶基因的抑制。
对于细胞内表达而言，可以使用DNA载体，例如包含RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的质粒载体。内源性miRNA的表达由RNA聚合酶II(PolII)启动子控制，并且在一些情况下，与RNA聚合酶III启动子相比较，shRNA由PolII启动子驱动最有效(Dickins等人，2005，《自然遗传学》(Nat.Genet.)39：914-921)。在一些实施方案中，可以通过可诱导型启动子或条件型表达系统(包括但不限于，RNA聚合酶类型II启动子)来控制shRNA的表达。在本发明的上下文中有用的启动子的实例是四环素诱导型启动子(包括TRE-紧(TRE-tight))、IPTG-诱导型启动子、四环素反式激活蛋白系统以及反向的四环素反式激活蛋白(rtTA)系统。还可以使用组成型启动子，以及细胞或组织特异性的启动子。许多启动子是普遍存在的，这样使得它们在所有的细胞和组织类型中表达。某一实施方案使用四环素应答性启动子(tetracycline-responsivepromoter)，它是体外和体内研究中最有效的条件型基因表达系统之一。针对可诱导型shRNA的描述见国际专利申请PCT/US2003/030901(公开号WO2004-029219A2)以及Fewell等人，2006，《今日药物发现》(DrugDiscoveryToday)11：975-982。
核碱基低聚物的递送
裸露的抑制性核酸分子或其类似物能够进入哺乳动物细胞并且抑制感兴趣的基因(例如，Brd4)的表达。尽管如此，可能希望的是利用一种辅助寡核苷酸或其他核碱基低聚物递送进入细胞的配制品(参见，例如，美国专利号5,656,611、5,753,613、5,785,992、6,120,798、6,221,959、6,346,613以及6,353,055，将它们各自通过引用结合在此。
药物治疗
在其它实施方案中，使用此处描述的方法发现的有药用价值的试剂(例如JQ1或具有此处描绘的化学式的化合物)，例如，通过合理的药物设计，可用作用于现有化合物的结构修饰的一种药物或信息。对于治疗用途而言，用此处披露的方法得以鉴别的这些组合物或试剂可以全身性地给药，例如配制在药学上可接受的缓冲液如生理盐水中。优选的给药途径包括，例如，在病人体内提供连续的、持续的药物水平的皮下注射、静脉注射、腹腔注射、肌内注射或皮内注射。使用一种在生理上可接受的载体中的、在此处得以鉴别的治疗有效量的治疗剂来对人类病人或其它动物进行治疗。对合适的载体以及它们的配制进行了描述，例如，在E.W.Martin著作的《雷明顿氏药学全书》(Remington′sPharmaceuticalSciences)中进行了描述。待被给药的治疗剂的用量的变化取决于给药方式、该病人的年龄和体重，以及白血病(例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生异常和骨髓增生障碍)的临床症状。总体上，尽管在某些情况下，由于该化合物特异性增加会需要较低的用量，但是用量会处于在其他与白血病相关联的疾病的治疗中使用的其他试剂所用的那些量的范围内。以减少癌症细胞的增殖、生长或存活的剂量将一种化合物进行给药，这个剂量通过使用本领域的技术人员已知的方法或使用任何测量细胞增殖或活力的测定来确定。
药用组合物的配制
用于治疗白血病的化合物的给予可以通过任何合适的手段，这些手段产生有效减少白血病细胞增殖或存活的与其他组分组合的治疗剂的浓度。该化合物可以任何合适量地包含于任何合适的载体物质中，并且总体上以该组合物总重的1-95％(按重量计)存在。该组合物可以是以一种适合于肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、或腹膜内)给药通路的剂型来提供。这些药用组合物可以按常规药物实践(见，例如，雷明顿：《试剂的科学与实践》(第20版)(Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(20thed.)，ed.)，A.R.Gennaro，LippincottWilliams&Wilkins，2000，以及《制药技术百科全书》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology)，编辑，J.Swarbrick与J.C.Boylan，1988-1999年，MarcelDekker公司，纽约)进行配制。在一个具体的实施方案中，将本发明的试剂直接全身性地给予受试者。
人类剂量最初可以通过从小鼠中使用的化合物的量进行推断来确定，正如本领域技术人员认识到的，与动物模型相比来修改对人类的剂量是本领域中的惯例。在一个实施方案中，以50mg/kg经口地或全身性地给予本发明的试剂。在某些其他实施方案中，可以想象到的是，剂量变化可以从大约1μg化合物/Kg体重之间至大约5000mg化合物/Kg体重；或从大约5mg/Kg体重至大约4000mg/Kg体重；或大约10mg/Kg体重至大约3000mg/Kg体重，或从大约50mg/Kg体重到大约2000mg/Kg体重；或从大约100mg/Kg体重到大约1000mg/Kg体重；或从大约150mg/Kg体重至大约500mg/Kg体重。在其他实施方案中，这个剂量可以是大约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000mg/Kg体重。在其他实施方案中，可以想到的是，剂量可以在大约5mg化合物/Kg体重至大约100mg化合物/Kg体重的范围内。在其他实施方案中，这些剂量可以是大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/Kg体重。当然，同在此类的治疗方案中常规做的一样，这个剂量可以往上或往下调节，这个调节取决于最初的临床试验和具体病人的需要。
根据本发明的这些药用组合物可以配制成在给药时基本上立刻释放出该活性化合物或者在给药后任何一个预定的时刻或时间段释放出该活性化合物。后一种类型的组合物一般被称为控制释放配制品，它包括(i)在身体内在较长的时间内产生一个基本上恒定的药物浓度的配制品；(ii)预定的滞后时间后，在身体内在较长的时间内产生一个基本上恒定的药物浓度的配制品；(iii)在一段预定的时间期间，通过维持身体内相对恒定有效的水平，同时相伴的与该活性物质的血浆水平波动(锯齿动力学模式)相关联的不希望的副作用最小化，来维持作用的配制品；(iv)通过，例如，控释组合物与胸腺相邻或接触的空间放置来定位作用的配制品；(v)允许方便给药，使得，例如，每一个或两个星期给药一次的配制品；以及(vi)靶向白血病的配制品，该白血病包括但不局限于急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、骨髓增生异常、以及骨髓增生障碍。对于某些应用而言，控释配制品排除了对在白天频繁给药以维持血浆水平于治疗水平的需要。
可以遵循许多策略中的任何一个，以便获得其中释放速率大于所谈论的化合物的代谢速率的控释。在一个实例中，控释是通过对各种配方参数和成分的合适选择来获得，包括，例如，不同的控释组合物和包衣类型。因此，将该治疗剂与合适的赋形剂配入一种给药时以受控方式释放该治疗剂的药用组合物中。实例包括单或多单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳剂、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂、以及脂质体
多种肠胃外组合物
该药用组合物可以剂型、配制品通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌内、腹膜内、等等)或经由合适的含有常规的、无毒的药学上可接受的载体和佐剂的递送装置或植入物进行肠胃外给药。此类组合物的配制和制备对药物配制领域的普通技术人员而言是众所周知的。配制可以在雷明顿：《药学科学与实践》(Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，同上)中找到。
可以用单位剂型(例如，在单剂量的安瓿中)，或者用包括若干剂量的小瓶来提供多种肠胃外使用组合物，并且其中可以加入合适的防腐剂(见下文)。该组合物的形式可以是一种溶液、悬浮液、乳液、输注装置、或用于植入的递送装置，或者它可以是一种在使用前用水或其它合适的载体复原的干粉剂。除减少白血病细胞的生长、增殖或存活的活性剂外，该组合物可以包含合适的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。该(这些)活性治疗剂可以掺入到用于控释的微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中。此外，该组合物可以包含悬浮、增溶、稳定、pH调节剂，张度调节剂，和/或分散剂。
如上文所述，根据本发明的这些药用组合物可以是适合于无菌注射的形式。为了制备这样的一种组合物，将该(这些)合适的活性治疗剂溶解于或悬浮于一种肠胃外可接受的液体载体中。可以采用的可接受的载体和溶剂是水，通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调整到合适的pH值的水，1，3-丁二醇，林格氏溶液(Ringer′ssolution)、以及等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。该水性配制品还可以包含一种或多种防腐剂(例如甲基、乙基或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中这些化合物之一仅少量或微溶于水的情况下，可以添加一种溶解增强剂或增溶剂，或该溶剂可包括10％-60％(w/w)的丙二醇等。
控释的肠胃外组合物
多种控释的肠胃外组合物可以是水悬浮液，微球，微胶囊，磁性微球，油溶液，油悬浮液，或乳液形式。可替代地，该活性药可以掺入到生物相容的载体、脂质体、纳米颗粒、埋植剂、或输注设备中。
用于制备微球和/或微胶囊的材料是，例如可生物降解的/可生物蚀解的聚合物如：聚泌乳激素、聚氰基丙烯酸异丁酯、聚(2-羟基乙基-L-左旋谷氨酸)、以及聚(乳酸)。当配制一种控释的肠胃外配制品时，可以使用的生物相容载体是碳水化合物(例如葡聚糖)、蛋白质(例如清蛋白)、脂蛋白或抗体。在埋植剂中使用的材料可以是非可生物降解的(例如聚二甲基硅氧烷)或可生物降解的(例如聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸或聚邻醚或其组合物)。
用于口服的固体制剂形式
用于口服的配制品包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的该(这些)活性成分的片剂。此类配制品对熟练的业内人士而言是已知的。赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙、或磷酸钠)；造粒剂和崩解剂(例如，纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、淀粉(包括马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐、或藻酸)；结合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇)；以及润滑剂，助流剂，和抗结合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅酸盐、氢化植物油、或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、湿润剂、缓冲剂，等。
这些片剂可以是无包衣的或或它们可以通过已知技术包衣，来可任选地延迟在胃肠道中的崩解和吸收并且从而提供在较长的时间内的持续作用该包衣可以调适于以一种预定的模式释放该活性药物(例如，为了获得一种控释配制品)，或者它可以调适于不释放该活性药物，直到通过胃后(肠溶包衣)。该包衣可以是一种糖包衣、一种膜包衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或一种肠溶包衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、虫胶、和/或乙基纤维素)。此外，可以使用一种延时材料，例如，单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
这些固体片剂组合物可以包含调适于使该组合物避免不需要的化学变化(例如，该活性治疗物质的释放前的化学降解)的一种包衣。该包衣可以是以与在《制药技术百科全书》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology，同上)中表述的一种相似方式应用于该固体制剂形式。
可以将至少两种治疗剂一起混合在该片剂中，或者可以分开。在一个实例中，该第一活性治疗剂包含在该片剂的内部，并且该第二活性治疗剂包含在该片剂的外部，使得该第二治疗剂的实质部分在该第一治疗剂释放前得以释放。
口服用配制品还可以呈现为咀嚼片、或硬明胶胶囊，其中该活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软明胶胶囊，其中该活性成分与水或一种油介质混合，例如，花生油，液体石蜡或橄榄油。可以用上述的按照片剂和胶囊剂的这些成分，以一种常规的使用例如混合器、流化床装置或喷雾干燥设备的方式来制备粉剂和颗粒剂。
控释的口服制剂形式
可以将多种用于口服的控释组合物，例如，构建成通过控制该活性物质的溶解和/或扩散来释放该活性治疗剂。通过化合物的片剂、胶囊、丸、或颗粒配制品的适当包衣，或通过将该化合物掺入到一种合适的基质中，从而可以够获得溶解或扩散的控释。一种控释包衣可以包含以上提到的这些包衣物质中的一种或多种和/或例如虫胶、蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈酰硬脂酰甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、醋酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯吡硌烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1，3-丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯，和/或聚乙烯醇。在一个控释基质配制品中，该基质材料还可以包括，例如，水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇，卡波姆934(carbopol934)、硅酮、甘油三硬脂酸酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯、和/或卤化氟烷。
含有一种或多种治疗化合物的控释组合物还可以是一种胃飘浮片剂或胶囊形式(例如，在口服给药时，漂浮在胃内容物之上一定时间段的一种片剂或胶囊)。该(这些)化合物的胃飘浮片剂配制品可以通过将该(这些)化合物与赋形剂以及20-75％(w/w)的水状胶质(例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、或羟丙基纤维素)的混合物进行粒化来制备。然后将所得颗粒压制成片剂。在与胃液接触时，该片剂在它的表面周围形成了一个基本上不透水的凝胶屏障。这个凝胶屏障参与保持小于一的密度，从而使该片剂仍然漂浮在胃液中。
联合治疗
可任选地，用于治疗白血病的治疗剂，这些白血病包括但不局限于急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、骨髓增生异常、以及骨髓增生障碍，是单独给予或与其他用于治疗癌症的标准疗法联合给予；这类方法对于技术人员而言是已知的，并且描述于E.W.Martin的雷明顿的药物科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)中。如果希望，本发明的试剂(例如JQ1，在此描绘的化学式的化合物，及其衍生物)是与对于治疗癌症而言有用的任何常规化疗剂联合给予。
试剂盒或药物系统
这些组合物可以被组装进用于在白血病的治疗中使用的试剂盒或药物系统(这些白血病例如，急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤、骨髓增生异常、以及骨髓增生障碍)。根据本发明的这个方面的试剂盒或药物系统包括一个载体工具，如一个盒、纸盒、管等，该载体工具中严格限定地具有一个或多个容器工具，如：小瓶、管、安瓿、瓶子等。本发明的试剂盒或药物系统还可以包括用于使用本发明的这些试剂的相关使用说明书。
疗法
疗法可以在任何进行癌症治疗的地方进行提供在家、医生的办公室、诊所、医院门诊部、或医院。一般在医院开始治疗，这样使得医生可以接近地观察疗法的效果并且做出任何需要的调整。疗法的持续时间取决于要治疗的癌症种类、病人的年龄和病况、病人的疾病的阶段和类型、以及病人的身体对治疗的响应。可以按不同的间隔(例如每天、每周、或每月)进行给药。可以按包括休息期的续-断周期(on-and-offcycles)给予疗法，这样使得病人的身体具有构建健康新细胞并且重新获得其力量的机会。
如上所述，如果希望，用本发明的化合物(例如JQ1)进行治疗，靶向Brd4的抑制性核酸分子可以与用于治疗增生性疾病的疗法(例如放射疗法、外科手术、或化学疗法)相组合。除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练业内人士的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中进行充分地说明，例如：“分子克隆：实验指南”(“MolecularCloning：ALaboratoryManual”)，第二版，(Sambrook，1989)；“寡核苷酸合成”(“OligonucleotideSynthesis”)(Gait，1984)；“动物细胞培养”(“AnimalCellCulture”)(Freshney(弗雷谢尼)，1987)；“酶学方法”(“MethodsinEnzymology”)“实验免疫学手册”(“HandbookofExperimentalImmunology”(Weir，1996)；“哺乳动物细胞的基因转移载体”(“GeneTransferVectorsforMammalianCells”)(Miller和Calos，1987)；“分子生物学现行规范”(“CurrentProtocolsinMolecularBiology”)(Ausubel，1987)；“PCR：聚合酶链式反应”(“PCR：ThePolymeraseChainReaction”)，(Mullis，1994)；“免疫学现行规范”(“CurrentProtocolsinImmunology”)(Coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施方案特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何进行和使用测试、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的公开和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。
实例
I.化学实例-制剂的合成和方法
本发明的化合物可以用此处描述的方法，和/或根据由此处描述的本领域的普通技术人员已知的方法进行合成。
方案S1.消旋溴基结构域抑制剂(±)-JQ1的合成
(2-氨基-4，5-二甲基噻吩-3-基)(4-氯苯基)甲酮(S2)
根据以上所示的方案制备该化合物JQ1。
将固体硫磺(220mg，6.9mmol，1.00当量)在2321C加入到4-氯苯甲酰基乙腈S1(1.24g，6.9mmol，1.00当量)，2-丁酮(0.62ml，6.9mmol，1当量)，以及吗啉(0.60ml，6.9mmol，1.00当量)的乙醇(20ml，0.35M)溶液中。该然后将该混合物加热至70℃。12小时后，将该反应混合物冷却至23℃并且倒入盐水(100ml)中。该将该水层用乙酸乙酯(3×50ml)进行萃取。将这些合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下进行浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，40克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得黄色固体状的S2(1.28g，70％)。
(S)-叔丁基-3-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-4-{[3-(4-氯苯甲酰基)-4，5-二甲基噻吩-2-基]氨基}-4-氧丁酸酯(S3)
将(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲铵六氟磷酸酯(HCTU)(827mg，2.0mmol，2.00当量)，和N，N-二异丙基乙胺(0.72ml，4.0mmol，4.00当量)依次加入到9-芴甲氧羰基-天冬氨酸β-叔丁基酯[Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH](864mg，2.1mmol，2.10当量)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中(1.5ml，1.0M)。然后将该混合物在23℃搅拌5分钟。再添加固体S2(266mg，1.0mmol，1当量)。将该反应混合物在23℃搅拌。16小时后，添加乙酸乙酯(20ml)和盐水(20ml)。将这两个层分离，并且将该水层用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。将这些合并的有机层用盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤而且在减压下进行浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，40克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得棕色油状的S3(625mg，90％)。
(S)-3-氨基4-((3-(4-氯苯甲酰基)-4，5-二甲基噻吩-2-基)氨基)-4-氧丁酸叔丁酯(S4)
将化合物S3(560mg，0.85mmol，1当量)在23℃溶解于20％哌啶的DMF溶液中(4.0ml，0.22M)。30分钟后，将乙酸乙酯(20ml)和盐水(20ml)加入到该反应混合物中。将这两个层分离，并且将该水层用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。将这些合并的有机层用盐水(3×25ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下进行浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，24克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得黄色固体状的游离胺S4(370mg，90％)。该对映异构体的纯度降至75％(用采用AS-H柱的Berger超临界流体色谱法(SFC)确定)。
(S)-2-(5-(4-氯苯基)-6，7-二甲基-2-氧-2，3-二氢-1H-噻吩并[2，3-e][1，4]二氮杂环庚-3-基)乙酸叔丁酯(S5)
将氨基酮(S4)(280mg，0.63mmol)溶解于10％乙酸乙醇溶液中(21ml，0.03M)。该反应混合物被加热至85℃。30分钟后，将所有的溶剂在减压下去除。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，12克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得白色固体状的化合物S5(241mg，95％)。S5的对映异构体纯度为67％(用采用AS-H柱的Berger超临界流体色谱法(SFC)确定)。
2-(5-(4-氯苯基)-6，7-二甲基-2-硫代-2，3-二氢-1H-噻吩并[2，3-e][1，4]二氮杂环庚-3-基)乙酸叔丁酯(S6)
将五硫化二磷(222mg，1.0mmol，2.00当量)、碳酸氢钠(168mg，2.0mmol，4.00当量)依次加到S5(210mg，0.5mmol，1当量)的二甘醇二甲醚溶液(1.25ml，0.4M)中。将该反应混合物加热至90℃。16h后，添加盐水(20ml)和乙酸乙酯(35ml)。将这两个层分离，并且将该水层用乙酸乙酯(3×30ml)萃取。将这些合并的有机层用盐水(2×15ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下进行浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，24克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得棕色固体状的含有回收的S5(73mg，34％)的S6(141mg，65％)。
2-(4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂环庚-6-基)乙酸叔丁酯[(±)JQ1]
在0℃，将肼(0.015ml，0.45mmol，1.25当量)加到S6(158mg，0.36mmol，1当量)的THF(2.6ml，0.14M)溶液中。将该反应混合物加温至23℃，并且在23℃搅拌1h。将所有的溶剂在减压下去除。该得到的肼直接使用，无需纯化。然后将该肼溶解于原乙酸三甲酯和甲苯(6ml，0.06M)的2∶3混合物中。将该反应混合物加热至120℃。2h后，将所有的溶剂在减压下去除。将残余物用快速柱色谱法(Combiflash系统，4克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得白色固体状的JQ1(在两步中，140mg，85％)。这些反应条件进一步使该手性中心差向异构化，产生消旋体，JQ1(用采用AS-H柱的Berger超临界流体色谱法(SFC)确定)。
方案S2.富含对映异构体的(+)-JQ1的合成
(S)-叔丁基-3-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-4-{[3-(4-氯苯甲酰基)-4，5-二甲基噻吩-2-基]氨基}-4-氧丁酸酯(S3)
将(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷(PyBOP)(494mg，0.95mmol，0.95当量)、N，N-二异丙基乙胺(0.50ml，2.8mmol，2.75当量)依次加入到9-芴甲氧羰基-天冬氨酸β-叔丁基酯[Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH](411mg，1.00mmol，1.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中(1.0ml，1.0M)中。然后在23℃将该混合物搅拌5分钟。然后添加固体状S2(266mg，1.0mmol，1当量)。将该反应混合物在23℃搅拌。4h后，添加乙酸乙酯(20ml)和盐水(20ml)。将这两个层分离，并且将该水层用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。将这些合并的有机层用盐水(30ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下进行浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，40克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得棕色油状的S3(452mg，72％)。
(S)-3-氨基4-((3-(4-氯苯甲酰基)-4，5-二甲基噻吩-2-基)氨基)-4-氧丁酸叔丁酯(S4)
将化合物S3(310mg，0.47mmol，1当量)在23℃下溶解于20％哌啶的DMF溶液中(2.2ml，0.22M)。30分钟后，将乙酸乙酯(20ml)和盐水(20ml)加入到该反应混合物中。将这两个层分离，并且将该水层用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。将这些合并的有机层用盐水(3×25ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下进行浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，24克硅凝胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得黄色固体状的游离胺S4(184mg，90％)。该对映异构体的纯度是91％(用采用AS-H柱的Berger超临界流体色谱法(SFC)确定)。
(S)-2-(5-(4-氯苯基)-6，7-二甲基-2-氧-2，3-二氢-1H-噻吩并[2，3-e][1，4]二氮杂环庚-3-基)乙酸叔丁酯(S5)
将氨基酮(S4)(184mg，0.42mmol)溶解于甲苯(10ml，0.04M)中。添加硅凝胶(300mg)，并且将该反应混合物加热至90℃。3h后，将该混合物冷却至23℃。将该硅凝胶进行过滤并且用乙酸乙酯进行洗涤。将这些合并的滤液浓缩。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，12克硅胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得白色固体状的化合物S5(168mg，95％)。S5的对映异构体纯度为90％(用采用AS-H柱的Berger超临界流体色谱法(SFC)确定)。
(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂环庚-6-基)乙酸叔丁酯[(+)JQ1]
在-78℃将叔丁醇钾(1.0MTHF溶液，0.3ml，0.30mmol，1.10当量)加到S5(114mg，0.27mmol，1当量)的THF(1.8ml，0.15M)溶液中。将该反应混合物加温至-10℃，并且在23℃搅拌30min。将该反应混合物冷却至-78℃。将氯磷酸二乙酯(0.047ml，0.32mmol，1.20当量)加入反应混合物中22。将该获得的混合物经45min加温至-10℃。将乙酰肼(30mg，0.40mmol，1.50当量)加入反应混合物中。将该反应混合物在23℃搅拌。1h后，将1-丁醇(2.25ml)加到反应混合物中，将其加热至90℃。1h后，将所有溶剂在减压下去除。将残余物用快速柱色谱法(CombiflashRF系统，4克硅胶，梯度0至100％的乙酸乙酯-己烷)纯化以获得对映异构体纯度(用采用AS-H柱的Berger超临界流体色谱法确定，85％己烷-甲醇，210nm，tR(R-对映异构体)＝1.59min，tR(S-对映异构体)＝3.67min))为90％的白色固体状的(+)-JQ1(114mg，92％)。用制备型HPLC(采用OD-H柱的Agilent高压液相色谱)将该产物进一步纯化以获得大于99％ee的S-对映异构体。
1HNMR(600MHz，CDCl3，25℃)δ7.39(d，J＝8.4Hz，2H)，7.31(d，J＝8.4Hz，2H)，4.54(t，J＝6.6MHz，1H)，3.54-3.52(m，2H)，2.66(s，3H)，2.39(s，3H)，1.67(s，3H)，1.48(s，9H).
13CNMR(150MHz，CDCl3，25℃)δ171.0，163.8，155.7，150.0，136.9，131.1，130.9，130.6，130.3，128.9，81.2，54.1，38.1，28.4，14.6，13.5，12.1.
对C21H24ClN2O3S[M+H]+的HRMS(ESI)计算值(calc’d)：457.1460，实验值(found)457.1451m/z。
TLC(EtOAc)，Rf：0.32(UV)
[α]22 D＝+75(c0.5，CHCl3)
采用Fmoc-D-Asp(Ot-Bu)-OH作为起始材料，以相似的方式合成(-)-JQ1，并且用制备型HPLC(采用OD-H柱的Agilent高压液相色谱)将该产品进一步纯化以获得大于99％ee的R-对映异构体。[α]22 D＝-72(c0.5，CHCl3)
另外的化合物的合成
如方案S3图示制备本发明的另外的化合物。
方案S3.肼衍生物的合成
如方案S3所示，将(+)-JQ1(1)的叔丁基醚进行切割以生成自由酸(2)，这种自由酸与肼偶联生成酰肼(3)。与4-羟基苯甲醛的反应生成腙(4)。
酰肼(3)和腙(4)二者均在至少一个生物测定中显示出活性。
通过酰肼(3)与多种含有羰基的化合物(见上表A)的反应制备一种化合物库。
制备另外化合物用作，如，测试开发的探针。在下面的方案S4中示出一个示例性的合成。
方案S4.可用作探针的衍生物的合成。
制备如下表中所示的额外的化合物：
每个化合物的色谱数据与该指定结构相一致。
II.生物学活性和治疗方法
实例1：对于急性髓性白血病细胞的增殖而言，Brd4是关键并且特异性地需要的
为了系统地探查急性髓性白血病细胞(AML)所需的表观遗传通路，进行了shRNA筛选。为此，构建了靶向243个已知染色质调节子的定制hRNA文库。该文库包括表观遗传标记的多数“写入器()”、“阅读器()”、和“消除器()”(附图1A)。将1,095个shRNAs(每个基因三至六个)的文库构建到TRMPV中，TRMPV是一种优化用于阴性选择RNAi筛选的载体。在初步筛选中，该文库作为一个池被转导进入一个已建立的Tet-On感受态AML小鼠模型细胞系中，该细胞系包括MLL-AF9和NrasG12D融合基因(Zuber等人，《自然生物技术》(NatBiotechnol)2011；29：79-83)。在药物选择后，通过添加强力霉素(dox)诱导shRNA表达。使用从基因组DNA扩增的shRNA引导链的深度测序，监控培养十四天以后文库表示中的变化。(附图1B和2A-2D)。在两个独立重复的每一个中，177个shRNA表现出大于二十倍的消耗，这被用作评分标准。对于靶向必需基因(Rpa1、Rpa3、Pcna、Polr2b)的所有八个阳性对照shRNA连同靶向两个已知MLL-AF9辅因子(Men1和Psip1)的若干shRNA而言，达到了正评分。具有在初步筛选中达到评分标准的至少两个独立shRNA的基因经历一个广泛的逐一验证，其中使用独立的MLL-AF9/NrasG12DAML系和载体系统(附图3A)(对于另外的细节，参见PCT公开号WO/2010/111712)。在初步筛选和验证阶段这二者中，靶向转录因子Brd4的shRNA是在最强烈消耗的shRNA中。总体来说，Brd4被鉴别为对该shRNA筛选的实验条件最具响应性的基因(附图1B和3B)。
Brd4是含溴基结构域的蛋白的BET家族的一个成员，这些蛋白结合乙酰化的组蛋白来影响转录。BRD4还是一个以鳞状细胞癌的罕见形式经由染色体易位而突变的原癌基因。尚未描述Brd4在白血病中的作用。小分子BET溴基结构域抑制剂的最新进展(Filippakopoulos等人，《自然》(Nature)2010；468：1067-73)，连同Brd4被鉴别为上述shRNA筛选中最具响应性的基因，这提示Brd4是用于AML治疗的一个新颖的药物靶标。五个独立的Brd4shRNA显示出了在敲低效率和生长抑制之间的近似相符性，这表明了中靶效应(on-targeteffects)(附图6A和6B)。Brd4抑制导致白血病细胞的细胞周期停滞以及凋亡，而在永生的鼠胚胎成纤维细胞()中的等价敲低只导致适度的细胞周期抑制而没有细胞毒性(附图4A-4D)。Brd4敲低还未能影响非转化的成红细胞的生长(附图4E)。此外，靶向BRD4的shRNA还足以在两个MLL-AF9+人AML系中诱导细胞周期停滞(附图5A-5D)。总之，这些结果表明在MLL-AF9+AML中，Brd4是关键的需要。
实例2：溴基结构域蛋白抑制剂JQ1特异性地阻断急性髓性白血病(AML)细胞增殖
在多种白血病细胞类型中，测试了JQ1(BET溴基结构域的顶级小分子抑制剂，具有对Brd4的第一溴基结构域的最高亲合力(等人)的效果。与成纤维细胞和G1E相比，小鼠MLL-融合白血病细胞的增殖对亚微摩尔的JQ1浓度显著敏感(附图6B)，这与Brd4-shRNA对这些不同细胞类型的增殖的相对影响一致。还在一系列已建立的人类白血病细胞系中(如在成年的和小儿的原代白血病样品中)检验了的JQ1的生长抑制效果。在13/14个AML细胞系(附图6C和7A)以及跨不同基因亚型的12/15个原代AML(附图8和9)中，观察到了JQ1(IC50＜500nM)的广泛生长抑制活性。此外3/3个测试的原代MLL-重排小儿白血病对JQ1高度敏感(附图9A和9B)，同时其他测试的非AML白血病和实体瘤细胞系显示出对该化合物的最小敏感性(附图6C和7B)。在所有测试的AML系中，JQ1处理普遍引发细胞周期停滞和凋亡。类似于shRNA-介导的Brd4敲低后所见的效果(附图6D、6E、8A-8D、9A-9C、10A-10C)。总之，这些数据表明在体外，Brd4对于AML生长是重要的，可以使用溴基结构域抑制剂JQ1对其进行有效靶向。
实例3：通过抑制Brd4，在体内抑制白血病进展
研究了Brd4对AML进展的体内相关性。为了在小鼠中建立的AML中抑制Brd4，用含抗Brd4shRNA的或含对照shRNA的TRMPV构建体转导Tet-On感受态MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞。然后将这些细胞移植到事先经亚致死剂量照射的第二受体小鼠中。在发病以后，通过生物发光成像对其进行确认，通过给予强力霉素(dox)诱导shRNA表达(附图11A-11F)。随后的监控揭示，Brd4抑制导致白血病进展的显著延迟，并且提供了显著的存活益处(附图12A-12C)。利用TRMPV载体中与shRNA表达相联系的dsRed报告子(Zuber等人，《自然生物技术》2011；29：79-83)，流式细胞术分析证实，如与对照相比，在终末白血病载荷内，Brd4-shRNA-阳性细胞被消耗。该数据表明，研究的小鼠中的致死性是由于Brd4-shRNA-阴性细胞的发展(附图12D和12E)。总之，这些数据表明，RNAi介导的Brd4抑制在体内抑制了白血病扩张。
实例4：在体内，JQ1处理抑制已建立的AML
为了检验在AML中JQ1是否具有单药活性，对用MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞移植的小鼠每天注射JQ1(50mg/kg)亦或载体进行处理。JQ1给药导致疾病进展的显著延迟并且显著延长了存活(附图12F-12H)。在已建立的疾病的环境中，JQ1也展示了单药活性，如在MLL-AF9/NrasG12D和在AML1-ETO9a/NrasG12D/p53-/-AML模型中所见(附图12I、13A-13E、以及14A-14C)，其中这两者都已知对常规化学疗法不敏感(Zuber等人，《基因与发育》()，2009；23：877-89)。与以前的发现一致(Filippakopoulos等人，《自然》2010；468：1067-73)，在小鼠中JQ1处理是很好地耐受的，如果有的话，也是对正常血细胞生成具有很小影响(附图15、16、17A和17B)。这些发现证明，JQ1作为单药在体内具有有效的并且白血病特异性的作用。
实例5：通过shRNA或JQ1的Brd4抑制降低白血病细胞的干细胞潜能并且诱导它们的分化
AML特征在于与无能力完成终末骨髓分化相联系的扩展的自我更新能力。因此，接下来考虑Brd4的存在是否影响白血病细胞的分化状态。Brd4shRNA表达和JQ1处理这二者将MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的形态学从骨髓单核细胞胚细胞(myelomonocyticblast)改变为具有巨噬细胞样外观的细胞(附图18A和18B)。在通过shRNA亦或JQ1处理的Brd4抑制时，上调的基因涉及巨噬细胞功能和Mac-1(一种髓样分化标志物)。Brd4抑制下调了c-kit，它的水平与MLL重排白血病中的白血病干细胞的频率相关(附图18C和18D)。此外，JQ1处理在多数的测试原代白血病样品中诱导了的成熟表型的形态学征象，尽管程度变化(附图8和9)。
为了进一步验证Brd4的抑制是否消除了LSC腔，对从Brd4-shRNA和JQ1处理的白血病细胞获得的表达微阵列进行了基因集合富集分析(GSEA)(Subramanian等人，《美国国家科学院院刊》2005；102：15545-50)。GSEA揭示了在Brd4抑制后的巨噬细胞特异性基因显著上调(附图18E和18F)，连同先前示出的基因表达信号的总体损失，从而从非自我更新的白血病细胞子集区别LSC(附图18G和18H)(Somervaille等人，《细胞干细胞》(CellStemCell)，2009；4：129-40)。附图18I包括示出RT-qPCR结果的图。在JQ1处理的人AML细胞系THP-1中可见基因表达改变的类似曲线(附图19)。重要地，在这些测定中，经由shRNA的Brd4敲低和药理学的BET溴基结构域抑制之间的强表型相似确立了Brd4是JQ1的靶标。因此，这些结果揭示，Brd4对于维持白血病干细胞群以及对于防止它们的终末分化是必要的。
实例6：在鼠和人白血病细胞中，JQ1抑制Myc通路(一条与白血病干细胞自我更新相关联的通路)
因为Myc通路与白血病干细胞自我更新相关联，并且Myc似乎是Brd4的下游靶标，因此研究了Brd4抑制对Myc水平的影响。在小鼠MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中，经由shRNA或JQ1处理的Brd4抑制导致MycmRNA水平和Myc蛋白水平的大幅减少；与此对比，Brd4在MEF或G1E细胞中具有最小作用(附图20A-20C、21A、和21B)。在JQ1暴露60分钟内发生MycmRNA水平的下调，定性地先于涉及巨噬细胞分化的基因的增加表达，例如Cd74(附图20D)。进一步支持直接转录调节，免疫沉淀反应实验鉴别了Myc启动子的～2千碱基上游的聚焦性Brd4占有区域，该区域在暴露于JQ1后消除(附图20E)。如预期那样，对用shRNA或用JQ1的Brd4抑制的RNAi或JQ1诱导的抑制还导致Myc靶基因表达的总体减少(附图21C和22)(还参见Kim等人，《细胞》2010；143：313-24；以及Schuhmacher等人，《核酸研究》，2001；29：397-406)。明显地，在检验的一系列广泛的小鼠和人白血病细胞系中，JQ1处理引发了Myc下调(附图20A-20C，附图23A和23B)，表明JQ1提供了一种在一系列白血病亚型中抑制Myc通路的工具。附图21D包括评估Myc下游靶基因表达变化的GSEA图。
实例7：Brd4通过独立于Myc的通路调节细胞存活
接下来，进行实验以进一步评估JQ1处理的抗增殖效果是否是经由抑制Myc活性发生。在此，产生MLL-AF9/NrasG12D白细胞培养，使得从逆转录病毒启动子异位表达MyccDNA，这导致完全抗JQ1诱导的转录抑制的轻微的但是组成性的Myc过表达(附图20F，24A和24B)。显著地，异位的Myc赋予对JQ1、Brd4shRNA诱导的细胞周期停滞、以及巨噬细胞分化的几乎完全的抗性(附图)。此外，总体表达曲线揭示，绝大部分JQ1诱导的转录变化实际是Myc下调的次级效应(附图26A-26C)。Myc自身的shRNA敲低也引发类似Brd4抑制的生长停滞和髓样分化的模式(附图27A-D)，这进一步支持Myc作为JQ1诱导的效应的重要中介物。重要地，异位Myc表达不能防止JQ1诱导的细胞死亡，这提示在调节细胞存活中Brd4的另外的独立于Myc的作用。这些发现表明，在维持Myc活性以保持白血病中的未分化细胞状态方面，Brd4具有重要作用。
通过采用靶向表观遗传调节子的无偏筛选方法(non-biasedscreeningapproach)，Brd4被鉴别为对AML疾病维持所需的关键因子。因为在AML中Brd4并不明显突变或过表达(附图28A和28B)，单通过该疾病的遗传的或转录的表征，尚未揭示白血病细胞对Brd4抑制的精细敏感性。此外，在此描述的结果证明，溴基结构域抑制剂在不同AML背景下具有广泛活性，并且通过比较它的效果与Brd4-shRNA诱导的那些，提供了以下证据：Brd4是JQ1抗白血病活性的相关靶标。JQ1是强健(robust)的抗白血病分子，在啮齿动物中具有约一小时的半寿期(附图29)。在体内，用Brd4shRNA也观察到这样的效果，明白地凸显了RNAi筛选在揭示癌症中新颖的药物靶标中的效用。
作为乙酰基-赖氨酸结合域的竞争性抑制剂，JQ1干扰Brd4“阅读”促进转录激活的组蛋白乙酰化标识的能力(Filippakopoulos等人，2010)。当应用于白血病细胞，JQ1干扰支持自我更新的转录回路；因此，JQ1诱导了白血病干细胞(LSC)的终末分化。Myb是MLL-AF9诱导的转录程序中的中心中介物，并且对于异常自我更新状态而言是重要的，这样使得Myb抑制足以消除疾病(Zuber，已提交)。有趣地，Brd4的遗传的或药理学的抑制之后产生的基因表达变化显著类似于在抑制MLL-AF9或Myb时所观察到的那些(附图)。然而，JQ1处理并不影响Hoxa7、Hoxa9、或Meis1的表达，它们是MLL-AF9的经良好确立的直接靶标。这表明，Brd4抑制并不抵消MLL-AF9的总体功能，而是抑制了大子集的其他下游靶标，例如经由Myc的抑制。总之，似乎MLL-AF9、Myb、和Brd4在恶性自我更新所必要的普通转录回路中功能性地交叉。该程序的关键效应因子是癌蛋白Myc(Zuber等人，已提交)，它已经被验证为一个有吸引力的治疗靶标，但不适合传统药理学抑制。
以上提到的实例明确证明，靶向Brd4对白血病背景具有选择性地压制了Myc表达并且限制了自我更新，因此避免了与系统的Myc抑制潜在相关联的造血毒性。因此，经由RNAi敲低或JQ1处理抑制Brd4通过直接调制表观遗传机器，定义了一种用于破解涉及鼠和人白血病相关联的难懂的致瘤通路的特定并有效的策略。
使用以下材料和方法，获得了在以上实例中的在此报告的结果。
质粒
对于有条件性的RNAi实验，从TRMPV-Neo载体亦或TtTMPV-Neo载体表达shRNA，这先前已经进行过描述(Zuber等人，《自然-生物技术》2011；29：79-83)。为了筛选验证，将shRNA克隆到LMN(MSCV-miR30-PGK-NeoR-IRES-GFP)中，LMN是基于LMP3通过用NeoR盒替代PuroR转基因而产生的。对于Myc拯救实验，将野生型小鼠MyccDNA亚克隆到MSCV-PGK-Puro-IRES-GFP(MSCV-PIG)中(Hemann等人，《自然遗传学》(NatGenet)2003；33：396-400)。
池化的阴性选择RNAi筛选
使用miR30适配的BIOPREDsi预测，设计靶向到调节小鼠基因的243染色质的定制shRNA文库(Huesken等人，《自然-生物技术》2005；23：995-1001)(6shRNA/基因)，并且通过PCR克隆一个在55k定制的阵列上合成的寡核苷酸池来构建该文库(安捷伦科技有限公司(AgilentTechnologies)，列克星敦，马萨诸塞州(Lexington，MA)，如以前所述(Zuber等人，2011)。在序列验证后，以相等的浓度在一个池中将1095个shRNA(3-6个/基因)与若干阳性和阴性对照shRNA组合在一起。将该池亚克隆到TRMPV-Neo中，并且使用主要导致单逆转录病毒整合的条件将其转导到Tet-OnMLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中，并且以＞500个细胞的计算数目表示每个shRNA(总计感染3千万个细胞，2％的转导效率)。使用mg/mlG418(Invitrogen公司，(卡尔斯巴德，加利福尼亚州(Carlsbad，CA))选择转导的细胞，持续5天；贯穿该实验，在每一传代＞2千万个细胞被维持以保存文库表现度(libraryrepresentation)。在药物选择后，获得T0样品(每个重复～2千万个细胞)，并且随后在添加0.5mg/mlG418和1μg/ml强力霉素下培养细胞以诱导shRNA表达。14天以后(＝12次传代，T14)，对于每个重复，使用一台FACSAriaIITM仪器(BDBiosciences公司，(斯帕克斯，马里兰州(Sparks，MD))对～1500万个表达shRNA(dsRed+/Venus+)的细胞进行分选。通过使用PhaseLockTM管(5prime公司，盖瑟斯堡，马里兰州(Gaithersburg，MD))进行两轮苯酚萃取随后进行异丙醇沉淀而分离来自T0和T14样品的基因组DNA，。通过shRNA引导链的PCR扩增产生深度测序模板文库，如以前所述(Zuber等人，2011)。在一台Illumina基因组分析器(圣迭戈，加利福尼亚州(SanDiego，CA)上，在8pM的最终浓度分析文库；将18nt用反向读译引导链的引物进行测序(miR30EcoRISeq，TAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA)。为了提供对于检测实验样品中的shRNA消耗而言足够的基线，希望的是在T0样品中获得每一shRNA＞500个读数，这需要每个样品＞1000万个读数来补偿池化的质粒制备中固有的或由PCR偏差引入的shRNA表现(shRNArepresentation)中的差异。在这些条件下，获得对于1072个(全部的97％)shRNA的＞500个读数的T0基线。使用定制的银河系平台(Galaxyplatform)(Taylor等人，《生物信息学实验指南》(CurrProtocBioinformatics)，第10章，105单元(2007))进行序列加工。对于每一shRNA和条件，将匹配读数的数目归一化到每一道的文库特定读数的总数，并且被输入数据库用于进一步分析。
细胞培养
所有小鼠MLL-白血病细胞系衍生自从患晚期疾病的受体小鼠获得的骨髓，并培养于补充了10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。MLL-AF9(单独)、MLL-AF9/NrasG12D、Tet-OnMLL-AF9/NrasG12D、和MLL-ENL/FLT3ITD的细胞培养物是如先前所述而得到(Zuber等人，《基因和发育》(GenesDev)2009；23：877-89和Zuber等人，2011)。永生化MEF培养物在先前得以描述(Zuber等人，2011)。G1E细胞是由MitchellWeiss(宾夕法尼亚大学)惠赠的。MEF细胞在含有10％FBS与1％谷氨酰胺(GIBCO公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州())的DMEM中培养。G1E细胞在含有15％FBS、2U/ml红细胞生成素(Sigma-Adrich公司)以及10％kit配体条件化培养介质的IMDM中培养。除了KASUMI-1在含有20％FBS的RPMI1640中培养外，所有的人白血病细胞系在含有10％FBS的RPMI1640中培养。NOMO-1和MOLM-13购自DSMZ公司。KASUMI-1、HL-60以及IMR-90从ATCC公司得到。K-562和THP-1是由MartinCarroll(宾夕法尼亚大学)惠赠的。U2OS、HeLa和Jurkat是由CSHL组织培养服务部门提供的。
蛋白质印迹
对于Brd4蛋白质印迹，将30g全细胞裂解RIPA提取物(25mMTrispH7.6，150mMNaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)上样至每个泳道。对于Myc蛋白印迹，直接在Laemmli缓冲液中裂解细胞。每个泳道上样约为50,000细胞当量。蛋白提取物用SDS-PAGE电泳进行分辨，并转移到硝酸纤维膜用于印迹。
增殖测定
通过经72小时对活细胞数目的增长计数来进行增殖测定。通过与碘化丙啶(PI)孵育来排除死细胞。在GuavaEasycyte(Millipore公司，比尔利卡，马萨诸塞州Billerica)上进行细胞浓度测量，利用前向/侧向散射/PI-细胞来仅对活细胞设门。使用以下公式计算增值率：ln(细胞浓度72h/细胞浓度0h)/72。通过归一化至经DMSO处理的细胞的增殖率来计算相对增殖率。
梅-格-吉姆萨离心涂片染色
可用1ug/ml强力霉素处理MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞来诱导TRMPVshRNA或用100nMJQ1处理两天。将50,000细胞重悬浮在100μlFACS缓冲液(5％FBS，含有0.05％NaN3的PBS)中，使用ShandonCytospin2涂片离心机以500rpm离心5min甩片(cytospun)在玻璃玻片上。根据制造商的方案进行梅-格(Sigma-Aldrich公司，#019K4368)以及吉姆萨(Sigma-Aldrich公司，#010M4338)染色。用40倍物镜的ZeissObserver显微镜采集图像。
BraU细胞周期分析和膜联蛋白V流式细胞计量术
根据制造商的方案(BD公司，APCBrdU流式试剂盒，#552598)进行BrdU掺入测定，其中将细胞用BrdU脉冲30分钟。将细胞用7-AAD或DAPI进行共染色用于DNA含量测量。对于所有条件性的shRNA实验，在shRNA+/dsRed+细胞群上对该分析进行设门。根据制造商(BD公司，APC膜联蛋白V，#550475)的方案进行针对凋亡的膜联蛋白V染色。在附图4e中，在活细胞(FSC/SCC)和dsRed+/shRNA+群上进行膜联蛋白V设门，以确保shRNA效果的清晰读出。这种设门方法选择性地将早期凋亡细胞(膜联蛋白V+，DAPI-)可视化，由此在这些图中明显缺乏积累的死细胞(膜联蛋白V+，DAPI+)。使用Flowjo软件来进行所有分析。
人AML细胞系中的shRNA实验
人shRNA克隆进入TRMPV-Neo载体，接着是THP-1和MOLM-13细胞的逆转录病毒转导，这些细胞经过修饰以使用MSCV-RIEP质粒(rtTA-ires-EcoR-PGK-Puro)来表达同向性受体()和rtTA3。将细胞用400μg/ml的G418进行选择1周。用1μg/ml的强力霉素处理细胞来诱导shRNA表达。将使用FACS的dsRed+/shRNA+细胞的相对改变用来检测生长抑制。如上所述进行BrdU细胞周期分析。
成人原代白血病样品分析(附图8)
原代白血病细胞是从12位诊断患有AML()或AML复发()的未受处理的病人的外周血(PB)或骨髓(BM)吸出样品中获得的。根据法美英(FAB)合作研究小组(Delhommeau等人，《新英格兰医学杂志》(NEnglJMed)2009；360：2289-301；和Ley等人，《新英格兰医学杂志》2010；363：2424-33)以及世界卫生组织()()提供的标准来建立诊断。用Ficoll提取单核细胞(MNC)并且被保存在液氮中直到使用。每一情况下，血液捐献或骨髓穿刺之前获得同意书。这项研究由维也纳大学医学院的机构审查委员会(伦理委员会)批准。HL60和MOLM13细胞系被包括用作对照(微生物与细胞培养德国汇总(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures)，DSMZ，不伦瑞克，德国)。解冻后，如通过台盼蓝排除法估算，AML细胞的生存力范围是从70％至99％。
在存在或不存在JQ1(10-5,000nM)的情况下，原代细胞(解冻的MNC，5-10x104细胞/孔)和细胞系(1-5x104细胞/孔)在96孔微量滴定板(TPP公司，Trasadingen，瑞士)中用添加10％的胎牛血清(FCS，Pasching公司)的RPMI1640(PAA实验室，Pasching公司，奥地利)培养基在37℃(5％CO2)培养48小时。在选择实验中，在存在或不存在增殖诱导细胞因子的混合物的情况下，将原代AML细胞与JQ1孵育。重组人(rh)G-CSF，100ng/ml(Amgen公司，千橡，加利福尼亚州())；rhSCF，100ng/ml(Peprotech公司，落基山，新泽西州())；和rhIL-3，100ng/ml(，维也纳，奥地利()。48小时后，加入0.5μCi3H-胸苷(16小时)。在Filtermate196收获器中，在滤膜上收获细胞。过滤器是空气干燥的，并且用β-计数器(Top-CountNXT，PackardBioscience公司)测量结合放射活性。所有的实验都是一式三份进行的。增殖是作为对照(培养在对照培养基中的细胞)的百分数计算的，并且JQ1的抑制效果是用IC50值表示。在细胞离心涂片器载玻片上通过莱特-吉姆萨染色分析药物暴露细胞的分化的形态学征象。
小儿原代白血病样品分析(附图9)
依据机构审查委员会批准的方案收集新诊断的患有急性白血病的儿童的诊断骨髓样品。依照赫尔辛基协议获得同意书。收集时，将原代白血病细胞用Ficoll-PaquePLUS(GE，Piscataway，新泽西州)通过密度离心进行富集，并且随后保存在液氮中。解冻冻存细胞的瓶，重悬在培养基中，并且通过密度离心来富集活的白血病细胞。细胞被保持在含有20％胎牛血清的补加培养基中。所有白血病细胞培养物在37℃、5％CO2下孵育。
将原代白血病样品在96孔板中用各剂量范围的JQ1和载体对照处理72小时。对于膜联蛋白结合实验，收获细胞并用膜联蛋白V-PE和7-AAD(BDPharmingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州()染色，用FACSCalibur读取，并用FlowJo软件分析(TreeStar公司，阿什兰，俄勒冈州()。对于WST-1测定，将WST-1试剂(，曼海姆，德国()加入培养基(1∶10稀释)并用Bio-Radmodel680型酶标仪(BioRadLaboratories公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州()在450nm测量吸光度。WST-1测定是一式三份地进行的。
将原代白血病样品在96孔板中用250nMJQ1和载体对照处理48小时。在基线、24小时和48小时制备细胞离心涂片，并且用莱特-吉姆萨(Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，蒙大拿州)溶液染色。用尼康EclipseE600显微镜系统获取图像。
骨髓组织学分析
将石蜡包埋切片用苏木精伊红(HE)染色。在具有尼康DigitalSight摄像机的尼康80i显微镜上，用NIS-ElementsF2.30软件以2560×1920的分辨率拍摄图片。用AdobePhotoshopCS2重新调整图像大小并且设定分辨率为300像素/英尺，应用自动对比并使用非锐化滤镜来改进图像清晰度。
正常造血功能的FACS评估(附图17)
人shRNA克隆进入TRMPV-Neo载体，接着是THP-1和MOLM-13细胞的逆转录病毒转导，这些细胞经过修饰以使用MSCV-RIEP质粒(rtTA-ires-EcoR-PGK-Puro)来表达同向性受体()和rtTA3。将细胞用400μg/ml的G418进行选择1周。用1μg/ml的强力霉素处理细胞来诱导shRNA表达。使用FACS的dsRed+/shRNA+细胞的相对改变用来检测生长抑制。如上所述进行BrdU细胞周期分析。
微阵列表达
通过CSHL微阵列共享资源来进行微阵列。使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN公司，日耳曼镇，马里兰州(，#74104)从107个细胞中提取RNA。在安捷伦2100生物分析仪()、RNA6000PicoSeriesII芯片(安捷伦，派罗阿尔托，加利福尼亚州，美国()评估RNA质量。用RINscore(2.0或更高版本)评估样品。用改良的Eberwine技术()扩增RNA，然后使用Ambion公司WT表达试剂盒(Ambion公司，奥斯汀，德克萨斯州()将aRNA转换。用安捷伦2100生物分析仪RNA6000Nano系列II芯片(安捷伦，派罗阿尔托，加利福尼亚州，美国)针对3′偏好(3′bias)对所有样品进行了aRNA和cDNA的大小分布的评估。然后将cDNA片段化，并利用Affymetrix基因芯片WT末端标签化试剂盒(Affymetrix公司，圣克拉拉，加利福尼亚州()来用生物素进行末端标签化。针对杂交准备样品，依据制造商对小鼠基因ST1.0基因芯片(Affymetrix公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)的说明进行杂交、清洗和扫描。使用Affymetrix表达控制台质量度量(AffymetrixExpressionConsoleQCmetrics)传送图像数据。通过基于R的Bioconductor中的
附图25中展示的热度图是使用GenePattern软件制作的()。简言之，RMA处理的微阵列数据被转换成log2标度。然后将选定的基因列表进行行归一化并且在GenePattern的HeatmapImage模块上运行。
基因集合富集分析()分析
使用具有1000表型排列(phenotypepermutation)的GSEAv2.07软件(Broad研究院()，剑桥，马萨诸塞州()进行基因集合富集分析(Subramanian等人美国科学院院刊2005；102：15545-50)。白血病干细胞和Myc基因集合是从指定的出版物获得的(Kim等人，《cell》2010；143：313-24，Schuhmacher等人，《核酸研究》2001；29：397-406，和Somervaille等人，《细胞干细胞》2009；4：129-40)。巨噬细胞发育基因集合是从IngenuityPathwayAnalysis(IPA)软件(Ingenuity公司，红木城，加利福尼亚州)获得的。Myb标志基因集合(shMybMLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中前500个下调基因)以及MLL-AF9标志基因集合(MLL-AF9Tet-OFFMLL-AF9/NrasG12D白血病细胞中前500个下调的基因)是从Lowe/Vakoc实验室未公开研究中的微阵列数据中得到的(Zuber等人，已提交)。
附图19中，为了在人微阵列数据上运行GSEA，首先用bioDBNetdbWalk模块(http://biodbnet.abcc.ncifcrf.gov/db/dbWalk.php)或人工地用NCBI数据库将小鼠的基因集合转换为人基因名。GSEA方法的详细描述和解释被提供在网站(http://www.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html)上。简言之，归一化的富集分数(NES)提供了“一个基因集合在基因排级列表的顶部或底部被过度表现的程度”假发现率q值(FDRq-val)“是具有给定NES的基因集表示假阳性结果的估算概率”“一般地，考虑到在多数表达数据集合中缺少一致性并且分析的基因集合的数目相对较少，25％的FDR截取是合适的。
染色质免疫沉淀
ChIP测定是精确按照所述来进行(Filippakopoulos等人)。用连续EGS(Pierce公司)/甲醛进行交联。所有的结果通过qPCR进行量化，该qPCR是使用SYBRgreen(ABI)在ABI7900HT上进行的。将每一IP信号参考为一种输入标准曲线稀释系列()以针对起始细胞数目方面的不同以及针对引物扩增效率进行归一化。
RT-qPCR
用Trizol试剂(Invitrogen公司，卡尔巴斯德，加利福尼亚州())制备RNA。用qScriptTMcDNASuperMix(，盖瑟斯堡，马里兰州(，#101414-106)来进行cDNA的合成。在ABITM7900HT上用Sybrgreen(ABI公司，卡斯巴尔德，加利福尼亚州，#4364344)进行定量PCR(qPCR)分析。用delta-Ct方法对所有信号进行定量。将所有的信号归一化到GAPDH水平。
引物
小鼠RT-qPCR引物(从5’至3’端书写)
Bim：CCTGCTTTGCTCTCTCCATTTT和CCCCACCCCAGACACAAGTA
Brd4：CCATGGACATGAGCACAATC和TGGAGAACATCAATCGGACA
Ccl4：CCCGAGCAACACCATGAAG和CCACGAGCAAGAGGAGAGAGA
Cd74：CCAACGCGACCTCATCTCTAA和AGGGCGGTTGCCCAGTA
Gapdh：TTCACCACCATGGAGAAGGC和CCCTTTTGGCTCCACCCT
Hoxa7：AGTTCAGGACCCGACAGGAA和CAGGTAGCGGTTGAAATGGAA
Hoxa9：CCGAAAACAATGCCGAGAA和CCGGGTTATTGGGATCGAT
Itgax：CCAGGTTGCCCAGTGAGAA和CTCAGATGGGCGGGTTCA
Mmp9：CATTCGCGTGGATAAGGAGT和TCACACGCCAGAAGAATTTG
Myc：GCCGATCAGCTGGAGATGA和GTCGTCAGGATCGCAGATGAAG
人RT-qPCR引物(从5’至3’端书写)
BIM：CACCGTGTCCATTACAGCAG和CTAAAATGCAGGAGGCCAAG
BRD4：CCCCTCGTGGTGGTGAAG和GCTCGCTGCGGATGATG
GAPDH：CCTGACCTGCCGTCTAGAAA和CTCCGACGCCTGCTTCAC
MYC：AGGGATCGCGCTGAGTATAA和TGCCTCTCGCTGGAATTACT
小鼠MycChIP引物(从5’至3’端书写)
Myc-3.8kb：TGTGGCTTTCCTGTCCTTTT和AGGGGACATCCCCATTTTAC
Myc-2.2kb：ATTCATTTTCCCCATCCACA和TTGCAAAGAGGGGGAGTAGA
Myc-1.9kb：ACAAATCCGAGAGCCACAAC和AACACCAAGAGCCACCAATC
Myc-1.8kb：GGTGGCTCTTGGTGTTTGAG和TCGAGCTCATTGCACAATTC
Myc-1.7kb：CAACTTTGAACAATGAGCACCT和CTCTCACTGCTACCCGGTTT
Myc-1.5kb：CGAGGAGTCCGGAATAAGAA和TCTTTTGCTCTGTGCATTGG
Myc-1kb：GCCTCTTGTGAAAACCGACT和CCGGTCTACACCCCATACAC
Myc+1kb：TGGAATCCTGAGGTCTTTGG和CAGAAATGCACCAAGCTGAA
Myc+1.5kb：CCCTCCCCTTTTATTTCGAG和GCTTTTCTTTCCGATTGCTG
Myc+3.7kb：TGCTTTGGGTGTGTCTGAAG和CTCCCAGAAAGGCAGAACAG
抗体
用于蛋白印迹的抗Brd4抗体是GerdBlobel的惠赠，用于的抗Brd4抗体购自Sigma公司(#HPA015055)。抗Myc抗体购自Epitomics公司(#1472-1)。在FACS中使用的抗体：APC抗小鼠CD117/ckit(Biolegend公司，#105811)、APC抗小鼠CD11b(Biolegend公司，#101211)、PacificBlue抗小鼠CD45.2(Biolegend公司，#109820)、小鼠造血谱系eFluor450混合物(ebioscience公司，#88-7772-72)、APC抗小鼠CD45R/B220(Biolegend公司，#103212)、APC抗小鼠TER-119/红系细胞(ErythroidCells)(Biolegend公司，#116212)、APC抗小鼠Ly-6G/Gr-1(ebioscience公司，#17-5931)、PE-Cy7抗小鼠CD117/ckit(ebioscience公司，#25-1171-82)和APC抗小鼠Sca-1(ebioscience公司，#17-5981-81)。抗β-肌动蛋白HRP抗体购自Sigma公司(#A3854)。
抗Brd4抗体是来自GerdBlobel的惠赠。Myc抗体(Epitomics公司加利福尼亚州(，，#1472-1)。用于FACS的抗体购自Biolegend公司(圣地亚哥，加利福尼亚州(，)，APC抗小鼠CD117/ckit(#105811)、APC抗小鼠CD11b(#101211)和PacificBlue抗小鼠CD45.2(#109820)。抗β-肌动蛋白HRP抗体购自Sigma公司(#A3854)。
动物研究
对于条件性的体内RNAi实验，用TRMPV-shRNA构建体对Tet-OnMLL-AF9/NrasG12D白血病细胞进行转导。通过尾静脉注射1x106个细胞进入经亚致死剂量(5.5Gy)辐射的B6/SJL(CD45.1)受体小鼠中来进行白血病细胞移植。
针对整个身体生物发光成像，用50mg/kg的D-荧光素(Goldbio公司，圣路易斯，蒙大拿州，)对小鼠进行腹膜内注射，并在10分钟后使用IVISSpectrum系统(，沃尔瑟姆，马萨诸塞州(，)进行分析。使用活体成像软件(LivingImagesoftware)()以及标准化的覆盖小鼠躯干和四肢的感兴趣矩形区域来进行定量
对于shRNA诱导，用含有强力霉素的饮用水(2mg/ml具有2％蔗糖；Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，蒙大拿州)和食物(625mg/kg，Harlan实验室，印第安纳波利斯，印第安纳州()来处理动物。对于JQ1治疗实验，通过在涡旋下滴加2-羟丙基-β-环糊精(Sigma-Aldrich公司)载体来将JQ1在DMSO中的100mg/ml储液稀释20倍，产生5mg/ml的最终浓度。将移植MLL-AF9/NrasG12D白血病细胞的小鼠每日腹膜内地(IP)注射新鲜制备的经载体稀释的JQ1(100mg/kg)或400μl载体(含有5％DMSO)。
微阵列分析
利用AffymetrixST1.0GeneChips进行表达微阵列。利用具有1000表型排列的GSEAv2.07软件(Subramanian等人)进行通路分析。
其他实施方案
从上述的描述中看出，很明显可以对在此描述的本发明进行变体和修改以使其适合于不同的用途和情况。这样的实施方案也在下述权利要求的范围内。
在此的变量的任何定义中的一系列要素的详述包括作为所列出要素的任何单个要素或组合(或子组合)的那个变量的定义。在此的实施方案的详述包括作为任何单个实施方案或与任何其他实施方案或其部分结合的实施方案。
通过引用将在这个说明书中提到的所有专利和出版物结合在此，其程度如同将每一个单独的专利和出版物具体并且个别地指明通过引用结合在此。

Claims (9)

1.一种试剂在制备用于治疗受试者中的白血病的药物中的用途，其中所述试剂是由下述结构式中的任一项所表示的化合物：
或其一种盐、溶剂合物或水合物。
2.权利要求1所述的用途，其中该白血病是急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、嗜酸细胞性白血病、毛细胞性白血病、何杰金氏淋巴癌、多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴癌、骨髓增生障碍或骨髓增生异常综合征。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述白血病是急性髓性白血病。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述试剂是以下结构式表示化合物JQ1，
或其一种盐、溶剂合物或水合物。
5.如权利要求1所述的用途，其中该受试者是哺乳动物。
6.如权利要求5所述的用途，其中该受试者是人类病人。
7.如权利要求6所述的用途，其中该人类病人是成人。
8.如权利要求6所述的用途，其中该人类病人是儿童。
9.如权利要求3所述的用途，其中该药物减少了受试者中的白血病细胞的生长、增殖或存活。
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